JP2019110904A - ウイルス様粒子の精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)ノロウイルスのウイルス様粒子を含む溶液を、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー用担体と接触させ、前記ウイルス様粒子を前記担体に結合させ、その後、バッファで前記担体を洗浄し、次いで、リン酸塩を含むバッファで前記担体から前記ウイルス様粒子を溶出させることにより、前記ウイルス様粒子を精製する方法であって、前記溶出に用いたバッファのリン酸塩濃度が10mM未満であることを特徴とするノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
(2)溶出に用いたバッファのリン酸塩濃度が3〜7mMであることを特徴とする(1)に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
(3)洗浄に用いたバッファがリン酸塩を含むバッファであり、そのリン酸塩濃度が10mM未満であることを特徴とする(1)又は(2)に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
(4)洗浄に用いたバッファのリン酸塩濃度が3〜7mMであることを特徴とする(3)に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
(5)ノロウイルスのウイルス様粒子を含む溶液が、ノロウイルスの核酸配列を発現する微生物又は細胞の培養上清であることを特徴とする(1)乃至(4)のいずれかに記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
(6)ノロウイルスのウイルス様粒子を含む溶液が、ノロウイルスの核酸配列を発現する昆虫細胞の培養上清であることを特徴とする(1)乃至(4)のいずれかに記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
(7)ノロウイルスの核酸配列が、構造タンパク質VP1をコードする核酸配列であることを特徴とする(5)又は(6)に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
(1)実験方法
1 機器及び試薬
本実施例で使用した機器、試薬等を下表に示した。
2.1 CHT平衡化バッファ(CHT EQW) ; 5 mM リン酸バッファ, pH6.5
NaH2PO4・2H2O 3.12 gとNa2HPO4・12H2O 1.90 gとMilliQ (登録商標)5.0 kgを室温で5分間混合した。バッファのpHを測定し、pHが6.5であることを確認した。得られたバッファは、2-8℃で保管した。
NaH2PO4・2H2O 2.73 gとNa2HPO4・12H2O 2.69 gとNaCl 14.61 gとMilliQ (登録商標)4.9 kgを室温で5分間混合した。バッファのpHを測定し、pHが6.5であることを確認した。得られたバッファは、2-8℃で保管した。
NaH2PO4・2H2O 0.59 gとNa2HPO4・12H2O 7.62 gと NaCl 43.8 gとMilliQ(登録商標) 4.9 kgを室温で5分間混合した。バッファのpHを測定し、pHが7.5であることを確認した。得られたバッファは、2-8℃で保管した。
NaH2PO4・2H2O 24.96 gとNa2HPO4・12H2O 85.95 gと NaCl 29.2 gとMilliQ(登録商標)2 kgを室温で5分間混合した。バッファのpHを測定し、pHが6.7であることを確認した。得られたバッファは、2-8℃で保管した。
NaH2PO4・2H2O 156 gとNa2HPO4・12H2O 537.5 gとMilliQ(登録商標) 4.3 kgを室温で5分間混合した。バッファのpHを測定し、pHが中性(例えば、pH6.7)であることを確認した。得られたバッファは、室温で保管した。
尿素1802 gとNaH2PO4・2H2O 3.9 gとNa2HPO4・12H2O 8.95 gとNaCl 292.5 gとMilliQ(登録商標) 2.9 kgを室温で5分間混合した。バッファのpHを測定し、pHが中性(例えば、pH7.0)であることを確認した。得られたバッファは、室温で保管した。
400 gのNaOH溶液とMilliQ(登録商標) 9.8 kgを室温で5分間混合した。得られた溶液は、室温で保管した。
40 gのNaOH溶液とMilliQ(登録商標) 10.0 kg を室温で5分間混合した。得られた溶液は、室温で保管した。
3.1 組換えバキュロウイルスの作製
GII-4に分類されるノロウイルスのウイルス株(タンペレ大学の入院患者から採取)のVP1(アミノ酸配列を配列番号1に示す。)をコードするcDNAをトランスファープラスミドpFastBac(Invitrogen)に組み込んだ。次にcDNAを組み込んだトランスファープラスミドを、バキュロウイルスゲノムDNAを保持する大腸菌であるDH10Bac(Invitrogen)に導入し、相同組換えによってノロウイルスVP1をコードするcDNAをバキュロウイルスゲノムDNAに組み込んだ。大腸菌からバキュロウイルスゲノムDNAを抽出精製し、昆虫細胞(expresSF+細胞、Protein Sciences)に導入して培養した。この培養上清から組換えバキュロウイルスを得た。
組換えバキュロウイルを昆虫細胞(expresSF+細胞)(1x106/mL)にMOI=1となるように加えた。その後、生存率が10%以下になるまで、5-6日間細胞の培養を行った。
GII-4 VP1発現培養液(Lot. F1274)を連続式遠心分離機(MN1, KOKUSAN)にかけ(遠心力:5,000 x g、流速:約4 mL/sec)、上清を回収した。上清の濁度はおよそ80 NTUであった。回収した上清を流速約200 mL/min以上で濾過し、CHTカラムにかけた。
CHT Type I 樹脂 700 mL (1 mL (カラム体積) = 0.6 g (乾燥重量))をカラムBPG100/500 (GE) (Φ10 cm x bed height 8.9 cm)に0.1 N NaOH溶液を用いて充填し、0.1 N NaOH溶液で保管した。
3.5.1 予洗
3 CVのMilliQ(登録商標)を流速150 cm/h (196 mL/min)でカラム上にロードした。
5 CVの平衡化バッファ(CHT EQW ; 5mM リン酸バッファ (pH 6.5))を流速150 cm/h (196 mL/min)でカラム上にロードした。
約14Lの濾過した培養液の上清を、流速115 cm/h (150 mL/min)で、平衡化したCHTカラム上にロードした。
6CVの平衡化バッファ(CHT EQW ; CHT EQW ; 5mM リン酸バッファ (pH 6.5))を流速160cm/h (122 mL/min)で流し、カラムを洗浄した。
6CVの平衡化バッファ(CHT WS ; 50 mM NaCl, 5 mM リン酸バッファ (pH6.5))を流速130cm/h (170 mL/min)で流し、カラムを洗浄した。
溶出バッファ(CHT ELU ; 150 mM NaCl, 5 mM リン酸バッファ (pH7.5))を流速115 cm/h (150 mL/min)で流し、GII-4 VP1をカラムから溶出させた。
6CVのポスト洗浄バッファ(CHT POST WS ; 250m M NaCl, 200 mM リン酸バッファ (pH6.7))を流速115cm/h (150 mL/min)で流し、カラムを洗浄した。
6 CVの再生バッファ 1 (CHT REG1 ; 500 mM リン酸ナトリウムバッファ)を流速115 cm/h (150 mL/min)で流し、カラムを洗浄した。
3CVの再生バッファ 2 (CHT REG2 ; 1M NaCl, 6 M 尿素含有5 mM リン酸バッファ)を流速115 cm/h (150 mL/min)で流し、カラムを洗浄した。
カラムを1 N NaOH溶液で1時間衛生化した。2CVの1 N NaOH溶液を流速115 cm/h (150 mL/min)でカラムにアプライし、次いで、1CVの1 N NaOH溶液を流速31 cm/h (40 mL/min)でカラムにアプライした。
3CVの0.1 N NaOH溶液を流速115 cm/h (150 mL/min)で流し、カラムを洗浄し、その後保存した。
溶出画分を0.45 + 0.2 μm フィルター(Sartopore 2 150, Sartorius)を用いて濾過した。
各サンプル80μLに5×DB(300mmol/L Tris-HCl pH6.8, 50% glycerol, 10% SDS, 0.5% BromoPhenolBlue, 500mmol/L DTT)20μLを混合して95℃で5分間加熱した後、SDS-PAGEゲル各レーンに10μLアプライし、200V, 35分間電気泳動した。泳動後のゲルを固定液(25% Methanol, 10% 酢酸, 10% Trichrolo acetic acid(TCA))に浸して5分間振盪し、その後CBB染色液(0.1% CBB, 7.7mmol/L Ethanol, 1.75mmol/L Acetic acid)に浸して1時間振盪して染色した後、脱色液(10% 酢酸)で一晩脱色した。ゲル画像はスキャナを用いて取得した。分子量マーカーはSeeBlue prestained standard (Invitrogen)を使用した。
各精製段階のサンプルの電気泳動の結果を図1に示す。各レーンの記号の意味は、以下の通りである。
AS (Applied Sample):精製前のカラムにロードするサンプル。
FT (Flow Through):カラムを素通りしたサンプル。カラム容積の24倍量(24CV)のASをロードし、約4倍量毎に少量サンプリングしたものがFT1からFT7である。FTを全量集めてプールしたものがFT poolである。
WS1, WS2 (Wash1, Wash2):洗浄1、洗浄2でカラムから溶出したサンプルを分取したもの。
ELU (Elution):カラムに吸着したGII-4 VP1を溶出させた画分。
Post WS (post wash):溶出後にカラム洗浄を実施した際にカラムから溶出したサンプル。
ELU1-1 whole:そのままのGII-4 VP1溶出画分。
ELU1-1 filtration:GII-4 VP1溶出画分に対してフィルターろ過を行った後のサンプル。
Claims (7)
- ノロウイルスのウイルス様粒子を含む溶液を、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー用担体と接触させ、前記ウイルス様粒子を前記担体に結合させ、その後、バッファで前記担体を洗浄し、次いで、リン酸塩を含むバッファで前記担体から前記ウイルス様粒子を溶出させることにより、前記ウイルス様粒子を精製する方法であって、前記溶出に用いたバッファのリン酸塩濃度が10mM未満であり、かつ前記溶出に用いたバッファのpHが7.0〜8.0であることを特徴とするノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
- 溶出に用いたバッファのリン酸塩濃度が3〜7mMであることを特徴とする請求項1に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
- 洗浄に用いたバッファがリン酸塩を含むバッファであり、そのリン酸塩濃度が10mM未満であることを特徴とする請求項1又は2に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
- 洗浄に用いたバッファのリン酸塩濃度が3〜7mMであることを特徴とする請求項3に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
- ノロウイルスのウイルス様粒子を含む溶液が、ノロウイルスの核酸配列を発現する微生物又は細胞の培養上清であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
- ノロウイルスのウイルス様粒子を含む溶液が、ノロウイルスの核酸配列を発現する昆虫細胞の培養上清であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
- ノロウイルスの核酸配列が、構造タンパク質VP1をコードする核酸配列であることを特徴とする請求項5又は6に記載のノロウイルスのウイルス様粒子の精製方法。
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