KR102542752B1 - 바이러스에 대한 무균 정제 방법 - Google Patents

바이러스에 대한 무균 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102542752B1
KR102542752B1 KR1020177032004A KR20177032004A KR102542752B1 KR 102542752 B1 KR102542752 B1 KR 102542752B1 KR 1020177032004 A KR1020177032004 A KR 1020177032004A KR 20177032004 A KR20177032004 A KR 20177032004A KR 102542752 B1 KR102542752 B1 KR 102542752B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
cell line
core
liquid medium
particles
Prior art date
Application number
KR1020177032004A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170138462A (ko
Inventor
로버트 슈레글
미하엘 베버
Original Assignee
발네바 에스이
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 발네바 에스이 filed Critical 발네바 에스이
Publication of KR20170138462A publication Critical patent/KR20170138462A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102542752B1 publication Critical patent/KR102542752B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/165—Mumps or measles virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18421—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18451—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 명세서에서 바이러스의 정제 방법 및 이의 조성물이 기재된다.

Description

바이러스에 대한 무균 정제 방법
본 개시내용은 바이러스의 정제 방법에 관한 것이다.
세계 보건 기구와 같은 규제 기관은 인간에게 투여되는 약제학적 조성물, 예컨대 백신의 생산을 위한 표준 및 가이드라인을 확립하는데, 이는 조성물의 양 및 성분을 제한한다. 예를 들어, 백신에 대해, 백신 제제는 멸균이어야 하며(즉, 독립적으로 복제하는 유기체가 없음) 요구사항 중에서도, 인간 용량 당 10ng 이하의 DNA를 함유한다. 이러한 표준은 인간 투여용 조성물의 안전성을 보장하기 위한 준비가 되어 있지만, 조성물을 생산하기 위해 사용되는 방법에 도전을 도입할 수 있다.
본 발명의 양상은 (a) 바이러스 입자를 포함하는 액체 배지를 제공하는 단계로서, 바이러스 입자는 직경이 약 100㎚ 초과인, 상기 액체 배지를 제공하는 단계; (b) 바이러스 입자를 리간드-활성화 코어, 및 기공을 포함하는 비활성 껍질을 포함하는 고체상 기질과 접촉시키는 단계로서, 상기 기공의 분자량 컷 오프는 바이러스 입자가 리간드-활성화 코어에 유입되는 것을 배제하고, 기공의 분자량 컷 오프보다 더 작은 분자는 리간드-활성화 코어에 유입될 수 있는, 상기 접촉시키는 단계; 및 (c) 바이러스 입자로부터 고체상 기질을 여과에 의해 분리시켜 최종 바이러스 제제를 생성하는 단계의 단계들을 포함하는, 바이러스 입자의 정제 방법을 제공하되; 상기 방법은 무균으로 수행된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 입자를 포함하는 액체 배지는 단계 (b) 전에 1회 이상의 사전 정제 단계(들)를 실시한다. 일부 실시형태에서, 사전 정제 단계는 (a) 복수의 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 액체 배지 내 숙주 세포 게놈 DNA를 효소 처리에 의해 분해시키는 단계; 및/또는 (b) 기공 크기가 750kDa 이상인 중공 섬유막을 이용하여 복수의 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 액체 배지를 한외여과/정용여과시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 입자는 직경이 약 200㎚, 300㎚, 400㎚, 500㎚ 이상이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 생 바이러스, 약독 생 바이러스, 변형된 생 바이러스 또는 재조합 생 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae), 플라비비리대(Flaviviridae), 필로비리대(Filoviridae), 아레나비리대(Arenaviridae), 랍도비리대(Rhabdoviridae) 및 코로나비리대(Coronaviridae)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스과에 속한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 파라믹소비리대 바이러스과(생 또는 비활성화)에 속한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 홍역 바이러스이다.
일부 실시형태에서, 고체상 기질의 코어에 유입되는 분자는 분자량이 700kDa 미만이다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질의 리간드-활성화 코어의 리간드는 양이온-, 음이온-, 소수성- 또는 혼합된 상호작용을 통해 리간드-활성화 코어에 유입되는 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질의 리간드-활성화 코어의 리간드는 옥틸아민이다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 슬러리로서 사용되고, 최종 농도가 2.5%(v/v) 내지 30%(v/v), 바람직하게는 3.3%, 5%, 6.6% 또는 10%, 가장 바람직하게는 10%에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 실온(20℃ 내지 25℃)에서 적어도 1시간, 바람직하게는 2시간, 3시간 또는 4시간, 가장 바람직하게는 2시간 동안 교반시키면서 바이러스를 포함하는 액체 배지와 함께 인큐베이션시킨다.
일부 실시형태에서, 복수의 상기 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 상기 액체 배지에 대해 상기 최종 바이러스 제제의 불순물의 상대적 감소는 60 내지 95% 범위이다. 일부 실시형태에서, 최종 바이러스 제제의 잔여 불순물은 1% 미만이다.
일부 실시형태에서, 제1항의 단계 (c)의 여과는 기공 크기가 1㎛ 이상인 필터를 이용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법 다음에 1회 이상의 무균 여과 단계(들)가 이어진다.
일부 실시형태에서, 바이러스는 EB66 세포주, Vero 세포주, Vero-αHis 세포주, HeLa 세포주, HeLa-S3 세포주, 293 세포주, PC12 세포주, CHO 세포주, 3T3 세포주, PerC6 세포주, MDSK 세포주, 닭 배아 섬유아세포 세포주, 오리 세포주, 및 이배체 조류 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 세포주에서 증식된다. 일부 실시형태에서, 상기 세포주는 오리 세포주이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포주는 이배체 조류 세포주이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포주는 EB66 세포주이다.
본 발명의 양상은 바이러스 감염에 대한 면역화를 위해 조성물을 제조하기 위한 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 용도를 제공한다.
다른 양상은 바이러스 감염을 치료하고/하거나 예방하기 위해 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 얻을 수 있는 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
수반하는 도면은 일정한 비율로 도시된 것으로 의도되지 않는다. 도면은 단지 예시적이며, 본 개시내용을 가능하게 하는데 필요하지 않다. 명확함의 목적을 위해, 모든 성분이 모든 도면에서 표지되지 않을 수도 있다. 도면에서:
도 1은 홍역 바이러스의 정제 공정의 개요를 도시한 도면.
도 2는 상이한 정제 단계에서 홍역 바이러스에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 자국을 도시한 도면. 삽도는 홍역 바이러스(좌측 피크)와 불순물(우측 피크) 둘 다에 대한 SEC 자국을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3B는 정제 방법의 다양한 단계 동안 샘플 내 숙주 세포 단백질(HCP)의 존재를 도시한 도면. 도 3A는 대표적인 은 염색 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 도 3B는 항-EB66-HCP-IgG 1차 항체를 이용하는 대표적인 웨스턴 블롯을 도시한 도면.
도 4A 내지 도 4C는 정용여과 및 벤조나제(BENZONASE)(등록상표) 처리 후에 샘플 내 HCP의 존재의 모니터링을 도시한 도면. 도 4A는 대표적인 은 염색 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 도 4B는 항-EB66-HCP-IgG 1차 항체를 이용하는 대표적인 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 4C는 항-홍역 바이러스 융합 단백질 1차 항체를 이용하는 대표적인 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 5A 및 도 5B는 정제 공정 동안 홍역 바이러스의 나노입자 추적 분석(NTA)을 제시한 도면. 도 5A는 홍역 바이러스의 채취로부터의 샘플의 NTA를 나타낸다. 도 5B는 정용여과 샘플의 NTA를 나타낸다.
도 6은 홍역 바이러스(MV-GFP)의 채취물로부터의 샘플의 크기 배제 크로마토그램(형광 신호 및 UV214nm; 우측 패널) 다중각 정적 빛 산란(MALS; 좌측 패널)에 의한 바이러스 크기 결정을 도시한 도면.
도 7은 고도로 정제된 홍역 바이러스(MV-GFP) 샘플의 크기 배제 크로마토그램(형광 신호 및 UV214㎚) 및 다중각 정적 빛 산란(MALS; 삽도)에 의한 바이러스 크기 결정을 도시한 도면.
도 8은 바이러스 제제로부터 불순물을 감소시키기 위해 한외여과/정용여과 후에 배취 흡착을 위한 흐름도를 도시한 도면.
도 9는 사전 멸균 공정 어셈블리의 개략도를 도시한 도면.
도 10은 캡토(등록상표) 코어 700 수지 또는 캡토(등록상표) 코어 700과 QSFF 수지 또는 캡토(등록상표) 코어 700과 수산화인회석(Hyx) 수지의 조합물을 이용하는 배취 흡착 후에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가되는 바와 같은 바이러스 회수 백분율(rec. MV GFP; 줄무늬) 및 불순물(민무늬 회색)을 제시한 도면.
도 11은 다양한 슬러리 농도(33% v/v 내지 2.5% v/v)에서 캡토(등록상표) 코어 700 수지를 이용하는 배취 흡착 후에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가한 바이러스 회수 백분율(rec. MV GFP; 줄무늬) 및 불순물(민무늬 회색)을 제시한 도면.
도 12는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가한 바와 같은 배취 흡착 샘플에서 바이러스 회수 백분율(rec. MV 주요 피크; 다이아몬드) 및 잔여 불순물(rec. 나머지; 정사각형)을 도시한 도면.
도 13은 흡착된 배취가 아닌 샘플에 대해 배취 흡착에 의해 진행된 샘플의 잔여 불순물에서의 상대적 감소를 도시한 도면.
도 14는 캡토(등록상표) 코어 700 배취 흡착(다이아몬드)에 의해 또는 배취 흡착 없이(정사각형) 진행된 샘플에서의 MV-GFP의 전반적인 수율을 제시한 도면.
도 15는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가한 바와 같은 정제 공정 동안 다양한 단계에서 캡토(등록상표) 코어 700 배취 흡착(다이아몬드)에 의해 또는 배취 흡착(정사각형) 없이 진행된 샘플 내 MV-GFP의 순도를 도시한 도면.
도 16은 SDS-PAGE 겔에 의해 평가한 바와 같은 정제 공정 동안 다양한 단계에서 캡토(등록상표) 코어 700 배취 흡착에 의해("w/ CC700") 또는 배취 흡착 없이("w/o CC700") 진행된 샘플 내 MV-GFP의 순도를 도시한 도면.
도 17은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가한 바와 같은 정제 공정 동안 다양한 농도에서 캡토(등록상표) 코어 700 배취 흡착(다이아몬드)에 의해 또는 배취 흡착(정사각형) 없이 진행된 샘플 내 잔여 불순물 백분율을 도시한 도면.
도 18은 다양한 바이러스과의 분류 및 특성을 나타내는 개략도를 도시한 도면(http://www.nlv.ch/Virologytutorials/Classification.htm).
본 명세서에서 바이러스의 정제를 위한 무균 방법 및 정제된 바이러스를 포함하는 조성물이 개시된다. 약제학적 조성물, 예컨대 백신 조성물의 생성에서, 대상체에 대한 투여를 위해, 조성물의 멸균 및 안전성을 보장되어야 한다. 멸균 조성물의 제조는 전형적으로 최종 조성물에 멸균 여과를 실시함으로써, 즉, 투여 전에 0.2㎛ 필터막을 통해 달성된다. 상대적으로 큰 바이러스(즉, 대략 100㎚ 이상)를 포함하는 조성물, 예컨대 바이러스 백신 조성물에 대해, 멸균 여과는 그것이 막 내에 보유된다는 것에 기인하여 바이러스의 실질적인 상실을 초래하여, 정제 공정으로부터 바이러스 수율을 감소시킬 수 있다. 추가적으로, 일부 바이러스, 예컨대 홍역 바이러스 및 전단 응력에 민감한 다른 바이러스, 정제 공정의 각각의 단계는 온화한 조건을 이용하여 수행되어 대안의 멸균 방법을 쓸모 없게 제공하여야 한다. 본 발명자들은 접선 유동 여과를 이용하는 바이러스 정제가 홍역 바이러스와 같은 상대적으로 큰 바이러스의 무균 조성물을 제조함에 있어서 충분히 성공적이지 않고 효율적이지 않다는 것을 발견하였다(미국 특허 제7,759,104호 및 본 명세서의 실시예 참조). 더 나아가, 접선 유동 여과 시스템 무균성을 유지 및 생성하는 것은 비싸며, 광대한 노력을 필요로 한다. 본 명세서에 기재된 방법은 완전한 무균성 조건 하에서 바이러스 제제를 허용하여 멸균 여과가 필요하지 않은 바이러스 제제를 생성한다.
본 발명은 다음의 설명에서 제시하거나 또는 예시한 구성 및 배열의 상세한 설명에 대한 그의 적용으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시형태가 있을 수 있고, 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본 명세서의 "포함하는(including)", "포함하는(comprising)" 또는 "갖는(having)", "함유하는(containing)", "수반하는(involving)" 및 본 명세서에서 이의 변형은 이후에 열거되는 항목 및 이의 동등물뿐만 아니라 추가적인 항목을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 양상은 바이러스를 정제하는 방법에 관한 것이다. 정제된 바이러스 제제가 요망되는 임의의 바이러스는 본 발명의 양상과 양립 가능할 수 있다. 용어 "바이러스", "바이러스 입자," "바이러스성 입자" 및 "비리온"은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 단백질 외피(캡시드), 및 선택적으로 지질 외막에 의해 둘러싸인 유전자 물질을 포함하는 바이러스를 지칭한다. 일반적으로, 바이러스는 단백질 외피 내에 함유된 바이러스 유전자 물질 및 바이러스가 감염 세포(숙주 세포)에서 전령 RNA(mRNA)를 생성할 수 있는 방법에 기반하여 분류될 수 있다, 도 18 참조. 예를 들어, 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 바이러스가 복제 동안 중간체를 통해 그의 핵산을 역전사시킨다는 것을 의미하는 레트로바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 바이러스, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 바이러스, 양성 가닥 단일 가닥 RNA(+ssRNA) 바이러스, 음성 가닥 단일 가닥 RNA(-ssRNA) 바이러스, 단일 가닥 RNA 레트로바이러스(ssRNA-RT), 또는 이중 가닥 DNA 레트로바이러스(dsDNA-RT)이다.
바이러스는 또한 그것이 감염시킬 수 있는 유형에 기반하여 분류될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 바이러스는 그것이 세포에 유입되고, 복제되며, 세포로부터 방출될 수 있다면, 세포를 감염시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 사멸 또는 비활성 바이러스일 수 있다. 이러한 예에서, 바이러스는 바이러스가 사멸 또는 비활성화되지 않는다면, 바이러스가 유입, 복제 및 방출될 수 있는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 진핵 세포를 감염시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 동물 바이러스이다(즉, 동물 세포를 감염시킬 수 있음). 다른 실시형태에서, 바이러스는 식물 바이러스이다(즉, 식물 세포를 감염시킬 수 있음).
본 명세서에 기재된 방법은 생 바이러스 또는 사멸 또는 비활성화 바이러스를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 약독 생 바이러스이다. 예를 들어, 바이러스는 야생형 바이러스에 비해 숙주에서의 감염, 독성 및/또는 복제가 감소될 수 있다. 다른 실시형태에서, 바이러스는 야생형 바이러스에 비해 숙주에서의 감염, 독성 및/또는 복제가 향상될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 돌연변이 또는 변형된 바이러스이고, 예를 들어 바이러스의 핵산은 야생형 바이러스에 비해 적어도 하나의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 재조합적으로 생성되며 상이한 공급원으로부터의 핵산을 함유할 수 있는 바이러스를 의미하는 재조합 생 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 전단응력에 민감하다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 바이러스 역가 및 감염력의 상실을 감소시키기 위해 약하게 조절된다.
일반적으로, 바이러스는 길이가 대략 20㎚로부터 1㎛ 초과인 크기의 범위에 있다. 본 명세서에 기재하는 바와 같은, 0.2㎛를 통한 여과("멸균 여과")를 수반하는 바이러스 제제 공정, 특히 대상체에 대한 투여를 위한 바이러스 제제는 필터 기공 크기보다 대략 100㎚ 이상으로 더 큰 바이러스에 대해 어렵거나 또는 가능하지 않다. 본 명세서에 기재된 방법은 임의의 바이러스를 정제하기 위해 사용될 수 있지만, 크기가 대략 100㎚ 이상인 바이러스에 대해 특히 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 크기가 평균적으로 대략 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 대략 1000㎚ 이상이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 다형성 바이러스일 수 있는데, 이는 바이러스의 집단 내에서, 바이러스가 상이한 크기 및/또는 형상으로 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 파라믹소비리대, 오르토믹소비리대, 플라비비리대, 필로비리대, 아레나비리대, 랍도비리대 또는 코로나비리대 과에 속한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 레트로, 코로나, 필(Fil), 랍도, 분야, 오르토믹소, 파라믹소, 아레나, 헤르페스, 이리도, 바큘로 또는 폭스 과로부터의 바이러스이다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 사용될 수 있는 특히 바람직한 바이러스는 홍역 바이러스, HIV, 거대 미미바이러스 또는 헤르페스 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 약독된 생 형태, 예컨대 본 명세서에 기재된 임의의 바이러스의 약독 바이러스, 예를 들어 약독된 홍역 바이러스이다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 양상은 바이러스를 정제하기 위한 무균성 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "무균성"은 임의의 오염성 생 유기체가 없는 조성물, 방법 및 조건을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 방법의 각각의 단계는 얻어진 바이러스 제제가 독립적으로 복제하는 생 유기체가 없을 수 있도록 무균성 조건 하에 수행된다.
본 명세서에 기재된 방법은 바이러스 제제로부터 불순물 또는 오염물질을 제거하는 순차적 단계를 통해 바이러스의 정제를 위한 무균성 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "불순물" 및 "오염물질"은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 정제 방법 동안의 임의의 단계에서의 바이러스 제제 내 원치않는 성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 불순물 또는 오염물질은 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 단백질을 포함하는 숙주 세포 또는 이의 단편; 바이러스 단편 또는 바이러스 핵산; 효소, 예컨대 벤조나제(등록상표) 뉴클레아제, 염; 및 액체 배지 성분일 수 있다. 용어 "잔여 불순물"은 정제 공정의 1회 이상의 단계 후에 남아있는 불순물 또는 오염물질의 임의의 양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 잔여 불순물은 최종 바이러스 제제 중에 남아있는 불순물이다.
본 명세서에 기재된 과정은 정제를 위하 복수의 바이러스를 포함하는 액체 배지를 제공하는 단계를 수반한다. 바이러스는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성되거나 또는 제공될 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 살아있는 숙주, 배아란, 조직 내, 예컨대 EB66(등록상표) 세포주 내에서 증식에 의해 생성될 수 있다. 바이러스를 생성하는 방법의 선택은 다양한 인자, 예컨대 바이러스 및 그것이 복제할 수 있는 숙주 세포의 유형 및 목적으로 하는 바이러스 생성의 양에 의존할 것이다.
특정 실시형태에서, 바이러스는 세포 또는 조직 배양물에서 증식된다. 바이러스의 유입 및 복제에 허용적인 임의의 세포(바이러스로 감염될 수 있음)는 바이러스 증식을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 1차 세포(예를 들어, 숙주 유기체로부터 단리된 세포)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 세포주로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포주는 포유류(예컨대, 인간 또는 비인간 포유류), 조류, 곤충 또는 식물의 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포주의 세포는 EB66(등록상표) 세포, Vero 세포, Vero-Hisα 세포, HeLa 세포, HeLa-S3 세포, 293 세포, PC12 세포, CHO 세포, 3T3 세포, PerC6 세포, 닭 배아 섬유아세포(CEF) 또는 이배체 조류 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포주의 세포는 현탁액 중에서 성장하고 부착되지 않는 세포이다. 일부 실시형태에서, 이배체 조류 세포는 조류 줄기 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이배체 조류 세포는 오리 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 EB66(등록상표) 세포주를 가진다.
세포 또는 세포 집단 내 바이러스 복제 후에, 바이러스는 감염 세포를 둘러싸는 액체 배지 내로 방출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 액체 배지 내로 바이러스를 방출하도록 (예를 들어, 효소적으로, 기계적으로) 용해될 수 있다. 바이러스가 방출되는 액체 배지의 유형은 숙주 세포의 유형 및 사용되는 바이러스 증식 방법에 의존할 것이다. 일부 실시형태에서, 액체 배지는 혈청, 혈장, 혈액, 세포외 유체, 요막액, 양수, 난황낭, 완충제 또는 세포 또는 조직 배양 배지를 함유한다. 세포 또는 세포 집단의 성장을 지지하는 임의의 세포 또는 조직 배양물이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 배양 기질, 예컨대 플라스크, 접시 또는 플레이트 상에서 단일층으로서 성장된다. 이러한 실시형태에서, 바이러스는 세포로부터 배양 배지를 제거함으로써 세포로부터 채취된다. 일부 실시형태에서, 세포는 배양 배지 내로 바이러스를 방출하도록 용해되고, 배양 배지는 바이러스를 채취하기 위해 수집된다. 다른 실시형태에서, 세포는 세포가 유동하거나 또는 배양 기질 상에 단지 약하게 부착되는 현탁액 중에서 성장된다. 일부 실시형태에서, 배양 기질은 롤링 플라스크, 진탕기 플라스크, 교반기 플라스크 또는 생물반응기일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 세포의 일부가 배양 기질에 부착되고 세포의 일부가 유동 및 비부착성인 혼합 배양물 중에서 성장된다. 일부 실시형태에서, 세포와 바이러스는 둘 다 액체 배지 중에서 존재한다.
세포를 배양시키기 위한 방법은 당업자에게 분명할 것이다. 예를 들어, 문헌[General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom] 참조.
일부 실시형태에서, 바이러스를 함유하는 액체 배지에 1회 이상의 사전 정제 단계가 실시된다. 일부 실시형태에서, 1회 이상의 사전 정제 단계는, 예를 들어, 1종 이상의 불순물 또는 오염물질의 존재를 감소시키고/시키거나, 숙주 세포 또는 이의 단편을 제거하고/하거나, 바이러스 수율을 향상시키고/시키거나 총 가공 시간을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 임의의 숙주 세포 또는 이의 단편은 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 바이러스를 포함하는 액체 배지로부터 분리 또는 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 액체 배지의 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다. 원심분리는 바이러스로부터 숙주 세포 또는 이의 단편의 분리를 초래하는 속도 및 지속기간으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 또는 이의 단편은 펠렛을 형성하는 반면, 바이러스는 액체 배지 내에 남아있다. 대안적으로 또는 추가로, 여과 방법, 예컨대 막 여과는 바이러스를 함유하는 액체 배지로부터 숙주 세포 또는 단편을 제거하기 위해(예를 들어, 한외여과) 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스가 필터를 통과할 수 있지만, 숙주 세포 및 이의 단편은 막 내에 트래핑된 채로 남아있도록 필터막이 선택된다.
일부 실시형태에서, 1회 이상의 사전 정제 단계는 바이러스를 포함하는 액체 배지에서 숙주 세포 게놈 DNA를 분해하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 게놈 DNA는 효소 처리에 의해 분해된다. 임의의 DNA 분해 효소는 본 명세서에 기재된 공정과 양립 가능할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소는 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 DNA와 RNA를 둘 다 분해한다. 뉴클레아제의 비제한적 예는 벤조나제(등록상표), DNA 분해효소 I, DNA 분해효소 II, Exo뉴클레아제 II, 마이크로코칼 뉴클레아제, 뉴클레아제 P1, 뉴클레아제 S1, 포스포다이에스터라제 I, 포스포다이에스터라제 II, RNA 분해효소 A, RNA 분해효소 H, RNA 분해효소 T1 또는 T7 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, DNA 분해 효소 처리는 길이가 약 200개 초과인 염기쌍의 DNA 단편의 존재를 감소시키거나 또는 제거한다. 바이러스를 포함하는 액체 배지에서 핵산을 분해하는 효소 농도, 인큐베이션 시간 및 온도는 당업자에게 분명할 것이다. 일부 실시형태에서, 이온 농도(예를 들어, Mg2+, Mn2+) 및/또는 바이러스를 포함하는 액체 배지의 pH는 또한 효소의 활성을 향상시키거나 또는 감소시키도록 최적화될 수 있다. DNA 분해 효소는 당업계에 공지된 임의의 공급원으로부터 단리되거나 또는 얻을 수 있고, 예를 들어 효소는 미생물, 식물 또는 포유류 효소일 수 있고/있거나; 재조합적으로 생성되고/되거나; 상업적으로 입수 가능하다.
일부 실시형태에서, 1회 이상의 사전 정제 단계는 바이러스를 포함하는 액체 배지의 한외여과 및/또는 정용여과를 수반한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "한외여과"는 반투과성막을 통해 액체 배지를 통과함으로써 성분의 크기 또는 분자량에 기반하여 혼합물의 성분을 분리시키는 방법을 지칭한다. 반투과성 막의 기공 크기(분자량 컷오프(MWCO))보다 더 큰 분자량을 갖는 성분은 막 상에서 보유되는 반면, 더 작은 분자량 성분이 막을 통과하도록 허용한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "정용여과"는 혼합물 및/또는 교환 완충제 중에서 성분, 예컨대 불순물 또는 오염물질의 농도를 감소시키는 방법을 지칭한다. 정용여과는 임의의 다수의 방법, 예를 들어, 연속적 정용여과, 불연속적 정용여과 또는 순차적 정용여과에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 한외여과 및 정용여과 방법은 동시에 또는 순차적으로 수행된다.
일부 실시형태에서, 한외여과 및 정용여과는 접선 유동 여과를 이용하여 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "직교류 여과"로서도 지칭되는 "접선 유동 여과"는 공급 스트림(즉, 바이러스를 함유하는 액체 배지)이 필터막에 대해 접하는 여과 방법이다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 중공 섬유막을 이용하여 수행된다. 공급 스트림 관형 섬유 내로 공급되고, 막의 MWCO보다 더 작은 공급물의 성분을 스트림을 통해 그리고 바깥으로 통과시키는 반면, 더 큰 성분은 스트림에서 유지되고, 시스템을 통해 재순환될 수 있다. 추가적인 액체 배지 또는 대안의 완충제가 혼합물의 작은 성분의 제거와 동일한 속도로 스트림에 연속적으로 첨가되고, 이에 의해 바이러스의 일관된 농도를 유지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스를 함유하는 액체 배지에 액체 배지 또는 대안의 완충제의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 적어도 30 용적 교환이 실시된다. 대안의 완충제의 비제한적 예는 인산염 완충 식염수(PBS), 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS), 얼스(Earle's) 균형 염 용액(EBSS), 행크스 균형 염 용액(HBSS) 또는 물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막의 MWCO는 적어도 500 킬로달톤(kDa), 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890 또는 적어도 900kDa이다. 일부 실시형태에서, 막의 MWCO는 750kDa 이상이다.
본 개시내용의 양상은 바이러스를 함유하는 액체 배지를 고체상 기질과 접촉시키는 단계에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 바이러스를 함유하는 액체 배지는 배취 흡착에 의해 고체상 기질과 접촉된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "배취 흡착"은 정제가 요망되는 분자(예를 들어, 바이러스)를 포함하는 성분의 액상 혼합물(예를 들어, 바이러스를 함유하는 액체 배지)에 고체상 기질이 첨가되는 방법을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 슬러리로서 지칭되는 완충제 용액 중에서 현탁된다. 고체상 기질은 혼합물의 성분을 흡착한다. 후속적으로, 고체상 기질 및 흡착된 성분은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 원심분리, 여과 또는 응집을 이용하여 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 정제가 요망되는 분자(예를 들어, 바이러스)는 고체상 기질에 흡착된다. 다른 실시형태에서, 불순물 또는 오염물질은 고체상 기질에 흡착되고, 정제가 요망되는 분자는 액상 중에 남아있다. 일반적 배취 흡착 방법 및 고려사항은, 예를 들어, 문헌[Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer Advanced Texts in Chemistry, New York, NY]에서 찾을 수 있다.
일부 실시형태에서, 고체상 기질은 혼합물의 성분에 결합하는 기질 및 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기질은 세파로스(SEPHAROSE)(등록상표) 또는 아가로스, 예컨대 고도로 가교된 아가로스이다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 혼합물 및 비활성 껍질의 성분에 결합하는 리간드를 함유하는 리간드-활성화 코어를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비활성 껍질은 기질 및 코어 리간드를 둘러싸고, MWCO를 갖는 기공을 포함한다. 일반적으로, 비활성 껍질의 기공은 고체상 기질의 리간드와 바이러스의 결합을 방지하고, 비활성 껍질에 유입되고 리간드와 상호작용하는 MWCO 미만의 크기 성분의 유입을 허용한다. 일부 실시형태에서, 비활성 껍질의 MWCO는 적어도 500 킬로달톤(kDa), 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890 또는 적어도 900 kDa이다. 일부 실시형태에서, 비활성 껍질의 MWCO는 700 kDa 이상이다. 일부 실시형태에서, 비활성 껍질의 기공은 고체상 기질의 리간드-활성화 코어 내로 불순물의 유입을 허용한다. 일부 실시형태에서, 불순물은 리간드-활성화 코어와 상호작용하거나 또는 결합한다. 일부 실시형태에서, 불순물은 당업계에 공지된 임의의 유형의 상호작용에 의해 리간드-활성화 코어와 상호작용하거나 또는 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 불순물은 양이온, 음이온, 소수성 또는 혼합된 상호작용에 의해 리간드 활성화 코어와 상호작용하거나 또는 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 고체상 기질의 리간드는 옥틸아민, 다이에틸아미노에틸, 4차 암모늄 또는 설폰산염이다. 본 명세서에 기재된 공정과 양립 가능할 수 있는 고체상 기질의 비제한적 예는 캡토(등록상표) 코어 700, 캡토(등록상표) DEAE, 캡토(등록상표) MMC, 캡토(등록상표) Q, 캡토(등록상표) S, 프락토겔(FRACTOGEL)(등록상표) TMAE, Hyx T II, Q 세파로스(등록상표) 패스트 플로(Fast Flow)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 캡토(등록상표) 코어 700이다.
일부 실시형태에서, 고체상 기질은 바이러스를 함유하는 액체 배지와 조합하기 전에 슬러리로서 완충제 용액 중에서 현탁된다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 2.5%(v/v) 내지 30%(v/v), 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 또는 7.5%(v/v) 내지 15%(v/v)의 최종 농도로 슬러리로서 바이러스를 함유하는 액체 배지와 조합된다. 일부 실시형태에서, 슬러리는 대략 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 28%, 29% 또는 30%(v/v)의 최종 농도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 슬러리는 대략 10%(v/v)의 최종 농도로 첨가된다.
지속기간, 온도 및 바이러스를 포함하는 고체상 기질과 액체 배지 사이의 접촉 방식을 포함하는 조건은 바이러스의 회수를 향상시키고, 액체 배지의 결합 및 불순물 제거를 향상시키기 위해 변화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 15℃ 내지 30℃, 예컨대 17℃ 내지 27℃, 또는 20℃ 내지 25℃의 온도에서 바이러스를 함유하는 액체 배지와 접촉되거나 또는 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 실온에서 바이러스를 함유하는 액체 배지와 접촉되거나 또는 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃ 또는 30℃의 온도에서 바이러스를 함유하는 액체 배지와 접촉되거나 또는 인큐베이션된다.
일부 실시형태에서, 고체상 기질은 1 내지 5시간, 1 내지 10시간, 1 내지 24시간, 5 내지 10시간, 10 내지 15시간, 또는 15 내지 24시간의 지속기간 동안 바이러스를 함유하는 액체 배지와 접촉되거나 또는 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 동안 바이러스를 함유하는 액체 배지와 접촉되거나 또는 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질은 대략 2시간 동안 바이러스를 함유하는 액체 배지와 접촉되거나 또는 인큐베이션된다.
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에서, 고체상 기질은 당업계에 공지된 임의의 방식에 의해 바이러스를 함유하는 액체 배지와 접촉되거나 또는 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 고체상 기질 및 바이러스를 함유하는 액체 배지는 용기 내에서 정적으로 또는 진탕, 뒤집기, 진동 또는 교반에 의해 접촉되거나 또는 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질 및 바이러스를 함유하는 액체 배지는 교반시키면서 인큐베이션한다.
배취 흡착 후에, 고체상 기질 및 임의의 결합된 성분은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 원심분리, 여과 또는 응집에 의해 액상으로부터 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질 및 임의의 결합된 성분은 본 명세서에 기재된 임의의 여과 방법과 같은 여과에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 고체상 기질 및 임의의 결합된 성분은 기공 크기가 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 적어도 2.0㎛인 막을 이용하여 막 여과에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 막의 기공 크기는 1.0㎛ 이상이다. 본 명세서에 기재된 공정에서 사용되는 고체상 기질은 재생될 수 있고(예를 들어, 세정 및 재멸균) 다시 배취 흡착을 위해 사용된다.
임의의 본 명세서에 기재된 공정을 이용하여 생성된 바이러스 제제는 추가적인 여과 단계 및/또는 동결건조를 포함하는 추가적인 가공 단계가 추가로 실시될 수 있다. 바이러스 제제는 또한 제제의 순도에 대한 분석이 실시될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 제제는 또한 불순물 및 오염물질, 숙주 세포 게놈 DNA, 및/또는 숙주 세포 단백질의 존재에 대해 평가될 수 있다. 바이러스 제제의 순도는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 상이한 파장에서 광학 밀도, 단백질 겔 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE), 웨스턴 블롯팅, ELISA, PCR, 및/또는 qPCR을 이용하여 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 제제는 잔여 불순물 또는 오염물질의 양에 대해 평가된다. 일부 실시형태에서, 잔여 불순물 또는 오염물질의 양은 정제 공정에서 더 초기에 불순물 또는 오염물질의 양과 비교된다. 일부 실시형태에서, 최종 바이러스 제제 내 불순물의 상대적 감소는 정제 공정에서 더 초기의 불순물의 존재에 비해 60 내지 95%이다. 일부 실시형태에서, 최종 바이러스 제제 내 불순물의 상대적 감소는 대략 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95%이다. 일부 실시형태에서, 최종 바이러스 제제는 5% 미만의 불순물 또는 오염물질을 함유한다. 일부 실시형태에서, 최종 바이러스 제제는 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 미만 또는 0.1% 미만의 불순물을 함유한다. 일부 실시형태에서, 최종 바이러스 제제는 1% 미만의 불순물을 함유한다.
임의의 본 명세서에 기재된 공정은 대상체에 대한 투여를 위해 정제된 바이러스를 포함하는 조성물의 제조에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유류 대상체, 예컨대 인간 또는 가축, 애완동물 또는 반려동물을 포함하는 비인간 동물이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 바이러스 또는 바이러스 제제와 유사한 바이러스에 대해 면역화가 필요한 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 공정을 이용하여 정제된 바이러스를 포함하는 바이러스 제제 또는 조성물은 바이러스 또는 바이러스 제제와 유사한 바이러스를 이용하여 감염을 치료하거나 또는 예방한다.
본 명세서에 기재된 공정을 이용하여 정제된 바이러스 제제 또는 바이러스 조성물은 당업계에 공지된 임의의 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제제 또는 조성물은 통상적인 경로를 통해, 예컨대 비경구로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "비경구" 투여는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 척추강내 또는 주입에 의해서를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 바이러스학, 세포 또는 조직 배양, 유전자 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 그리고 이들의 기법에서 사용되는 명명법은 해당 업계에서 잘 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따르며 그리고 달리 표시되지 않는 한 본 명세서 전체적으로 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 그리고 더 구체적인 참고문헌에서 기재된 바와 같다.
본 발명은 어떤 방법으로 추가로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되는 다음의 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전체적으로 인용되는 모든 참고문헌의 전체 내용(문헌 참고문헌, 발행된 특허, 공개 특허 출원 및 공동 계류 중인 특허 출원을 포함)은 본 명세서에, 특히 본 명세서에 상기 언급된 교시에 대해 참고로 명확하게 포함된다. 그러나, 임의의 참고문헌의 인용은 참고문헌이 선행 기술이라는 용인하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: EB66 세포에서 생성된 생 홍역 바이러스 백신에 대한 정제 공정의 개발
하류의 정제 공정을 EB66(등록상표) 세포 상에서 생성된 약독 홍역 바이러스 백신에 대해 진행하였다.
감염 세포 배양 배지의 정화
세포 배양물 내 바이러스의 생성 후에, 세포를 여과에 의해 제거하였다. 바이러스 입자의 상당한 상실 없이 세포 배양물 상청액으로부터 세포의 제거를 위해 심층 여과와 막 여과뿐만 아니라 적합한 분리 범위(심층 여과) 및 기공 크기(막 여과)를 평가하였다. 3㎛/1㎛를 함유하는 조합 필터(파커 PLPLK-01DD-PNL-S)를 사용하여 바이러스 입자로부터 세포를 분리시켰다. 여과 후에, 시각적 현미경 분석에 의해 정화 상청액 중에서 EB66(등록상표) 세포는 검출되지 않았다.
DNA 제거
엔도뉴클레아제 벤조나제(등록상표)를 사용하여 정화된 채취물 세포 배양 상청액("채취")으로부터 gDNA를 제거하였다. 다양한 효소 농도, 온도 및 시간을 평가하였다. 최소 농도의 1 내지 2mM Mg2 + 또는 Mn2 +를 효소와 함께 채취물에 첨가하였다. 혼합물의 pH를 7.2 내지 8.0에서 유지하였다. 임의의 남아있는 DNA의 양 및 크기뿐만 아니라 바이러스 감염의 임의의 상실을 다양한 시점에 시험하였다.
최종 효소 농도 5U/㎖를 실온(18 내지 22℃)에서 DNA 분해를 위해 밤새 인큐베이션(대략 12 내지 16시간)에서 사용하였다. 남아있는 DNA 함량 및 크기를 90, 176 및 316bp 앰플리콘에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. 이들 방법을 이용하여, 숙주 세포 DNA(HCD)의 총량은 크기가 317bp 초과인 DNA에 대해 440ng으로부터 0.5ng으로 그리고 크기가 176bp 초과인 DNA에 대해 1400ng으로부터 2ng으로 감소되었다(표 1).
접선 유동 여과에 의한 홍역 바이러스의 정제
중공 섬유 및 대응하는 공정 매개변수에 기반한 접선 유동 여과(TFF) 시스템을 적용하여 전단력을 최소화하고, 바이러스 외막의 파괴 및 바이러스 감염의 상실을 피하였다. 다양한 내강 직경(0.5 내지 1.0㎜) 및 재순환 유속은 1000 내지 6000s-1의 전단 속도를 갖는 것을 발견하였다. 홍역 바이러스의 완전한 체류를 허용하기 위해 막 컷오프를 최적화하는 한편, 다양한 불순물(단백질, DNA 단편, 배지 성분)은 막을 통과시켰다. 상기 공정을 실온에서 수행하였고, 따라서 공정 시간을 고려하였다.
정화 및 벤조나제(등록상표) 처리된 채취물을 750kDa 중공 섬유막(GE 헬스케어)을 이용하여 2000s-1의 전단 속도에 대응하는 유속으로 5 내지 10배로 농축시켰다. 농축 후에, 남아있는 불순물(예를 들어, 배지 성분, 숙주 세포 단백질(HCP), DNA 단편)을 제거하기 위해 PBS 완충제를 이용하여 대략 10회 정용여과 주기를 수행하였다. 바이러스 안정화를 위한(즉, 후속적 동결건조를 위한) 부형제를 정용여과 완충제 중에 직접 첨가하거나 또는 농축 바이러스 벌크에 저장 용액으로서 첨가할 수 있다. 상기 기재한 공정 중에 적용한 온화한 조건에도 불구하고, 바이러스 감염력의 총 상실은 거의 1 log TCID50(50% 조직 배양물 감염 용량)이었다.
배취 흡착에 의한 홍역 바이러스의 정제
한외여과/정용여과 단계 후에 적용될 수 있는 선택적 배취 흡착 공정 단계를 진행하였다. 상이한 리간드(양이온-, 음이온-, 소수성 및 혼합 방식)를 이용하는 다양한 크로마토그래피를 결합 잔여 불순물(예를 들어, HCP, DNA 단편)에 대해 평가한 한편, 홍역 바이러스를 상청액 중에서 유지시켰다. 캡토(등록상표) 코어 700 수지(GE 헬스케어(GE Healthcare))의 용도는 MV-GFP(생 약독 홍역 바이러스(슈와르츠(Schwartz) 균주) 암호화 녹색 형광 단백질)의 높은 회수와 함께 HCP의 추가적인 감소를 초래하였다. 캡토(등록상표) 코어 700 수지는 리간드-활성화 코어 및 비활성 껍질로 구성된다. 비활성 껍질은 거대 분자(MWCO 대략 700kDa)가 껍질의 기공을 통해 코어에 유입되는 것을 배제한다. 따라서 거대 분자는 상청액 중에서 수집하는 한편, 더 작은 불순물은 수지의 내부 리간드에 결합한다. 수지의 각각의 비드의 코어는 소수성으로 그리고 양으로 하전되는 리간드에 의해 기능화되어, 코어에 유입될 만큼 충분히 작은 다양한 불순물의 고도로 효율적인 다모드 결합을 초래한다. 첨가 후에 최종 슬러리 농도를 10% v/v로 최적화하였다. 캡토(등록상표) 코어 700 배지의 첨가 후에, 잔여 HCP는 추가로 감소될 수 있다. 흥미롭게도, 남아있는 DNA 단편은 수지에 결합하지 않는다. 남아있는 불순물 및 바이러스 감염력의 평가를 표 1에 제시한다.
여과에 의한 최종 연마
캡토(등록상표) 코어 700 수지와 함께 또는 이것 없이 농축 바이러스 벌크를 막 여과함으로써 최종 연마 단계를 수행하였다. 1 내지 2㎛ 범위의 기공 크기를 갖는 막 필터를 평가하고, 바이러스 입자의 회수를 평가하였다.
정제 공정 전체적으로 불순물의 제거
샘플 qPCR에 의한 hcDNA
(ng/㎖) 		ELISA에 의한 HCP
잔여 벤조나제 		바이러스 감염력
농도 		총
감염력
90 bp 176 bp 317 bp ㎍/㎖ ng/㎖ Log 10 TCID 50 /㎖ Log 10 TCID 50
MV 채취물 RG25(출발 용적 내지 1ℓ) 4003 1400 440 208 - 6.60 9.60
정화된 채취물 RG25 + 벤조나제 11 2.0 0.5 - 5 U/㎖의 첨가* 6.74 9.74
UF/DF 체류액(0.2ℓ)
(5x 농축, 10회 정용여과 주기)		 14 3.7 1.2 31 6.50 8.80
배취 흡착 후 상청액(0.22ℓ)
(최종 여과 전 약물 물질)		 14 3.8 1.2 <10 6.17 8.51
방법
크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 또한 UV 흡수를 생성하는 불순물(예를 들어, HCP, DNA)에 대해 정제 공정 전체적으로 바이러스의 순도를 결정하였다. 도 2 및 표 2는 정제 공정 전체적으로 바이러스 순도의 근사치를 제시한다. 불순물(1차 숙주 세포 단백질)의 상당한 감소를 관찰하였다.
UV 흡수(다양한 파장에서) 및 형광 방출(GFP에 특이적)과 함께 SEC를 바이러스 분석을 위해 적용하였다. 간략하게, 0.5㎖/분의 유속으로 250mM 염화나트륨으로 보충한 PBS 완충제 중의 세파크릴(Sephacryl) S500 칼럼(10 x 300㎜; 분리 범위 20 Mio Da까지) 상에서 분리를 수행하였다. UV 신호를 214㎚, 280㎚ 및 260㎚에서 기록하였다. GFP에 특이적인 EM509㎚(EX395㎚)의 파장에서 형광을 검출하였다. 다중각 정적 빛 산란(MALS) 검출기에 SEC를 연결함으로써 바이러스 사이즈에 관한 추가적인 데이터를 수집하였다. 미니DAWN(miniDAWN)(등록상표) 트레오스(TREOS)(등록상표) 기기(와이엇(Wyatt))에 의해 바이러스 입자 크기를 측정하였다. 채취 샘플의 예시적인 크로마토그램을 도 6에 나타내고, 고도로 정제된 바이러스 제제를 도 7에 나타낸다.
도 2에 제시한 자국의 크기 배제 크로마토그래피 분석
샘플 SEC에 따른 순도(214㎚)
(면적 바이러스 피크 대 총 면적)
MV 채취물 RG25 1%
정화된 채취물 RG25 + 벤조나제 3%
UF/DF 체류액
(5x 농축, 10회 정용여과 주기)		 43%
배취 흡착 후의 상청액 70%
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
정량적 ELISA에 추가로, 정제 공정 내내 숙주 세포 단백질의 ELISA 존재 및 감소를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 정성적으로 모니터링하였다(도 3A, 도 3B, 도 4A 및 도 4B). 추가적으로, 특정 항체를 이용함으로써 바이러스 단백질의 존재를 검출하였다(도 4C).
간략하게, 200V에서 50분 동안 4 내지 12% 비스 트리스(BisTris) 겔 상에서 감소된 샘플을 분리시켰다. 웨스턴 블롯팅을 위해 나이트로셀룰로스 막에 은 염색 또는 비염색 겔을 옮겼다. 적절한 항체(각각 항-EB66(등록상표)-HCP-IgG 또는 항-홍역 바이러스 융합 단백질(F))를 이용하여 HCP 또는 바이러스 단백질을 검출하였다. 항-토끼 IgG-HRP 컨쥬게이트를 2차 항체로서 사용하였다.
나노입자 추적 분석
나노사이트(NanoSight) 기기를 이용하여 바이러스 입자의 농도 및 크기를 결정하기 위해 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하였다. 하류 공정(DSP) 동안 입자 크기의 변화는 바이러스 입자 완전성의 상실을 나타낼 수 있다. 바이러스의 입자 크기는 NTA에 따라 대략 100 내지 400㎚ 범위인 것을 발견하였다(도 5A 내지 도 5B). 크기 분포는 균일하지 않고, (문헌에 따라) 상당한 다형태성을 나타냈지만 정제 전체적으로 거의 일정하게 머물러있었다. 정용여과 후에 채취물의 추적 분석 그래프는 도 5A 내지 도 5B에 도시한 바와 같은 입자 크기 분포의 상당한 변화를 나타내지 않았다.
숙주 세포 DNA(HCD)의 정량화
EB66(등록상표)로부터 잔여 숙주 세포 DNA는 qPCR에 의해 결정되었다. 간략하게, LINE(긴 산재 뉴클레오타이드 요소)의 3개의 상이한 부분적으로 중복된 단편을 증폭시켰다(90, 176 및 319bp)(예를 들어, 문헌[Walker et al., (2004) Genomics 83:518-527] 참조). LINE은 오리 게놈 내 수많은 복제물 중에 존재하는 가변적 반복 서열이다. 176bp 단편의 증폭에 의해 EB66(등록상표) 잔여 숙주 세포 DNA의 정량화를 수행하였다. 다른 두 qPCR 앰플리콘(90 및 316bp)을 사용하여 EB66(등록상표)로부터의 잔여 숙주 세포 DNA의 크기 분포를 결정하였다. 3회 증폭의 정량화 한계(LOQ)는 0.01ng/㎖이고, 176bp 단편의 증폭을 위한 변동 계수(CV)는 분석 타당성에서 결정하여 21.3%였다.
숙주 세포 단백질의 평가
EB66(등록상표)으로부터 잔여 숙주 세포 단백질(HCP)의 존재를 ELISA에 의해 결정하였다. 간략하게, EB66(등록상표) 전체 세포 용해물을 이용하여 토끼를 면역화함으로써 정제된 다클론성 토끼 항체를 얻고, 세파로스(SEPHAROSE)(등록상표)에 결합된 EB66-HCP를 이용하여 친화도 정제하고 나서, 잔여 HCP의 검출을 위해 사용하였다. 마이크로 타이터 플레이트를 다클론성 항체로 코팅하고, 이어서 시험 샘플 및 대조군과 함께 인큐베이션시켰다. 바이오틴일화된 다클론성 토끼 2차 항체를 이용하여 포획 EB66(등록상표) 단백질을 검출하였다. 분석의 역학적 범위는 5 내지 1280ng/㎖이고, 분석의 CV는 대조군 차트로부터 얻은 바와 같이 9.2%였다.
잔여 벤조나제 검출
상업적으로 입수 가능한 ELISA 키트(머렉사(Merck)로부터의 벤조나제 ELISA II, Art. 1.01681)를 이용하여 잔여 벤조나제(등록상표)를 결정하였다. 간략하게, HRP-결합 검출 항체를 이용하여 검출한 잔여 벤조나제(등록상표)를 포획하기 위해 사전 코팅된 마이크로 플레이트를 사용하였다. ELISA에 대한 검출 한계는 0.1ng/㎖였다.
정제 공정 MV-GFP는 숙주 세포 DNA의 효율적인 제거를 나타내었다. 채취물의 시작 숙주 세포 DNA 함량은 176bp 앰플리콘에 대해 1400ng/㎖이었고, 317bp 앰플리콘에 대해 440ng/㎖였다. 벤조나제 처리에 의해 숙주 세포 DNA를 효율적으로 제거하였고, 후속적 정제 단계 내내 거의 일정하게 남아있었다. 176bp 앰플리콘의 qPCR 분석에 따라, 한외여과/정용여과 후에 잔여 숙주 세포 DNA 농도는 4ng/㎖ 미만이었다. 317bp 앰플리콘에 의해 분석한 바와 같은 더 큰 DNA 단편은 대략 1ng/㎖였다. 배취 크로마토그래피의 적용은 잔여 DNA의 함량을 추가로 감소시키지 않았다. 대상체에 투여되는 최종 조성물을 적어도 103 TCID50/용량으로 조절한다. 바이러스 제제의 추가적인 희석(대략 106 TCID50)이 필요할 수 있으며, 숙주 세포 DNA의 최종 함량을 대략 0.4 내지 0.04ng/용량의 추정량으로 감소시킬 것이다.
ELISA에 의해 결정한 숙주 세포 단백질의 최종 농도는 10㎍/㎖ 미만이었고, 이는 용량 당 1㎍ 미만으로 추가로 감소될 것이다. 벤조나제(등록상표) ELISA II 분석을 이용하는 벤조나제(등록상표)의 검출 및 정량화는 잔여 벤조나제(등록상표)가 정제 공정 내내 효율적으로 제거되어, 최종 농도를 분석의 검출 한계 미만으로(<0.1ng/㎖) 생성한다는 것을 시사한다.
실시예 2: 배취 흡착 크로마토그래피 단계의 최적화
한외여과/정용여과 단계 후에 MV-GFP에서 잔여 불순물을 추가로 감소시키기 위해, 흡착제로서 크로마토그래피 수지를 이용하는 배취 흡착을 진행하였다. 배취 흡착은 단일 단계이며, 적합한 혼합 용기에서 MV-GFP 물질에 흡착제(수지)를 첨가하는 것과 정해진 시간 기간 동안 인큐베이션시키는 것을 수반한다. 후속적으로 흡착제는, 예를 들어, 여과 또는 원심분리에 의해 제거한다. 오토클레이브에 의해 흡착제의 멸균 후 공정 백(process bag) 내로 흡착제를 무균 도입할 수 있다. 공정 흐름 다이어그램을 도 8에 나타낸다. 배취 흡착을 포함하는 공정 어셈블리를 도 9에 다이어그램으로 나타낸다.
배취 흡착을 위한 수지의 선별
잔여 불순물의 감소를 위한 적합한 수지를 확인하기 위해, 상이한 리간드(양이온-, 음이온-, 소수성 및 혼합 방식)를 이용하는 다양한 크로마토그래피의 선별을 소규모로 수행하였다. 시험한 수지는 캡토(등록상표) 코어 700, 캡토(등록상표) DEAE, 캡토(등록상표) MMC, 캡토(등록상표) Q, 캡토(등록상표) S, 프락토겔(FRACTOGEL)(등록상표) TMAE, 수산화인회석 II형 및 QSFF를 포함하였다.
각각의 상이한 크로마토그래피 수지를 PBS 중에서 50% 슬러리로서 제조하고 나서, 한외여과/정용여과 후 MV-GFP 채취물에 10% v/v를 첨가하였다. 모든 샘플을 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 수지를 원심분리에 의해 제거하였다. 실시예 1에 기재한 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 상청액을 분석하였다. 캡토(등록상표) 코어 700 수지는 잔여 불순물(HCP)의 상당한 감소를 나타난 반면, MV-GFP의 높은 회수율을 유지하였다(표 3).
Figure 112017109314437-pct00001
QSFF와 함께 캡토(등록상표) 코어 700 및 수산화인회석(Hyx T II)과 함께 캡토(등록상표) 코어 700을 포함하는 수지 조합물을 평가하였다. 각각의 캡토(등록상표) 코어 700 및 조합물의 50% 슬러리를 PBS 중에서 제조하고 나서, UF/DF MV-GFP 채취물에 10% v/v을 첨가하였다. 샘플을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 수지를 원심분리에 의해 제거하고 나서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 상청액을 분석하였다. 캡토(등록상표) 코어 700 수지의 사용은 잔여 불순물(HCP)의 감소를 초래한 반면, 높은 회수율의 MV-GFP가 남아있었지만, 캡토(등록상표) 코어 700과 QSFF 및 캡토(등록상표) 코어 700과 Hyx의 조합물은 잔여 불순물의 감소도 또는 MV-GFP의 회수율도 개선시키지 않았다(도 10).
바이러스 샘플에 첨가된 캡토(등록상표) 코어 700 슬러리의 양은 또한 최적화되었다. 33%(v/v) 내지 2.5%(v/v)의 농도로 캡토(등록상표) 코어 700 슬러리(PBS 중의 50%)를 시험하였다. 간략하게, 캡토(등록상표) 코어 700 슬러리를 한외여과/정용여과 MV-GFP 채취물에 첨가하고 나서, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 수지를 원심분리에 의해 제거하고 나서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 상청액을 분석하였다. 결과는 10%(v/v) 초과의 슬러리가 10%(v/v)로 첨가된 슬러리에 비해 잔여 불순물의 감소를 상당히 개선시키지 않으며, MV-GFP 회수에 추가로 부정적으로 영향을 미친다는 것을 나타내었다(도 11). 10%(v/v) 미만의 슬러리 첨가가 회수된 불순물 양의 약간의 증가를 초래하였지만, 10%(v/v) 샘플에 비해 회수된 바이러스의 양을 개선시켰다(도 11). 시험한 가장 낮은 슬러리 농도는 2.5%(v/v)이고, 비처리 샘플에 비해 대략 75%의 잔여 불순물울 제거하였다(도 11).
하류의 공정의 진행
캡토(등록상표) 코어 700 배취 흡착의 최적화 후에, 상기 방법은 MV-GFP 하류 공정(DSP) 진행으로부터의 샘플을 이용하여 평가하였다. 몇몇 DSP 진행 실행으로부터의 샘플을 시험하였다. 간략하게, 상기 기재한 중공 섬유 모듈 TFF 공정을 이용하여 농축 채취물 물질을 농축시키고, 이어서, 다양한 주기의 정용여과를 실시하였다(즉, 5, 10, 15 및 20회 용적 변화). 모든 수행 실험 결과의 요약을 표 4에 나타낸다.
배취 흡착 없이 진행한 물질에 비해 불순물의 상대적 감소는 66 내지 93%였다. MV 제제의 순도는 50 내지 76%의 범위에 있었고, 배취 흡착과 조합된 20회 정용여과 주기(완충제 용적 교환)를 이용하여 가공한 샘플에서 수행하였다. 배취 흡착과 함께 가공한 물질의 바이러스 수율은 배취 흡착 없이 가공한 각각의 물질의 수율과 비슷하였다.
채취 물질을 여과하고 나서, 숙주 세포 DNA를 분해하기 위해 50 단위 벤조나제(등록상표)를 이용하여 처리하였다. 물질을 750kDa 중공 섬유 모듈을 이용하여 TFF에 의해 농축하고 나서, 후속적으로 PBS에 대해 정용여과하였다. 농축 물질로부터 샘플을 제거하고 나서, 다음의 5, 10, 15 및 20 용적을 교환하였다. 캡토(등록상표) 코어 700 슬러리를 각각의 단계의 샘플에 10%(v/v) 농도로 첨가하였다. 샘플을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 원심분리에 의해 수지를 제거하고 나서, 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 상청액을 분석하였다.
도 12에 제시하는 바와 같이 배취 흡착을 실시한 샘플 및 배취 흡착을 실시하지 않은 샘플 내 MV-GFP 및 잔여 불순물의 회수율. 배취 흡착이 없는 샘플에 비해 배취 흡착을 한 샘플 내 잔여 불순물의 상대적 감소를 도 13에 나타낸다. 상대적 MV-GFP 회수율은 샘플에 따라 안정하게 남아있었지만, 잔여 불순물은 캡토(등록상표) 코어 700 샘플을 이용하여 배취 흡착에 의해 상당히 감소되었다. 20 DV를 이용하여 가공하였지만 배취 흡착은 없는 샘플에 비해 샘플을 캡토(등록상표) 코어 700 수지를 이용하여 20 정용여과 용적 변화(20 DV) 및 배취 흡착으로 처리하였을 때 회수한 불순물의 82% 감소가 달성되었다.
배취 흡착과 함께 가공한 그리고 배취 흡착이 없는 샘플로부터 회수한 MV-GFP의 전반적 수율을 크기 배제 크로마토그래피로부터의 데이터를 이용하여 계산하였다(도 14). 20회 정용여과 주기 후 MV-GFP 수율은 배취 흡착 없이 가공한 샘플에서 51%였고, 배취 흡착으로 가공한 샘플에 대해 54%였다.
각각의 공정 단계 후에 MV-GFP 물질의 순도를 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정량적으로 그리고 SDS-PAGE 전기영동을 이용하여 정성적으로 평가하였다. MV-GFP 물질의 순도는 배취 흡착 후에 상당히 개선되었다(도 15 및 도 16). 배취 흡착 없이 달성된 최대 순도는 20 DV 샘플에 의해 29%이지만, 단지 5회의 배취 흡착과 조합된 정용여과 용적 변화(5 DV) 후에 상당한 순도가 이미 달성되었다. 이는 가공 시간의 상당한 감소를 제공한다. 배취 흡착과 조합된 20DV 샘플에 의해 가장 고수준의 순도(69%)가 달성되었다.
농축된 채취 샘플에 비해 배취 흡착과 함께 가공한 그리고 배취 흡착 없이 가공한 샘플 내 불순물의 감소를 도 17에 나타낸다. 배취 흡착 없이, 잔여 불순물은 96% 또는 log 1.4로 감소되었다. 캡토(등록상표) 코어 700 배취 흡착을 이용하여, 잔여 불순물은 99% 초과 또는 log 2.2로 감소되었다.
결론적으로, 캡토(등록상표) 코어 700 수지를 이용하는 배취 흡착은 바이러스 수율에 대한 부정적 영향 없이 잔여 불순물의 상당한 감소를 가능하게 하였다. 캡토(등록상표) 코어 700 수지에 의한 배취 흡착은 정용여과만을 이용하여 달성될 수 없는 바이러스 순도 수준을 초래하였다. 배취 흡착 없이 20회의 정용여과 주기 후에 순도 수준은 배취 흡착과 조합한 단지 5회의 정용여과 주기에 의해 달성되었다.
Figure 112017109314437-pct00002

Claims (23)

  1. 바이러스 입자의 정제 방법으로서,
    (a) 바이러스 입자를 포함하는 액체 배지를 제공하는 단계로서, 상기 바이러스 입자는 직경이 100㎚ 초과인, 상기 액체 배지를 제공하는 단계;
    (b) 바이러스 입자를, 리간드를 포함하는 코어 및 기공을 포함하는 껍질을 포함하는 고체상 기질과 접촉시키는 단계로서, 상기 기공의 크기는 바이러스 입자가 상기 코어에 유입되는 것을 배제하고, 상기 기공의 크기보다 더 작은 분자는 상기 코어에 유입될 수 있는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 바이러스 입자로부터 상기 고체상 기질을 여과에 의해 분리시켜 최종 바이러스 제제를 생성하는 단계를 포함하고,
    상기 고체상 기질은 슬러리로서 사용되고, 최종 농도가 2.5%(v/v) 내지 30%(v/v)에서 사용되며,
    상기 방법은 무균성으로 수행되는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (b) 전에 상기 바이러스 입자를 상기 포함하는 상기 액체 배지에 1회 이상의 사전 정제 단계(들)를 실시하는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 입자는 직경이 200㎚, 300㎚, 400㎚ 또는 500㎚ 이상인, 바이러스 입자의 정제 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 고체상 기질의 상기 코어에 유입되는 상기 분자는 분자량이 700kDa 미만인, 바이러스 입자의 정제 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 고체상 기질은 20℃ 내지 25℃의 온도에서 적어도 1시간 동안 교반시키면서 상기 바이러스 입자를 포함하는 상기 액체 배지와 함께 인큐베이션시키는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제1항의 단계 (c)의 여과는 기공 크기가 1㎛ 이상인 필터를 이용하여 수행되는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 사전 정제 단계는,
    (a) 복수의 상기 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 상기 액체 배지 내 숙주 세포 게놈 DNA를 효소 처리에 의해 분해시키는 단계; 및/또는
    (b) 기공 크기가 750kDa 이상인 중공 섬유막 이용하여 복수의 상기 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 상기 액체 배지를 한외여과 또는 정용여과시키는 단계를 포함하는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법 다음에 1회 이상의 무균 여과 단계(들)가 이어지는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 최종 바이러스 제제는 1% 미만의 잔여 불순물은 갖는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 EB66 세포주, Vero 세포주, Vero-αHis 세포주, HeLa 세포주, HeLa-S3 세포주, 293 세포주, PC12 세포주, CHO 세포주, 3T3 세포주, PerC6 세포주, MDSK 세포주, 닭 배아 섬유아세포 세포주, 오리 세포주, 및 이배체 조류 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 세포주에서 증식된, 바이러스 입자의 정제 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포주는 오리 세포주인, 바이러스 입자의 정제 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 세포주는 이배체 조류 세포주인, 바이러스 입자의 정제 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 세포주는 EB66 세포주인, 바이러스 입자의 정제 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 생 바이러스, 약독 생 바이러스, 변형된 생 바이러스 또는 재조합 생 바이러스인, 바이러스 입자의 정제 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae), 플라비비리대(Flaviviridae), 필로비리대(Filoviridae), 아레나비리대(Arenaviridae), 랍도비리대(Rhabdoviridae) 및 코로나비리대(Coronaviridae)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스과에 속하는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 바이러스는 상기 파라믹소비리대 바이러스과에 속하는, 바이러스 입자의 정제 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스는 홍역 바이러스인, 바이러스 입자의 정제 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
KR1020177032004A 2015-04-03 2016-04-04 바이러스에 대한 무균 정제 방법 KR102542752B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15248012 2015-04-03
EP15248012.5 2015-04-03
PCT/EP2016/057324 WO2016156613A1 (en) 2015-04-03 2016-04-04 Aseptic purification process for viruses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170138462A KR20170138462A (ko) 2017-12-15
KR102542752B1 true KR102542752B1 (ko) 2023-06-12

Family

ID=52823558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177032004A KR102542752B1 (ko) 2015-04-03 2016-04-04 바이러스에 대한 무균 정제 방법

Country Status (12)

Country Link
US (2) US10662412B2 (ko)
EP (1) EP3277802B1 (ko)
JP (1) JP6720288B2 (ko)
KR (1) KR102542752B1 (ko)
CN (1) CN107567496B (ko)
AU (1) AU2016239877B2 (ko)
CA (1) CA2980812A1 (ko)
DK (1) DK3277802T3 (ko)
ES (1) ES2741011T3 (ko)
HK (1) HK1248763B (ko)
PT (1) PT3277802T (ko)
WO (1) WO2016156613A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3277802T (pt) 2015-04-03 2019-07-22 Valneva Se Processo de purificação asséptica para vírus
US20210047626A1 (en) 2018-04-24 2021-02-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Scalable chromatography process for purification of human cytomegalovirus
US11690907B2 (en) 2018-06-12 2023-07-04 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
EP3806629A4 (en) 2018-06-12 2022-05-04 Kentucky Bioprocessing, Inc. VIRUS AND ANTIGEN CLEANING AND CONJUGATION
US11696948B2 (en) 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
US11529413B2 (en) 2018-06-12 2022-12-20 Kbio Holdings Limited Virus and antigen purification and conjugation
EP3581646A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 Themis Bioscience GmbH Integrated manufacturing and chromatographic system for virus production
US20210275662A1 (en) 2018-07-13 2021-09-09 Valneva Se Method for rescuing and producing a virus in avian cells
EP3914067A4 (en) * 2019-01-22 2022-11-02 2seventy bio, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR MAKING VIRAL VECTORS
CN113943291B (zh) * 2021-11-30 2023-09-08 湖北广济药业股份有限公司 一种核酸酶去除核黄素中的残留dna的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014031480A1 (en) 2012-08-24 2014-02-27 Xcellerex, Inc. Virus purification and formulation process

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1907537A4 (en) 2005-07-14 2010-11-10 Mayo Foundation PREPARATIONS BASED ON PARAMYXOVIRIDAE VIRUS
FR2967072B1 (fr) * 2010-11-05 2013-03-29 Univ Dundee Procede pour ameliorer la production de virus et semences vaccinales influenza
CN102406933A (zh) 2011-11-25 2012-04-11 成都康华生物制品有限公司 一种麻疹减毒活疫苗的制备方法
PT3277802T (pt) 2015-04-03 2019-07-22 Valneva Se Processo de purificação asséptica para vírus

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014031480A1 (en) 2012-08-24 2014-02-27 Xcellerex, Inc. Virus purification and formulation process

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VACCINE. 2014, vol. 32, no. 30, pages 3721-3724.

Also Published As

Publication number Publication date
CN107567496A (zh) 2018-01-09
US20200347364A1 (en) 2020-11-05
AU2016239877B2 (en) 2022-01-13
CN107567496B (zh) 2022-07-15
DK3277802T3 (da) 2019-07-22
US10662412B2 (en) 2020-05-26
EP3277802B1 (en) 2019-06-05
EP3277802A1 (en) 2018-02-07
JP6720288B2 (ja) 2020-07-08
US11629339B2 (en) 2023-04-18
ES2741011T3 (es) 2020-02-07
HK1248763B (zh) 2020-06-26
US20180119110A1 (en) 2018-05-03
JP2018511347A (ja) 2018-04-26
AU2016239877A1 (en) 2017-10-26
CA2980812A1 (en) 2016-10-06
PT3277802T (pt) 2019-07-22
WO2016156613A1 (en) 2016-10-06
KR20170138462A (ko) 2017-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102542752B1 (ko) 바이러스에 대한 무균 정제 방법
CN105012947B (zh) 狂犬病病毒的纯化方法
KR102364111B1 (ko) 세포 배양물로부터 폴리오바이러스의 정제 방법
KR20160096215A (ko) 바이러스 항원 및 백신의 제조 방법
CN105745218B (zh) 去除残留细胞培养杂质
EP4028511A1 (en) Inactivation process for viruses
CN112384615A (zh) 用于纯化包膜病毒的方法
CN111527202B (zh) So3色谱在病毒纯化方法中的应用
EP3784276A1 (en) Scalable chromatography process for purification of human cytomegalovirus
KR102546626B1 (ko) 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험
US8778653B2 (en) Method for reducing DNA impurities in viral compositions

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant