JP3059443B2 - 分離材料 - Google Patents

分離材料

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JP3059443B2
JP3059443B2 JP1078729A JP7872989A JP3059443B2 JP 3059443 B2 JP3059443 B2 JP 3059443B2 JP 1078729 A JP1078729 A JP 1078729A JP 7872989 A JP7872989 A JP 7872989A JP 3059443 B2 JP3059443 B2 JP 3059443B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒドロキシル基を含有する支持体を基材とす
る分離材料に関する。この分離材料はその表面が共有結
合した重合体で被覆されており、支持体が脂肪族ヒドロ
キシル官能性基を含み、かつアクリレート類およびメタ
アクリレート類に基づく親水性ポリマー、ポリビニルア
ルコールに基づくポリマー、ジオール置換シリカゲルか
らなる群から選択され、共有結合した重合体がグラフト
重合により、支持体に結合しており、該重合体は同一ま
たは異なる、次式Ｉで示される反復単位を有する： ［式中R1はＨまたはCH3であり、 −CN、−CHO、−OH、−CH2−NH2または−CH2NR2R3であ
り、 Ｒ′およびＲ″は、それぞれＨまたはCH3であり、あ
るいはＹが−OHである場合には、基Ｒ′および基Ｒ″の
うちの一つはまた、−OHであることができ、 Ｘは、−OH、−NR2R3または−OR4であり、 R2およびR3は、それぞれ、アルキルまたはフエニル
基、あるいはアルキル部分にそれぞれ10個までのＣ原子
を有するフエニルアルキル基またはアルキルフエニル基
であり、これらの基は置換基として１個または２個以上
のアルコキシ、シアノ、アミノ、モノアルキルアミノ、
ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、カルボ
キシル、スルホニル、アセトキシまたはアセトアミノ基
を有することができ、あるいはR2およびR3はそれぞれ、
Ｃ原子５〜10個をそれぞれ有する環状基または二環状基
であり、この基中に存在する１個または２個以上のCH基
あるいは１個または２個以上のCH2基はＮまたはNHによ
り、ＮまたはNHとＳにより、あるいはＮまたはNHとＯに
より、置き換えられており、あるいはR2およびR3はそれ
ぞれ、構造式 −（CH2）ｎ−SO2−（CH2）nS（CH2）nOH（式中ｎは２
−６である） で示されるスルホンスルフイドであり、あるいは基R2お
よび基R3のうちの一つはまた、Ｈであることができ、R2
とR3とはこれらの基の両方が酸性基であるかまたは塩基
性基であり、あるいはこれらの基の一方または両方が中
性基であるように相互に配位しており、 ｎは２〜100であり、そして R4は、アルキルまたはフエニル、あるいはアルキル基中
にそれぞれ10個までのＣ原子を有するフエニルアルキル
またはアルキルフエニル基であり、これらの基は置換基
として１個または２個以上のアルコキシ、シアノ、カル
ボキシル、スルホニルまたはアセトキシ基を有すること
ができる］。
本発明はまた上記分離材料の製造方法に関する。
本発明による分離材料は巨大分子の分離、特にバイオ
ポリマー（生体高分子）の分別（フラクシヨネーシヨ
ン）に使用することができる。
たとえば核酸、タンパク質、酵素、細胞構成単位（su
bcellular unit）、ペプチド、モノクローナル抗体また
は全細胞などの生物学的巨大分子の分離および精製は遺
伝子工学およびバイオテクノロジーに関して極めて重要
になつている。
数種のバイオポリマーの分離法は文献に記載されてい
る。
たとえば、核酸混合物およびタンパク質混合物は向流
分配法によつて、水性ポリエチレングリコール−デキス
トラン二相系で分離することができることが知られてい
る［P.A.Albertson（1971），第２版,AlmquisT ＆ Wiks
ell,Stockholm］。
さらに、発展したものとしては、二相系によるバイオ
ポリマーの分配クロマトグラフイ用の相支持体が、EP−
0,154,246に記載されている。これらの相支持体は相系
中で不溶性である非吸着性支持体基体粒子よりなり、こ
の粒子の表面が当該相系の相のうちの一つに対して親和
性を有する、強力な接着性物質（たとえば、化学的に結
合されているポリアクリルアミド）で被覆されているも
のである。
生物学的巨大分子の分別（フラクシヨネーシヨン）に
イオン交換体を使用することも知られている。慣用の材
料は、たとえばポリメタアクリレート類、ポリスチレン
類、アガロース、交叉結合したデキストラン、あるいは
適当な官能性基を有するシリカゲル類のようなポリマー
よりなる。
しかしながら、このような物質の溶解能力および結合
能はしばしば、非常に不充分である。さらにまた、分離
しようとする生体分子はしばしば変性され、あるいは、
完全に溶出されなくなる。
本発明の目的は、バイオポリマーの分別用のクロマト
グラフイにおいて、普遍的に使用することができ、かつ
また前記の欠点を示さない、すなわち分別しようとする
分子を変性することなく、そして高効率で完全に可逆的
に結合させることができるクロマトグラフィ用分離材料
を開発することにある。
驚くべきことに、本発明によるクロマトグラフィ用分
離材料は前記の要件を充足し、巨大分子、特にバイオポ
リマーの分別に適することが見い出された。この点で、
これらの分離材料はアフイニテイクロマトグラフイ、逆
転相または疎水性クロマトグラフイあるいは非常に特
に、イオン交換クロマトグラフイに普遍的に適してい
る。
従つて、本発明はヒドロキシル基を有する支持体を基
材とし、この支持体粒子の表面が共有結合しているポリ
マーによつて被覆されている分離材料に関し、この分離
材料は該ポリマーが同一または異なる、式Ｉで示される
反復単位を有することを特徴とするものである。
本発明はまた、ヒドロキシル基を有する支持体粒子を
基材とし、この支持体粒子の表面が共有結合しているポ
リマーによつて被覆されているクロマトグラフィ用分離
材料をセリウム（IV）イオンの存在におけるグラフト重
合により製造する方法に関し、この方法はヒドロキシル
基を有する支持体粒子を次式II CR＊Ｒ＊＊＝CR1−Ｙ II ［式中R1、Ｒ＊およびＲ＊＊はそれぞれ、ＨまたはCH3
であり、 −CN、−CHO、−OCOCHR5R6、−CH2−NH2または−CH2NR2
R3であり、 Ｘは−OH、NR2R3またはOR4であり、 R2およびR3はそれぞれ、アルキルまたはフエニル基、
あるいはアルキル基中に10個までのＣ原子を有するフエ
ニルアルキルまたはアルキルフエニル基であり、これら
の基は置換基として、１個または２個以上のアルコキ
シ、シアノ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキル
アミノ、トリアルキルアンモニウム、カルボキシル、ス
ルホニル、アセトキシまたはアセトアミド基を有するこ
とができ、あるいはR2およびR3はそれぞれ、Ｃ原子５〜
10個を有する環状基または二環状基であり、この基中に
存在する１個または２個以上のCH基あるいは１個または
２個以上のCH2基はＮまたはNHにより、ＮまたはNHとＳ
により、あるいはＮまたはNHとＯにより置き換えられて
おり、あるいはR2およびR3はそれぞれ、構造式−（C
H2）ｎ−SO2−（CH2）ｎ−Ｓ（CH2）nOH（式中ｎは２−
６である） で示されるスルホンスルフイドであり、あるいは基R1お
よび基R2のうちの一つはまた、Ｈであることができ、R1
およびR2はこれらの基の両方が酸性基であるか、または
塩基性基であり、あるいはこれらの基の一方または両方
が中性基であるように、相互に配位しており、R4はアル
キルまたはフエニル基、あるいはアルキル基中に10個ま
でのＣ原子を有するフエニルアルキルまたはアルキルフ
エニル基であり、これらの基は置換基として、１個また
は２個以上のアルコキシ、シアノ、カルボキシル、スル
ホニルまたはアセトキシ基を有することができ、そして R5およびR6はそれぞれ、Ｈであるか、または５個まで
のＣ原子を有するアルキル基である］ で示されるモノマーおよび（または）式III ［式中Ｒ＊およびR1はＨまたはCH3である］ で示されるモノマーの溶液中に懸濁し、重合させ、所望
により、このようにして得られた生成物を引続いて、ヒ
ドロキシル基を有する分離材料に変換する方法である。
本発明はまた、バイオポリマーの分別に、これらのク
ロマトグラフィ用分離材料を使用することに関する。
本発明によるクロマトグラフィ用分離材料の構造はEP
0,154,246の相支持体の構造と類似している。しかしな
がら、EP 0,154,246に記載されている材料に比較して、
本発明による材料の場合には、支持体粒子の表面上のポ
リマーの構造および性質が異なつている。EP 0,154,246
に記載の材料は主として、二相系の分配クロマトグラフ
イ用の相支持体として使用されており、それら自体はク
ロマトグラフイ的に活性な基を有するものではない。こ
れに反して、本発明による材料はそれら自体がクロマト
グラフイ的に活性であり、イオン交換体として、かつま
たアフイニテイクロマトグラフイまたは疎水性クロマト
グラフイ用の支持体として使用することができる。
本発明による分離材料はヒドロキシル基を有する支持
体粒子よりなり、その表面上に、式IIおよび（または）
式IIIで示されるモノマーを原料とするポリマー物質
が、このヒドロキシル基のα−Ｃ原子を介してグラフト
されているものである。
使用できる支持体粒子は全ての一般に知られている多
孔質および無孔質クロマトグラフイ用支持体であり、こ
れらはその表面上に一塩基性または二塩基性脂肪族ヒド
ロキシル官能性基を有するものである。
この場合に、たとえば、アクリレート類およびメタア
クリレート類をに基づく親水性ポリマー、ポリビニルア
ルコールに基づくポリマー、ジオール置換シリカゲルが
好適である。しかしながら、ビニル化合物、アクリルア
ミド、（メタ）アクリル酸エステルまたはヒドロキシル
化された形の（メタ）アクリロニトリルのようなモノマ
ーを基材とするその他のポリマーまたはコポリマーを使
用することができることは勿論のことである。
支持体粒子にヒドロキシル基を介して結合するポリマ
ー材料は式IIおよび（または）式IIIで示されるモノマ
ーに基づくものである。これらのモノマーは（メタ）ア
クリル酸（Ｙ＝−COOH）、（メタ）アクリル酸誘導体 アリルアミン（Ｙ＝−CH2NH2、−CH2NR2R3）、（メタ）
アクリロニトリル（Ｙ＝−CN）、アクロレイン（Ｙ＝−
CHO）、ビニルカルボキシレート（Ｙ＝−OCOCHR5R6）、
あるいは式IIIで示されるビニレンカルボネートであ
る。
これらのモノマーはいずれも、中性、酸性または塩基
性であることができる可逆性結合基を有し、そして水溶
液中でラジカル重合することができる物質である。
式IIIで示されるビニレンカルボネートあるいは式II
で示されるビニルカルボキシレートCR＊Ｒ＊＊＝CR1−O
COCHR5R6をモノマーとして使用する場合に、得られる生
成物は好ましくは、引続いてヒドロキシル基を有する分
離材料に変換する。このヒドロキシル相への変換はそれ
自体既知の温和なアルカリ加水分解または酸加水分解に
よつて達成される。一例として、この反応は、たとえば
Y.Tezuka等によつて、Macromol.Chem.186,685−694頁
（1985年）に記載されているように、K2CO3メタノール
溶液を室温で使用して行なうことができる。
式Ｉ、式IIおよび式IIIにおいて、R1は好ましくはＨ
であり、従つて、アクリル酸誘導体が好ましい。
式IIに存在するＹは好ましくは −OCOCHR5R6または−CH2NH2であり、二番目に好ましく
は−CNまたは−CHOである。従つて、式Ｉ中に存在する
Ｙは第一に好ましくは −OH（−OCOCHR5R6基は好ましくは、ヒドロキシル相に
変えられることによる）、または−CH2NH2であり、二番
目に好ましくは、−CNまたは−CHOである。
R5およびR6は相互に独立して、Ｈであるか、または５
個までのＣ原子を有するアルキル基である。好ましく
は、基R5および基R6のうちの少なくとも一つはＨであ
る。次にあげる基は特に好ましい：アセチルオキシ、プ
ロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、バレリルオキシお
よびヘキサノイルオキシ基。
式Ｉおよび式IIの両方において、Ｘは−OR4、−OHま
たは−NR2R3であり、好ましくは−NR2R3である。
この場合に、その分子中に存在するＸが−NR2R3であ
り、そして基R2および基R3のうちの一つがＨである相当
する化合物が好ましい。
基R2および（または）基R3は好ましくは、アルキル、
フエニル、フエニルアルキルまたはアルキルフエニル基
であり、このアルキル基および（または）フエニル基は
置換基として、１個または２個以上の、好ましくは１個
または２個の、特に好ましくは１個の、アルコキシ、シ
アノ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミ
ノ、トリアルキルアンモニウム、カルボキシル、スルホ
ン酸、アセトキシまたはアセトアミノ基を有することが
できる。
基R2および（または）基R3は好ましくは、アルキル基
中に10個までのＣ原子、好ましくは６個までのＣ原子、
特に好ましくは４個までのＣ原子を有する、アルキル、
アルコキシアルキル、シアノアルキル、アミノアルキ
ル、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノア
ルキル、トリアルキルアンモニウムアルキル、カルボキ
シアルキルまたはスルホニルアルキルであり、これらの
基は直鎖状または分枝鎖状であることができる。従つ
て、R2および（または）R3は好ましくは、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ
メチル、エトキシメチル、２−メトキシエチル、２−、
３−または４−オキサペンチル、２−、３−、４−また
は５−オキサヘキシル、２−、３−、４−、５−、また
は６−オキサヘプチル、イソプロピル、２−ブチル、イ
ソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチ
ルペンチル、３−メチルペンチル、２−オキサ−３−メ
チルブチル、３−オキサ−４−メチルブチル、２−メチ
ル−３−オキサペンチル、２−メチル−３−オキサヘキ
シルであり、さらにまた、R2および（または）R3はヘプ
チル、オクチル、ノニルあるいはデシルである。
さらに、シアノ基、カルボン酸基またはスルホン酸基
で置換されているアルキル基はまた、好ましい。従つ
て、R2および（または）R3は好ましくはシアノメチル、
シアノエチル、シアノプロピル、シアノブチル、シアノ
ペンチル、シアノヘキシル、２−シアノプロピル、２−
シアノブチル、カルボキシルメチル、カルボキシルエチ
ル、カルボキシルプロピル、カルボキシルイソプロピ
ル、カルボキシルブチル、カルボキシルペンチル、カル
ボキシルヘキシル、カルボキシル−２−メチルプロピ
ル、カルボキシル−２−メチルブチル、スルホニルメチ
ル、スルホニルエチル、スルホニルプロピル、スルホニ
ルブチル、スルホニルペンチル、スルホニルヘキシル、
スルホニル−２−メチルプロピル、スルホニル−２−メ
チルブチル、スルホニル−３−メチルブチル、スルホニ
ル−２−メチルペンチル、スルホニル−３−メチルヘキ
シルあるいはスルホニル−２−エチルペンチルである。
さらにまた、１個のアミノ基、モノアルキルアミノ
基、ジアルキルアミノ基またはトリアルキルアンモニウ
ム基で置換されているアルキル基が好ましい。この場合
に、これらのアルキル基は同一または異なることがで
き、そして10個まで、好ましくは６個まで、特に好まし
くは４個までのＣ原子を有し、従つて、好ましくは、ジ
メチルアミノエチル、ジエチルアミノエチル、メチルア
ミノエチル、メチルアミノプロピル、ジメチルアミノプ
ロピル、エチルアミノエチル、プロピルアミノエチル、
プロピルアミノプロピル、ジプロピルアミノエチル、ジ
プロピルアミノブチル、ジエチルアミノエチル、トリメ
チルアンモニウムエチル、トリメチルアンモニウムプロ
ピル、トリメチルアンモニウムブチル、トリエチルアン
モニウムエチル、トリエチルアンモニウムプロピル、ト
リエチルアンモニウムエチル、アミノエチル、アミノプ
ロピル、アミノブチルあるいはアミノペンチルである。
これらのアルキル基および置換されているアルキル基の
いずれも、フエニル基上の置換基としても、同様に好ま
しい。
R2および（または）R3はまた、好ましくは、構造式−
（CH2）ｎ−SO2−（CH2）−Ｓ−（CH2）nOH（式中、ｎ
＝２、３、４、５または６であり、好ましくは、ｎは
２、３または４である）で示されるスルホンスルフイド
である。
好ましくは、R2および（または）R3はまた、フエニル
基の意味を有し、この基は好ましくは、置換基として、
１個のシアノ、シアノアルキル、アミノ、アミノアルキ
ル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキ
ル、アルコキシ、アルコキシアルキル、モノアルキルア
ミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、トリアルキ
ルアンモニウム−またはトリアルキルアンモニウムアル
キル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、スルホン
酸またはスルホニルアルキルを有する。これらの置換基
の好ましい意味は前記した好ましいアルキル基および置
換されているアルキル基に相応する。フエニル環上の置
換基は好ましくは、ｐ位置に存在する。
ｐ−アセトキシフエニル、ｐ−アミノフエニルまたは
ｐ−アセトアミノフエニルは同様に、R2および（また
は）R3に対する好ましい意味の一つである。
R2および（または）R3はさらにまた、好ましくはアル
キルフエニル基またはフエニルアルキル基であり、この
アルキル基、置換されているアルキル基または置換され
ているフエニル基にはまた、前記の好ましい意味がそれ
ぞれ、あてはまる。
従つて、たとえば下記の置換されているフエニル基が
特に好ましいものとして考慮される:4−シアノフエニ
ル、４−アルキルフエニル、４−（N,N−ジメチルアミ
ノ）フエニル、４−（N,N−ジアルキルアミノエチル）
フエニル、４−エトキシフエニル、４−エトキシエチル
フエニル、４−トリアルキルアンモニウムフエニル、４
−カルボキシフエニル、４−スルホニルフエニル、フエ
ニルエチル、４−（Ｎ−エチルアミノ）フエニルプロピ
ルまたは４−シアノフエニルエチル。
さらにまた、式Ｉで示される単位あるいは式IIで示さ
れるモノマーは好ましくは、その分子中に存在するR2お
よび（または）R3が環状基または二環状基であるもので
ある。この場合に、この基はＣ原子５〜10個を有する芳
香族または飽和環であることができ、この基中に存在す
る１個または２個以上のCH基、あるいは１個または２個
以上のCH2基はＮまたはNHにより、あるいはＮまたはNH
とＳにより、あるいはＮまたはNHのＯにより置き換えら
れている。
従つて、R2および（または）R3は好ましくはまた、ピ
リジン基、イミダゾリル基、インドリル基、さらにま
た、好ましくはピロル基、ピリミジン基、ピラジン基、
キノリン基またはイソキノリン基である。
R2および（または）R3はまた、たとえばチアゾール、
チアジアゾール、モルホリン、トリアジン、ピペラジ
ン、ベンゾチアゾール、プリン、ピラゾール、トリアゾ
ール、ピロリジンまたはイソオキサゾール基であること
ができる。
この場合に、芳香族基およびヘテロ環状基は特に好ま
しい。適当な交換体を生成させるために、基R2および基
R3は相互に配置していなければならず、従つてこれらの
基は両方ともに、酸性基または塩基性基であるか、ある
いはこれらの基のうちの一つは中性基である。これらの
基を適当に配分することは当業者の難なく行なうことの
できることであり、従つて、所望のイオン交換体の機能
および目的に応じて、R2およびR3を適当に配分し、適当
な基を組合せることは当業者の難なく行なうことのでき
ることである。
好ましくは、２個の基R2およびR3のうちの一つは中性
基である。
R4は好ましくは、アルキル基中に10個までのＣ原子を
有する、好ましくは６個までのＣ原子を有する、特に好
ましくは４個までのＣ原子を有するアルキル、アルコキ
シアルキル、シアノアルキル、カルボキシアルキルまた
はスルホニルアルキルであり、この基は直鎖状または分
枝鎖状であることができる。従つて、R4は好ましくは、
メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシ
ル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−メトキシエ
チル、２−、３−または４−オキサペンチル、イソプロ
ピル、２−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イ
ソペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチ
ル、２−オキサ−３−メチルブチル、３−オキサ−４−
メチルブチル、２−メチル−３−オキサペンチルあるい
は２−メチル−３−オキサヘキシルである。
さらにまた、シアノ、カルボキシルまたはスルホニル
基で置換されているアルキル基はまた好ましい。従つ
て、R4は好ましくは、シアノメチル、シアノエチル、シ
アノプロピル、シアノブチル、シアノペンチル、シアノ
ヘキシル、２−シアノプロピル、２−シアノブチル、カ
ルボキシメチル、カルボキシルエチル、カルボキシルプ
ロピル、カルボキシルイソプロピル、カルボキシルブチ
ル、カルボキシルペンチル、カルボキシルヘキシル、カ
ルボキシル−２−メチルプロピル、カルボキシル−２−
メチルブチル、スルホニルメチル、スルホニルエチル、
スルホニルプロピル、スルホニルブチル、スルホニルペ
ンチル、スルホニルヘキシル、スルホニル−２−メチル
プロピル、スルホニル−２−メチルブチル、スルホニル
−３−メチルブチル、スルホニル−２−メチルペンチ
ル、スルホニル−３−メチルヘキシルまたはスルホニル
−２−エチルペンチルである。
これらのアルキル基および置換されているアルキル基
は同様に、フエニル基上の置換基としても好適である。
好ましくは、R4またはフエニル基の意味を有し、この
フエニル基は好ましくは１個のシアノ、シアノアルキ
ル、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、カル
ボキシル、カルボキシアルキル、スルホニルまたはスル
ホニルアルキルにより置換されている。これらの置換基
の好ましい意味は前記のアルキル基および置換されてい
るアルキル基に相当する。フエニル基上の置換基は好ま
しくは、ｐ位置に存在する。
式IIで示されるモノマー中に存在するＲ＊およびＲ
＊＊は好ましくはＨであり、従つて、式Ｉ中に存在する
Ｒ′およびＲ″はまた、好ましくは水素の意味を有す
る。
式Ｉにおいて、Ｙ＝−OHであり、そして基Ｒ′および
基Ｒ″のうちの一つがまた、−OHである分離材料はまた
好ましい。この場合には、モノマーとして、式IIIで示
されるビニレンカルボネートを使用しなければならな
い。従つて、重合により生成される生成物は引続いて、
ヒドロキシル相に変換されなければならない。
式III中に存在するＲ＊およびR1は好ましくは、Ｈで
ある。式Ｉにおいて、ｎは反復単位の数を表わし、ｎは
２〜100、好ましくは５〜60であり、10〜30の鎖長は特
に好ましい。
本発明による材料を製造するためには、ヒドロキシル
基を有する支持体粒子をモノマーの溶液、好ましくは水
溶液中に懸濁する。ポリマー系物質のグラフトは酸素を
排除して、慣用のレドツクス重合によつて行なう。重合
触媒として、セリウム（IV）イオンを使用する。これは
この触媒が支持体粒子の表面上にラジカル部位を生成
し、この部位からモノマーのグラフト重合が開始される
からである。生成する鎖長の長さはセリウム（IV）塩の
調節によつて、あるいはまた、モノマー濃度によつて所
望の通りに、当業者が制御することができる。
これらの方法自体は、既知の方法であるが、その詳細
に関しては、E.MinoおよびS.KaizermanによるJ.of Poly
mer Science,Vol.XXXI,No.122（1958年）,242−243頁を
参照することができる。
その表面にコポリマーが結合されている分離材料を製
造するためには、相応して異なる、式IIおよび（また
は）式IIIで示されるモノマーを溶液中に単に懸濁する
ことができる。
この場合に、本発明による交換体を得るためには、共
重合させる式Ｉで示されるモノマーは、両方のモノマー
が塩基性基または酸性基を含有するか、あるいはモノマ
ーの一方が中性基を含有するように選択せねばならな
い。
換言すれば、共重合に適するモノマーの選択には、従
来技術から当業者が推定することができる一般法則およ
び条件を適用することができる。
多数の式IIおよび（または）式IIIで示されるモノマ
ーを使用することができるが、これらのモノマーは、ア
フイニテイクロマトグラフイまたは疎水性クロマトグラ
フイ用の広範囲の弱塩基性の、または弱酸性の、あるい
は強酸性のまたは強塩基性の交換体および支持体に導か
れる。
本発明による材料は、たとえばペプチド、タンパク質
および核酸のようなバイオポリマーの分別に特に適して
いる。
さらにまた、本発明の材料はウイルス、細胞オルガネ
ラ、原核生物細胞、単細胞生物細胞ならびにタンパク複
合物質の分離および精製に使用することができる。
多数のモノマーを使用することによつて、各分離対象
に対して最適の分離材料を製造することができ、このよ
うにして、親和効果をイオン結合と組合せることができ
る。
式Ｉ中に、 −CH2NH2または−CH2NR2R3を含有する分離材料はイオン
交換材料として特に適している。式Ｉ中に−CHO基を含
有する材料はアフイニテイクロマトグラフイに特に適し
ている。
さらにまた、たとえば、デスオキシリボ核酸はこれら
の材料に完全に可逆的に結合され、それらのサイズによ
つて制限断片（restriction fragment:制限酵素ヌクレ
アーゼによつて切断されたDNAの短少な断片）に分離さ
れる。
本発明の新規な交換体の最大の利点はグラフトされた
鎖状ポリマーの可動性によつて、各装荷巨大分子がそれ
ぞれ、マトリツクスから最適の距離に存在する相当する
カウンターグループを見い出し得ることにある。
さらにまた、たとえば塩基性交換基を有する交換体は
巨大分子の酸性基の配列に適合し、逆転することはない
ので、結合した巨大分子の構造上の変化は生じない。
従つて、本発明により、構造的にかつまた機能的に新
規である多くの極めて種々の分離材料を巨大分子、特に
バイオポリマーの分離に利用することが可能となる。
本発明を以下の例により、さらに説明する。
これらの例においては、原料材として、下記のヒドロ
キシル基含有支持体が使用されている:Fractogel TSK
HW 65（Ｓ）ビニルを基材とする−5S（Ｓ）−多孔質混
合ポリマー、1meqのOH/g.（E.Merck社製） LiChrospher ジオール：ジオール−置換シリカゲル
（E.Merck社製）。
例 １ 弱酸性カチオン交換体の製造 吸引過したFractogel HW 65（ｓ）50mlを水150ml
中のアクリル酸19gの溶液中に懸濁し、アルゴンですす
ぎ、0.1M HNO3中の硝酸セリウム（IV）アンモニウムの
0.4M溶液15mlを酸素の排除の下で25℃において加え、混
合物を同一温度で３時間撹拌する。反応生成物を吸引
過し、水で、次いで10％酢酸中の硫化ナトリウム500ml
で、次いで0.2M NaOAc溶液500mlで、最後に再度、水で
洗浄する。
この生成物は酸性基0.8mVal/mlを有し、装填ゲルの1m
l当りで99mgのリソチームを20mM Naリン酸塩緩衝液（pH
7.0）から結合する。この結合されたリソチームはリン
酸塩中NaCl0.5モル／中に再び、完全に放出される。
例 ２ 弱塩基性イオン交換体の製造 沈澱させたLiChrospher ジオール（孔巾1,000Å、粒
子サイズ10μｍ）を蒸留水で、0.2M NaOAc溶液で、次い
で再度、水で、充分に洗浄し、引続いて、温度調節マン
トルを備えた1,000ml反応容器内の水700ml（HNO3でpH5.
0に調整されている）中のN,N−ジメチルアミノエチル−
アクリルアミド（Ａ）104gの溶液に懸濁させる。温度は
25℃に調整し、そして大気中酸素はArによつて懸濁液か
ら排除する。1M HNO3中の0.4M硝酸セリウムアンモニウ
ム溶液100mlを空気の排除の下で加え、懸濁液をブレー
ド撹拌機により約200rpmで３時間撹拌する。空気の添加
により反応を止め、反応生成物を別し、水500mlで洗
浄し、10％AcOH中の0.2M Na2SO3500mlで、次いで、0.2M
NaOAc500mlですすぎ、次いで水で中性まで洗浄する。
Ｎ含有量:1.1％；牛血清アルブミンに対する結合能:60m
g/ゲルml（0.05M Tris緩衝液、pH8.3） 例 ３ 塩基性交換体の製造 LiChrospher ジオール（孔巾1,000Å、粒子サイズ10μ
ｍ）のグラフト重合 製造は例２と同様に行なうが、（Ａ）の代りに、N,N
−ジエチルアミノエチル−アクリルアミド（Ｂ）123gを
使用する。
Ｎ含有量:0.5％；牛血清アルブミンに対する結合能:45m
g/ml（0.05Tris緩衝液、pH8.3）。
例 ４ 強塩基性アニオン交換体の製造 原料材料:LiChrospher ジオール（孔巾1,000Å、粒子
サイズ10μｍ）。
製造は例２と同様に行ない、（Ａ）の代りに、トリメ
チルアンモニウムエチル−アクリルアミド（Ｃ）113gを
使用する。
Ｎ含有量:0.5％；牛血清アルブミンに対する結合能:76.
3mg/ゲルml（0.05M Tris緩衝液、pH8.3）。
例 ５ 強酸性交換体の製造 原料材料:LiChrospher ジオール（孔巾1,000Å、粒子
サイズ10μｍ）。
製造は例２と同様に行ない、（Ａ）の代りに、２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（Ｄ）15
0gを使用する。
N:0.2％、S:0.2％；リソチームに対する結合能:36mg/ゲ
ルml（20mM PO4、pH7.0）。
例 ６ 弱塩基性交換体の製造 原料材料:Fractogel TSK HW 55（Ｓ） 製造は例２と同様に行ない、LiChrospher ジオール
の代りに、Fractogel 100mlおよびN,N−ジメチルアミ
ノエチル−アクリルアミド（Ａ）60gを使用する。
N:5.31％；牛血清アルブミンに対する結合能:57mg/ゲル
ml（0.05M Tris、pH8.3）。
例 ７ 塩基性交換体の製造 原料材料:Fractogel TSK HW 65（Ｍ） 製造は例２と同様に行ない、（Ａ）の代りに、N,N−
ジエチルアミノエチル−アクリルアミド123gを使用す
る。
N:2.5％；牛血清アルブミンに対する結合能:79mg/ゲルm
l（0.05M Tris緩衝液、pH8.3）。
例 ８ 強塩基性アニオン交換体の製造 原料材料:Fractogel TSK HW 65（Ｍ）100mlトリメチ
ルアンモニウムエチルアクリルアミド113g 製造は例２と同様に行なう。
N:3.80％；牛血清アルブミンに対する結合能:154mg/ゲ
ルml（0.05Tris緩衝液、pH8.3）。
例 ９ 例２と同様にして、強酸性イオン交換体をFractogel
TSK HW 65（Ｓ）100mlおよび２−アクリルアミド−
２−メチルプロパンスルホン酸150gから製造する。
N:0.5％、S:0.7％；リソチームに対する結合能:51mg/ゲ
ルml（20mM PO4、pH7.0）。
前記例において、 Trisはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン,HClで
あり、そしてPO4はリン酸ナトリウム緩衝剤を表わす。
例 10 例１と同様にして、逆転相−クロマトグラフイに適す
るシアノ−FractogelをFractogel TSK HW 65（Ｓ）10
0mlとアクリルニトリル60gとの反応により製造する。
Ｎ含有量;8.9％。
例 11 例２と同様にして、一級アミンのクロマトグラフイ用
の、あるいはアフイニテイクロマトグラフイのための一
級アミンおよびタンパク質の不動化用のアルデヒド相を
LiChrospher ジオール100ml（孔巾1,000Å、粒子サイ
ズ10μｍ）、アクロレイン39.2gおよびＮ−メチルアク
リルアミド50gから、混合グラフト重合によつて製造す
る。
例 12 例１と同様にして、アミノ相をFractogel TSK HW 6
5（Ｓ）100mlおよびアリルアミン160gから製造する。
Ｎ含有量:0.55％ 例 13 例２と同様にして、アセトキシ相を沈殿させたLiChro
spher ジオール100ml（孔巾1,000Å、粒子サイズ10μ
ｍ）およびビニルアセテート36gから製造する。このア
セトキシ相は室温でK2CO3メタノール溶液により処理す
ることによつて、ヒドロキシル相に変換することができ
る［Y.Tezuka等によるMacromol.Chem.186,685−694頁
（1985年）参照］。
例 14 例２と同様にして、温和なアルカリ加水分解または酸
加水分解により所望のヒドロキシル相に容易に変換でき
る相を、沈殿させたLiChrospher ジオール100ml（孔巾
1,000Å、粒子サイズ10μｍ）およびビニレンカルボネ
ート140gから製造する。
次例は使用例に関するものである。
例 Ａ DNA制限断片の分別 例２に従い製造された塩基性交換体を20mM Tris−HCl
（pH6.5）中に入れてSuperformance カラム（50×10m
m、E.Merck社製）中に充填し、同一緩衝液を使用して2m
l/分で平衡化し、次いで長さ11、18、31、45、80、85、
87、222、262、267、270、314、434、458、587および65
7塩基対を有するpDS1プラスミドから制限断片の３吸着
単位（260nm）を装荷する。引続いて、平衡緩衝液中のN
aCl勾配（０〜1M NaCl）を用いて、1ml/分で溶出し、各
制限断片の非常に良好な分離が達成された。
例 Ｂ ヤギ血清の分別 例８で製造された材料をSuperformance カラム（50
×10mm）中に装填し、Tris−HCl（pH8.3）20mMを用いて
平衡化し、緩衝液250μ中の血清50μを装荷し、次
いで同一緩衝液中のNa2SO4の０〜500mMの直線状勾配を
用いて溶出する。アルブミンからのグロブリンの格別の
分離が得られる。
例 Ｃ 例３により製造された材料をSuperformance カラム
（50×10mm）中に充填し、20mM NaPO4（pH6.8）を用い
て平衡化し、緩衝液100μ中のβ−ラクトグロブリン
ＡとＢとの市販混合物0.6mgを装荷し、次いで上記緩衝
液中のNa2SO4の０〜500mMの勾配（直線状）の各50mlに
より溶出する。β−ラクトグロブリンＡとβ−ラクトグ
ロブリンＢとの非常に良好な分離が得られる。
例 Ｄ モノクローナル抗体を使用するマウス腹水の分別 例３により製造された材料をSuperformance カラム
（50×10mm）中に充填し、20mM Tris−HCl（pH8.3）を
用いて平衡化し、緩衝液4.5ml中の腹水1.5mlを装荷し、
次いで上記の初めに用いた緩衝液中のNa2SO4の０〜250m
Mの勾配（100ml）により溶出する。
例 Ｅ 人間血清中の免疫グロブリン（IgG）の分別 1.例５で製造された材料をSuperformance カラム（50
×10mm）中に充填し、NaOAc/HOAc（pH5.0）10mMを用い
て平衡化し、IgG3.5mgを装荷し、次いで同一緩衝液中の
NaCl勾配（100ml、０〜1M）を用いて溶出する。比較的
良好な分別が得られる。
2.例９で製造した材料を使用して、１と同様に分別を行
なう。
3.慣用のSP−Fractogel 650（ｓ）で、E1と同様にIgG分
別を行なう。この場合に得られる溶出様相は如何なる分
別もほとんど示さない。
これらの実験から、慣用の材料を使用した場合には本
発明による交換体を使用する場合に比較して、貧弱な分
離が生じるものと結論することができる。
例 Ｆ モノクローナル抗体を使用するマウス腹水の分別 例５により製造された強酸性交換体をSuperformance
カラム（50×10mm）に充填し、10mM NaOAc/AcOH（pH
5.0）を用いて平衡化し、腹水100μを装荷し、次いで
勾配溶出する（０〜500mM NaCl 50ml）。モノクローナ
ル抗体を使用して、免疫グロブリンの良好な分離が得ら
れる。
前記例から、本発明によるイオン交換体を使用して、
非常に良好な分離を達成することができること、そして
また、これらの材料がバイオポリマーの分離に有利に適
していることが証明される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｂ０１Ｊ 41/14 Ｂ０１Ｊ 41/14 Ａ (72)発明者 ヨアヒム・キンケル ドイツ連邦共和国Ｄ‐6100ダルムシユタ ツト、フランクフルテル、シユトラーセ 250 (56)参考文献 特開 昭61−166861（ＪＰ，Ａ) 特開 昭49−93285（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−257236（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−501310（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 30/48 B01J 39/00 - 47/14 B01D 15/00 - 15/08 B01J 20/00 - 20/34 C08J 5/20 - 5/22

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒドロキシル基を有する支持体粒子を基材
    としその表面が共有結合したポリマーで被覆されている
    クロマトグラフィ用分離材料であつて、 ａ）支持体粒子が脂肪族ヒドロキシル官能性基を含み、
    かつアクリレート類およびメタアクリレート類に基づく
    親水性ポリマー、ポリビニルアルコールに基づくポリマ
    ー、ジオール置換シリカゲルからなる群から選択される
    材料からなり、 ｂ）共有結合したポリマーがグラフト重合により、支持
    体粒子に結合しており、 ｃ）ポリマーが、式Ｉ ［式中R1はＨまたはCH3であり、 −CN、−CHO、−OH、−CH2、−NH2または−CH2NR2R3で
    あり、 Ｒ′およびＲ″はそれぞれＨ又はCH3であり、そしてＹ
    が−OHである場合には、基Ｒ′および基Ｒ″のうちの一
    つは、−OHであつてもよく、 Ｘは、−OH、−NR2R3または−OR4であり、 R2およびR3はそれぞれ、アルキル基またはフエニル基、
    あるいはアルキル基中に10個までのＣ原子をそれぞれ有
    するフエニルアルキル基またはアルキルフエニル基であ
    り、これらの基は置換基として、１個または２個以上の
    アルコキシ、シアノ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジ
    アルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、カルボキ
    シル、スルホニル、アセトキシまたはアセトアミノ基を
    有することができ、あるいはR2およびR3は、それぞれ、
    Ｃ原子５〜10個を有する環状基または二環状基であり、
    この基中に存在する１個または２個以上のCH基あるいは
    CH2基は、ＮまたはNHにより、あるいは、ＮまたはNHと
    Ｓにより、あるいはＮまたはNHとＯにより置き換えられ
    ており、あるいはR2およびR3は、それぞれ、構造式 −（CH2）ｎ−SO2−（CH2）nS（CH2）nOH（式中ｎは２
    −６である） で示されるスルホンスルフイドであり、そして基R2およ
    び基R3のうちの一つは、Ｈであつてもよく、ここに、R2
    およびR3は、これらの基の両方が酸性基であるかまたは
    両方が塩基性基であり、あるいはこれらの基の両方また
    は一方が、中性基であるように相互に配位しており、ｎ
    は２〜100であり、そして R4は、アルキルまたはフエニル基、あるいはアルキル基
    中に10個までのＣ原子を有するフエニルアルキルまたは
    アルキルフエニル基であり、これらの基は置換基とし
    て、１個または２個以上のアルコキシ、シアノ、カルボ
    キシル、スルホニルまたはアセトキシ基を有することが
    できる］ で示される、同一または異なる反復単位を含有すること
    を特徴とする、前記分離材料。
  2. 【請求項２】上記式Ｉにおいて、 であり、このＸはOHまたは−OR4（式中、R4は、請求項
    １に記載の意味を有する）である、請求項１に記載の分
    離材料。
  3. 【請求項３】上記式Ｉにおいて、 であり、このＸは−NR2R3であり、 R2およびR3がそれぞれ、各アルキル基中に10個までのＣ
    原子を有するアルキル、アルコキシアルキル、シアノア
    ルキル、アミノアルキル、モノアルキルアミノアルキ
    ル、ジアルキルアミノアルキル、トリアルキルアンモニ
    ウムアルキル、カルボキシアルキルまたはスルホニルア
    ルキルであり、あるいはR2およびR3はそれぞれフエニル
    基であり、この基は非置換であるか、あるいは置換基と
    して、１個または２個以上のアルキル、アルコキシ、ア
    ルコキシアルキル、シアノ、シアノアルキル、アミノア
    ルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミ
    ノ、モノアルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノア
    ルキル、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルアン
    モニウムアルキル、カルボキシル、カルボキシアルキ
    ル、スルホニル、スルホニルアルキル、アセトキシまた
    はアセトアミノ基を有し、上記アルキル部分は10個まで
    のＣ原子を有し、あるいはR2およびR3はそれぞれ、Ｃ原
    子５〜10個を有する環状基または二環状基であり、この
    基中に存在する１個または２個以上のCH基あるいはCH2
    基はＮまたはNHにより、あるいはＮまたはNHとＳによ
    り、あるいはＮまたはNHとＯにより置き換えられてお
    り、あるいはR2およびR3はそれぞれ、構造式 −（CH2）ｎ−SO2−（CH2）ｎ−Ｓ−（CH2）nOH（式中
    ｎは２−６である） で示されるスルホンスルフイドであり、そして基R2およ
    び基R3のうちの一つは、Ｈであつてもよく、ここでR2お
    よびR3は、これらの基の両方が酸性基であるか、または
    塩基性基であり、あるいはこれらの基の一方または両方
    が中性基であるように、相互に配位していることを特徴
    とする、請求項１に記載の分離材料。
  4. 【請求項４】上記式Ｉにおいて、Ｙが−CH2NH2または−
    CH2NR2R3であり、そしてR2およびR3が請求項１に記載の
    意味を有することを特徴とする、請求項１に記載の分離
    材料。
  5. 【請求項５】上記式Ｉにおいて、Ｙが−CN、−CHOまた
    は−OHであることを特徴とする、請求項１に記載の分離
    材料。
  6. 【請求項６】アフイニテイクロマトグラフイあるいはイ
    オン交換クロマトグラフイに使用する、請求項１〜５の
    いずれかに記載の分離材料。
  7. 【請求項７】請求項６に記載の分離材料を、分離される
    物質の少なくとも１つがバイオポリマーである物質の分
    離に使用する方法。
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