WO2007123242A1 - ＩｇＧ精製用分離剤、及びそれを用いたＩｇＧ単量体の精製方法 - Google Patents

ＩｇＧ精製用分離剤、及びそれを用いたＩｇＧ単量体の精製方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a separating agent for purifying IgG, a method for producing the same, and a method for purifying IgG monomer using the same. More specifically, dimer to multimer and Z or aggregate of IgG (hereinafter referred to as IgG polymer) present in the IgG elution fraction purified by protein A affinity chromatography or the like.
  • the present invention relates to a separation agent used for removing impurities containing) from IgG monomers by ion exchange chromatography and a method for purifying IgG monomers using the same.
  • IgG immunoglobulin G
  • protein A is a protein isolated from Staphyrococal aureus cell membranes that exhibits binding properties to IgG. Protein A has the property of binding specifically to IgG from various animals, and since the amount of IgG bound per unit protein is large, affinity chromatography using a carrier in which Protein A is immobilized is used. Are used in industrial scale antibody purification processes.
  • a separation material for a biopolymer a separation material in which the surface of a support particle containing a hydroxy group is coated with a covalently bonded polymer is known (for example, And Patent Document 3).
  • IgG immunoglobulin
  • Example E there is no disclosure about separation and purification of only the IgG monomer with high purity, in which immunoglobulin (IgG) in human serum is fractionated.
  • IgG immunoglobulin
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 59-206045 (Claim 1)
  • Patent Document 2 JP-A-1 68272 (Claim 1)
  • Patent Document 3 JP-A-1-310744 (claim 1st paragraph, page 9, upper right column, lines 15-19, page 12, lower left column, lines 13-20)
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a separation agent for purifying IgG that can efficiently separate and purify IgG with high purity, and purification of an IgG monomer using the same. To provide a method.
  • the present inventor has obtained a separating agent that fixes polyacrylic acid and Z or polymethacrylic acid on a carrier.
  • the inventors have found that the separation from the polymer can be carried out under mild conditions and that the above-mentioned problems can be solved at once, and the present invention has been completed.
  • the present invention is a separation agent for purifying IgG as shown below, and a method for purifying IgG using the same.
  • porous carrier is selected from the group consisting of inorganic porous materials, polysaccharides, and synthetic polymer capsules.
  • a method for purifying an IgG monomer comprising contacting and eluting a mixture containing an IgG monomer and impurities with the separating agent according to any one of [1] to [6] above.
  • the elution method is to increase the eluent salt concentration or eluent PH linearly and elute IgG adsorbed on the separating agent; eluent salt concentration or eluent pH stepped Wherein the IgG adsorbed on the separating agent is eluted; or the IgG monomer is not adsorbed on the separating agent, and only the IgG polymer is adsorbed.
  • the purification method according to [7] or [8].
  • the separation agent for purifying IgG of the present invention When the separation agent for purifying IgG of the present invention is used, a mixture containing an IgG monomer and an impurity containing an IgG polymer purified by protein A affinity chromatography or the like is used. Impurities can be efficiently separated, and only the target IgG monomer can be purified with high purity.
  • FIG. 1 is a chromatogram showing the separation results of the humanized monoclonal antibody described in Example 5.
  • FIG. 2 is a chromatogram showing the separation results of the humanized monoclonal antibody described in Example 6.
  • FIG. 3 is a chromatogram showing the separation results of the humanized monoclonal antibody described in Comparative Example 1.
  • FIG. 4 is a chromatogram showing the separation result of the humanized monoclonal antibody described in Comparative Example 2.
  • the separation agent for purifying IgG of the present invention is a separation agent characterized in that polyacrylic acid and Z or polymethacrylic acid are immobilized on a carrier.
  • Purification of IgG monomers by the separating agent of the present invention is mainly based on electrostatic interaction between IgG and the separating agent.
  • a method for removing lipoproteins in blood using an adsorbent having a polymer polyanion moiety uses biological affinity between the lipoprotein and the adsorbent.
  • the separation mechanism is different from that of the present invention.
  • polyacrylic acid and Z or polymethacrylic acid function as a carrier for IgG adsorption.
  • polyacrylic acid and Z or polymethacrylic acid are immobilized on the surface of the separation agent in contact with IgG. It is necessary to be informed.
  • the separating agent of the present invention includes polyacrylic acid and Z Alternatively, it is preferable that polymethacrylic acid is dispersed on the support surface and fixed at multiple points.
  • the viscosity average molecular weight of polyacrylic acid and Z or polymetatalic acid to be bound to the carrier is preferably in the range of 500000 to 1,000,000, and especially as the molecular weight increases, The degree of separation between the monomer and the IgG polymer is improved.
  • the material and porosity inside the separation agent that does not come into contact with IgG are not directly related to the separation mechanism by electrostatic interaction of the present invention.
  • Any porous material can be used. From a practical point of view, it is desirable to increase the amount of IgG that can be processed in a single operation, both in terms of time and cost. Therefore, it is recommended to prepare a porous carrier strength separation agent to increase the surface area of the separation agent.
  • Preferred is a separating agent having a specific surface area of lm 2 Zg or more.
  • porous carrier used in the separation agent of the present invention a known carrier used as a packing material for column chromatography can be used without particular limitation, and is not particularly limited.
  • synthesis of inorganic porous materials such as porous glass and porous silica gel, polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, polyacrylamide, polymethyl methacrylate, polybutyl alcohol, styrene-dibutylbenzene copolymer, etc. Polymers and the like are preferable.
  • a carrier is preferred.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and examples thereof include spherical particles, non-spherical particles, membranes, monoliths (continuous bodies), and the like.
  • the shape of the separating agent of the present invention is not particularly limited because it varies depending on the use form.
  • a packing material for column chromatography It is more preferable to use spherical particles in order to perform uniform packing in the column.
  • a continuous columnar porous body mounted on a column may be used.
  • Sarakuko can also perform chromatography using a membrane-like separating agent.
  • the size of the separating agent particles is determined according to the usage conditions. It is preferable to select an appropriate size according to the conditions, but it is not particularly limited. For example, when used as a packing material for HPLC, the average particle size is usually 5 to 15 111, and a small amount is required. It is preferable to use a particle size of 15 to 50 / zm for the purpose of removal, and 50 to 300 ⁇ m for the purpose of use in industrial processes! /.
  • a method for fixing polyacrylic acid and Z or polymethacrylic acid to the carrier is not particularly limited, and any known method can be used.
  • a method of reacting polyacrylic acid and Z or polymethacrylic acid after introducing an epoxy group on the surface of the carrier using an epichlorohydrin polyfunctional epoxy compound or the like on the surface of the carrier, After introduction of the group, a method of aminating with ammonia or the like, and bonding the amino group and the carboxyl group of acrylic acid and / or polymethacrylic acid with a carpositimide reagent is possible.
  • the method for purifying an IgG monomer according to the present invention is a mixture containing an impurity containing an IgG polymer and an IgG monomer purified by protein A affinity chromatography or the like. It is characterized by contacting with a separating agent and eluting.
  • the kind of IgG in the purification method of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the method of contacting a mixture containing an impurity containing an IgG polymer and an IgG monomer with the separation agent of the present invention is not particularly limited.
  • Known ion exchange chromatography methods can be used. That is, the monomer of IgG is separated from impurities including the polymer of IgG by adsorbing the mixture to the separation agent of the present invention in a buffer solution and then eluting the mixture.
  • the method for eluting IgG adsorbed on the separation agent of the present invention is not particularly limited.
  • the eluent salt concentration or the eluent pH is linearly determined. Increase the amount of adsorbed IgG (linear gradient elution), or increase the eluent salt concentration or eluent pH stepwise to elute the adsorbed IgG (stepwise gradient elution). Can do. It is also possible to use a method in which only the IgG polymer is adsorbed without increasing the salt concentration of the eluent and adsorbing the IgG monomer to the separating agent.
  • Concentrated aqueous ammonia (100 ml) was added to the flask and stirred at 50 ° C. for 2 hours to obtain an amino group-containing gel into which an amino group had been introduced.
  • polyacrylic acid viscosity average molecular weight; 5,000
  • 1ethyl-3- (dimethylaminopropyl) -carpoimide was added at 4 ° C while maintaining pH 4.5, and the mixture was stirred at the same temperature for 24 hours. After completion of the reaction, it was washed with 0.5 molar saline solution and then with water to obtain a polyacrylic acid-fixing gel of the present invention.
  • the amount of immobilized polyacrylic acid was 4 mg Zml gel.
  • polyacrylic acid viscosity average molecular weight; 250,000
  • the amount of polyacrylic acid introduced was 5 mg / ml gel.
  • EAH Sepharose 4B (trade name, manufactured by GE, particle diameter: 45 to 165 ⁇ ) in which 2 g of polyacrylic acid (average viscosity; 5,000) was dissolved in 100 ml of water and amino groups were previously introduced into the agarose gel m) 100 ml was added.
  • 2 g of 1-ethyl 3- (dimethylaminopropyl) -carposimide was added at 4 ° C while maintaining pH 4.5, and the mixture was stirred at the same temperature for 24 hours. After completion of the reaction, the mixture was washed with 0.5 molar saline solution and then with water to obtain a polyacrylic acid-fixed gel that is a separating agent of the present invention.
  • the amount of polyacrylic acid immobilized was 6 mg Zml gel.
  • Example 2 To 100 ml of the epoxidized gel obtained in Example 1, 2 g of polymethacrylic acid was added to 100 ml of water. The dissolved aqueous solution was added and reacted at 40 ° C for 16 hours. After completion of the reaction, the mixture was washed with 0.5 molar saline and then with water to obtain a polyacrylic acid-fixed gel gel as a separating agent of the present invention. The amount of immobilized polymethacrylic acid was 4 mg Zml gel.
  • the separation agent of the present invention obtained in Example 1 was packed in a column having an inner diameter of 6 mm and a length of 4 cm, and a humanized monoclonal antibody was injected into the column, and then an IgG polymer (dimer to aggregate) was added. Separation of the mixture of impurities and IgG monomer was carried out by a method of linearly increasing the eluent salt concentration (linear gradient). Figure 1 shows the resulting chromatogram.
  • Example 1 the separation of IgG monomer and polymer with the separating agent of the present invention obtained in Example 1 was carried out by the following method. That is, a column (6 mm inner diameter, length 4 cm) was filled with the separation agent obtained in Example 1, and then connected to an FPLC apparatus (Akta Prime, manufactured by GE). After equilibration with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) with a column volume of 10 times at a flow rate of 0.5 mlZ, human monoclonal antibody (100 ⁇ g) was injected. Elution was carried out using a linear salt concentration gradient elution method of 60 minutes using 5 OmM phosphate buffer containing 1M NaCl. In Fig. 1, the horizontal axis shows the retention time (minutes). The peak eluting at around 22 minutes is IgG monomer, and the peak eluting at around 38 minutes is IgG polymer.
  • Akta Prime manufactured by GE
  • human monoclonal antibody 100 ⁇ g
  • FIG. 2 shows the resulting chromatogram.
  • the peak eluting around 23 minutes is IgG monomer
  • the peak eluting around 42 minutes is IgG polymer.
  • IgG monomer under the same separation conditions as in Example 5 except that T OYOPEARL CM-650 (trade name, manufactured by Tosoh Corporation) into which carboxymethyl group was introduced into TOYOPEARL HW-65C was used as a separating agent. And a mixture of IgG polymers were separated.
  • Figure 3 shows the resulting chromatogram. In FIG. 3, the peak force is gG monomer eluting around 22 minutes, and the peak eluting around 30 minutes is the IgG polymer.
  • the method of ion exchange chromatography which is usually used for further purification, can separate IgG monomers from impurities including IgG polymers. Insufficient, low recovery rate of IgG, and high cost due to long time, so it can be used as a separation agent for IgG purification.

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Abstract

　ＩｇＧを効率よく高純度に分離精製し得るＩｇＧ精製用分離剤、及びそれを用いたＩｇＧ単量体の精製方法を提供する。 　ポリアクリル酸及び／又はポリメタクリル酸が多孔性の担体に固定化されていることを特徴とするＩｇＧ精製用分離剤、及び該分離剤にＩｇＧの単量体とＩｇＧの重合体を含む不純物とを含む混合物を接触させ、次いで溶出させるＩｇＧ単量体の精製方法。

Description

明 細 書
IgG精製用分離剤、及びそれを用いた IgG単量体の精製方法
技術分野
[0001] 本発明は、 IgG精製用分離剤、その製造方法及びそれを用いた IgG単量体の精製 方法に関する。より具体的には、プロテイン Aァフィユティークロマトグラフィー等により 精製された IgG溶出画分中に存在する IgGの二量体〜多量体及び Z又は凝集体（ 以下、これらを IgGの重合体と称する。）を含む不純物を、イオン交換クロマトグラフィ 一により、 IgGの単量体から除去する際に用いられる分離剤、及びそれを用いた IgG 単量体の精製方法に関するものである。
背景技術
[0002] IgG (免疫グロブリン G)は治療薬、体外診断薬として有用であり、今後も益々需要 が高まることが予測されている。このような用途に使用するためには IgGを高純度で 精製できる技術の開発が必要である。 IgGの精製には一般にプロテイン Aを用いたァ フィ-ティークロマトグラフィーが用いられて 、る。プロテイン Aは IgGに結合特性を示 す、 Staphyrococal aureusの菌体膜より分離されたタンパク質である。プロテイン Aは、種々の動物由来の IgGと特異的に結合する性質があり、かつ単位タンパク質あ たりの IgGの結合量が多いため、このプロテイン Aを固定ィ匕した担体を用いるァフィ- ティークロマトグラフィーが工業スケールの抗体精製プロセスに使用されている。しか しながら、このプロテイン Aを用いるァフィユティークロマトグラフィーは、吸着した IgG を溶出する方法として pH4以下の酸性溶液を使用するため、抗体の高次構造が変 化し、さらに会合、凝集へと進行することが起こる。また、細胞培養の段階で凝集体も 発現しており、これら IgGの重合体を含む不純物をプロテイン Aを用いたァフィ-ティ 一クロマトグラフィーで除去するのは困難であった。
[0003] 上記の問題を解決するため、プロテイン Aを用いたァフィユティークロマトグラフィー で精製した後、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性相互作用クロマトグラフィーを 組み合わせた方法が通常用いられている。し力しながら、従来のイオン交換クロマト グラフィーでは IgGの単量体と、 IgGの重合体を含む不純物との分離が不十分なた め、高純度の IgG (すなわち、 IgGの単量体）を得るためには IgGの収量を犠牲にす る必要があった。また疎水性相互作用クロマトグラフィーでは IgGの回収率が低ぐま た長時間を要するためコスト高となるという問題があった。
[0004] 一方、ポリア-オンを担体に固定ィ匕した分離剤が種々提案されており、例えば、低 比重リポ蛋白質吸着材として、表面に分子量が 25000以上である高分子ポリア-ォ ン部を有する吸着材が知られている (例えば、特許文献 1参照)。また、免疫複合体 の吸着体として、水不溶性多孔質担体にァニオン性官能基を有する化合物が固定 ィ匕されてなる吸着体が知られている（例えば、特許文献 2参照)。し力しながら、これら の文献には、 IgGの単量体と IgGの重合体を含む混合物力 IgGの単量体のみを分 離精製することにつ 、ては何ら開示されて 、な 、。
[0005] また、バイオポリマー（生体高分子)の分離材料として、ヒドロキシ基を含有する支持 体粒子の表面が共有結合した重合体で被覆されて 、る分離材料が知られて 、る (例 えば、特許文献 3参照)。同文献、例 Eによれば、人間血清中の免疫グロブリン (IgG) の分別が行なわれている力 IgGの単量体のみを高純度で分離精製することについ ては何ら開示されていない。また、当該分離材料では、表面特性と深く関わるグラフト 鎖の分子量、分子量分布およびグラフト密度 (グラフト鎖の表面密度)を制御すること が困難であり、担体上に存在する重合体の分子量も小さくなるため、 IgGの単量体と I gGの重合体との分離が不十分になることが予想される。
[0006] 以上のとおり、 IgGを診断薬、治療薬として広く使用するためには、 IgG単量体を高 純度でかつ安価に大量生産することが必要である力 従来技術には解決しなければ ならない多くの問題があり、それらの問題を解決できる新規な分離剤、及び IgG単量 体の精製方法の開発が望まれて 、た。
[0007] 特許文献 1：特開昭 59— 206045号公報 (特許請求の範囲第 1項）
特許文献 2：特開平 1 68272号公報 (特許請求の範囲第 1項）
特許文献 3：特開平 1― 310744号公報 (特許請求の範囲第 1項、第 9頁右上欄 15行 〜19行、第 12頁左下欄 13行〜 20行）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0008] 本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、 IgGを効率よく高 純度に分離精製し得る IgG精製用分離剤、及びそれを用いた IgG単量体の精製方 法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者は、上記の課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、担体にポリアク リル酸及び Z又はポリメタクリル酸を固定ィヒした分離剤力 IgGの単量体と IgGの重 合体との分離を温和な条件下で実施できるとともに、上記した課題を一挙に解決でき ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下に示すとおりの IgG精製用分離剤、及びそれを用いた IgGの 精製方法である。
[0010] [1]ポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸が担体に固定ィ匕されていることを特徴 とする IgG精製用分離剤。
[2]ポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸力、担体の表面上に分散して多点で 固定化されていることを特徴とする上記 [1]に記載の分離剤。
[3]ポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸の粘度平均分子量が、 5000以上で あることを特徴とする上記 [ 1]又は [2]に記載の分離剤。
[4]担体が多孔性の担体であることを特徴とする上記 [ 1]乃至 [3]の 、ずれかに記 載の分離剤。
[5]多孔性の担体が、無機多孔質材料、多糖類、及び合成高分子カゝらなる群より 選ばれることを特徴とす上記 [4]に記載の分離剤。
[6]担体の形状が、球状粒子、非球状粒子、膜、又はモノリス (連続体)であることを 特徴とする上記 [ 1]乃至 [5]の 、ずれかに記載の分離剤。
[7] IgG単量体と不純物を含む混合物を上記 [ 1]乃至 [6]の 、ずれかに記載の分 離剤と接触させ、溶出させることを特徴とする IgG単量体の精製方法。
[8]不純物が IgGの二量体〜多量体及び Z又は凝集体 (すなわち、 IgGの重合体） を含有することを特徴とする上記 [7]に記載の精製方法。
[9]溶出させる方法が、溶離液塩濃度若しくは溶離液 PHを直線的に増加させ、前 記分離剤に吸着した IgGを溶出させる方法;溶離液塩濃度若しくは溶離液 pHを段階 的に増加させ、前記分離剤に吸着した IgGを溶出させる方法;又は IgGの単量体を 前記分離剤に吸着させず、 IgGの重合体のみを吸着させる方法、であることを特徴と する上記 [7]又は [8]に記載の精製方法。
発明の効果
[0011] 本発明の IgG精製用分離剤を使用すると、プロテイン Aァフィユティークロマトグラフ ィ一等で精製された、 IgGの単量体と IgGの重合体を含む不純物とを含む混合物か ら、当該不純物を効率良く分離することが可能となり、目的の IgG単量体のみを高純 度に精製することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]実施例 5に記載のヒト化モノクローナル抗体の分離結果を示すクロマトグラムで ある。
[図 2]実施例 6に記載のヒト化モノクローナル抗体の分離結果を示すクロマトグラムで ある。
[図 3]比較例 1に記載のヒト化モノクローナル抗体の分離結果を示すクロマトグラムで ある。
[図 4]比較例 2に記載のヒト化モノクローナル抗体の分離結果を示すクロマトグラムで ある。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明の IgG精製用分離剤は、ポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸が担体に 固定化されて ヽることを特徴とする分離剤である。
本発明の分離剤による IgGの単量体の精製は、主として、 IgGと分離剤との間の静 電気的相互作用に基づくものである。上記したとおり、高分子ポリア二オン部を有す る吸着材により血液中のリポ蛋白質を除去する方法が提案されて 、るが、この方法は リポ蛋白質と吸着材との間の生物学的親和性に基づくものであり、本発明とは分離機 構が異なるものである。本発明の分離剤はポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸 が IgG吸着の担い手として機能するものであり、そのためには IgGと接触する分離剤 の表面にポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸が固定ィ匕されていることが必要で ある。なお、分離能力を考慮すると、本発明の分離剤としては、ポリアクリル酸及び Z 又はポリメタクリル酸が担体表面上に分散して多点で固定ィ匕されているものが好まし い。
[0014] 本発明の分離剤において、担体に結合させるポリアクリル酸及び Z又はポリメタタリ ル酸の粘度平均分子量は好ましくは 5, 000〜100万の範囲であり、特に高分子量 になるにつれて、 IgGの単量体と IgGの重合体との分離度が向上する。
本発明の分離剤においては、 IgGと接触しない分離剤内部の材質及び多孔性は、 本発明の静電気的相互作用による分離機構とは直接には関係しないため、担体とし て無孔質の材料と多孔質の材料のいずれも使用することができる。実用面からは、時 間的にもコスト的にも一回の操作で処理できる IgGの量が多いほうが望ましいため、 多孔性の担体力 分離剤を調製して分離剤の表面積を大きくするのが好ましぐ lm2 Zg以上の比表面積を有する分離剤が更に好ましい。
[0015] 本発明の分離剤において使用される多孔性の担体としては、カラムクロマトグラフィ 一用の充填剤として使用される公知の担体を特に制限なく使用することができ、特に 限定するものではないが、例えば、多孔質ガラス、多孔質シリカゲル等の無機多孔質 材料、ァガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類、ポリアクリルアミド、ポリメチ ルメタタリレート、ポリビュルアルコール、スチレンージビュルベンゼン共重合体等の 合成高分子等が好適なものとして挙げられる。本発明の分離剤を工業スケールで使 用する場合には、精製操作の後に分離剤のアルカリ洗浄が実施されるため、これら のうち、アルカリに対して耐性のある多糖類、合成高分子等からなる担体が好ましい 。また、担体の形状としては、特に限定するものではないが、例えば、球状粒子、非 球状粒子、膜、モノリス (連続体)等が挙げられる。
[0016] 本発明の分離剤の形状としては、その使用形態により異なるため、特に限定するも のではないが、例えば、カラムクロマトグラフィー用の充填剤として用いる場合には、 粒子状の分離剤とすることが好ましぐカラム中に均一な充填を行うためには球状粒 子とすることがさらに好ましい。また、連続した一体型の円柱状の多孔質体をカラムに 装着したものでもよい。さら〖こは、膜状の分離剤を用いたクロマトグラフィーも可能で ある。
分離剤の形状を粒子状にして使用する場合、分離剤粒子の大きさは、その使用条 件によって適当な大きさを選択することが好ましぐ特に限定するものではないが、例 えば、、 HPLC用の充填剤として用いる場合は、平均粒子径が通常5〜15 111、少 量の分取を目的とする場合には 15〜50/z m、工業プロセスで使用する目的では 50 〜300 μ m程度の粒子径を用いるのが好まし!/、。
[0017] 本発明において、担体にポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸を固定ィ匕する方 法としては特に限定するものではなぐ公知の方法を用いることができる。例えば、担 体表面にェピクロルヒドリンゃ多官能エポキシィ匕合物等を用いて、担体表面にェポキ シ基を導入した後、ポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸を反応させる方法や、 エポキシ基導入後、アンモニア等を用いてでァミノ化し、ァミノ基とアクリル酸及び/ 又はポリメタクリル酸のカルボキシル基とをカルポジイミド試薬で結合させる方法等が 可能である。
[0018] 本発明の IgG単量体の精製方法は、プロテイン Aァフィユティークロマトグラフィー 等で精製された、 IgGの重合体を含む不純物と IgGの単量体とを含む混合物を本発 明の分離剤と接触させ、溶出させることをその特徴とする。
本発明の精製方法における IgGの種類はポリクロナール抗体、モノクロナール抗体 のいずれであってもよい。
[0019] 本発明の精製方法において、 IgGの重合体を含む不純物と IgGの単量体とを含む 混合物を本発明の分離剤と接触させる方法としては、特に限定するものではないが、 例えば、公知のイオン交換クロマトグラフィーによる方法を使用することができる。す なわち、当該混合物を緩衝液中で本発明の分離剤に吸着させ、その後、溶出させる ことにより、 IgGの重合体を含む不純物から IgGの単量体が分離される。
[0020] 本発明の精製方法において、本発明の分離剤に吸着した IgGを溶出させる方法と しては、特に限定するものではないが、例えば、溶離液塩濃度若しくは溶離液 pHを 直線的に増加させ、吸着した IgGを溶出させる方法 (リニアグラジェント溶出）、溶離 液塩濃度若しくは溶離液 pHを段階的に増加させ、吸着した IgGを溶出させる方法（ ステップワイズグラジェント溶出）を使用することができる。また、溶離液の塩濃度を高 めておき、 IgGの単量体を分離剤に吸着させず、 IgGの重合体のみを吸着させる方 法を使用することもできる。 実施例
[0021] 以下に、本発明の実施例を挙げ、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は 下記の実施例に限定されるものではない。
[0022] 実施例 1
親水性ビュル系ポリマーを基材としたゲル濾過クロマトグラフィー用充填剤 TOYO PEARL HW— 65C (商品名、東ソー株式会社製、タンパク質排除限界分子量 5 X 106、粒子径 50〜： LOO μ m) 100mlにェピクロノレヒドリン 100g、 NaOH水溶液（NaO H ;40g、 H O ; 180g)を加え、 40°Cで 4時間反応しエポキシ化ゲルを得た。このゲル
2
に濃アンモニア水 100mlをカ卩え、 50°Cで 2時間攪拌し、ァミノ基が導入されたァミノ 基含有ゲルを得た。
次にポリアクリル酸 (粘度平均分子量； 5, 000) 2gを 100mlの水に溶解し、上記アミ ノ基含有ゲル 100mlを加えた。この溶液に、 1—ェチル—3— (ジメチルァミノプロピ ル）—カルポジイミド 2gを pH4. 5に保ちながら 4°Cで添加し、同温度で 24時間攪拌 した。反応終了後、 0. 5モル食塩水、次いで水で洗浄し、本発明のポリアクリル酸固 定ィ匕ゲルを得た。固定ィ匕されたポリアクリル酸の量は 4mgZmlゲルであった。
[0023] 実施例 2
ポリアクリル酸 (粘度平均分子量； 250, 000)を用い、実施例 1と同様の反応を実施 し、本発明の分離剤を得た。ポリアクリル酸の導入量は 5mg/mlゲルであった。
[0024] 実施例 3
ポリアクリル酸 (粘度平均； 5, 000) 2gを 100mlの水に溶解し、次いでァガロースゲ ルに予めアミノ基が導入された EAH セファローズ 4B (商品名、 GE社製、粒子径 4 5〜165 μ m) 100mlを加えた。この溶液に、 1—ェチル 3— (ジメチルァミノプロピ ル）—カルポジイミド 2gを pH4. 5に保ちながら 4°Cで添加し、同温度で 24時間攪拌 した。反応終了後、 0. 5モル食塩水、次に水で洗浄し、本発明の分離剤であるポリア クリル酸固定ィ匕ゲルを得た。固定ィ匕されたポリアクリル酸の量は 6mgZmlゲルであつ た。
[0025] 実施例 4
実施例 1で得られたエポキシ化ゲル 100mlに、ポリメタクリル酸 2gを 100mlの水に 溶解した水溶液を加え、 40°Cで 16時間反応した。反応終了後、 0. 5モル食塩水、 次いで水で洗浄し、本発明の分離剤であるポリアクリル酸固定ィ匕ゲルを得た。固定ィ匕 されたポリメタクリル酸の量は 4mgZmlゲルであった。
[0026] 実施例 5
実施例 1で得られた本発明の分離剤を内径 6mm、長さ 4cmのカラムに充填し、該 カラムにヒト化モノクローナル抗体を注入した後、 IgGの重合体（二量体〜凝集体)を 含む不純物と IgGの単量体との混合物の分離を溶離液塩濃度を直線的に増加させ る方法 (リニアグラジェント）で実施した。得られたクロマトグラムを図 1に示す。
実施例 1で得られた本発明の分離剤による IgGの単量体と重合体の分離は、具体 的には、以下の方法で実施した。すなわち、カラム（6mm内径、長さ 4cm)に実施例 1で得られた分離剤を充填した後、 FPLC装置 (Akta Prime, GE社製）に接続した 。流速 0. 5mlZ分でカラム容量 10倍量の 50mMりん酸緩衝液 (pH6. 0)で平衡ィ匕 した後、ヒトイ匕モノクローナル抗体（100 μ g)を注入した。溶出は 1M NaClを含む 5 OmMりん酸緩衝液を用い、 60分の直線塩濃度勾配溶出法で分離した。図 1におい て横軸は保持時間（分)を示し、 22分付近に溶出しているピークが IgGの単量体で、 38分付近に溶出しているピークが IgGの重合体である。
[0027] 実施例 6
実施例 2で得られた本発明の分離剤を用いる以外は、実施例 5と同様の分離条件 で IgGの単量体と IgGの重合体との混合物の分離を行なった。得られたクロマトダラ ムを図 2に示す。図 2において、 23分付近に溶出しているピークが IgGの単量体で、 42分付近に溶出しているピークが IgGの重合体である。
[0028] 比較例 1
分離剤として、 TOYOPEARL HW—65Cにカルボキシメチル基が導入された T OYOPEARL CM— 650 (商品名、東ソー株式会社製)を用いた以外は、実施例 5 と同様の分離条件で IgGの単量体と IgGの重合体との混合物の分離を行なった。得 られたクロマトグラムを図 3に示す。図 3において、 22分付近に溶出しているピーク力 gGの単量体で、 30分付近に溶出して 、るピークが IgGの重合体である。
図 1、図 2と図 3の比較から明らかなとおり、本発明の分離剤を使用すると、従来の カチオン交換体 (TOYOPEARL CM— 650)を使用した場合に比べ、 IgGの単量 体と IgGの重合体との分離度が格段に向上し、高純度の IgG単量体が得られている
[0029] 比較例 2
分離剤として、アクリル酸を担体にグラフト重合させた分離剤である Fractogel E MD COO" (商品名、メルク社製)を用いた以外は、実施例 5に記載と同一条件で I gGの単量体と IgGの重合体との混合物の分離を行なった。得られたクロマトグラムを 図 4に示す。図 4において、 20分付近に溶出しているピークが IgG単量体で、 33分 付近に溶出して 、るピークが IgG重合体である。
図 1、図 2と図 4の比較力も明らかなように、本発明の分離剤を使用すると、特許文 献 3に開示されたような分離材料 (Fractogel EMD COO_)を使用した場合に比 ベ、 IgG単量体が効率良く分離，精製されている。
産業上の利用可能性
[0030] プロテイン Aァフィユティークロマトグラフィー精製後の、更なる精製に通常用いられ ているイオン交換クロマトグラフィーによる方法が持つ、 IgGの単量体と、 IgGの重合 体を含む不純物との分離が不十分、 IgGの回収率が低い、また長時間を要するため コスト高、等の問題点が解消されるため、 IgG精製用分離剤として利用可能性は高い
なお、 2006年 4月 25曰に出願された曰本特許出願 2006— 120626号の明細書 、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開 示として取り入れるものである。

Claims

請求の範囲
[1] ポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸が担体に固定ィ匕されていることを特徴と する IgG精製用分離剤。
[2] ポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸力 担体の表面上に分散して多点で固定 化されて!/ヽることを特徴とする請求項 1に記載の分離剤。
[3] ポリアクリル酸及び Z又はポリメタクリル酸の粘度平均分子量が 5, 000以上である ことを特徴とする請求項 1又は請求項 2に記載の分離剤。
[4] 担体が多孔性の担体であることを特徴とする請求項 1乃至請求項 3の 、ずれかに 記載の分離剤。
[5] 多孔性の担体が、無機多孔質材料、多糖類及び合成高分子からなる群より選ばれ ることを特徴とする請求項 4に記載の分離剤。
[6] 担体の形状が、球状粒子、非球状粒子、膜、又はモノリス (連続体)であることを特 徴とする請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載の分離剤。
[7] IgG単量体と不純物を含む混合物を請求項 1乃至請求項 6のいずれかに記載の分 離剤と接触させ、溶出させることを特徴とする IgG単量体の精製方法。
[8] 不純物が IgGの二量体乃至多量体及び Z又は凝集体を含有することを特徴とする 請求項 7に記載の精製方法。
[9] 溶出させる方法が、溶離液塩濃度若しくは溶離液 PHを直線的に増加させ、前記分 離剤に吸着した IgGを溶出させる方法；溶離液塩濃度若しくは溶離液 pHを段階的に 増加させ、前記分離剤に吸着した IgGを溶出させる方法;又は IgGの単量体を前記 分離剤に吸着させず、 IgGの重合体のみを吸着させる方法、であることを特徴とする 請求項 7又は請求項 8に記載の精製方法。
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