JP4024209B2 - イオン交換クロマトグラフィー用アルカリ安定型親水性吸着剤 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的物質（例えば、ウィルスのみならず、たんぱく質、ペプチドまたは核酸）のクロマトグラフ分離に特に適しているイオン交換クロマトグラフィー用吸着剤に関する。

生物学的物質のクロマトグラフ分離では、特に製造過程において、吸着剤は多数の性質を有していなければならず；これらは、第一に分離装置の洗浄には普通である（定置洗浄：ＣＩＰ）アルカリ溶液に対する優れた耐性、そして高い流速が達成できるための適切な機械的安定性、そしてまた精製される物質の吸着剤への不可逆的結合を防ぐための適切な親水性を含む。更に、高い結合能力はまた、分離過程を経済的に行うことができるために必要である。結合能力はまた、実質的に高い流速に保持されるべきである。すなわち、静的結合能力のみならず、動的結合能力もまた高いべきである。吸着剤が誘導体化された（derivatised）、例えば接合材料からなる場合、基材の必要不可欠な性質は、誘導体化（derivatisation）によって損なわれてはならない。

EP 0 337 144には、イオン交換クロマトグラフィー用吸着剤が開示されている。EP 0 337 144の教示によると、誘導体化アクリルアミドモノマーは、(メタ)アクリレート架橋ポリマーまたはシリカゲル誘導体などのジオール置換基材に接合される。この方法で得られるイオン交換体が優れた分離性質と優れた圧力の安定性を示すが、イオン交換体は、アルカリ溶液に対して限られた安定性のみを有する。

よって、改善された性質、特に改善されたアルカリ安定性と優れた動的結合能力を有するイオン交換クロマトグラフィー用吸着剤を提供するという目的が生じる。

本発明は、以下のプロセス段階：
ａ）基材が、ジオール基含有ビニルモノマーと、重合可能な基がカルボキサミド基含有鎖よって結合した架橋モノマーとを含む架橋ビニルポリマーであり、この基材がグラムあたり１ｍｍｏｌより多いジオール基を含む、基材の製造段階；
ｂ）モノマーが、イオン性基またはイオン性基のための前駆基を含む、接合される１または２以上のモノマーの水溶液への基材の添加段階；
ｃ）グラフト重合が、セリウム（ＩＶ）イオンにより開始され、懸濁密度（基材の濃度）、モノマー濃度、開始剤濃度、ｐＨ、時間、温度、そして重合抑制剤の添加といったプロセスパラメータが、接合度が支持体１ｇ（乾燥重量）あたり０．５〜２ｍｍｏｌを達成するように選ばれる、基材へのモノマーの接合段階；
ｄ）そして最後に、適切な場合には、段階ｂ）で導入したイオン性基のための前駆基を、イオン性基に変換する段階
により得ることができるイオン交換クロマトグラフィー用アルカリ安定型親水性吸着剤に関する。

本発明は、前記のプロセス段階を有するイオン交換クロマトグラフィー用アルカリ安定型親水性吸着剤の製造方法と、少なくとも２種類の物質を分離するためにこの方法で得られる吸着剤の使用に関する。

図１は、線形流速の関数として例Ａ１に従って製造したＤＥＡＥイオン交換体のたんぱく質結合能力を示す；実験の詳細を、使用例Ｂ１に示す。１５００ｃｍ／ｈの線形流速においても、最大結合能力の約７０％が尚測定される。よって、本発明の吸着剤は、対象物質を捕集するのに非常に適している。

図２は、接合度の関数として例Ａ２に従って製造したＳＯ_３イオン交換体のたんぱく質結合能力を示す；実験の詳細を、使用例Ｂ２に示す。接合度の関数としての結合能力は、乾燥重量１ｇあたり約０．６ｍＭ（２％の硫黄に相当）の明確な最大を有する曲線を通る。ゲル１ｇあたり約４００ｍｇのリゾチームの結合能力が達成される。

基材１ｇ（乾燥重量）あたり１ｍｍｏｌより多いジオール基含有量を有する基材を用い、基材１ｇ（乾燥重量）あたり０．５〜２ｍｍｏｌの接合度を達成するようグラフト重合における反応を実施する場合、大幅に改善された性質を有するイオン交換体を得ることができることが見出された。適している基材は、親水性、マクロポーラス（macroporous）、高度に架橋したポリマー材料、特にジオール基含有ビニルモノマーと重合可能な基がカルボキサミド基含有鎖によって結合した架橋モノマーとを含む架橋ビニルポリマーである。これらは基材１ｇあたり１ｍｍｏｌより多いジオール基、特に１ｇあたり２〜６ｍｍｏｌのジオール基を含有する。Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドと３−アリルオキシ−１，２−プロパンジオール（１：０．６）とを含む多孔質ビーズコポリマーの使用が好まれる（製造元：Degussa/Roehm, Darmstadt）。用いられる基材はまた、アミド性またはエーテル性架橋を有し、エーテルまたはアミド結合した脂肪族水酸基を表面に有する、または後者に化学的に変換することができる基を有するポリマーであることができる。重要な要因は、好ましくは、基材の表面上での適切な濃度での脂肪族ジオール基の形態での水酸基の存在である。理想的な場合、ポリマー基材の単官能モノマー成分すべての官能基は、脂肪族ジオール基に代表されるべきである。しかしながら、ジオール基の形態でのこれらの基の少なくとも５０％の割合もまた、適している。ジオール基の決定方法は、当業者に知られている。特に適している基材は、EP 0 482 339に開示されている。

本発明に従って用いられる基材は特に、（マクロ）ポーラスビーズポリマーの形態である；しかしながら、無孔質ビーズポリマーまたは別の形態のポリマー、例えば異なる形状を有する多孔質のシリンダーもしくは成形、または膜、フィラメントもしくは織物を採用することもまた可能である。

モノマーは、以下に一層詳細に説明するが、グラフト重合でこれらの基材に接合し、基材１ｇあたり０．５〜２ｍｍｏｌの接合度が得られるよう制御される。接合度の上限を著しく超える場合、得られた吸着剤は頻繁に機械特性障害を損なう。本発明に従って、改善された性質、特に改善された動的結合能力および非常に優れたアルカリ安定性を有するイオン交換体が得られる。

本発明に従って、接合はセリウム（ＩＶ）イオンにより開始される（G. Mino and S. Kaizerman (1958) J. Polymer Science 31, 242-243; G. Mino et al. (1959) J. Polymer Science 38, 393-401）。更なる詳細は、EP 0 337 144に開示されている。強度に酸性の水溶液中のセリウム（ＩＶ）塩との反応により、基材上に遊離基が生じ、ジオール基は、脂肪族水酸基より明らかに迅速に反応する。遊離基連鎖反応は、この反応で形成された遊離基で開始し、加えられたモノマーは、連鎖に組み込まれる。よってこの連鎖は、直線状であり、基材の脂肪族ラジカルを含有するモノマー単位に連結する。重合は、セリウム塩参加の停止反応により終了する。このため、（平均）連鎖の長さは、基材、開始剤およびモノマーの濃度比により影響され得る。この件の詳細を、以下に記述する。更に、同型のモノマーまたは代わりに種々のモノマーの混合物を採用することができる；後者の場合、接合コポリマーを形成する。

用いられる溶媒が水に加えて有機溶媒を含む混合物で、これらの溶媒が水と混合可能であり、水酸基を含有しない場合、セリウム（ＩＶ）塩との反応もまた可能である。ここでは特にジオキサンまたはテトラヒドロフランが好まれる。反応バッチでの有機溶媒の割合は、典型的に５〜８０容量％で、特に２０〜５０容量％である。この工程の変法により、水にやや溶けにくいに過ぎないモノマーとの接合が可能になる。

本発明に従って好まれる基材１ｇあたり０．５〜２ｍｍｏｌの接合度を達成するために、基材濃度（懸濁密度）、モノマー濃度、開始剤濃度、ｐＨ、時間、温度および重合抑制剤の添加といったプロセスパラメータを変化させる。接合する基材の所定の懸濁密度と、よって既定の反応性表面積とセリウム（ＩＶ）塩によって酸化され得る使用可能な官能基数については、接合度を、本発明によると、グラフト生成物という意味では主に以下のパラメータの変化により設定することができる。
ａ）モノマー濃度（０．０５〜２ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．２〜０．８ｍｏｌ／ｌ）：増加がグラフト重合体の生成増加という結果になる。
ｂ）ｐＨ（０〜６、好ましくは１〜２）：ｐＨの増加がグラフト重合体の生成の減少という結果になる。
ｃ）開始剤濃度（１０^−６〜１０^−１ｍｏｌ／ｌ；好ましくは１０^−３〜１０^−２ｍｏｌ／ｌ）：開始剤濃度の増加が一層多い開始時点数という結果になり、よってグラフト重合体連鎖が形成される。しかしながら、停止反応中の金属複合体参加による早期連鎖停止もまた、過剰に高い開始剤濃度において生じる。その結果、グラフト密度は増加するが、平均重合度達成が犠牲になり、これは、接合度もまた、再び減少し得ることを意味する。
ｄ）時間：反応継続期間の延長は、グラフト重合体生成の増加をもたらす；典型的な漸近的近似の最大量は、約２０時間後に達成される。最適反応時間は、０．５〜５時間の間である。
ｅ）温度：混合物中の金属複合体の安定性に関して、および支持材料の多孔系での水溶性反応体の拡散に関して、補助的な役割のみ果たす。好ましい温度は、１０〜６０℃の間である。最高および最低温度は、水性懸濁液の融点または沸点により与えられる。
ｆ）抑制剤：当業者に馴染みのある遊離基重合反応の抑制剤を、基本的に極めて特定的な接合度に達成するために減速剤としてまたは早期反応停止のために用いることができる。

抑制剤は、とりわけ、キノン／ヒドロキノン、亜硫酸ナトリウム、すべての即酸化可能な金属塩および金属複合体などの酸化還元活性物質；アルデヒドおよび類似する容易に酸化可能な有機物質を含む。あまり適していないのは、モノヒドロキシルもしくは近隣ジヒドロキシル官能を含む化合物またはポリヒドロキシル化合物および存在するモノマーとの一次酸化生成物がいくつかの場合においてはグラフト重合体化支持材料から除去するのが難しいホモポリマーの生成となる関連物質である。空気中の酸素もまた、重合反応を遅くするのに適している。

本発明によると、以下のモノマーは特に、グラフト重合体に好まれる：
Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、Ｎ−（２−トリメチルアンモニウムエチル）アクリルアミド塩酸塩、Ｎ−（３−トリメチルアンモニウムプロピル）アクリルアミド塩酸塩、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、アクリル酸、アクリロニトリル、また、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、アクリルアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド。

アクリル酸とアクリルアミド以外では、一般的に、アミド窒素がセリウム(ＩＶ)により酸化することができる官能基（例えばヒドロキシルまたはカルボキシル基）を含有する置換基を持っていなければ、Ｎ−置換アクリルアミドは基本的に本発明のグラフト重合体に適している。更に、これらのモノマーは、イオン性基またはイオン性基に変換することができる基を含有すべきである。

例えばアクリロニトリルまたはアクリルアミドを含有するグラフト重合体は、ポリマー類似加水分解によってカルボキシル基を含有するイオン交換体に変換することができる。

しかしながら、電荷密度を調節するために、イオン性基を含有しないコモノマーを添加することもまた、適切であり得る。アクリルアミドの他には、例えば、Ｎ−（２−メトキシエチル）アクリルアミドおよびＮ−（２−エトキシエチル）アクリルアミドがこの目的に適している。

対応メタクリル酸誘導体も同様に適している。

アミド結合、特にＮ−アルキルアミド結合は、非常にアルカリ安定型であることが見出された。

EP 0 337 144に公開されている吸着剤と比較して、本発明による吸着剤は動的結合能力が著しく増加している。これは、顕著な最適化の結果となる結合能力と接合度との間の相関関係が従来の技術では認識されていなかったために可能となったのである。更に、本発明による吸着剤はアルカリ安定性が著しく改善されている。

本発明による吸着剤は、従来知られている吸着剤の代わりに、例えばEP 337 144に開示されている吸着剤の代わりに有利に使用することができる。よって、本発明による吸着剤は、ペプチド、たんぱく質または核酸などの生物ポリマーの分離だけでなく、またウィルス、細胞小器官、原核細胞または真核細胞、およびたんぱく質複合体の分離および精製にも使用できる。

これ以上の説明がなくても、当業者は上記の記載を最も広い範囲で利用することが可能であると推測される。したがって、好ましい態様および例は、単に記述による開示であると考えられるべきであって、如何なる意味においても決して限定するものではない。

本明細書中に記載する全ての出願、特許および刊行物、ならびに2001年10月5日に出願した対応出願DE 101 49 256.1の全ての開示内容は、参考文献の形態によって本出願中に組み込まれる。

例
他に記載が無い限り、基材の重量データは、材料を過剰量のアセトンで５回洗浄し、それに続き減圧下で５０℃で一定の重量に乾燥する決定のための乾燥重量に関する。

室温（Ｒ．Ｔ．）とは、１５〜３０℃のことを指す。

Ａ 製造例
製造例Ａ１：ＤＥＡＥイオン交換材料の製造
ａ）モノマー溶液：
モノマー溶液は、０〜５℃で１．２リットルの水に溶解した１２７ｇ（１．０９ｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジエチレンジアミンのアクリル化によって得られる。このために、９５ｇ（１．０５ｍｏｌ）のアクリロイルクロライドを、指示温度範囲が反応中維持される速度で攪拌されたアミン溶液に添加する。アクリロイルクロライドの添加が完了したら、混合物を更に３０分反応させ、次いで溶液を６５％硝酸を用いてｐＨ２．０に調整する。

ｂ）接合：
１ｋｇ（含水重量）の基材混合物（親水性、マクロポーラス、高架橋ポリマー材料、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドと３−アリルオキシ−１，２−プロパンジオールとのコポリマー（１：０．６）；（製造元：Degussa/Roehm, Darmstadt, ドイツ）を温度調節可能な攪拌反応器内で新しく製造したモノマー溶液に添加する。基材混合物とモノマー溶液とを懸濁液になるまで攪拌し、合計容積３リットルになるよう水を加える。続いて懸濁液を４２℃まで加熱し、窒素で覆い、そして、６０ｍｌの０．５Ｍ硝酸中１６．４４ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）（３０ｍｍｏｌ）の溶液を、更に攪拌しながら添加する。

４２℃で１２〜１８時間後、懸濁液をろ過または遠心分離し、残留したゲルを水、０．２Ｍアスコルビン酸／０．５Ｍ硫酸の混合物、次に再び水、そして１ＭＮａＯＨ、再び水で、標準分析方法の検出感度の限界まで反応混合物の全水溶性構成物質がゲルから除去されるまで多数回連続して洗浄する。

完成品を、室温で、２０％のエタノールを含有する塩溶液の懸濁液中で、または、例えば、０．１ＭＮａＯＨで保存する。

分析：
ＢＳＡについての結合能力は約５００ｍｇ／ｇである（ゲルの乾燥重量を基準として）。

接合度は、固定化ＤＥＡＥ基の酸／塩基滴定で測定して、約１ｍｍｏｌ／ｇ（モノマー単位で、乾燥重量を基準として）である。

製造例Ａ２：ＳＯ_３イオン交換体材料の製造
ＳＯ_３基を含む陽イオン交換体は、本明細暑中で述べたモノマーの代わりに２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸をモノマーとして用い、製造例Ａ１の記述と同様にして製造する。

製造を、異なる接合度の交換体の様々な製造をして様々な変種について繰り返す。それぞれの接合度は、硫黄含有量の元素分析で決定する。

製造例Ａ３：強度に塩基性のイオン交換体材料（ＴＭＡＥ）の製造
ＴＭＡＥ基を含む、陰イオン交換体を、本明細書中で述べたモノマーの代わりにＮ−（２−トリメチルアンモニウムエチル）アクリルアミド塩酸塩をモノマーとして用い、製造例Ａ１の記述と同様にして製造する。

Ｂ 使用例
使用例Ｂ１：ウシ血清アルブミンとの結合能力の決定（破過曲線）
例Ａ１に従って製造したイオン交換体材料を、SuperFormance（登録商標）ガラスカラム（１５０ｘ１６ｍｍ；吸着剤層の深さは１２５ｍｍ）中に導入し、適用緩衝液（５０ｍＭＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．３）と平衡にする。この緩衝液中のウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を連続的に加え(線形流量：１００ｃｍ／ｈ）、溶出曲線を２８０ｎｍにて光度計により測定する。能力（１２５ｍｇ／１ｍｌのゲル）を、破過曲線（１０％）から決定する。

実験を、一層高い流速で繰り返す。結果を、図１に示す。線形流速が１５００ｃｍ／ｈでも、最大結合能力の約７０％が尚測定される。

使用例Ｂ２：リゾチームとの結合能力の決定（破過曲線）
例Ａ２に従って製造したイオン交換体材料を、SuperFormance（登録商標）ガラスカラム（１５０ｘ１６ｍｍ；吸着剤層の深さは１００ｍｍ）中に導入し、適用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）と平衡にする。この緩衝液中のリゾチーム溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を連続的に加え(線形流量：１００ｃｍ／ｈ）、溶出曲線を２８０ｎｍにて光度計により測定する。能力（リゾチーム１１０ｍｇ／１ｍｌのゲル）を、破過曲線（１０％）から決定する。

実験を、様々な製造物（異なる接合度）で繰り返す。結果を、図２に示す。接合度の関数としての結合能力は、乾燥重量１ｇあたり約０．６ｍＭ（２％の硫黄に相当）の明確な最大を有する曲線で表される。

使用例Ｂ３：アルカリ溶液中の吸着剤の有効寿命
例Ａ１に従って製造したＤＥＡＥイオン交換体を、室温でＮａＯＨ水溶液（１または５ｍｏｌ／ｌ）中に保存する。１年後、結合能力は、５％（１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ中）または１０％（５ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ中）に低下した。

線形流速の関数として例Ａ１に従って製造したＤＥＡＥイオン交換体のたんぱく質結合能力を示す。 接合度の関数として例Ａ２に従って製造したＳＯ_３イオン交換体のたんぱく質結合能力を示す。

Claims (5)

1. 以下のプロセス段階：
   ａ）基材が、ジオール基含有ビニルモノマーと、重合可能な基がカルボキサミド基含有鎖によって結合した架橋モノマーとを含む架橋ビニルポリマーであり、この基材がグラムあたり１ｍｍｏｌより多いジオール基を含む、基材の製造段階；
   ｂ）モノマーが、イオン性基またはイオン性基のための前駆基を含む、接合されるモノマーの水溶液への基材の添加段階；
   ｃ）グラフト重合が、セリウム（ＩＶ）イオンにより開始され、懸濁密度（基材の濃度）、モノマー濃度、開始剤濃度、ｐＨ、時間、温度および重合抑制剤の添加といったプロセスパラメータが、接合度が支持体１ｇ（乾燥重量）あたり０．５〜２ｍｍｏｌを達成するように選ばれる、基材へのモノマーの接合段階；
   ｄ）そして最後に、適切な場合には、段階ｂ）で導入したイオン性基のための前駆基を、イオン性基に変換する段階
   により得られる、イオン交換クロマトグラフィー用アルカリ安定型親水性吸着剤。
2. イオン性基またはイオン性基のための前駆基を含むモノマーに加えて、追加の中性モノマーが段階ｂ）で添加される、請求項１に記載のイオン交換クロマトグラフィー用アルカリ安定型親水性吸着剤。
3. 少なくとも２種類の物質のクロマトグラフ分離のための、請求項１または２に記載のイオン交換クロマトグラフィー用アルカリ安定型親水性吸着剤の使用。
4. 以下のプロセス段階：
   ａ）基材が、ジオール基含有ビニルモノマーと、重合可能な基がカルボキサミド基含有鎖によって結合した架橋モノマーとを含む架橋ビニルポリマーであり、この基材がグラムあたり１ｍｍｏｌより多いジオール基を含む、基材の製造段階；
   ｂ）モノマーが、イオン性基またはイオン性基のための前駆基を含む、接合されるモノマーの水溶液への基材の添加段階；
   ｃ）グラフト重合が、セリウム（ＩＶ）イオンにより開始され、所定の懸濁密度でのモノマー濃度、所定のモノマー濃度と懸濁密度での開始剤濃度、ｐＨ、時間、温度および重合抑制剤の添加といったプロセスパラメータが、接合度が支持体１ｇ（乾燥重量）あたり０．５〜２ｍｍｏｌを達成するように選ばれる、基材へのモノマーの接合段階；
   ｄ）そして最後に、適切な場合には、段階ｂ）で導入したイオン性基のための前駆基を、イオン性基に変換する段階
   を有する、イオン交換クロマトグラフィー用アルカリ安定型親水性吸着剤の製造方法。
5. イオン性基またはイオン性基のための前駆基を含むモノマーに加えて、追加の中性モノマーが段階ｂ）で添加される、請求項４に記載のイオン交換クロマトグラフィー用アルカリ安定型親水性吸着剤の製造方法。

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