JP7087125B2 - アパタイトカラムを使用したウイルスの精製方法 - Google Patents
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Description
[A]
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
pH値を第1のpH値から第2のpH値に亘って直線的に変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るpH勾配溶出工程を含む、精製方法。
[B]
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
pH値を第1のpH値から第2のpH値に亘って変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るpH勾配溶出工程を含み、
前記第1のpH値が6.0以下であり、前記第2のpH値が7.5以上である精製方法。
[C]
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
請求項1に記載の精製方法によって該組成物中の不純物を除去するステップとを含む、ウイルス粒子の生産方法。
ここで、我々は、ポリオウイルスのセービン2型株を精製するための、セラミックフルオロアパタイト(CFAp)とCHApを用いた連続した液体クロマトグラフィー手順の設計および試験バリデーションについて報告する。
セービン2型ウイルスを含む細胞培養上清の調製
Vero細胞(the American Type Culture Collection、マナッサス、バージニア、アメリカ)を、10%ウシ胎児血清(FBS、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社)およびL-グルタミン(2mM、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社)を含むミニマム・エッセンシャル・メディウム(MEM、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ、アメリカ)で、225cm2フラスコ(住友ベークライト社、東京、日本)において、5%CO2、37℃で3日間培養した。その後、この培地を2%FBSおよび2mM L-グルタミンを含むMEMに変更し、その細胞をさらに1日間培養した。その培地をFBSを含まないMEM(63mL)に変更した後、セービン2型ウイルスをMOI0.01で細胞単層上に接種し、37℃で2日間培養した。その後、細胞培養上清を回収し、細胞デブリを除去するために0.45μmフィルター(ポリエーテルスルフォン細胞膜、サーモフィッシャサイエンティフィック社)を通し、使用時まで-80℃で安定化剤なしで保管した。このウイルスは、この条件下で高度に安定しており、4か月の保管期間に亘ってTCID50値の変化を示さなかった(データ省略)。
CHT、セラミック・ハイドロキシアパタイト、タイプII(CHAp;粒径40μm)およびCFT、セラミック・フルオロアパタイト・タイプII(CFAp;粒径40μm)をバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社(ヘルクレス、カリフォルニア、アメリカ)から購入した。これらは、厳密な仕様を有するセラミック・タイプの材料であり、その粒子を、自社で乾燥法を用いて、空のステンレス鋼カラム(4.6mmi.d×35mm、杉山商事、神奈川、日本)に詰めた。
クロマトグラフィーは、10mL又は20mLの試料ループを用いて、1.0mL/分の流速で、BioLogic DuoFlow(商標)システム(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社)を使用して行った。このサンプルを、CHAp/CFApカラムにロードし、10mMから600mMのリン酸ナトリウムバッファー(NaPB)の直線的濃度勾配を使用して溶出させた。260nm、280nmの紫外線(UV)吸収度および電気伝導度について、得られた溶出液を測定した。回収した画分を4℃に維持し、直ちに下記の評価のために使用した。使用前にバッファーをフィルター(0.22μm)に通した。フラクションコレクターを生物学的安全キャビネットの中に設置し、チューブをオートクレーブ滅菌した。さらに、使用前にポンプ、カラム及びラインの内部を消毒用エタノール(甘糟化学産業株式会社、東京、日本)で滅菌し、オートクレーブ滅菌された超純水と、その後の600mM NaPBで洗浄し、10mM NaPBで平衡化した。試験後、このカラムとシステムを、10カラム容積の0.5M NaOHで殺菌し、アルカリ性溶液を除去するためにオートクレーブ滅菌した超純水で洗浄した。
セービン2型ウイルスの力価は、96ウェルマイクロプレートの中のVero細胞のコンフルエント単層を使用して50%組織培養感染量(TCID50)により得られた。コンフルエント単層を準備するために、Vero細胞(100μL、1×105細胞/mL)を、10%FBSを含むMEMの中で37℃で1日培養した。液体クロマトグラフィー分離によって得られた画分を、10%FBSを含むMEMでそれぞれ10倍に階段希釈した。得られた希釈液(50μL)を、各ウェル(n=3)の中に接種し、1週間培養した。その後、細胞変性が生じたかどうか判定するために、そのマイクロプレートの各ウェルを、光学顕微鏡CKX31(オリンパス株式会社、東京、日本)で観察した。力価はReed Muench方法を使用して計算した。
Quant-iT(商標)PicoGreen dsDNA Assay Kit(サーモフィッシャ・サイエンティフィック社)及びMicro BCA; Protein Assay Kit(サーモフィッシャ・サイエンティフィック社)を使用して、キット付属の手順書に従い二本鎖DNA(dsDNA)およびタンパクの濃度を測定した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS―PAGE)のために、液体クロマトグラフィー画分を、限外ろ過(Ultracel YM-10、 Millipore社、ビルリカ、マサチューセッツ、アメリカ)で濃縮し、15%ポリアクリルアミドゲル(c-PAGEL、ATTO社、東京、日本)にアプライした。各タンパクバンドは銀染色法によって視覚化した。分子量は、Gel Doc(商標)EZ Imager(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社)によって算出した。
セービン2型ウイルスの精製のための2ステップ手順
最初に、我々は、弱毒化セービン2型ウイルスを精製するために、ワンステップのCHApクロマトグラフィー法を使用した。しかし、この方法を使用してウイルス画分からタンパクおよびDNA不純物の双方を分離することはできなかった。そのため、我々は、CHApクロマトグラフィーを実行する前の第1のステップとして、CFApクロマトグラフィーによる分離を導入することを試みた。この2段階クロマトグラフィー手順の概要を図1に示す。ステップ1において、pH勾配溶出を使用したCFApクロマトグラフィーによって、感染細胞の様々なタンパク混合物を含む細胞培養上清から、ウイルス粒子を直接分離した。ステップ2において、高濃度の塩化ナトリウム(NaCl)を含むNaPB濃度勾配溶出法を使用したCHApクロマトグラフィーによって、得られたウイルス画分を分離して、その画分から混入dsDNAを除去した。我々は、ウイルスを分離するために、以下に述べられるように各ステップを最適化した。
CFAp(セラミックフルオロアパタイト)
CHAp(セラミックハイドロキシアパタイト)
NaPB(リン酸ナトリウム・バッファー)
我々は、異なるpH値で、NaPBの同様の濃度勾配を用いた溶出により、CHApカラムで、3種のウイルス[ポリオウイルスセービン2型;デングウイルス タイプ1(Hawaii) (ウイルス学分野, 熱帯医学研究所、長崎大学、日本);及び、インフルエンザウイルス NYMC X-181(National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire, 英国)]を分離した(図6Aないし図8C)。我々は、ウイルスの物理化学的性質に拘わらず、バッファーのpHが低下するにつれて、これらのウイルスの保持容量が増加することを発見した。しかし、pH6.4において、セービン2型ウイルス画分は、タンパク不純物を含んでいた(図6A~図6C)が、デングウイルス画分は、タンパク画分から分離されたと考えられた(図7A~図7C)。そのため、我々は、CFApクロマトグラフィーを適用することを試みた。CFApクロマトグラフィーは、CHApと同様の分離を示すが、CHAp(適用可能なpH領域は6.5ないし14)と比較して、酸性に高い耐性(適用可能なpH領域は5~14)がありバッファーのpHを下げることが出来る。我々は、pH勾配の使用によって、低いpHとウイルスとの間の接触時間を減少させ、300mM NaPB pH5.0から8.2までの直線的なpH勾配を使用したCFApカラムにより、細胞培養上清からセービン2型ウイルスを分離した(図2A)。ウイルスの平均保持容量は、9.6±0.44mL(11回の独立した測定値、平均±標準偏差)であるとわかった。このことは分離の高い再現性を示している。得られた画分(図2Aの「Fr.A」)は、TCID50において94.1%±42.2%の平均回収率(11回の独立した測定値)と、91.87%の平均タンパク質除去率(2回の独立した測定値)を示した。SDS-PAGEを使用した画分の分析では、約37、32および30kDaの3本のバンド(図2B)が示された。これは、セービン2型ウイルスのカプシドタンパクVP1、VP2及びVP3の以前に報告されている分離パターンに適合していた。このことは、ウイルスがタンパク夾雑物から分離されたことを示している。しかし、この画分は、除去する必要がある宿主細胞に由来するdsDNAを依然として含んでいた(平均除去率88.15%、2回の独立した測定値)。
図2 セラミックフルオロアパタイト(CFAp)カラムにおけるpH勾配溶出によるセービン2型ウイルスの精製
(A)以下の条件下で得られたクロマトグラム:
カラム、CFAp;
サンプル(量)、セービン2型ウイルスを含む細胞培養上清(5mL);
カラム洗浄、10mMリン酸ナトリウムバッファ(NaPB;pH6.4、10mL)および300mM NaPB(pH6.4、20mL);
平衡化(300mM NaPB(pH5、15 mL));
溶出、10mLに対してpH5からpH8.2までの300mM NaPBの直線的pH勾配);
分離後の洗浄、300mM NaPB(pH8.2、5mL)および600mM NaPB(pH8.2、10mL);
青線、280nmの紫外線(UV)吸収度;
黒破線、電気伝導度;
赤線(50%組織培養感染量(TCID50)における感染力);
紫線、二本鎖DNA(dsDNA)の量。
「Fr.A」を評価のためにプールした。
(B)ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)分析
分子量分画10000の限外濾過によって、細胞培養上清及びプールされたFr. Aをそれぞれ10倍、30倍に濃縮した。マーカータンパクの分子量はkDaで与えられる。
移動相へのNaCl添加の影響
ハイドロキシアパタイトのリン酸サイト表面の過剰なナトリウムイオンがリン酸サイトとDNAとの間のクーロン反発力を減少させて、その結果として、DNAに対するカルシウムサイトの相対的親和性を高めるという知識に基づいて、次に、我々は、ステップ2の移動相中の高濃度のNaClによってウイルス画分から2本鎖DNAを除去することが可能になるかどうかを調べた。これを評価するために、我々は、0ないし1.5M NaCl存在下で、2種のウイルス(インフルエンザウイルスNYMC X-181及びネコカリシウイルス)を分離した。我々は、バッファー中のNaCl濃度が増加するにつれて2本鎖DNAの保持容量が増加し、ウイルス粒子の保持容量が減少したことを発見した(図9)。したがって、移動相中の高濃度のNaClは、ウイルス画分から2本鎖DNAを除去するのに有効であることがわかった。我々は、細胞培養上清中の2本鎖DNAからセービン2型ウイルスを分離するために、移動相の中で1Mおよび1.5MのNaClを使用した(図3)。両方の分離において、ウイルス粒子と比較して2本鎖DNAの保持量が増加し、1M NaClの添加がウイルスピークから2本鎖DNAを除去するのに充分であったことを示していた(除去率97.32%)。更に、この分離の再現性は高く、濃度勾配溶出開始後のウイルス保持容量は、5.0±0.5mLであった(3回の独立した測定値)。
図3 NaClの存在下におけるセービン2型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、以下に記載の条件下で、(A)1M NaCl、(B)1.5M NaClが存在する状態で行った。条件:
カラム、セラミックハイドロキシアパタイト(CHAp);
サンプル(量)、セービン2型ウイルス(5mL)を含む細胞培養上清;
バッファーpH、7.2;
カラム洗浄、10mMリン酸ナトリウムバッファー(NaPB;9mL);
平衡化、NaClを含む10mM NaPB(14mL);
溶出、30mLに対してNaClを含む10mMから600mMのNaPBの直線的濃度勾配;
分離後の洗浄、600mM NaPB(10mL)。
線は図2と同様である。
TCID50、50%組織培養感染量
我々は、細胞培養上清からセービン2型ウイルスを分離するために、2ステップの連続した手順(上述されているステップ1および2)を行った。代表的なケースを、図4に示す。
図4 セービン2型ウイルスの連続した―2段階精製
(A)セラミックフルオロアパタイト(CFAp)カラムにおけるpH勾配溶出によるセービン2型ウイルスの精製(ステップ1)。
カラム、CFAp;
サンプル(量)、セービン2型ウイルスを含む細胞培養上清(10mL);
洗浄、10mMリン酸ナトリウムバッファー(NaPB)(pH6.4、9mL)及び300mM NaPB(pH6.4、20mL);
平衡化、300mM NaPB(pH5、15mL);
溶出、10mLに対して300mM NaPBのpH5からpH8.2までの直線的pH勾配;
洗浄後の分離、300mM NaPB(pH8.2、5mL)及び600mM NaPB(pH8.2、10 mL)。
線は図2と同様である。Fr.Bをプールし、ステップ2でさらに精製した。
(B)セラミックハイドロキシアパタイト(CHAp)カラムにおける1M NaClを含むNaPB溶出による、Fr.Bからの2本鎖DNA(dsDNA)の除去(ステップ2)
カラム、CHAp;
サンプル(量)、(A)において得られたFr.Bを、0.9%NaClで6.7倍に希釈したもの(17mL);
バッファー、pH7.2;
カラム洗浄、10mM NaPB(13mL);
平衡化、1M NaClを含む10mM NaPB(14mL);
溶出、10mLに対して、1M NaClを含む10mMから187mMまでのNaPBの直線的濃度勾配;
洗浄、600 mM NaPB(10mL)。
さらなる評価のために、Fr.Cをプールした。
(C)2ステップ精製により得られたプール画分のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析
上記(B)でプールしたFr.C及び細胞培養上清を、分子量分画10000の限外濾過により、それぞれ100倍、10倍に濃縮した。サイズは左側のkDaで与えられる。矢印は、画分Cの中の主なタンパクを示している。TCID5050%組織培養感染量
臨床試験、前臨床試験、又は、商業的製剤において使用されるワクチンを製造する場合、その目標は、精製時に、不純物を最小化し、ワクチンの回収率を最大化することである。不純物は、典型的には、宿主細胞に由来するDNAとタンパク、細胞培養培地の成分、及び/又は、精製工程で放出されるいくつかのリガンドである。この研究において、我々は、濃縮やバッファー交換をせずに、細胞培養上清から直接、セービン2型ウイルスの精製に成功した。TCID50における58.7%±30.0%の平均回収率を達成し、タンパク、2本鎖DNAの平均除去率は、それぞれ、99.95±0.006%、99.99%±0.003%を達成した(3回の独立した試験)。
ステップ1および2のいずれもが再現性が高いので、検出工程の必要もなくウイルス画分を得ることができた。この保持容量に依存した分離は、ワクチンを作るのに必要な時間およびコストを低減するはずである。更に、この手順は、現在のところ多段階精製工程およびオフライン精製工程を含んでいるが、今後すべての精製ステップを自動化することは可能となるだろう。さらに、この2ステップのクロマトグラフィーの精製は、スケールアップ可能なプロセスを使用して構築されているので、他の現行の方法よりもスケールアップがより簡単である(図5)。
図5 タンデムカラムシステム
CFAp、セラミックフルオロアパタイト;
CHAp、セラミックハイドロキシアパタイト;
NaPB、リン酸ナトリウムバッファー;
PV、ポリオウイルス。
図6A~図6C
異なるpH値でのセラミックハイドロキシアパタイト(CHAp)カラムで分離したセービン2型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、(A)pH6.4、(B)pH7.2、及び、(C)pH8.2のバッファーpHで行った。
カラム、CHAp(40μm);
サンプル(量)、セービン2型ウイルスを含む細胞培養上清(5mL);
カラム洗浄および平衡化、10mMリン酸ナトリウムバッファー(NaPB;11mL);
溶出、20mLに対して10mMから300mMまでのNaPB直線的濃度勾配;
分離後の洗浄、600mM NaPB(8mL)。
青線、280nm紫外線(UV)吸収度;
黒破線、電気伝導度;
赤線、50%組織培養感染量(TCID50)における感染価;
紫線、2本鎖DNA(dsDNA)量。
異なるpH値においてセラミックハイドロキシアパタイト(CHAp)カラムにより分離されたデングウイルス1型を含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、(A)pH6.4、(B)pH7.2および(C)pH8.2のバッファーpHで行った。
カラム、CHAp(40μm);
サンプル(量)、デングウイルス1型を含む細胞培養上清(10mL);
カラム洗浄および平衡化、10mMリン酸ナトリウム・バッファー(NaPB;10mL);
溶出、30mLに対して10mMから300mMまでのNaPB、及び、8mLに対して300mMから600mMまでの直線的濃度勾配;
洗浄後の分離、600mM NaPB(5mL)。
線は、赤線を除いて図6A~図6Cと同様である。赤線は、赤血球凝集(HA)アッセイにおけるウイルス活性を示す。
異なるpH値においてセラミックハイドロキシアパタイト(CHAp)カラムによって分離したインフルエンザウイルスNYMC X-181を含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、(A)6.5、(B)6.8および(C)7.5のバッファーpH値で行った。
カラム、CHAp(40μm);
サンプル(量)、インフルエンザウイルスNYMC X-181を含む細胞培養上清(5mL);
カラム洗浄および平衡化、10mMリン酸ナトリウムバッファー(NaPB;15mL);
溶出、30mLに対して10mMから600mMまでのNaPBの直線的濃度勾配;
洗浄、600mM NaPB(5mL)。
線は、赤線を除いて図6A~図6Cと同様である。赤線は、赤血球凝集(HA)アッセイにおけるウイルス活性を示す。
NaClの存在下での、インフルエンザウイルスNYMC X-181を含む細胞培養上清のクロマトグラム
バッファーは、(A)0M、(B)0.14M、(C)0.5M、及び、(D)1MのNaClを含んでいた。
カラム、セラミックハイドロキシアパタイト(CHAp);
サンプル(量)、インフルエンザウイルスNYMC X-181を含む細胞培養上清(5mL);
バッファーpH、7.5;
カラム洗浄および平衡、NaClを含む5mMリン酸ナトリウムバッファー(NaPB(15mL);
溶出、30mLに対して、NaClを含む5mMから600のmMまでのNaPBの直線的濃度勾配;
分離後の洗浄、600mM NaPB(5mL)。
線は、赤線を除いて図6A~図6Cと同様である。赤線は、赤血球凝集(HA)アッセイにおけるウイルス活性を示す。
Claims (3)
- ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
pH値を第1のpH値から第2のpH値に亘って直線的に変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るpH勾配溶出工程を含み、
前記第1のpH値が6.0以下であり、前記第2のpH値が7.5以上であり、
前記リン酸カルシウム系化合物は、フルオロアパタイトを主成分とし、酸性条件下でも使用可能なものであり、
前記ウイルス粒子は、前記第1のpH値から前記第2のpH値に亘るpH値の変化に応じて前記吸着剤に対する吸着性が低下するものである精製方法。 - ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
pH値を第1のpH値から第2のpH値に亘って変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るpH勾配溶出工程を含み、
前記第1のpH値が6.0以下であり、前記第2のpH値が7.5以上であり、
前記リン酸カルシウム系化合物は、酸性条件下でも使用可能なものであり、
前記ウイルス粒子は、前記第1のpH値から前記第2のpH値に亘るpH値の変化に応じて前記吸着剤に対する吸着性が低下するものである精製方法。 - ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
請求項1または2に記載の精製方法によって該組成物中の不純物を除去するステップとを含む、ウイルス粒子の生産方法。
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