JP6720288B2 - ウイルス用無菌精製プロセス - Google Patents
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Description
発明の分野
本開示は、ウイルスの精製プロセスに関する。
本開示は、ウイルスの精製プロセスに関する。
背景
世界保健機構などの規制機関は、ワクチンなどヒトに投与される医薬組成物の製造について、組成物の量及び成分を制限する基準及び指針を設定している。例えば、ワクチンの場合、ワクチン製剤は、必要条件の中でも特に、滅菌されていなければならず（すなわち、独立して複製する生命体を含まない）、かつヒト１用量あたり１０ｎｇを超えるＤＮＡを含有してはならない。そのような基準は、ヒトに投与するための組成物の安全性を確保する目的で設定されているが、組成物の製造に用いられるプロセスに困難をもたらす場合がある。
世界保健機構などの規制機関は、ワクチンなどヒトに投与される医薬組成物の製造について、組成物の量及び成分を制限する基準及び指針を設定している。例えば、ワクチンの場合、ワクチン製剤は、必要条件の中でも特に、滅菌されていなければならず（すなわち、独立して複製する生命体を含まない）、かつヒト１用量あたり１０ｎｇを超えるＤＮＡを含有してはならない。そのような基準は、ヒトに投与するための組成物の安全性を確保する目的で設定されているが、組成物の製造に用いられるプロセスに困難をもたらす場合がある。
本発明の態様は、ウイルス粒子を精製するプロセスを提供し、本プロセスは、以下の工程：（ａ）ウイルス粒子を含む液状媒体を用意する工程であって、ウイルス粒子は、直径が約１００ｎｍ超である、工程；（ｂ）ウイルス粒子を、孔を有する不活性殻とリガンド活性化核とを含む固相マトリクスに接触させる工程であって、孔の分子量カットオフは、ウイルス粒子をリガンド活性化核に進入させず、かつ孔の分子量カットオフより小さい分子は、リガンド活性化核に進入することができる、工程；ならびに（ｃ）濾過により、固相マトリクスをウイルス粒子から分離して、最終ウイルス調製物を製造する工程；を含み、本プロセスは無菌で行われる。
実施形態によっては、ウイルス粒子を含む液状媒体は、工程（ｂ）の前に、１つまたは複数の予備精製工程（複数可）に供される。実施形態によっては、予備精製工程は、（ａ）複数のウイルスまたはウイルス粒子を含む液状媒体中の宿主細胞ゲノムＤＮＡを、酵素処理により消化すること；及び／または（ｂ）複数のウイルスまたはウイルス粒子を含む液状媒体を、７５０ｋＤａ以上の孔径を有する中空繊維膜を用いて限外／透析濾過することを含む。
実施形態によっては、ウイルス粒子は、直径が、約２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、またはそれ以上である。実施形態によっては、ウイルスは、生ウイルス、弱毒生ウイルス、改変生ウイルス、または組換え生ウイルスである。実施形態によっては、ウイルスは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）からなる群より選択されるウイルス科に属する。実施形態によっては、ウイルスは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する（生きているまたは不活性化している）。実施形態によっては、ウイルスは、麻疹ウイルスである。
実施形態によっては、固相マトリクスの核に進入する分子は、７００ｋＤａ未満の分子量を有する。実施形態によっては、固相マトリクスのリガンド活性化核のリガンドは、リガンド活性化核に進入する分子を、カチオン、アニオン、疎水性、または混合相互作用を介して結合することができる。実施形態によっては、固相マトリクスのリガンド活性化核のリガンドは、オクチルアミンである。実施形態によっては、固相マトリクスは、スラリーとして、２．５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは３．３％、５％、６．６％、または１０％、特に好ましくは１０％の最終濃度で使用される。実施形態によっては、固相マトリクスは、ウイルス粒子を含む液状媒体とともに、室温（２０℃〜２５℃）で、攪拌しながら、少なくとも１時間、好ましくは２時間、３時間、または４時間、特に好ましくは２時間、インキュベートされる。
実施形態によっては、複数のウイルスまたはウイルス粒子を含む液状媒体に対する最終ウイルス調製物の不純物の相対減少度は、６０〜９５％の範囲にある。実施形態によっては、最終ウイルス調製物の残存不純物は、１％未満である。
実施形態によっては、請求項１の工程（ｃ）の濾過は、１μｍ以上の孔径を有するフィルターを用いて行われる。実施形態によっては、プロセスに続いて、１つまたは複数の無菌濾過工程（複数可）を行う。
実施形態によっては、ウイルスは、ＥＢ６６細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、Ｖｅｒｏ−αＨｉｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞株、２９３細胞株、ＰＣ１２細胞株、ＣＨＯ細胞株、３Ｔ３細胞株、ＰｅｒＣ６細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ニワトリ胚線維芽細胞細胞株、アヒル細胞株、及び二倍体トリ細胞株からなる群より選択される細胞株で増殖させたものである。実施形態によっては、この細胞株は、アヒル細胞株である。実施形態によっては、この細胞株は、二倍体トリ細胞株である。実施形態によっては、この細胞株は、ＥＢ６６細胞株である。
本発明の態様は、ウイルス感染に対する免疫化用組成物を製造するための、本明細書中記載されるプロセスのいずれかの使用を提供する。
他の態様は、ウイルス感染を治療及び／または予防するための、本明細書中記載されるプロセスのいずれかにより得られるウイルス粒子を含む組成物を提供する。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
ウイルス粒子の精製プロセスであって、以下の工程：
（ａ）ウイルス粒子を含む液状媒体を用意する工程であって、該ウイルス粒子は、直径が約１００ｎｍ超である、工程；
（ｂ）該ウイルス粒子を、孔を有する不活性殻とリガンド活性化核とを含む固相マトリクスに接触させる工程であって、該孔の分子量カットオフは、該ウイルス粒子を該リガンド活性化核に進入させず、かつ該孔の該分子量カットオフより小さい分子は、該リガンド活性化核に進入することができる、工程；及び
（ｃ）濾過により、該固相マトリクスを該ウイルス粒子から分離して、最終ウイルス調製物を製造する工程
を含み、
無菌で行われる、前記プロセス。
［２］
前記ウイルス粒子を含む前記液状媒体が、工程（ｂ）の前に１つまたは複数の予備精製工程（複数可）に供される、［１］のプロセス。
［３］
前記ウイルス粒子は、直径が、約２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、またはそれ以上である、［１］または［２］のプロセス。
［４］
前記固相マトリクスの前記核に進入する前記分子が、７００ｋＤａ未満の分子量を有する、［１］から［３］のいずれかのプロセス。
［５］
前記固相マトリクスの前記リガンド活性化核のリガンドが、前記リガンド活性化核に進入する前記分子を、カチオン、アニオン、疎水性、または混合相互作用を介して、結合することができる、［１］から［４］のいずれかのプロセス。
［６］
前記固相マトリクスの前記リガンド活性化核の前記リガンドが、オクチルアミンである、［１］から［５］のいずれかのプロセス。
［７］
前記固相マトリクスがスラリーとして使用され、最終濃度が、２．５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは３．３％、５％、６．６％、または１０％、最も好ましくは１０％である、［１］から［６］のいずれかのプロセス。
［８］
前記固相マトリクスが、前記ウイルス粒子を含む前記液状媒体とともに、室温（２０℃〜２５℃）で、攪拌しながら、少なくとも１時間、好ましくは２時間、３時間、または４時間、最も好ましくは２時間、インキュベートされる、［１］から［７］のいずれかのプロセス。
［９］
複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体に対する最終ウイルス調製物の不純物の相対的減少が、６０〜９５％の範囲にある、［１］から［８］のいずれかのプロセス。
［１０］
［１］の工程（ｃ）の前記濾過が、１μｍ以上の孔径を有するフィルターを用いて行われる、［１］から［９］のいずれかのプロセス。
［１１］
前記予備精製工程が、以下：
（ａ）複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体中の宿主細胞ゲノムＤＮＡを、酵素処理により消化すること；及び／または
（ｂ）複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体を、７５０ｋＤａ以上の孔径を有する中空繊維膜を用いて、限外／透析濾過すること
を含む、［２］から［１０］のいずれかのプロセス。
［１２］
前記プロセスに続いて、１つまたは複数の無菌濾過工程（複数可）が行われる、［１］から［１１］のいずれかのプロセス。
［１３］
前記最終ウイルス調製物の前記残存不純物が、１％未満である、［１］から［１２］のいずれかのプロセス。
［１４］
前記ウイルスが、ＥＢ６６細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、Ｖｅｒｏ−αＨｉｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞株、２９３細胞株、ＰＣ１２細胞株、ＣＨＯ細胞株、３Ｔ３細胞株、ＰｅｒＣ６細胞株、ＭＤＳＫ細胞株、ニワトリ胚線維芽細胞細胞株、アヒル細胞株、及び二倍体トリ細胞株からなる群より選択される細胞株で増殖させたものである、［１］から［１３］のいずれかのプロセス。
［１５］
前記細胞株が、アヒル細胞株である、［１４］のプロセス。
［１６］
前記細胞株が、二倍体トリ細胞株である、［１４］のプロセス。
［１７］
前記細胞株が、ＥＢ６６細胞株である、［１４］のプロセス。
［１８］
前記ウイルスが、生ウイルス、弱毒生ウイルス、改変生ウイルス、または組換え生ウイルスである、［１］から［１７］のいずれかのプロセス。
［１９］
前記ウイルスが、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）からなる群より選択されるウイルス科に属する、［１］から［１８］のいずれかのプロセス。
［２０］
前記ウイルスが、前記パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス科に属する、［１９］のプロセス。
［２１］
前記ウイルスが、麻疹ウイルスである、［２０］のプロセス。
［２２］
ウイルス感染に対する免疫化用の組成物を製造するための、［１］から［２１］のいずれかのプロセスの使用。
［２３］
ウイルス感染を治療及び／または予防するための、［１］から［２１］のいずれかのプロセスにより得られるウイルス粒子を含む、組成物。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
ウイルス粒子の精製プロセスであって、以下の工程：
（ａ）ウイルス粒子を含む液状媒体を用意する工程であって、該ウイルス粒子は、直径が約１００ｎｍ超である、工程；
（ｂ）該ウイルス粒子を、孔を有する不活性殻とリガンド活性化核とを含む固相マトリクスに接触させる工程であって、該孔の分子量カットオフは、該ウイルス粒子を該リガンド活性化核に進入させず、かつ該孔の該分子量カットオフより小さい分子は、該リガンド活性化核に進入することができる、工程；及び
（ｃ）濾過により、該固相マトリクスを該ウイルス粒子から分離して、最終ウイルス調製物を製造する工程
を含み、
無菌で行われる、前記プロセス。
［２］
前記ウイルス粒子を含む前記液状媒体が、工程（ｂ）の前に１つまたは複数の予備精製工程（複数可）に供される、［１］のプロセス。
［３］
前記ウイルス粒子は、直径が、約２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、またはそれ以上である、［１］または［２］のプロセス。
［４］
前記固相マトリクスの前記核に進入する前記分子が、７００ｋＤａ未満の分子量を有する、［１］から［３］のいずれかのプロセス。
［５］
前記固相マトリクスの前記リガンド活性化核のリガンドが、前記リガンド活性化核に進入する前記分子を、カチオン、アニオン、疎水性、または混合相互作用を介して、結合することができる、［１］から［４］のいずれかのプロセス。
［６］
前記固相マトリクスの前記リガンド活性化核の前記リガンドが、オクチルアミンである、［１］から［５］のいずれかのプロセス。
［７］
前記固相マトリクスがスラリーとして使用され、最終濃度が、２．５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは３．３％、５％、６．６％、または１０％、最も好ましくは１０％である、［１］から［６］のいずれかのプロセス。
［８］
前記固相マトリクスが、前記ウイルス粒子を含む前記液状媒体とともに、室温（２０℃〜２５℃）で、攪拌しながら、少なくとも１時間、好ましくは２時間、３時間、または４時間、最も好ましくは２時間、インキュベートされる、［１］から［７］のいずれかのプロセス。
［９］
複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体に対する最終ウイルス調製物の不純物の相対的減少が、６０〜９５％の範囲にある、［１］から［８］のいずれかのプロセス。
［１０］
［１］の工程（ｃ）の前記濾過が、１μｍ以上の孔径を有するフィルターを用いて行われる、［１］から［９］のいずれかのプロセス。
［１１］
前記予備精製工程が、以下：
（ａ）複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体中の宿主細胞ゲノムＤＮＡを、酵素処理により消化すること；及び／または
（ｂ）複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体を、７５０ｋＤａ以上の孔径を有する中空繊維膜を用いて、限外／透析濾過すること
を含む、［２］から［１０］のいずれかのプロセス。
［１２］
前記プロセスに続いて、１つまたは複数の無菌濾過工程（複数可）が行われる、［１］から［１１］のいずれかのプロセス。
［１３］
前記最終ウイルス調製物の前記残存不純物が、１％未満である、［１］から［１２］のいずれかのプロセス。
［１４］
前記ウイルスが、ＥＢ６６細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、Ｖｅｒｏ−αＨｉｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞株、２９３細胞株、ＰＣ１２細胞株、ＣＨＯ細胞株、３Ｔ３細胞株、ＰｅｒＣ６細胞株、ＭＤＳＫ細胞株、ニワトリ胚線維芽細胞細胞株、アヒル細胞株、及び二倍体トリ細胞株からなる群より選択される細胞株で増殖させたものである、［１］から［１３］のいずれかのプロセス。
［１５］
前記細胞株が、アヒル細胞株である、［１４］のプロセス。
［１６］
前記細胞株が、二倍体トリ細胞株である、［１４］のプロセス。
［１７］
前記細胞株が、ＥＢ６６細胞株である、［１４］のプロセス。
［１８］
前記ウイルスが、生ウイルス、弱毒生ウイルス、改変生ウイルス、または組換え生ウイルスである、［１］から［１７］のいずれかのプロセス。
［１９］
前記ウイルスが、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）からなる群より選択されるウイルス科に属する、［１］から［１８］のいずれかのプロセス。
［２０］
前記ウイルスが、前記パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス科に属する、［１９］のプロセス。
［２１］
前記ウイルスが、麻疹ウイルスである、［２０］のプロセス。
［２２］
ウイルス感染に対する免疫化用の組成物を製造するための、［１］から［２１］のいずれかのプロセスの使用。
［２３］
ウイルス感染を治療及び／または予防するための、［１］から［２１］のいずれかのプロセスにより得られるウイルス粒子を含む、組成物。
添付の図面は、正確な縮尺で描かれることを意図しない。図面は、例示にすぎず、本開示の実施可能性に必須ではない。明確にする目的で、各図面において必ずしも全ての成分に標識を付けない場合がある。図面中、以下のとおりである。
本明細書中開示されるのは、ウイルス精製のための無菌プロセス及び精製されたウイルスを含む組成物である。ワクチン組成物など医薬組成物の製造では、対象に投与するために、組成物の無菌状態及び安全性が保証されなければならない。滅菌組成物の調製は、典型的には、最終組成物を、投与前に、滅菌濾過する、すなわち、０．２μｍフィルター膜を通して濾過することにより達成される。ウイルスワクチン組成物など比較的大きなウイルス（すなわち、約１００ｎｍ以上）を含む組成物の場合、滅菌濾過は、ウイルスが膜に保持されるために、かなりのウイルスの損失をもたらし、濾過工程からのウイルスの収率を減少させる場合がある。さらに麻疹ウイルス及び剪断応力に敏感な他のウイルスなど、ウイルスによっては、精製プロセスの各工程を穏やかな条件下で行わなければならず、代替滅菌方法が役に立たなくなる。本発明者らは、麻疹ウイルスなどの比較的大きいウイルスの無菌組成物の調製では、タンジェンシャルフロー濾過を用いるウイルス精製方法が、成功せず及び不十分であったことを見出した（米国特許第７，７５９，１０４号及びその中の実施例を参照）。その上さらに、タンジェンシャルフロー濾過装置を無菌にして維持することは、費用がかかり、かつ多大な努力を要する。本明細書中記載されるプロセスは、完全な無菌条件下でのウイルス調製を可能にし、滅菌濾過を必要としないウイルス調製物をもたらす。
本発明は、その応用において、以下の説明に記載されるまたは図面に例示される、成分の構築及び配置の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々なやり方で実施されることまたは実行されることが可能である。また、本明細書中使用される表現及び用語は、説明を目的とするものであって、限定するものと見なされるべきではない。本明細書中、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、及びそれらの変形の使用は、その語の後に列挙される項目及びそれらの等価物ならびにさらなる項目を包含するものとする。
本発明の態様は、ウイルスを精製するプロセスに関する。精製ウイルス調製物が望まれるウイルスであればどれでも、本発明の態様に適合することができる。「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ウイルス性粒子」、及び「ビリオン」という用語は、同義で使用することができ、タンパク質コート（カプシド）、及び任意で脂質エンベロープに取り囲まれた遺伝子材料を含むウイルスを示す。一般に、ウイルスは、タンパク質コート内に含まれているウイルス遺伝子材料及びウイルスが感染細胞（宿主細胞）中でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生する方法に基づいて、分類することができる。図１８を参照。例えば、ウイルスは、ＤＮＡウイルスでもＲＮＡウイルスでもよい。実施形態によっては、ウイルスは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）である。レトロウイルスとは、複製中に中間体を通じて自身の核酸を逆転写するウイルスを意味する。実施形態によっては、ウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルス、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルス、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルス、ポジティブ一本鎖ＲＮＡ（＋ｓｓＲＮＡ）ウイルス、ネガティブ一本鎖ＲＮＡ（−ｓｓＲＮＡ）ウイルス、一本鎖ＲＮＡレトロウイルス（ｓｓＲＮＡ−ＲＴ）、または二本鎖ＤＮＡレトロウイルス（ｄｓＤＮＡ−ＲＴ）である。
ウイルスは、ウイルスが感染することができる宿主細胞の型に基づいて分類することもできる。本明細書中使用される場合、ウイルスが細胞に進入し、複製し、細胞から放出されることが可能な場合、そのウイルスはその細胞に感染できる。実施形態によっては、ウイルスは、死んでいてもよくまたは不活性化ウイルスであってもよい。そのような例では、もしウイルスが死んでいないまたは不活性化していなければ、そのウイルスは進入、複製、放出が可能であると思われる場合に、そのウイルスは、宿主細胞に感染できると見なされる。実施形態によっては、ウイルスは、真核生物細胞に感染できる。実施形態によっては、ウイルスは、動物ウイルスである（すなわち、動物細胞に感染できる）。他の実施形態において、ウイルスは、植物ウイルスである（すなわち、植物細胞に感染できる）。
本明細書中記載されるプロセスは、生ウイルスまたは死菌もしくは不活性化ウイルスを精製するために使用することができる。実施形態によっては、ウイルスは、弱毒生ウイルスである。例えば、ウイルスは、野生型ウイルスと比較して、感染性低下、病原性低下、及び／または宿主での複製減少を有する場合がある。他の実施形態において、ウイルスは、野生型ウイルスと比較して、感染性向上、病原性向上、及び／または宿主での複製増加を有する場合がある。実施形態によっては、ウイルスは、変異または改変ウイルスであり、例えば、ウイルスの核酸は、野生型ウイルスと比べて少なくとも１つの変異を有する場合がある。実施形態によっては、ウイルスは組換え生ウイルスであり、組換え生ウイルスとは、組換えで作り出されたものであり由来の異なる核酸を含有する場合があるウイルスを意味する。実施形態によっては、ウイルスは、剪断応力に敏感である。実施形態によっては、ウイルスは、ウイルス力価及び感染性の損失を減らすために穏やかに取り扱われる。
一般に、ウイルスは、長さが約２０ｎｍから１μｍ超までのサイズ範囲にある。本明細書中記載されるとおり、０．２μｍを通す濾過（「滅菌濾過」）が含まれるウイルス調製プロセス、特に対象への投与用ウイルス調製は、約１００ｎｍまたはフィルター孔径より大きいウイルスに関しては困難または不可能である。本明細書中記載されるプロセスは、任意のウイルスを精製するのに使用することができるが、サイズが約１００ｎｍ以上あるウイルスに特に有用な可能性がある。実施形態によっては、ウイルスは、サイズが平均で、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または約１０００ｎｍ以上ある。実施形態によっては、ウイルスは、多形性ウイルスの場合があり、多形性ウイルスとは、ウイルス集団内において、ウイルスが様々なサイズ及び／または形状で存在する可能性があることを意味する。実施形態によっては、ウイルスは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属する。実施形態によっては、ウイルスは、レトロ（Ｒｅｔｒｏ）、コロナ（Ｃｏｒｏｎａ）、フィロ（Ｆｉｌ）、ラブド（Ｒｈａｂｄｏ）、ブニア（Ｂｕｙｎａ）、オルトミクソ（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ）、パラミクソ（Ｐａｒａｍｙｘｏ）、アレナ（Ａｒｅｎａ）、ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ）、イリド（Ｉｒｉｄｏ）、バキュロ（Ｂａｃｕｌｏ）、またはポックス（Ｐｏｘ）科のウイルスである。本明細書中記載されるプロセスで使用するのに特に好適なウイルスは、麻疹ウイルス、ＨＩＶ、巨大ミミウイルス、またはヘルペスウイルスである。実施形態によっては、ウイルスは、弱毒化生命体、例えば、本明細書中記載されるウイルスのいずれかの弱毒ウイルス、例えば、弱毒麻疹ウイルスである。
本明細書中記載される本発明の態様は、ウイルスを精製する無菌プロセスに関する。本明細書中使用される場合、「無菌」という用語は、どのような混入生命体も含まない、組成物、プロセス、及び条件を示す。実施形態によっては、プロセスの各工程は、得られるウイルス調製物が、独立して複製する生命体を含まないでいられるように、無菌条件下で行われる。
本明細書中記載されるプロセスは、ウイルス調製物から不純物または混入物を除去する順次工程を通じてウイルスを精製する無菌方法を提供する。本明細書中使用される場合、「不純物」及び「混入物」は、同義で使用することができ、精製プロセス中の任意の工程でのウイルス調製物に含まれる望ましくない成分を示す。実施形態によっては、不純物または混入物は、宿主細胞ＤＮＡ及び／または宿主細胞タンパク質をはじめとする、宿主細胞またはその断片；ウイルス断片またはウイルス核酸；ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）ヌクレアーゼなどの酵素、塩；ならびに液状媒体の成分、である場合がある。「残存不純物」という用語は、精製プロセスの１つまたは複数の工程後の任意の量の残存する不純物または混入物を示す。実施形態によっては、残存不純物は、最終ウイルス調製物に残存する不純物である。
本明細書中記載されるプロセスは、精製用の複数のウイルスを含む液状媒体を用意することを含む。ウイルスは、当該分野で既知の任意の方法により産生させまたは用意することができる。例えば、ウイルスは、生きた宿主、胚卵、組織培養物、または細胞株中で、例えばＥＢ６６（登録商標）細胞株中で増殖させることにより、産生することができる。ウイルスの産生方法の選択は、様々な要因、例えば、ウイルス、及びウイルスが複製することができる宿主細胞の種類、及び望まれるウイルス産生量などに依存することになる。
ある特定の実施形態において、ウイルスは、細胞または組織培養物中で増殖する。ウイルスの進入及び複製を許容する（ウイルスに感染することができる）細胞であればなんでもウイルス増殖に使用することができる。実施形態によっては、細胞は、初代細胞である（例えば、宿主生命体から単離された細胞）。実施形態によっては、細胞は細胞株に由来する。実施形態によっては、細胞株は、哺乳類（ヒトまたは非ヒト哺乳類など）、鳥、昆虫、または植物の細胞に由来する。実施形態によっては、細胞株の細胞は、ＥＢ６６（登録商標）細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ−Ｈｉｓα細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞、２９３細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、または二倍体トリ細胞である。実施形態によっては、細胞株の細胞は、懸濁液中で成長し、付着していない細胞である。実施形態によっては、二倍体トリ細胞は、トリ幹細胞に由来する。実施形態によっては、二倍体トリ細胞は、アヒル細胞である。実施形態によっては、細胞は、ＥＢ６６（登録商標）細胞株のものである。
細胞または細胞集団でのウイルス複製後、ウイルスは、感染細胞を取り囲む液状媒体へと放出される場合がある。実施形態によっては、宿主細胞は、溶解して（例えば、酵素により、機械的に）、ウイルスを液状媒体へと放出する場合がある。ウイルスが放出される液状媒体の種類は、宿主細胞の種類及び使用したウイルス増殖方法に依存することになる。実施形態によっては、液状媒体は、血清、血漿、血液、細胞外液、尿膜液、羊水、卵黄嚢、緩衝液、または細胞もしくは組織培養培地を含有する。細胞または細胞集団の成長を支持する任意の細胞または組織培養培地を使用することができる。
実施形態によっては、細胞は、培養基材、例えばフラスコ、皿、プレート上に単層として成長する。そのような実施形態では、ウイルスは、細胞から培養培地を除去することにより、細胞から収集される。実施形態によっては、細胞を溶解してウイルスを培養培地に放出させ、培養培地を取り出してウイルスを収集する。他の実施形態において、細胞は、懸濁液中で増殖しており、細胞は浮遊しているかまたは培養基材に軽く付着しているだけである。実施形態によっては、培養基材は、回転フラスコ、震蘯フラスコ、スピンフラスコ、またはバイオリアクターが可能である。さらに他の実施形態において、細胞は、混合培地で成長しており、細胞のある一部は培養基材に付着しており、また細胞のある一部は浮遊しており付着していない。実施形態によっては、細胞及びウイルスは両方とも液状媒体中に存在する。
細胞を培養する方法は、当業者には明白である。例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍを参照。
実施形態によっては、ウイルスを含有する液状媒体は、１つまたは複数の予備精製工程に供される。実施形態によっては、１つまたは複数の予備精製工程は、例えば、１種または複数の不純物もしくは混入物の存在を減少させるために、宿主細胞またはその断片を除去するために、ウイルス収率を向上させるために、及び／または合計処理時間を短縮するために、使用される場合がある。
実施形態によっては、任意の宿主細胞またはその断片を、当該分野で既知の任意の適切な手段により、ウイルスを含む液状媒体から分離または除去することができる。実施形態によっては、宿主細胞は、液状媒体の遠心または濾過により除去される。遠心は、宿主細胞またはその断片とウイルスとの分離をもたらす速度及び期間で行うことができる。例えば、宿主細胞またはその断片はペレットを形成するが、一方でウイルスは液状媒体に残る。あるいはまたはそれに加えて、濾過方法、例えば膜濾過などを用いて、宿主細胞またはその断片をウイルス含有液状媒体から除去することができる（例えば、限外濾過）。実施形態によっては、フィルター膜は、ウイルスはフィルターを通過することができるが、宿主細胞及びその断片は膜に捕捉されて残るように選択される。
実施形態によっては、１つまたは複数の予備精製工程は、ウイルスを含む液状媒体中で宿主細胞ゲノムＤＮＡを分解することを含む。実施形態によっては、宿主細胞ゲノムＤＮＡは、酵素処理により分解される。任意のＤＮＡ分解酵素が、本明細書中記載されるプロセスと適合する可能性がある。実施形態によっては、酵素は、ヌクレアーゼである。実施形態によっては、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を分解する。ヌクレアーゼの非限定的な例として、制限なく、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ、ＤＮＡ分解酵素ＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩ、小球菌ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、ホスホジエステラーゼＩ、ホスホジエステラーゼＩＩ、ＲＮＡ分解酵素Ａ、ＲＮＡ分解酵素Ｈ、ＲＮＡ分解酵素Ｔ１、またはＴ７エンドヌクレアーゼが挙げられる。実施形態によっては、ＤＮＡ分解酵素処理は、長さが約２００塩基対を超えるＤＮＡフラグメントの存在を減少させまたは排除する。ウイルスを含む液状媒体中で核酸を分解するための酵素濃度、インキュベーション時間、及び温度は、当業者には明白である。実施形態によっては、ウイルスを含む液状媒体のイオン濃度（例えばＭｇ２＋、Ｍｎ２＋）及び／またはｐＨも、酵素活性を向上または低下させるために最適化することができる。ＤＮＡ分解酵素は、当該分野で既知の任意の供給源から単離または得ることができ、例えば、酵素は、微生物、植物、または哺乳類の酵素であっても；組換えで産生されたものであっても；及び／または市販品であってもよい。
実施形態によっては、１つまたは複数の予備精製工程は、ウイルスを含む液状媒体の限外濾過及び／または透析濾過を含む。本明細書中使用される場合、「限外濾過」は、液状媒体を、半透膜を通過させることにより、成分のサイズまたは分子量に基づいて混合物の成分を分離する方法を示す。半透膜の孔径（分子量カットオフ（ＭＷＣＯ））より大きい分子量を有する成分は、膜上に保持されるが、孔径より小さい分子量の成分は、膜を通過することができる。本明細書中使用される場合、「透析濾過」は、混合物中の成分、例えば不純物または混入物の濃度を低下させる、及び／または緩衝液を交換する方法を示す。透析濾過は、複数ある方法のうち任意のもの、例えば、連続透析濾過、不連続透析濾過、または逐次透析濾過により行うことができる。実施形態によっては、限外濾過及び透析濾過方法は、同時にまたは順次、行われる。
実施形態によっては、限外濾過及び透析濾過は、タンジェンシャルフロー濾過を用いて行われる。本明細書中使用される場合、「タンジェンシャルフロー濾過」は、「クロスフロー濾過」とも称され、これは、供給流（すなわち、ウイルス含有液状媒体）が、フィルター膜に接している濾過方法である。実施形態によっては、タンジェンシャルフロー濾過は、中空繊維膜を使用して行われる。供給流は、管状繊維中に供給され、膜のＭＷＣＯよりも小さい供給液の成分は、通過することができて流れの外に出るが、一方ＭＷＣＯよりも大きい成分は、流れの中に維持されて、装置を通じて再循環することができる。追加の液状媒体または代替緩衝液を、混合物から小さい成分が除去されるのと同じ速度で継続的に流れに加えることができ、それによりウイルスの濃度を一定に維持することができる。実施形態によっては、ウイルスを含む液状媒体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または少なくとも３０回の体積の液状媒体または代替緩衝液での交換に供される。代替緩衝液の非限定的な例として、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、または水が挙げられる。
実施形態によっては、膜のＭＷＣＯは、少なくとも５００キロダルトン（ｋＤａ）、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、または少なくとも９００ｋＤａである。実施形態によっては、膜のＭＷＣＯは、７５０ｋＤａ以上である。
本開示の態様は、ウイルスを含む液状媒体を、固相マトリクスと接触させることに関する。実施形態によっては、ウイルスを含む液状媒体は、バッチ吸着により固相マトリクスと接触する。本明細書中使用される場合、「バッチ吸着」は、固相マトリクスを、精製が望まれる分子（例えば、ウイルス）をはじめとする成分の液相混合物（例えば、ウイルスを含む液状媒体）に、加える方法を示す。実施形態によっては、固相マトリクスは、緩衝液に懸濁しており、これはスラリーと称する。固相マトリクスは、混合物中の成分を吸着する。続いて、固相マトリクス及び吸着された成分を、当該分野で既知の任意の方法、例えば遠心、濾過、または綿状沈殿などを用いて、混合物から分離することができる。実施形態によっては、精製が望まれる分子（例えば、ウイルス）が、固相マトリクスに吸着される。他の実施形態では、不純物または混入物が、固相マトリクスに吸着され、精製が望まれる分子は、液相に残ったままである。一般的なバッチ吸着方法及び考察は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｘｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに見ることができる。
実施形態によっては、固相マトリクスは、マトリクス、及び混合物の成分を結合するリガンドを含む。実施形態によっては、マトリクスは、セファロース（登録商標）またはアガロース、例えば高度に架橋したアガロースなどである。実施形態によっては、固相マトリクスは、混合物の成分を結合するリガンドを含有するリガンド活性化核、及び不活性殻を含む。実施形態によっては、不活性殻は、マトリクス及び核リガンドを取り囲み、ＭＷＣＯがある孔を有する。一般に、不活性殻の孔は、ウイルスが固相マトリクスのリガンドと結合することを防ぐとともに、ＭＷＣＯ未満のサイズの成分の進入を許容して、不活性殻に進入させ、リガンドと相互作用させる。実施形態によっては、不活性殻のＭＷＣＯは、少なくとも５００キロダルトン（ｋＤａ）、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、または少なくとも９００ｋＤａである。実施形態によっては、不活性殻のＭＷＣＯは、７００ｋＤａ以上である。実施形態によっては、不活性殻の孔は、不純物が固相マトリクスのリガンド活性化核に進入することを許容する。実施形態によっては、不純物は、リガンド活性化核と相互作用または結合する。実施形態によっては、不純物は、当該分野で既知の任意の種類の相互作用により、リガンド活性化核と相互作用または結合することができる。実施形態によっては、不純物は、カチオン、アニオン、疎水性、または混合相互作用により、リガンド活性化核と相互作用または結合することができる。
実施形態によっては、固相マトリクスのリガンドは、オクチルアミン、ジエチルアミノエチル、第四級アンモニウム、またはスルホン酸である。本明細書中記載されるプロセスと適合性がある可能性がある固相マトリクスの非限定的な例として、制限なく、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＤＥＡＥ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｑ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｓ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＴＭＡＥ、Ｈｙｘ Ｔ ＩＩ、Ｑセファロース（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗが挙げられる。実施形態によっては、固相マトリクスは、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００である。
実施形態によっては、固相マトリクスは、ウイルスを含む液状媒体と一緒にする前に、スラリーとして緩衝液に懸濁している。実施形態によっては、固相マトリクスは、最終濃度２．５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）、または７．５％（ｖ／ｖ）〜１５％（ｖ／ｖ）でスラリーとしてウイルスを含む液状媒体と一緒にされる。実施形態によっては、スラリーは、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２８％、２９％、または３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で加えられる。実施形態によっては、スラリーは、約１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で加えられる。
固相マトリクスとウイルスを含む液状媒体とを接触させる期間、温度、及び様式をはじめとする条件は、ウイルスの回収率を向上させ、不純物の結合及び液状媒体からの除去を向上させる目的で、変更することができる。実施形態によっては、固相マトリクスは、１５℃〜３０℃、例えば１７℃〜２７℃、または２０℃〜２５℃などの温度で、ウイルスを含む液状媒体と接触させられるまたはともにインキュベートされる。実施形態によっては、固相マトリクスは、室温で、ウイルスを含む液状媒体と接触させられるまたはともにインキュベートされる。実施形態によっては、固相マトリクスは、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、または３０℃の温度で、ウイルスを含む液状媒体と接触させられるまたはともにインキュベートされる。
実施形態によっては、固相マトリクスは、１〜５時間、１〜１０時間、１〜２４時間、５〜１０時間、１０〜１５時間、または１５〜２４時間の期間、ウイルスを含む液状媒体と接触させられるまたはともにインキュベートされる。実施形態によっては、固相マトリクスは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間、ウイルスを含む液状媒体と接触させられるまたはともにインキュベートされる。実施形態によっては、固相マトリクスは、約２時間、ウイルスを含む液状媒体と接触させられるまたはともにインキュベートされる。
本明細書中記載される実施形態のいずれにおいても、固相マトリクスは、当該分野で既知の任意の様式で、ウイルスを含む液状媒体と接触させるまたはともにインキュベートすることができる。例えば、固相マトリクス及びウイルスを含む液状媒体は、静置したまま、または震蘯しながら、反転させながら、振動させながら、もしくは攪拌しながら、容器中で接触させるまたはインキュベートすることができる。実施形態によっては、固相マトリクス及びウイルスを含む液状媒体は、攪拌しながらインキュベートする。
バッチ吸着後、固相マトリクス及びあらゆる結合した成分を、当該分野で既知の任意の方法、例えば、遠心、濾過、または綿状沈殿などにより、液相から除去することができる。実施形態によっては、固相マトリクス及びあらゆる結合した成分は、濾過、例えば、本明細書中記載される濾過方法のいずれかにより除去される。実施形態によっては、固相マトリクス及びあらゆる結合した成分は、少なくとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または少なくとも２．０μｍの孔径を持つ膜を用いて、膜濾過により除去される。実施形態によっては、膜の孔径は、１．０μｍ以上である。本明細書中記載されるプロセスで使用される固相マトリクスは、再生させることができ（例えば、洗浄して再滅菌する）、バッチ吸着に再度使用することができる。
本明細書中記載されるプロセスのいずれかを用いて製造したウイルス調製物は、追加の処理工程にさらに供される場合があり、そのような工程として、追加の濾過工程及び／または凍結乾燥が挙げられる。ウイルス調製物は、調製物の純度について分析に供される場合もある。例えば、ウイルス調製物は、不純物及び混入物、宿主細胞ゲノムＤＮＡ、及び／または宿主細胞タンパク質の存在についても、評価される場合がある。ウイルス調製物の純度は、当該分野で既知の任意の方法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、様々な波長での吸光度、タンパク質ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、及び／またはｑＰＣＲなどを用いて評価することができる。
実施形態によっては、ウイルス調製物は、残存不純物または混入物の量について評価される。実施形態によっては、残存不純物または混入物の量は、精製プロセスのより早い段階での不純物または混入物の量と比較される。実施形態によっては、最終ウイルス調製物の不純物の相対的減少度は、精製プロセスのより早い段階での不純物の存在に対して、６０〜９５％である。実施形態によっては、最終ウイルス調製物の不純物の相対的減少度は、約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％である。実施形態によっては、最終ウイルス調製物は、５％未満の不純物または混入物を含有する。実施形態によっては、最終ウイルス調製物は、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％未満の不純物を含有する。実施形態によっては、最終ウイルス調製物は、１％未満の不純物を含有する。
対象に投与する用の精製ウイルスを含む組成物の製造に、本明細書中記載されるプロセスのいずれかを使用することができる。実施形態によっては、対象は、哺乳類対象、例えば、ヒトまたは非ヒト動物などであり、そのような動物として、家畜、ペット、または伴侶動物が挙げられる。実施形態によっては、組成物は、ウイルスに対してまたはウイルス調製物のものと類似のウイルスに対して免疫化する必要がある対象に投与される場合がある。実施形態によっては、本明細書中記載されるプロセスを用いて精製されたウイルスを含むウイルス調製物または組成物は、ウイルスによるまたはウイルス調製物のものと類似のウイルスによる感染を治療するまたは予防するためのものである。
本明細書中記載されるプロセスを用いて精製されたウイルス調製物またはウイルス組成物は、当該分野で既知の任意の経路により対象に投与することができる。実施形態によっては、調製物または組成物は、非経口などの従来経路で投与することができる。本明細書中使用される場合、「非経口」投与として、制限なく、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、くも膜下腔内、または輸液による投与が挙げられる。
本明細書中別段の記載がない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本開示の方法及び技法は、概して、当該分野で周知の従来方法に従って行われる。一般に、本明細書中記載される、生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、ウイルス学、細胞または組織培養、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学に関して使用される命名法、ならびにそれらの技法は、当該分野で周知のものであり一般的に使用されるものである。本開示の方法及び技法は、概して、当該分野で周知の従来方法に従って行われ、様々な一般的及びより専門的な参照で記載されるとおりである。こうした参照は、別段の記載がない限り、本明細書全体にわたり言及及び説明される。
本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、実施例は、いかなる方法でもさらなる制限をかけるとして見なされるべきではない。本出願全体にわたり言及される参照（参考文献、交付済み特許、公開特許出願、及び同時係属特許出願を含む）の全ての完全な内容は、特に、本明細書中上記で参照されている教示に関して、本明細書により参照として明白に援用される。しかしながら、どの参照の引用も、その参照を先行技術として承認することを意図しない。
実施例１：ＥＢ６６細胞で産生された生麻疹ウイルスワクチン用の精製プロセスの開発
ＥＢ６６（登録商標）細胞で産生された弱毒麻疹ウイルスワクチン用の下流精製プロセスを開発した。
ＥＢ６６（登録商標）細胞で産生された弱毒麻疹ウイルスワクチン用の下流精製プロセスを開発した。
感染細胞培養培地の清澄化
細胞培養でウイルスを産生させた後、細胞を濾過して除去した。深層濾過及び膜濾過の両方、ならびに適切な分離範囲（深層濾過）及び孔径（膜濾過）を、ウイルス粒子を顕著に損失することのない細胞培養上清からの細胞除去について評価した。３μｍ／１μｍを有するコンビネーションフィルター（Ｐａｒｋｅｒ ＰＬＰＬＫ−０１ＤＤ−ＰＮＬ−Ｓ）を使用して、ウイルス粒子から細胞を分離した。濾過後、目視顕微鏡観察分析では、清澄化上清にＥＢ６６（登録商標）細胞は検出されなかった。
細胞培養でウイルスを産生させた後、細胞を濾過して除去した。深層濾過及び膜濾過の両方、ならびに適切な分離範囲（深層濾過）及び孔径（膜濾過）を、ウイルス粒子を顕著に損失することのない細胞培養上清からの細胞除去について評価した。３μｍ／１μｍを有するコンビネーションフィルター（Ｐａｒｋｅｒ ＰＬＰＬＫ−０１ＤＤ−ＰＮＬ−Ｓ）を使用して、ウイルス粒子から細胞を分離した。濾過後、目視顕微鏡観察分析では、清澄化上清にＥＢ６６（登録商標）細胞は検出されなかった。
ＤＮＡ除去
エンドヌクレアーゼＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を使用して、清澄化した収集細胞培養物上清（「収集物」）からｇＤＮＡを除去した。様々な酵素濃度、温度、及び時間を評価した。１〜２ｍＭの最小濃度のＭｇ２＋またはＭｎ２＋も、酵素とともに収集物に加えた。混合物のｐＨを、７．２〜８．０に維持した。あらゆる残存ＤＮＡの量及び大きさについて、ならびにウイルス感染性のどのような損失についても、様々な時点で試験した。
エンドヌクレアーゼＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を使用して、清澄化した収集細胞培養物上清（「収集物」）からｇＤＮＡを除去した。様々な酵素濃度、温度、及び時間を評価した。１〜２ｍＭの最小濃度のＭｇ２＋またはＭｎ２＋も、酵素とともに収集物に加えた。混合物のｐＨを、７．２〜８．０に維持した。あらゆる残存ＤＮＡの量及び大きさについて、ならびにウイルス感染性のどのような損失についても、様々な時点で試験した。
５Ｕ／ｍｌの最終酵素濃度を用いて、ＤＮＡ分解のため室温（１８〜２２℃）で一晩インキュベーション（約１２〜１６時間）した。残存ＤＮＡ含有量及びサイズを、９０、１７６、及び３１６ｂｐアンプリコンのｑＰＣＲにより分析した。これらの方法を用いて、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）の合計量を、サイズが３１７ｂｐを超えるＤＮＡについては４４０ｎｇから０．５ｎｇに、及びサイズが１７６ｂｐを超えるＤＮＡについては１４００ｎｇから２ｎｇに減少させた（表１）。
タンジェンシャルフロー濾過による麻疹ウイルスの精製
中空繊維を利用したタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）装置及び該当するプロセスパラメーターを適用して、剪断力を最小限に抑え、ウイルス外被の破壊及びウイルス感染性の損失を回避した。様々な内径（０．５〜１．０ｍｍ）及び再循環流速が１０００〜６０００ｓ−１の剪断率を有することがわかった。膜カットオフを最適化して、麻疹ウイルスを完全に保持させつつ、種々の不純物（タンパク質、ＤＮＡ断片、培地成分）は膜を通過させた。プロセスは室温で行ったので、プロセス時間も考慮に入れた。
中空繊維を利用したタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）装置及び該当するプロセスパラメーターを適用して、剪断力を最小限に抑え、ウイルス外被の破壊及びウイルス感染性の損失を回避した。様々な内径（０．５〜１．０ｍｍ）及び再循環流速が１０００〜６０００ｓ−１の剪断率を有することがわかった。膜カットオフを最適化して、麻疹ウイルスを完全に保持させつつ、種々の不純物（タンパク質、ＤＮＡ断片、培地成分）は膜を通過させた。プロセスは室温で行ったので、プロセス時間も考慮に入れた。
清澄化しＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）処理した収集物を、７５０ｋＤａ中空繊維膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、２０００ｓ−１の剪断率に相当する流速で、５〜１０倍に濃縮した。濃縮後、ＰＢＳ緩衝液を用いて約１０回の透析濾過サイクルを行い、残存不純物（例えば、培地成分、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ断片）を除去した。ウイルス安定化用（すなわち、その後の凍結乾燥用）賦形剤は、透析濾過緩衝液に直接加える、または貯蔵原液として濃縮ウイルスバルクに加えることができる。上記のプロセスで適用した条件が穏やかであるにも関わらず、ウイルス感染性の総合損失は、ほぼ１ｌｏｇＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）であった。
バッチ吸着による麻疹ウイルスの精製
限外／透析濾過工程後に適用可能な随意のバッチ吸着プロセスを開発した。異なるリガンドを持つ様々なクロマトグラフィー樹脂（カチオン、アニオン、疎水性、及び混合様式）を、麻疹ウイルスを上清に維持したままでの残存不純物（例えば、ＨＣＰ、ＤＮＡ断片）との結合について評価した。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用は、ＭＶ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質をコードする生減弱麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｔｚ株））の高回収率とともにＨＣＰのさらなる減少をもたらした。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂は、リガンド活性化核及び不活性殻で構成される。不活性殻は、大きい分子（ＭＷＣＯ約７００ｋＤａ）が殻の孔を通じて核に進入することを許容しない。したがって、より大きい分子は、上清に集められ、一方でより小さい不純物は樹脂の内部リガンドと結合する。樹脂の各ビーズの核は、疎水性であると同時に正電荷を帯びているリガンドで機能化されており、その結果、核に進入するのに十分な小ささの様々な不純物と高効率で多様式に結合する。添加後の最終スラリー濃度を、最適化して１０％ｖ／ｖにした。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００培地の添加後、残存ＨＣＰはさらに減少させることができる。興味深いことに、残存ＤＮＡ断片は、樹脂と結合しなかった。残存不純物及びウイルス感染性の評価を表１に提示する。
限外／透析濾過工程後に適用可能な随意のバッチ吸着プロセスを開発した。異なるリガンドを持つ様々なクロマトグラフィー樹脂（カチオン、アニオン、疎水性、及び混合様式）を、麻疹ウイルスを上清に維持したままでの残存不純物（例えば、ＨＣＰ、ＤＮＡ断片）との結合について評価した。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用は、ＭＶ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質をコードする生減弱麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｔｚ株））の高回収率とともにＨＣＰのさらなる減少をもたらした。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂は、リガンド活性化核及び不活性殻で構成される。不活性殻は、大きい分子（ＭＷＣＯ約７００ｋＤａ）が殻の孔を通じて核に進入することを許容しない。したがって、より大きい分子は、上清に集められ、一方でより小さい不純物は樹脂の内部リガンドと結合する。樹脂の各ビーズの核は、疎水性であると同時に正電荷を帯びているリガンドで機能化されており、その結果、核に進入するのに十分な小ささの様々な不純物と高効率で多様式に結合する。添加後の最終スラリー濃度を、最適化して１０％ｖ／ｖにした。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００培地の添加後、残存ＨＣＰはさらに減少させることができる。興味深いことに、残存ＤＮＡ断片は、樹脂と結合しなかった。残存不純物及びウイルス感染性の評価を表１に提示する。
濾過による最終仕上げ
ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂を含むまたは含まない濃縮ウイルスバルクを膜濾過することにより、最終仕上げ工程を行った。１〜２μｍの範囲の孔径を持つ膜フィルターを評価し、ウイルス粒子の回収率を評価した。
ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂を含むまたは含まない濃縮ウイルスバルクを膜濾過することにより、最終仕上げ工程を行った。１〜２μｍの範囲の孔径を持つ膜フィルターを評価し、ウイルス粒子の回収率を評価した。
（表１）精製プロセス全体を通じた不純物の除去
方法
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、不純物（例えばＨＣＰ、ＤＮＡ）に対する精製プロセス全体を通じたウイルス純度を求めた。不純物もＵＶ吸収を生じる。図２及び表２に、精製プロセス全体を通じたウイルス純度の概算を示す。不純物（主に宿主細胞タンパク質）の顕著な減少が観察された。
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、不純物（例えばＨＣＰ、ＤＮＡ）に対する精製プロセス全体を通じたウイルス純度を求めた。不純物もＵＶ吸収を生じる。図２及び表２に、精製プロセス全体を通じたウイルス純度の概算を示す。不純物（主に宿主細胞タンパク質）の顕著な減少が観察された。
ＳＥＣをＵＶ吸収（様々な波長で）及び蛍光発光（ＧＦＰに特異的）と併用してウイルス分析に適用した。簡単に述べると、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００カラム（１０×３００ｍｍ；分離範囲は最大２０Ｍｉｏ Ｄａ）で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを補充したＰＢＳ緩衝液中、流速０．５ｍＬ／分で分離を行った。ＵＶシグナルを、２１４ｎｍ、２８０ｎｍ、及び２６０ｎｍで記録した。蛍光は、ＧＦＰに特異的な波長のＥＭ５０９ｎｍ（ＥＸ３９５ｎｍ）で検出した。ウイルスサイズに関する追加データは、ＳＥＣを多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出機に接続することで得た。ウイルス粒子サイズは、ｍｉｎｉＤＡＷＮ（登録商標）ＴＲＥＯＳ（登録商標）装置（Ｗｙａｔｔ）で測定した。収集物試料の例示クロマトグラムを図６に示し、高純度ウイルス調製物を図７に示す。
（表２）図２に示したチャートのサイズ排除クロマトグラフィー分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット
定量ＥＬＩＳＡに加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により、精製プロセス全体を通じた宿主細胞タンパク質の存在及び減少を、定量的にモニタリングした（図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、及び図４Ｂ）。さらに、ウイルスタンパク質の存在を、特異的抗体を用いて検出した（図４Ｃ）。
定量ＥＬＩＳＡに加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により、精製プロセス全体を通じた宿主細胞タンパク質の存在及び減少を、定量的にモニタリングした（図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、及び図４Ｂ）。さらに、ウイルスタンパク質の存在を、特異的抗体を用いて検出した（図４Ｃ）。
簡単に述べると、減少した量の試料を、４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル上で、５０分間２００Ｖで分離させた。銀染色または無染色ゲルを、ウエスタンブロット法のためニトロセルロース膜に移した。ＨＣＰまたはウイルスタンパク質を、適切な抗体（それぞれ、抗ＥＢ６６（登録商標）−ＨＣＰ−ＩｇＧまたは抗麻疹ウイルス融合タンパク質（Ｆ））で検出した。抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を二次抗体として用いた。
ナノ粒子トラッキング解析
ＮａｎｏＳｉｇｈｔ装置を使用し、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を用いて、ウイルス粒子の濃度及びサイズを求めた。下流プロセス（ＤＳＰ）中の粒子サイズの変化は、ウイルス粒子の完全性の損失を表示するものとなり得る。ビリオンの粒子サイズは、ＮＴＡにより約１００〜４００ｎｍの範囲にあることがわかった（図５Ａ〜図５Ｂ）。サイズ分布は、均一ではなかったが、顕著な多形性を示し（文献に従って）、それでも精製全体を通じてほぼ一定したままであった。収集物及び透析濾過後のトラッキング解析グラフは、図５Ａ〜図５Ｂに示すとおり、粒子サイズ分布に目立った変化がないことを示した。
ＮａｎｏＳｉｇｈｔ装置を使用し、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を用いて、ウイルス粒子の濃度及びサイズを求めた。下流プロセス（ＤＳＰ）中の粒子サイズの変化は、ウイルス粒子の完全性の損失を表示するものとなり得る。ビリオンの粒子サイズは、ＮＴＡにより約１００〜４００ｎｍの範囲にあることがわかった（図５Ａ〜図５Ｂ）。サイズ分布は、均一ではなかったが、顕著な多形性を示し（文献に従って）、それでも精製全体を通じてほぼ一定したままであった。収集物及び透析濾過後のトラッキング解析グラフは、図５Ａ〜図５Ｂに示すとおり、粒子サイズ分布に目立った変化がないことを示した。
宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）の定量
ＥＢ６６（登録商標）由来の残存宿主細胞ＤＮＡを、ｑＰＣＲにより求めた。簡単に述べると、ＬＩＮＥ（長鎖散在反復配列）の３種の異なる部分的に重複した断片を、増幅した（９０、１７６、及び３１９ｂｐ）（例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８３：５１８−５２７を参照）。ＬＩＮＥは、アヒルゲノムに多数のコピーで存在する可変反復配列である。ＥＢ６６（登録商標）残存宿主細胞ＤＮＡの定量は、１７６ｂｐ断片の増幅により行った。その他２種のｑＰＣＲアンプリコン（９０及び３１６ｂｐ）は、ＥＢ６６（登録商標）由来の残存宿主細胞ＤＮＡのサイズ分布を求めるのに使用した。アッセイ検証から決定されるとおり、３種のアンプリコンの定量限界（ＬＯＱ）は、０．０１ｎｇ／ｍＬであり、１７６ｂｐ断片の増幅の変動係数（ＣＶ）は、２１．３％であった。
ＥＢ６６（登録商標）由来の残存宿主細胞ＤＮＡを、ｑＰＣＲにより求めた。簡単に述べると、ＬＩＮＥ（長鎖散在反復配列）の３種の異なる部分的に重複した断片を、増幅した（９０、１７６、及び３１９ｂｐ）（例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８３：５１８−５２７を参照）。ＬＩＮＥは、アヒルゲノムに多数のコピーで存在する可変反復配列である。ＥＢ６６（登録商標）残存宿主細胞ＤＮＡの定量は、１７６ｂｐ断片の増幅により行った。その他２種のｑＰＣＲアンプリコン（９０及び３１６ｂｐ）は、ＥＢ６６（登録商標）由来の残存宿主細胞ＤＮＡのサイズ分布を求めるのに使用した。アッセイ検証から決定されるとおり、３種のアンプリコンの定量限界（ＬＯＱ）は、０．０１ｎｇ／ｍＬであり、１７６ｂｐ断片の増幅の変動係数（ＣＶ）は、２１．３％であった。
宿主細胞タンパク質の評価
ＥＢ６６（登録商標）由来の残存宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の存在は、ＥＬＩＳＡで求めた。簡単に述べると、ウサギをＥＢ６６（登録商標）全細胞溶解液で免疫化することにより精製ポリクローナルウサギ抗体を得て、セファロース（登録商標）とカップリングさせたＥＢ６６−ＨＣＰを用いて親和性精製し、残存ＨＣＰの検出に使用した。マイクロタイタープレートをポリクローナル抗体でコーティングし、次いで、試験試料及び対照とともにインキュベートした。捕捉されたＥＢ６６（登録商標）タンパク質を、ビオチン化ポリクローナルウサギ二次抗体で検出した。対照チャートから得られるとおり、アッセイのダイナミックレンジは、５〜１２８０ｎｇ／ｍＬであり、アッセイのＣＶは、９．２％であった。
ＥＢ６６（登録商標）由来の残存宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の存在は、ＥＬＩＳＡで求めた。簡単に述べると、ウサギをＥＢ６６（登録商標）全細胞溶解液で免疫化することにより精製ポリクローナルウサギ抗体を得て、セファロース（登録商標）とカップリングさせたＥＢ６６−ＨＣＰを用いて親和性精製し、残存ＨＣＰの検出に使用した。マイクロタイタープレートをポリクローナル抗体でコーティングし、次いで、試験試料及び対照とともにインキュベートした。捕捉されたＥＢ６６（登録商標）タンパク質を、ビオチン化ポリクローナルウサギ二次抗体で検出した。対照チャートから得られるとおり、アッセイのダイナミックレンジは、５〜１２８０ｎｇ／ｍＬであり、アッセイのＣＶは、９．２％であった。
残存ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ検出
残存ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を、市販されているＥＬＩＳＡキット（ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ ＥＬＩＳＡ ＩＩ、Ａｒｔ．１．０１６８１、Ｍｅｒｃｋより）を用いて検出した。簡単に述べると、予めコーティングされたマイクロタイタープレートを使用して、残存ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を捕捉し、これをＨＲＰとカップリングした検出抗体で検出した。ＥＬＩＳＡの検出限界は、０．１ｎｇ／ｍＬであった。
残存ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を、市販されているＥＬＩＳＡキット（ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ ＥＬＩＳＡ ＩＩ、Ａｒｔ．１．０１６８１、Ｍｅｒｃｋより）を用いて検出した。簡単に述べると、予めコーティングされたマイクロタイタープレートを使用して、残存ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を捕捉し、これをＨＲＰとカップリングした検出抗体で検出した。ＥＬＩＳＡの検出限界は、０．１ｎｇ／ｍＬであった。
精製プロセスＭＶ−ＧＦＰは、宿主細胞ＤＮＡの効率的除去を示した。収集物の最初の宿主細胞ＤＮＡ含有量は、１７６ｂｐアンプリコンが１４００ｎｇ／ｍＬ及び３１７ｂｐアンプリコンが４４０ｎｇ／ｍＬであった。宿主細胞ＤＮＡは、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ処理により効率的に除去され、その後の精製工程全体を通じてほぼ一定のままであった。１７６ｂｐアンプリコンのｑＰＣＲ分析によれば、限外濾過／透析濾過後の残存宿主細胞ＤＮＡ濃度は、４ｎｇ／ｍＬ未満であった。３１７ｂｐアンプリコンにより分析されるとおり、より大きなＤＮＡフラグメントは、約１ｎｇ／ｍＬであった。バッチクロマトグラフィーの使用は、残存ＤＮＡの含有量をさらに減少させることはなかった。対象に投与される最終組成物は、少なくとも１０３ＴＣＩＤ５０／用量に調整される。ウイルス調製物のさらなる希釈（約１０６ＴＣＩＤ５０）が必要になる場合があり、そのような希釈は、宿主細胞ＤＮＡの最終含有量を約０．４〜０．０４ｎｇ／用量という推定量に低下させると思われる。
ＥＬＩＳＡにより明らかになった宿主細胞タンパク質の最終濃度は、１０μｇ／ｍＬ未満であり、これもさらに、１用量あたり１μｇ未満に低下させられると思われる。ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）ＥＬＩＳＡ ＩＩアッセイを用いたＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）の検出及び定量は、残存ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）が、精製プロセス全体を通じて効率的に除去されて、アッセイの検出限度未満（＜０．１ｎｇ／ｍＬ）の最終濃度になることを示唆する。
実施例２：バッチ吸着クロマトグラフィー工程の最適化
限外／透析濾過工程後のＭＶ−ＧＦＰ材料中の残存不純物をさらに減少させるため、吸着剤としてクロマトグラフィー樹脂を用いたバッチ吸着を開発した。バッチ吸着は、単独工程であり、適切な混合容器中、吸着剤（樹脂）をＭＶ−ＧＦＰ材料に加えること及び所定の時間インキュベートすることを含む。続いて、吸着剤を、例えば、濾過または遠心により除去する。吸着剤は、オートクレーブで吸着剤を滅菌した後、無菌でプロセスバッグに導入することができる。プロセスの流れ図を図８に示す。バッチ吸着を含むプロセスアセンブリは、図９に図示する。
限外／透析濾過工程後のＭＶ−ＧＦＰ材料中の残存不純物をさらに減少させるため、吸着剤としてクロマトグラフィー樹脂を用いたバッチ吸着を開発した。バッチ吸着は、単独工程であり、適切な混合容器中、吸着剤（樹脂）をＭＶ−ＧＦＰ材料に加えること及び所定の時間インキュベートすることを含む。続いて、吸着剤を、例えば、濾過または遠心により除去する。吸着剤は、オートクレーブで吸着剤を滅菌した後、無菌でプロセスバッグに導入することができる。プロセスの流れ図を図８に示す。バッチ吸着を含むプロセスアセンブリは、図９に図示する。
バッチ吸着用樹脂のスクリーニング
残存不純物を減少させるのに適した樹脂を同定するため、異なるリガンドを持つ様々なクロマトグラフィー樹脂（カチオン、アニオン、疎水性、及び混合様式）のスクリーニングを小規模で行った。試験した樹脂には、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＤＥＡＥ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｑ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｓ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＴＭＡＥ、ヒドロキシアパタイトＩＩ型、及びＱＳＦＦが含まれていた。
残存不純物を減少させるのに適した樹脂を同定するため、異なるリガンドを持つ様々なクロマトグラフィー樹脂（カチオン、アニオン、疎水性、及び混合様式）のスクリーニングを小規模で行った。試験した樹脂には、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＤＥＡＥ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｑ、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｓ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＴＭＡＥ、ヒドロキシアパタイトＩＩ型、及びＱＳＦＦが含まれていた。
異なるクロマトグラフィー樹脂それぞれを、ＰＢＳ中５０％スラリーとして調製し、限外濾過／透析濾過後のＭＶ−ＧＦＰ収集物に１０％ｖ／ｖで加えた。全ての試料を、４℃で一晩インキュベートした。樹脂を遠心で除去した。上清を、実施例１に記載されるとおり、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂は、ＭＶ−ＧＦＰの高回収率を維持しつつ、残存不純物（ＨＣＰ）の顕著な減少を示した（表３）。
（表３）固相マトリクスを選択するための、クロマトグラフィー樹脂のスクリーニング
ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００とＱＳＦＦ、及びＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００とヒドロキシアパタイト（Ｈｙｘ Ｔ ＩＩ）を含む樹脂の併用も評価した。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００及び併用物それぞれの５０％スラリーをＰＢＳで調製し、ＵＦ／ＤＦ ＭＶ−ＧＦＰ収集物に１０％ｖ／ｖで加えた。試料を室温で２時間インキュベートした。樹脂を遠心で除去し、上清をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂の使用は、ＭＶ−ＧＦＰの高回収率を維持しつつ、残存不純物（ＨＣＰ）の減少をもたらしたが、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００とＱＳＦＦ及びＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００とＨｙｘの併用は、残存不純物の減少もＭＶ−ＧＦＰの回収も改善しなかった（図１０）。
ウイルス試料に加えるＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００の量を最適化した。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００スラリー（ＰＢＳ中５０％）を、３３％（ｖ／ｖ）〜２．５％（ｖ／ｖ）の濃度で試験した。簡単に述べると、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００スラリーを、限外濾過／透析濾過ＭＶ−ＧＦＰ収集物に加え、室温で２時間インキュベートした。樹脂を遠心で除去し、上清をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。結果は、＞１０％（ｖ／ｖ）でスラリーを加えても、スラリーを１０％（ｖ／ｖ）で加えた場合と比較して残存不純物の減少に目立った改善はなく、しかもＭＶ−ＧＦＰ回収率に悪影響を及ぼしたことを示した（図１１）。１０％（ｖ／ｖ）未満でスラリーを加えた結果、１０％（ｖ／ｖ）の試料と比較して、不純物量はわずかに増加したものの、回収されるウイルス量が改善した（図１１）。試験したスラリーの最低濃度は２．５％（ｖ／ｖ）であり、未処理の試料と比較して、約７５％の残存不純物が除去された（図１１）。
下流処理の開発
ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００バッチ吸着の最適化後、ＭＶ−ＧＦＰ下流プロセス（ＤＳＰ）開発から得られる試料で方法を評価した。複数のＤＳＰ開発実行から得られる試料を試験した。簡単に述べると、濃縮した収集物材料を、上記の中空繊維モジュールＴＦＦプロセスを用いて濃縮し、次いで様々なサイクルの透析濾過（すなわち、５、１０、１５、及び２０回体積交換）に供した。行った実験全ての結果の概要を表４に示す。
ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００バッチ吸着の最適化後、ＭＶ−ＧＦＰ下流プロセス（ＤＳＰ）開発から得られる試料で方法を評価した。複数のＤＳＰ開発実行から得られる試料を試験した。簡単に述べると、濃縮した収集物材料を、上記の中空繊維モジュールＴＦＦプロセスを用いて濃縮し、次いで様々なサイクルの透析濾過（すなわち、５、１０、１５、及び２０回体積交換）に供した。行った実験全ての結果の概要を表４に示す。
不純物の相対減少度は、バッチ吸着なしで処理した材料と比較して６６〜９３％であった。ＭＶ調製物の純度は、５０〜７６％の範囲であり、バッチ吸着と組み合わせて２０回の透析濾過サイクル（緩衝液体積で交換する）で処理した試料で達成された。バッチ吸着で処理した材料のウイルス収率は、バッチ吸着せずに処理した各材料の収率に匹敵するものであった。
収集物材料を、濾過し、５０単位のＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）で処理して、宿主細胞ＤＮＡを消化させた。材料を、７５０ｋＤａ中空繊維モジュールを用いたＴＦＦで濃縮し、続いてＰＢＳに対して透析濾過した。濃縮材料から５、１０、１５、及び２０回体積交換後に、試料を取り出した。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００スラリーを、１０％（ｖ／ｖ）濃度で、各段階で試料に加えた。試料を室温で２時間インキュベートした。樹脂を遠心で除去し、上清を、サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した。
バッチ吸着に供された試料及びバッチ吸着に供されなかった試料のＭＶ−ＧＦＰ及び残存不純物の回収率を、図１２に示す。バッチ吸着しなかった試料に対するバッチ吸着した試料の残存不純物の相対減少度を図１３に示す。相対的ＭＶ−ＧＦＰ回収率は、試料にまたがって一定のままであったものの、残存不純物は、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００試料を用いたバッチ吸着により顕著に減少した。試料を２０回透析濾過体積交換（２０ＤＶ）及びＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂を用いたバッチ吸着で処理した場合、２０ＤＶで処理したがバッチ吸着はない試料と比較して、回収不純物の８２％の減少が達成された。
バッチ吸着ありまたはなしで処理された試料から回収されたＭＶ−ＧＦＰの総合収率を、サイズ排除クロマトグラフィーのデータを用いて計算した（図１４）。２０回の透析濾過サイクル後のＭＶ−ＧＦＰ収率は、バッチ吸着なしで処理した試料では５１％、バッチ吸着ありで処理した試料では５４％であった。
各プロセス段階後のＭＶ−ＧＦＰ材料の純度を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて定量的に評価し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いて定性的に評価した。ＭＶ−ＧＦＰ材料の純度は、バッチ吸着後、顕著に改善された（図１５及び図１６）。バッチ吸着なしで達成された最高純度が２０ＤＶ試料での２９％であった一方で、バッチ吸着を併用するとそれに匹敵する純度がたった５回の透析濾過体積交換（５ＤＶ）後にすでに達成された。これは、処理時間の大幅な短縮をもたらす。最高レベルの純度（６９％）は、バッチ吸着を併用した２０ＤＶ試料で達成された。
濃縮収集物試料と比較した場合の、バッチ吸着あり及びなしで処理された試料中の残存不純物の減少を、図１７に示す。バッチ吸着なしでは、残存不純物は、９６％またはｌｏｇ１．４で減少した。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００バッチ吸着を用いると、残存不純物は、＞９９％またはｌｏｇ２．２で減少した。
まとめると、ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂を用いたバッチ吸着は、ウイルス収率に悪影響を及ぼすことなく、残存不純物を大幅に減少させることができた。ＣＡＰＴＯ（登録商標）Ｃｏｒｅ７００樹脂を用いたバッチ吸着は、透析濾過のみでは達成することができないウイルス純度のレベルをもたらした。バッチ吸着なしで２０回の透析濾過サイクル後の純度レベルは、バッチ吸着を併用するとたった５回の透析濾過サイクルで達成された。
（表４）ＭＶバッチ吸着実験の概要
Claims (23)
- ウイルス粒子の精製プロセスであって、以下の工程：
（ａ）ウイルス粒子を含む液状媒体を用意する工程であって、該ウイルス粒子は、直径が約１００ｎｍ超である、工程；
（ｂ）該ウイルス粒子を、孔を有する不活性殻とリガンド活性化核とを含む固相マトリクスに接触させる工程であって、該孔の分子量カットオフは、該ウイルス粒子を該リガンド活性化核に進入させず、かつ該孔の該分子量カットオフより小さい分子は、該リガンド活性化核に進入することができる、工程；及び
（ｃ）濾過により、該固相マトリクスを該ウイルス粒子から分離して、最終ウイルス調製物を製造する工程
を含み、
前記固相マトリクスが、前記ウイルス粒子を含む液状媒体に、２．５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で、スラリーとして添加され、かつ、
前記プロセスのそれぞれの工程が無菌で行われる、プロセス。 - 前記ウイルス粒子を含む前記液状媒体が、工程（ｂ）の前に１つまたは複数の予備精製工程（複数可）に供される、請求項１に記載のプロセス。
- 前記ウイルス粒子は、直径が、約２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、またはそれ以上である、請求項１または２に記載のプロセス。
- 前記固相マトリクスの前記核に進入する前記分子が、７００ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記固相マトリクスの前記リガンド活性化核のリガンドが、前記リガンド活性化核に進入する前記分子を、カチオン、アニオン、疎水性、または混合相互作用を介して、結合することができる、請求項１から４のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記固相マトリクスの前記リガンド活性化核の前記リガンドが、オクチルアミンである、請求項１から５のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記固相マトリクスがスラリーとして使用され、最終濃度が、２．５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは３．３％、５％、６．６％、または１０％、最も好ましくは１０％である、請求項１から６のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記固相マトリクスが、前記ウイルス粒子を含む前記液状媒体とともに、室温（２０℃〜２５℃）で、攪拌しながら、少なくとも１時間、好ましくは２時間、３時間、または４時間、最も好ましくは２時間、インキュベートされる、請求項１から７のいずれか１項に記載のプロセス。
- 複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体に対する最終ウイルス調製物の不純物の相対的減少が、６０〜９５％の範囲にある、請求項１から８のいずれか１項に記載のプロセス。
- 請求項１の工程（ｃ）の前記濾過が、１μｍ以上の孔径を有するフィルターを用いて行われる、請求項１から９のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記予備精製工程が、以下：
（ａ）複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体中の宿主細胞ゲノムＤＮＡを、酵素処理により消化すること；及び／または
（ｂ）複数の前記ウイルスまたはウイルス粒子を含む前記液状媒体を、７５０ｋＤａ以上の孔径を有する中空繊維膜を用いて、限外／透析濾過すること
を含む、請求項２から１０のいずれか１項に記載のプロセス。 - 前記プロセスに続いて、１つまたは複数の無菌濾過工程（複数可）が行われる、請求項１から１１のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記最終ウイルス調製物の前記残存不純物が、１％未満である、請求項１から１２のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記ウイルスが、ＥＢ６６細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、Ｖｅｒｏ−αＨｉｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞株、２９３細胞株、ＰＣ１２細胞株、ＣＨＯ細胞株、３Ｔ３細胞株、ＰｅｒＣ６細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ニワトリ胚線維芽細胞細胞株、アヒル細胞株、及び二倍体トリ細胞株からなる群より選択される細胞株で増殖させたものである、請求項１から１３のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記細胞株が、アヒル細胞株である、請求項１４に記載のプロセス。
- 前記細胞株が、二倍体トリ細胞株である、請求項１４に記載のプロセス。
- 前記細胞株が、ＥＢ６６細胞株である、請求項１４に記載のプロセス。
- 前記ウイルスが、生ウイルス、弱毒生ウイルス、改変生ウイルス、または組換え生ウイルスである、請求項１から１７のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記ウイルスが、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）からなる群より選択されるウイルス科に属する、請求項１から１８のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記ウイルスが、前記パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス科に属する、請求項１９に記載のプロセス。
- 前記ウイルスが、麻疹ウイルスである、請求項２０に記載のプロセス。
- ウイルス感染に対する免疫化用の組成物を製造するための、請求項１から２１のいずれか１項に記載のプロセスの使用。
- ウイルス感染を治療及び／または予防するための組成物を製造するための請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプロセスの使用。
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