JP3970319B2 - 分離用材料およびそれらの製造方法 - Google Patents

Description

本発明はヒドロキシル基を含有しており、その表面が共有結合したポリマーで被覆されている支持体を基材とする分離用材料およびそれらの製造方法に関する。本発明による分離用材料は高分子、特にバイオポリマーの分別に使用することができる。生体高分子、例えば核酸、蛋白質、酵素、細胞レベル以下単位、ペプチド類、モノクローナル抗体または完全細胞の分離および精製は、遺伝子工学およびバイオテクノロジーに関連して格別の重要性を得てきている。
例えば、生物学的高分子の分別にイオン交換体を使用することは公知である。慣用の材料はポリマー類、例えばポリメタアクリレート類、ポリスチレン類、アガロース、架橋したデキストランまたはシリカゲルからなり、これらは適当な官能性基を担持している。
EP 337 144には、ヒドロキシル基を含有しており、その表面が共有結合したポリマーで被覆されている支持体を基材とする分離用材料が記載されており、このポリマーはセリウム（IV）イオンの存在におけるグラフト重合により支持体に結合されている同一または相違する反復単位からなる。
全体として、これらの分離用材料は最適とはいえず、特に製造方法およびそのグラフト形成率（grafting yield）に関しては、依然としてかなりの欠陥を有している。
本発明の目的は、上記欠陥を有さない最適の分離用材料を入手できるようにすることにある。
ヒドロキシル基を含有する支持体の表面が、共有結合したポリマーで被覆されている支持体を基材とする分離用材料の製造方法であって、ポリアクリル化混合物中、１〜３．５モル／リットルの濃度の、塩化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、またはこれらの塩の混合物からなる無機塩およびセリウム（ＩＶ）イオンの存在下でグラフト重合することにより、式Ｉ

式中、ＸはＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃Ｈであり、そして
ｎは２〜１００である、
で表わされる同一の反復単位からなるポリマーをヒドロキシル基を含有する支持体の表面に共有結合させて被覆することを特徴とする、前記方法に関する。この場合に、重合に必要なモノマーを、水性溶液中で安定剤の存在下にアクリロイルクロライドとアミノエタンスルホン酸とを反応させることによって製造し、グラフト重合に直接使用すると特に有利である。該安定剤は４−メトキシフェノールであるのが好ましい。
驚くべきことに、本発明による支持材料は高速クロマトグラフイ分離に特に適することが証明された。本発明による分離用材料は高分子、特にバイオポリマーのイオン交換クロマトグラフイに広く利用できる。
本発明による分離用材料はヒドロキシル基を有し、かつまたその上にモノマースルホエチルアクリルアミドから出発して、このヒドロキシル基のα−Ｃ原子を介してポリマー物質がグラフトされている支持粒子からなる。
支持粒子は、その表面上に一級または二級の脂肪族ヒドロキシル官能性基を有する、一般に公知の有孔質および無孔質のクロマトグラフイ用支持体の全部であることができる。
この場合の好ましい例としては、アクリレートおよびメタアクリレートを基材とする親水性ポリマー、ポリビニルアルコールを基材とするポリマー、ジオール置換シリカゲル、アガロースを基材とする多糖類、セルロース、セルロース誘導体またはデキストランを基材とするポリマーが挙げられる。しかしながら、ヒドロキシル化した形態のビニル化合物、アクリルアミド、（メタ）アクリル酸エステル類または（メタ）アクリロニトリルなどのモノマーを基材とする、その他のポリマーまたはコポリマーを使用することもできることは勿論のことである。
降下流法と称される高速クロマトグラフイ分離の性能は、近年重要性を増してきている。高速分離の実施において、例えば蛋白質の精製において考慮されるべき重要な二点がある。すなわち、精製される蛋白質と支持材料との接触が長過ぎると、生物学的活性の減少を導くこと、および長い溶離時間の間に細胞破裂分解をもたらすプロテアーゼが放出されることである。
しかしながら、高速分離を行う場合の基本的予備条件は、蛋白質結合能が線型流動速度（linear flow rate）とは独立していることにある。連続孔を有する粒子を構築することによって、1000cm／時間よりも早い線型流動速度を有する非常に高速のクロマトグラフイ用の材料が開発されている。しかしながら、結合したリガンドの種類がまた、高速クロマトグラフイ用支持材料の適応性に対して影響を及ぼすことは、現在まで知られていなかったことである。
本発明によりここに、リガンド（カチオン交換体中の）の化学構造といわゆる動的蛋白質結合能（dynamic protein binding capacity）（線型流に依存する漏出能）の大きさとの間には依存性が存在することが見出された。
動的蛋白質結合能を測定するために、モノマー スルホエチルアクリルアミドをセリウム（IV）イオンの存在下にフラクトゲル（Fractogel）（登録商標名）上にグラフトさせ、カラム［スーパーフォーマンス（Superformance）（登録商標名）、50〜10mm］に充填した。試料としては、リン酸塩緩衝液中のリゾチーム10mg／mlの溶液を使用した。この場合に、720cm／時間の線型流動速度において、動的蛋白質結合能は25.6％のみ減少されることが見出された。同一実験方法によるが、グラフトされるモノマーとしてスルホイソブチルアクリルアミドを使用した場合には、この動的蛋白質結合能は65.5％減少された。これは、驚くべきことに、結合したリガンドの性質が高速クロマトグラフイ用支持材料の適合性に対して多大の影響力を有することを示している。
さらにまた、グラフト重合用の混合物中の無機塩の濃度が高いほど、グラフト形成率の格別の増大が得られることが、驚くべきことに見出された。これは中でも、置換ポリアクリルアミド型のグラフトしたイオン交換体の場合に、蛋白質に対する動的結合能の格別の増大によって証明される。この従来未知の驚くべき効果の結果として、基材上にグラフト重合させることによって製造されるクロマトグラフイ支持体および使用されるその他の粒子または膜状材料の内面に達成することができるリガンド濃度の制御可能性が得られる。この効果は、強力に酸性の基を含有する親水性モノマーを使用した場合、例えば本発明に従い使用されるスルホエチルアクリルアミドの場合に、特に得られる。
グラフト重合用のポリアクリル化混合物中の無機塩の濃度は、１〜3.5モル／リットル、好ましくは２〜３モル／リットルの範囲にあるべきである。この重合においては、重合の開始に使用される開始剤、例えばセリウム（IV）イオンとの相互反応を受けないか、僅かにのみ相互反応を受ける塩の全部を使用することができる。本発明による方法に適する無機塩には、例えば塩化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等、およびまたこれらの塩の混合物がある。
ポリアクリル化混合物中により高濃度の無機塩（例えば、３モル／リットルの塩化ナトリウムまたは１モル／リットルの塩化ナトリウムおよび１モル／リットルの過塩素酸ナトリウム）を添加することによって、例えばフラクトゲル（登録商標名）HW65（Ｓ）またはフラクトゲル（登録商標名）HW65（Ｍ）に対するスルホエチルアクリルアミドのグラフト形成率は、より少ない塩濃度（１モル／リットルの塩化ナトリウム）を有する相当する混合物に比較して、３倍まで増加される。図１は、３モル／リットルの塩化ナトリウムが存在するか（曲線ａ）、または１モル／リットルの塩化ナトリウムが存在するかあるいは塩が添加されていない場合（曲線ｂ）における、リゾチームに対するフラクトゲル（登録商標名）EMD SE−650（Ｓ）の動的結合能のポリアクリル化時間に対する依存性を示している。この混合物の濃度はそれぞれの場合に、ゲル2.5リットル／総容積12.5リットルであった。塩が添加されていない混合物に比較して、蛋白質に対して達成することができる結合能にかかわる結果に際立った改良が見られる。さらにまた、この種の「グラフト動態」（grafting kinetics）の組込みにより決定される反応条件は、バッチ中の重要成分を変更した場合でも、生成物の蛋白質結合能の再現性を有する制御を可能にすることは明白である。
種々の無機塩がこれらによって重合混合物中に導入されるイオンの種類に応じてグラフト形成率に対して相違する効果を有する。リゾチームに対するグラフト生成物の最高結合能は、ゲル200mg／mlを使用して、１モル／リットルの過塩素酸ナトリウムを存在させてポリアクリル化させることによって得られた。これに関連して、使用されたモノマー溶液中で事前に行われた中和反応の結果として、反応混合物中に１モル／リットル濃度の塩化ナトリウムをさらに存在させた。しかしながら、過塩素酸ナトリウムを省略した混合物では、反応時間を12時間まで延長させた場合でも、ゲル65mg／mlの最高結合能が達成された。過塩素酸ナトリウムの代わりに塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウムを１〜3.5モル／リットルの濃度で添加することによって、100〜180mg／mlの数値まで増大した結合能が得られた。
本発明による分離用材料の製造は、スルホエチルアクリルアミドを用いるグラフト重合によって行う。この場合に、スルホエチルアクリルアミドは、その一部をアクリル酸誘導体とアミノエタンスルホン酸との反応によって製造する。使用される好適アクリル酸誘導体はアクリロイルクロライドであり、この化合物は新たに蒸留し、暗所で−20℃において保存すると、約２年間にわたり本発明による使用に対する適性を保有する。アクリロイルクロライドとアミノエタンスルホン酸とを反応させる場合に、安定剤を添加する必要がある。この安定剤は、使用直前のアクリロイルクロライドに添加し、次いで数時間以内に、かつまた10℃より温くならないうちに、アクリル化反応に使用することができる。この方法で安定化されたスルホエチルアクリルアミドは、検知できる有害な変化を受けることなく、数か月にわたり暗所で10℃以下の温度において水溶液として安定である。
本発明に従う有効な安定剤は、特に４−メトキシフェノールであることが証明された。この安定剤は、約0.01〜2mMの濃度でグラフト混合物中に使用すべきである。
この方法により製造されたスルホエチルアクリルアミドの水溶液は、HPLCを用いる分析において副生成物の存在の兆しを示さない。従って、４−メトキシフェノールによるアクリロイルクロライドの前述の簡単な安定化はオリゴマー形成の回避に適するものと見做されるべきことがまた証明される。驚くべきことに、引続くグラフト重合中における前記の特異な安定剤の存在は重合の結果に対して妨害作用を有していない。
例１
アミノエタンスルホン酸のアクリル化
蒸留水400ml中のアミノエタンスルホン酸50gおよび水酸化ナトリウムペレット32gの溶液を、氷浴中で５℃に冷却させる。短時間前に４−メトキシフェノール3.85mgが添加されているアクリロイルクロライド32mlを、温度が８℃を越えないように１時間かけて、この溶液に滴下して添加する。次いで氷浴を取り除き、この混合物のpHを25％塩酸によりpH4に調整し、次いでさらに１時間撹拌する。
例２
フラクトゲル（登録商標名）に対する重合
例１による溶液810mlおよび0.5M硝酸50ml中に溶解した硝酸セリウム（IV）アンモニウム14.5gからの開始剤溶液を、塩化ナトリウム292.2gを含有する蒸留水1200mlおよびフラクトゲル（登録商標名）HW 65 S 400mlからなる懸濁液に添加し、この混合物を室温で５時間撹拌する。この反応混合物をP2ガラスフリットを用いて吸引濾過し、次いで下記の洗浄溶液により洗浄する：
各500mlの、
0.2M硫酸／0.2M亜硫酸ナトリウム、
蒸留水、２回、
0.2M硫酸、
蒸留水、２回、
1M水酸化ナトリウム溶液、
蒸留水、
リン酸塩緩衝液、0.2M、pH7。
得られたゲルは、0.02Mリン酸塩緩衝液（pH7）中の0.2％ナトリウムアジドに添加するか、あるいは別法として、20％エタノール／150mM塩化ナトリウム中で保存する。
塩化ナトリウム292.2gの代わりに、例えば硫酸アンモニウム330.35gまたは過塩素酸ナトリウム351.15gを使用することもできる。
例３
動的蛋白質結合能の測定
ａ）スーパーホーマンス（Superformance）（登録商標名）50−10mmカラムに、例２からの分離用材料を充填し、次いで20mMリン酸塩緩衝液（pH7）中のリゾチーム10mg／mlの試料50mlを適用する。この溶出液を280nmで測定し、下記の結果を得た：

この表は、例２による分離用材料を使用した場合の720cm／時間の線型流動速度における動的蛋白質結合能は25.6％減少したのみであることを示している。
ｂ）スルホエチルアクリルアミド基の代わりに、スルホイソブチルアクリルアミド基を付加した分離用材料を用いて、測定を行う。例3a）と同様の方法を行い、下記の結果を得た：

この結果は、720cm／時間の線型流動速度において、動的蛋白質結合能は出発時結合能の35％の数値を有するのみであることを示している。

Claims (3)

1. ヒドロキシル基を含有する支持体の表面が、共有結合したポリマーで被覆されている支持体を基材とする分離用材料の製造方法であって、ポリアクリル化混合物中、１〜３．５モル／リットルの濃度の、塩化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、またはこれらの塩の混合物からなる無機塩およびセリウム（ＩＶ）イオンの存在下でグラフト重合することにより、式Ｉ
   

   

   式中、ＸはＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃Ｈであり、そして
   ｎは２〜１００である、
   で表わされる同一の反復単位からなるポリマーをヒドロキシル基を含有する支持体の表面に共有結合させて被覆することを特徴とする、前記方法。
2. モノマーを、水性溶液中で安定剤の存在下にアクリロイルクロライドとアミノエタンスルホン酸とを反応させることによって製造し、グラフト重合に直接使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 使用する安定剤が４−メトキシフェノールであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。

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