JPS62227446A - アフイニテイ・クロマトグラフイ−用吸着体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アフイニテイ・クロマトグラフィー用吸着体
に関する。

（従来の技術） アフイニテイ・クロマトグラフィーは、所謂生物学的な
特異性のあるアフイニテイ　（親和性）を相互にもつ２
種類の物質又は物質群の一方をリガンドとして水不溶性
の担体に固定化して固定相とし、この固定相に対するア
フイニテイの差を利用して、目的物質をこれに混在する
不純物から分離精製するクロマトグラフィーであって、
生物化学、特に酵素化学の分野における分離精製に広く
用いられている。上記担体としては、従来、デキストラ
ン、アガロース等の多糖類やポリアクリルアミドからな
る粒子径４０〜５００μｍ程度の親水性ゲル粒子が一般
に用いられている。

アフイニテイ・クロマトグラフィーによる分離精製は、
通常、カラム法又は回分法によって行なわれる。カラム
法は、吸着体粒子をカラムに充填し、これを適宜の溶剤
によって平衡化した後、このカラムに目的物質と共に不
純物を含む試料液体を加え、目的物質を吸着体に′吸着
させた後、吸着体にアフイニテイをもたない不純物をカ
ラムから洗浄除去し、次いで、吸着体に吸着された目的
物質を適宜の溶剤によって溶出させ、このようにして、
目的物質を不純物から分離精製する。

従って、このカラム法によれば、目的物質を連続して分
離し得る利点を有するが、カラムにおける溶剤の良好な
流れを確保すると共に、吸着体の圧密化を避けるために
、比較的大きい吸着体粒子を用いる必要がある。従って
、吸着体粒子は、単位体積当たりの表面積が小さいので
、カラム法は大量の試料の分離精製には不適であるとさ
れている。他方、吸着体粒子の表面積を大きくするため
に、多孔性や膨潤性とした粒子が用いられるときは、粒
子の圧縮や変形が一層著しくなり、耐久性が更に劣るこ
ととなる。

他方、回分法は、適宜の容器中において、吸着体粒子と
試料液体とを混合攪拌し、吸着体に目的物質を吸着させ
た後、この吸着体を遠心分離、濾過等の方法によって分
離し、これを洗浄し、次いで、容器中で溶出溶剤と共に
攪拌して、目的物質を溶出させ、吸着体から分離する。

従って、回分法は大量の試料の分離精製に適するものの
、一般には、吸着効率及び溶出効率が前記カラム法に劣
るために、従来、余り用いられていない。

更に、従来、知られている吸着体は、いずれも目的物質
以外の不純物が非特異的に吸着する傾向が尚強い。

（発明の目的） 本発明は、従来のアフイニテイ・クロマトグラフィーに
おける問題、特に、吸着体における問題を解決するため
になされたものであって、吸着及び溶出効率が高いのみ
ならず、耐久性にすぐれ、しかも、目的物質以外の不純
物の非特異的な吸着がないアフィニティ・クロマトグラ
フィー用吸着体を提供することを目的とする。

（発明の構成） 本発明によるアフイニテイ・クロマトグラフィー用吸着
は、粒子径０．０５〜５μｍであり、且つ、官能基を存
する水分散型高分子重合体粒子を担体とし、この担体上
にリガンドが共有結合にて固定化されていることを特徴
とする。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、こ
れを担体としてリガンドを共有結合にて固定化するため
に、少なくとも粒子表面に官能基を有することが必要で
あり、かかる官能性単量体とこの単量体に共重合性を有
する他の共単量体との乳化共重合によって得ることがで
きる。このような共重合による水分散型高分子重合体粒
子が乳化剤を含むときは、この重合体粒子にリガンドを
固定化してなる吸着体にも乳化剤が混入して、不純物が
吸着体に非特異的に吸着する傾向が強まるので、上記共
重合は、好ましくは乳化剤の不存在下に行なわれる。

上記官能製単量体の官能基としては、例えばカルボキシ
ル基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、ホルミル基、
カルバモイル基、イソチオシアナート基、アジドカルボ
ニル基、ヒドラジド基、酸無水物基等を挙げることがで
きる。従って、これらの官能基を有する単量体成分とし
て、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、桂皮酸、クロ
トン酸、イタコン酸や、或いはマレイン酸、フマル酸、
これらのエステル誘導体、酸無水物等のようなカルボキ
シル基を有する単量体、例えば、ヒドロキシエチルアク
リレート、２−ヒドロキシメチルメタクリレートのよう
な水酸基を有する単量体、例えば、グリシジルメタクリ
レートのようなグリシジル基を有する単量体を挙げるこ
とができる。特に、本発明においては、官能性単量体と
して、カルボキシル基を有する単量体が好ましく用いら
れる。

また、かかる官能性単量体と共重合性を有する前記共単
量体としては、例えば、エチレン、プロピレン等のオレ
フィン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビニル等のビニル系
単量体、スチレン、メチルスチレン、クロロスチレン等
のスチレン系単量体、アクリル酸メチル等のアクリル酸
エステル系単量体、メタクリル酸メチル等のメタクリル
酸エステル系単量体、ブタジェン等のジエン系単量体等
が用いられる。

更に、上記官能性単量体と共単量体との乳化共重合時の
重合安定性を改善し、又は得られる水分散型高分子重合
体粒子を改質するために、２．２．２−トリフルオロエ
チルメチルメタクリレート等のようなフッ素化メタクリ
ル酸エステル、アクリロニトリル、メタクリレートリル
、アクリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、ス
ルホプロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ−
ビニルピロリドン等の単量体を前記単量体と共重合させ
ることもできる。

特に、本発明においては、水分散型高分子重合体粒子は
、単量体成分として、一般式 ％式％ （但し、Ｒ１は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ・２
は （但し、ｍはＯ〜１２の整数を示し、ｘ　＋　ｙ　＝ｍ
−１であり、Ｒ３は水素又はアセチル基を示す。）を示
し、Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ。

を示し、ｎはＯ〜１２の整数を示す。）で表わされるア
クリル酸フルオロアルキルエステル誘導体を含有してい
ることが好ましい。全単量体成分における上記単量体成
分の割合は、通常は、５０〜９９重景％の範囲である。

上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体の具体
例として、例えば、　　　 ＣＨｚ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣＨｚＣｈＣｌｌ、＝Ｃ（
Ｃ１１３）ＣＯＯＣＲ２□（ＣＦｚ）　ＪＣＨｇ＝Ｃ（
ＣＨ３）ＣＯＯＣＲ２（ＣＦりａｌ目ＣＩＩｚ＝Ｃ（Ｃ
Ｈｚ）Ｃｏｏ（ＣＨｚ）　ｚ（ＣＦｚ）　ｓＦ等を挙げ
ることができる。

一般に、アフイニテイ・クロマトグラフィーにおいて、
吸着体に試料を吸着させた後、非吸着成分を洗浄除去す
るに際して、吸着体に非特異的に目的物質以外の物質が
目的物質と共に吸着されるとき、前述したように、溶出
操作時に夾雑物として混入し、所期の精製を行なうこと
ができない。

ここにおいて、本発明において用いる水分散型高分子重
合体粒子が上記したアクリル酸フルオロアルキルエステ
ル誘導体を単量体成分として含有するときは、その理由
は必ずしも明らかではないが、吸着体への目的物質以外
の非特異的吸着が効果的に防止される。特に、かかる共
単量体成分を含む単量体混合物を乳化剤の不存在下に乳
化重合させて水分散型高分子重合体粒子を調製し、かか
る粒子を担体としてリガンドを固定化するとき、得られ
る吸着体は、目的物質以外の不純物の非特異的吸着がな
いうえに、吸着及び溶出効率が高い。

また、前記スチレンスルホン酸ナトリウム、スルホプロ
ピル（メタ）アクリレートナトリウム塩等のように、ス
ルホン酸基を有する単量体は、乳化剤の不存在下に乳化
共重合を行なう場合の重合安定性を高める効果にすぐれ
る。

上述した単量体と共に、共単量体成分として多官能性単
量体を内部架橋剤として乳化共重合させて、架橋させた
水分散型高分子重合体粒子を得ることもできる。一般に
、親水性基を有する共重合体は、水膨潤性を有して、保
存性、耐ｐ）性、分散安定性等の安定性が不十分である
場合があるが、このように、重合体粒子に架橋構造を導
入することによって、水分散型高分子重合体粒子を非膨
潤化して、重合体粒子の水性媒体中での分散安定性を高
めることができ、更にミ得られる重合体粒子のガラス転
移温度を高めることができる。

かかる内部架橋用多官能性単量体としては、例えば脂肪
族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好ま
しく用いられる。具体例として、エチレングリコールジ
（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ
）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、ジプロピレンゲリコールジ（メタ）アクリ
レート、１．３−プチレンゲリコールジ（メタ）アクリ
レート、トリメチロールプロパントリ　（メタ）アクリ
レート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリ
レート等が好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼ
ンやＮ、　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド等も内部
架橋剤として用いることができる。

尚、個々の単量体の具体的な種類は、得られる吸着体が
その使用時や保存時に融着、凝集を起こさないように、
所要のガラス転移点を有するように選ばれる。重合体粒
子のガラス転移点は、吸着体の使用温度を考慮して、好
ましくは１０℃以上、特に室温以上である。

更に、本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子
は、その粒子径が０．０５〜５μｍの範囲にあることが
好ましい。特に、０．１〜２μｍの範囲にあることが好
ましい。粒子径が５μｍを越えるときは、粒子の単位体
積当たりの表面積が小さく、アフイニテイ・クロマトグ
ラフィーによる分離精製効率が低い。他方、０．０５μ
ｍよりも小さいときは、例えば、回分法による場合に、
吸着後の粒子の遠心分離や膜分離による分離が困難とな
る。

本発明においては、所要の単量体成分を重合させた後、
得られた水分散型高分子重合体粒子に官能基を導入する
こともできる。このための方法としては、例えば、アク
リル酸エステルを単量体成分として重合させて得た重合
体粒子を加水分解することにより、カルボキシル基を有
する重合体粒子を得ることができる。また、アミノ基や
ヒドラジド基を有する水分散型高分子重合体粒子を調製
するには、例えば、アクリルアミドのようなアミド基を
有する単量体、又はアクリル酸メチルのようなメチルエ
ステル基を有する単量体をそれぞれ他の単量体と乳化共
重合し、得られた共重合体中のアミド基をホフマン分解
し、又はメチルエステル基をヒドラジンと反応させるこ
とにより得ることができる。

更に、本発明によるアフイニテイ・クロマトグラフィー
用吸着体においては、水分散型高分子重合体粒子にリガ
ンドを共有結合によって結合するに際して、必要に応じ
てリガンドの重合体粒子上での自由度を高めるために、
重合体粒子とりガントとをスペーサ基を介在させて共有
結合にて結合させることができる。このスペーサ基は、
予め重合体粒子に結合させ、この後にこのスペーサ基と
りガントとを結合させてもよ（、或いはスペーサ基を予
めリガンドに結合させ、これを重合体粒子に結合させて
もよい。更に、必要に応じて、重合体粒子及びリガンド
の両者に予めスペーサ基を結合させ、これらを相互に結
合させることもできる。

上記スペーサ基として用い得る化合物は、少なくとも二
官能性の有機化合物であり、多官能性の重合体を排除す
るものではないが、特に、炭素数１〜１２の炭素鎖基を
有する二官能性の有機化合物が好ましい。このようなス
ペーサ基として機能する化合物の具体例として、例えば
、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、
キシリレンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−ア
ミノプロピオン酸、Ｔ−アミノ酪酸、Ｃ−アミノカプロ
ン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアルキルカルボ
ン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニン、アルギニ
ン、グリシルグリシルグリシン等のアミノ酸類等が好ま
しく用いられるが、これらに限定されるものではない。

前記した官能基を有する水分散型高分子重合体粒子に直
接にリガンドを共有結合にて結合し、又は重合体粒子に
スペーサ基を結合し、また、このスペーサ基にリガンド
を共有結合にて結合するための方法は、特に制限されず
、従来より知られている任意の方法によることができる
。例えば、好ましい方法の一つとして、結合試薬として
水溶性カルボジイミドを用いる方法を挙げることができ
る。例えば、アミノアルキルカルボン酸をスペーサ基と
して用いる場合であれば、水溶性カルボジイミドを用い
て、アミノアルキルカルボン酸を水分散型高分子重合体
粒子に結合させ、次いで、この重合体粒子に結合された
アミノアルキルカルボン酸に水溶性カルボジイミドを用
いて同様にして、リガンドを共存結合にて結合させるこ
とができる。

かかる方法において用いる水溶性カルボジイミドとして
は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロへキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−
ｐ−）ルエンスルホネート等を挙げることができる。こ
のような水溶性カルボジイミドを用いて、スペーサ基を
介して、又は介さずして直接に、共有結合によってリガ
ンドを重合体粒子に結合させるには、従来より知られて
いる通常の方法及び条件によることができる。

また、官能基が水酸基であるときは臭化シアン法により
、また、アミノ基であるときはジアルデヒドと反応させ
、これら官能基を活性化することによって、スペーサ基
を結合させ、次いで、上記と同様にして免疫反応体及び
／又は標識剤を重合体粒子に共有結合にて結合させるこ
とができる。

また、重合体粒子に直接にリガンドを結合させることも
できる。

このようにして、水分散型高分子重合体粒子にリガンド
を結合させた後、例えば膜分離法や濾過、遠心分離法等
、従来の通常の分離法によって、本発明によるアフイニ
テイ・クロマトグラフィー用吸着体を分離精製すること
ができる。

本発明によるアフイニテイ・クロマトグラフィー用吸着
体は、従来の通常のアフイニティ・クロマトグラフィー
における膨潤ゲルと同様にして用いることができる。従
って、吸着体は、勿論、カラム法にも使用し得るが、特
に、回分方に使用するとき、粒子の単位体積当たりの表
面積が大きいと共に、吸着及び溶出速度が大きいので、
大量の試料の分離精製を高い効率にて行なうことができ
る０回分方式による場合、吸着体濃度を５〜５０重量％
の範囲とした水分散液として、吸着及び溶出を行なうこ
とが好適である。

（発明の効果） 以上のように、本発明によるアフィニティ・クロマトグ
ラフィー用吸着体は、平均粒子径が０．０５〜５μｍの
水分散型高分子重合体粒子を担体とし、この担体上にリ
ガンドが共有結合にて結合されている。従って、かかる
吸着体は、単位体積当たりの表面積が大きいと共に、前
述したように、吸着及び溶出効率が高いので、例えば、
回分法による試料の大量処理に特に好適である。

更に、本発明による吸着体は、強固な重合体粒子からな
るので、従来の吸着体に比較して耐久性に格段にすぐれ
、また、その製造及び精製も容易である。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例 （１）水分散型高分子重合体粒子の調製第１表に示す単
量体混合物２０ｇ及び蒸留水１７０ｇを窒素気流下に温
度６７℃にて攪拌しながら、これに過硫酸アンモニウム
０．２ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を触媒として
加え、８時間重合させた。この後、重合体粒子を蒸留水
で遠心洗浄し、固形分濃度２０重景％となるように蒸留
水に再分散させた。第１表に得られた水分散型高分子重
合体粒子の平均粒子径を示す。

（２）　　水分散型高分子重合体粒子へのスペーサ基の
結合 上記番号４の水分散型高分子重合体粒子の分散液を固形
分濃度５重量％に調整し、その１００ｍ１をε−アミノ
カプロン酸水溶液（０，０２Ｍ）１００ｍｌと混合した
後、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７，５に調整
した。

次に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２５■／ｍｌ）　２０
ＩＩ１１を上記ε−アミノカプロン酸を含む重合体粒子
の水性分散液に加え、室温にて一夜攪拌下に反応させた
。重合体粒子をホウ酸緩衝液（ｐ１１？、５．０．０１
Ｍ）にて３回・遠心洗浄して、スペーサ基の結合された
水分散型高分子重合体粒子を得、これを上記と同様のホ
ウ酸緩衝液に固形分濃度２０重量％となるように再分散
させた。これを水分散型高分子重合体粒子５とする。

（３）吸着体の調製 上記のそれぞれの重合体粒子の水性分散液９ｍｌに１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩水溶液（５■／ｍｌ）　７゜２ｍｌと抗ヒ
トアルブミン水溶液（８■／＋ｎｌ）２３ｍｌを加え、
緩慢に攪拌しつつ、１０℃の温度にて１７時間反応させ
た。

この後、重合体粒子をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
，０，２Ｍ、塩化ナトリウム０．５Ｍを含む。）でよく
遠心洗浄した後、同じ緩衝液に再分散させて、抗ヒトア
ルブミン固定化水分散型高分子重合体粒子の水性分散液
（固形分濃度２０重量％）９ｎ＋１を得た。このとき、
７３％の抗ヒトアルブミン抗体が結合した。

（比較例） 比較のために、活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ（ファー
マシア社製アガロース系担体）を０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液でよく洗浄し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０，０
，ＯＩＭ）で十分に平衡化した膨潤ゲル９ｍｌを用いて
、抗ヒトアルブミン水溶液（８■／ｍｌ）　　２３ｍｌ
を加え、抗ヒトアルブミンを固定化した。

一晩放置したのち、トリス−塩酸緩衝液（ｐ）１８゜０
．０．２Ｍ、塩化ナトリウム０．５Ｍを含む）でよ（洗
浄し、抗ヒトアルブミン結合セファロース４Ｂを得た。

このとき７０％の抗ヒトアルブミン抗体が結合した。

（４）　　ヒト全血清からのアルブミンの分離上で得た
それぞれの抗ヒトアルブミン固定化吸着体の水性分散液
（固形分２０重景％）３ｍｌにヒト全血清３ｍｌをよく
分散させ、１０分ごとにその１ｍｌを遠心分離し、トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐｔ１８．０゜０．２Ｍ）で２回遠心
洗浄した後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，８，０，
２Ｍ、塩化ナトリウム０．５Ｍを含む。）で３０分間、
溶出した。比較例として抗ヒトアルブミン固定化ＣＨ−
セファロース４Ｂ３ｍｌにヒト全血清３ｍｌを攪拌中加
え、１０分ごとに１ｎ１１サンプリングし、トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０，０，２Ｍ）で洗浄した後、グリ
シン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，８，０，２Ｍ、塩化ナトリ
ウム０．５Ｍを含む）で溶出した。得られたアルブミン
の量を第１表に示す。

本発明の吸着体によれば、比較例のそれに比べて、アル
ブミンの吸着効率が高いことが明らかである。

、　　また、吸着時間を６０分として得られた溶出アル
ブミンについて、高速液体クロマトグラフィーにて測定
した純度を第１表に示す。本発明の吸着体では、抗原抗
体反応によらない物理的吸着をおさえうろことが明らか
である。

また、上で得た吸着体５を種々の固形分濃度に調整した
。この吸着体の分散液１ｍｌとヒト全血清Ｉｎ＋１とを
よく混合し、回分法にて吸着時間９０分、溶出時間３０
分として、上記と同様にして、アルブミンを分離精製し
た。結果を第２表に示す。溶出アルブミンの純度はいず
れも９９％以上であった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）粒子径０．０５〜５μｍであり、且つ、官能基を
   有する水分散型高分子重合体粒子を担体とし、この担体
   上にリガンドが共有結合にて固定化されていることを特
   徴とするアフイニテイ・クロマトグラフィー用吸着体。
2. （２）官能基がカルボキシル基であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載のアフイニテイ・クロマトグ
   ラフィー用吸着体。
3. （３）水分散型高分子重合体粒子が単量体成分として、
   一般式 ＣＨ＿２＝ＣＲ＾１ＣＯＯＲ＾２（ＣＦ＿２）＿ｎＣＦ
   Ａ＿２（但し、Ｒ＾１は水素又は低級アルキル基を示し
   、Ｒ＾２は ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
   あり、Ｒ＾３は水素又はアセチル基を示す。）を示し、
   Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ＿３を示し、
   ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
   体を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載のアフイニテイ・クロマトグラフィー用吸着体。