JPWO2014157670A1 - 液体クロマトグラフィー用カチオン交換体、その製造方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

分離、分析する対象に対する高い保持力、十分な対象の吸着容量、高い分離能及び機械強度を有し、低操作圧を有する液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を提供する。非多孔性粒子の表面に、アミノ基を有するジカルボン酸化合物がアミド結合により導入されたポリアクリル酸が固定されている液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。

Description

本発明は、分離、分析する対象に対して高い保持力、十分な対象の吸着容量、高い分離能及び機械強度を有し、低操作圧である液体クロマトグラフィー用カチオン交換体に関するものである。

液体クロマトグラフィー用のカチオン交換体には、以下の特性が要求される。
（１）試料中に含まれる塩濃度の影響を受けにくくするために、タンパク質等の対象物質（単に、対象ともいう）に対して高い保持力を有する（保持力）。
（２）微量成分の分離性能を保つために十分な対象の吸着容量を有する（吸着容量）。
（３）分離・分析精度向上のために高い分離能、選択能を有する（分離、選択能）。
（４）分離・分析時間の短縮のために速い操作流速に耐える機械強度を有する（機械的強度）。
（５）操作流速の低下を招かない低操作圧である（操作圧）。

液体クロマトグラフィー用のカチオン交換体は、交換体を構成する粒子にカチオン交換基（リガンド）を導入したものである。粒子については、上記（３）の分離、選択能の改善を目的として、粒子内拡散のない非多孔性の粒子を使用すること（非特許文献１参照）や平均粒子径が１０μｍ程度の粒子を使用することが提案されている。
平均粒子径については更なる微粒子化が進み、平均粒子径５μｍ以下の粒子を使用することが近年では提案されている。このような微粒子の使用に伴う分離・分析時間の長時間化を防止するために、より高い操作圧を負荷する必要が生じ、粒子に求められる上記（４）の機械的強度は１００ＭＰａ程度になっている。

一方、カチオン交換基としては、従来からスルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等が知られている。なかでもカルボキシル基は溶離液ｐＨによって解離度が変化しやすく、また水素結合を形成するなど特異な吸着挙動を示すため、溶離条件によって選択性が変化しやすい。
スルホン酸型の様な強カチオン交換型では、分離困難な試料の分離を成しうることから、タンパク質異性体の分離等に広く用いられている。
カルボン酸基の粒子への導入方法としては、アクリル酸、メタクリル酸等のモノマーと架橋性モノマーを共重合させる方法や、水酸基を有する架橋粒子にハロゲン化アルキルカルボン酸をアルカリにより脱塩縮合させる方法、ポリアクリル酸などの多官能カルボキシル基を有する化合物を、エポキシ基、アミノ基、水酸基等のカルボン酸と結合可能である官能基を有する粒子と、加熱又は縮合剤等を用いて導入する方法が知られている。

合成ポリマーを骨格とする非多孔性の粒子（合成ポリマー粒子）は、上記（３）の分離、選択能とともに（４）の機械的強度も達成し得るものである。そこで非多孔性のポリマー粒子に従来のようなカチオン交換基の導入方法を適用することが考えられる。しかし、合成ポリマー粒子は、一般的に、後で粒子表面にカチオン交換基を導入するための官能基を有したモノマーと、粒子の機械的強度を高めるための多官能不飽和架橋性モノマーの共重合体とを用いて製造する。そのため、粒子の機械的強度を高くするために多官能不飽和架橋性モノマーを多く使用すると、粒子表面の官能基量が減少し、粒子表面に十分な量のカチオン交換基を導入できなくなり、粒子表面のカチオン交換基密度が下がる。この結果、対象の保持力が不十分となり（上記（１）の保持力が達成できない）、さらに非多孔性であるがゆえの小表面積に起因して、特にタンパク質や核酸等の生体高分子、に対する吸着容量を大きくできず、上記（２）の吸着容量が損なわれ、対象の溶出ピークがブロード化してしまう。

このため、上記（１）の保持力や（２）の吸着容量の改善を目的として、カチオン交換能を有するビニルポリマー鎖を粒子表面にグラフトして固定する方法（特許文献１〜４参照）や、細孔内に水溶性ポリマーを固定化する方法（特許文献５参照）が提案されている。しかし、グラフトによってポリマー鎖を粒子表面に固定すると、操作圧が高くなり、上記（５）の操作圧に反して操作流速の低下を招いてしまう。また細孔内に水溶性ポリマーを固定する方法は非多孔性粒子には適用することができない。
上記（２）の吸着容量及び（５）の操作圧の改善を目的として、カルボン酸基を有する共重合ポリマーと、カルボン酸基と反応可能な官能基を有するポリマーを、粒子の表面に部分的架橋によって固定する方法も提案されている（特許文献６参照）。

しかし、この方法を、平均粒子径が５μｍ程度の微粒子に適用すると、上記（５）の要求に反して操作流速の低下を招いてしまう。導入するポリマー分子量を小さくすることにより操作圧を低減することは可能であるが、充填剤のイオン交換量が減少してしまうために、（１）の保持力や（２）の吸着容量の改善を達成することは困難である。分子量５０００程度の低分子量イオン交換ポリマーを導入した場合でも、操作圧が導入前の１．５〜２倍にまで上昇してしまい、（４）の機械的強度及び（５）の操作圧の改善が十分ではなく、またこれらの粒子を用いた充てん剤においても、さらなる（３）の分離、選択能の向上が求められている。

米国特許５４５３１８６ 米国特許３７２３３０６ 日本特公昭５７−２３６９４号公報 日本特公昭５７−５８３７３号公報 日本特開２００８−２３２７６４号公報 日本特開２００２−３０６９７４号公報

Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、 Ｊｏｕｒａｎｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ Ｖｏｌｕｍｅ３９８、１９８７、Ｐａｇｅ ３２７−３３４

上記のような状況に鑑みて、本発明の目的は、上記の（１）〜（５）の特性の向上に応えることが可能であり、特に（３）の分離、選択能の向上した液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を提供することにある。

本発明者は、鋭意研究を行った結果、実質的に非多孔性粒子の表面に、アミノ基を有するジカルボン酸化合物が導入されたポリアクリル酸が固定されている液体クロマトグラフィー用カチオン交換体が、対象に対して高い保持力、十分な対象の吸着容量、及び充分な機械強度を有する。特に抗体などの電荷異性体に対しては、高い分離性能、及び選択性を示し、低操作圧を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の要旨を有するものである。

１．非多孔性粒子の表面に、アミノ基を有するジカルボン酸化合物がアミド結合により導入されたポリアクリル酸が固定されていることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
２．前記非多孔性粒子が、体積平均粒子径５μｍ以下を有する、シリカ、ジルコニア若しくはアルミナの無機基材、又は架橋多糖若しくはビニル系モノマー架橋重合体の有機基材である、上記１に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
３．前記有機基材が、単官能性ビニルモノマーと多官能性ビニルモノマーの共重合体である、上記２に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
４．前記ポリアクリル酸は、分子量が５、０００以上２０、０００以下である、上記１に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
５．前記アミノ基を有するジカルボン酸化合物が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である上記１に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
６．前記カチオン交換体のイオン交換容量が、１０〜５０μ当量／ｍＬである上記１に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。

７．非多孔性粒子が有する官能基と、ポリアクリル酸に含まれるカルボン酸とを反応させて、非多孔性粒子の表面にポリアクリル酸を導入し、前記ポリアクリル酸が導入された粒子とアミノ基を有するジカルボン酸化合物とを反応させる、上記１乃至６のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を製造する方法。
８．前記非多孔性粒子が、平均粒子径が５μｍ以下の、シリカ、ジルコニア若しくはアルミナの無機基材、又は架橋多糖若しくはビニル系モノマー架橋体の有機基材である、上記(７)に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を製造する方法。
９．溶媒として水を使用する、上記７又は８に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を製造する方法。

１０．前記ポリアクリル酸の導入の触媒として、さらにアミド化縮合剤又はアルカリを用いる、上記７乃至９のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を製造する方法。
１１．前記ポリアクリル酸が導入された粒子と、アミノ基を有するジカルボン酸化合物とを反応させる触媒として、さらにアミド化縮合剤を用いる、上記７乃至１０のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を製造する方法。
１２．前記アミド化縮合剤が、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモリホニウム クロリドである、上記（１１）に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を製造する方法。

１３．上記１乃至６のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を充填して成る液体クロマトグラフィー用カラム。
１４．上記１３に記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用い、イオン交換クロマトグラフィーにより抗体の電荷異性体を測定する方法。
１５．上記１３に記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用い、イオン交換クロマトグラフィーによりグリコヘモグロビンを測定する方法。

本発明のカチオン交換体は、従来のカチオン交換対と比較して、上記の（１）〜（５）の特性を改善することができ、特に（２）の吸着容量及び（３）の分離、選択能を大きく改善することができる。
本発明の粒子として、ビニルモノマー共重合体（架橋体）を使用する場合、１００ＭＰａに耐えうる機械強度が実現でき、（４）の機械的強度の改善が可能であり、また、（３）の分離、選択能及び（５）の操作圧が改善し得る。特にポリアクリル酸を導入した後、アミノ基を有するジカルボン酸を導入する手法は、ポリマー導入による操作圧増大が小さいために（５）の操作圧が改善され、より速い流速で測定できることから、（３）の分離、選択能及び（４）の機械的強度の改善ができる。

実施例１〜３及び比較例１〜４のクロマトグラムである。 実施例２及び比較例４のクロマトグラムである。 実施例１及び比較例４のクロマトグラムである。

本発明の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体は、非多孔性粒子を基材とするものである。本発明における「非多孔性」とは、微孔が一切存在しない粒子はもちろんのこと、カチオン交換体を用いて分離等を行なう対象が入り込めないサイズの孔がある粒子も含まれる。この場合の孔の平均直径は、２０Å以下が好ましく、１０Å以下がより好ましい。粒子の孔のサイズを制御する方法は、例えば米国特許第４３８２１２４号等、従来から公知である。
非多孔性粒子は、特に（３）の分離、選択能の改善を目的として、体積平均粒子径（Ｄ５０）を５μｍ以下とすることが好ましく、１．５〜３．０μｍがより好ましい。

非多孔性粒子の基材としては、例えば、無機基材（例えば、シリカ、ジルコニア、アルミナ等）や、有機基材（例えば、架橋多糖や、アクリルアミド、アクリルステル、スチレン等のビニルモノマー架橋体）であれば良い。なかでも、無機基材としては、基材の有するカチオン交換性の観点からシリカ基材が好ましく、有機基材としては、親水性及び微細孔の観点から架橋親水性（メタ）アクリル酸エステルが好ましい。
特に、有機基材の粒子は、例えば日本特公昭５８−５８０２６号や日本特開昭５３−９０９９１号に開示の、単官能ビニルモノマー（グリシジルメタクリレート、ビニルベンジルグリシジルエーテル等）と、多官能ビニルモノマー（エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、グリセンポリメタクリレート、ジビニルベンゼン等）を組み合わせた混合液の懸濁重合による方法、あるいは日本特開２００１−２７１６号に記載の、前記モノマーを組み合わせたシード重合による方法で製造できる。

有機基材の非多孔性粒子を使用する場合には、単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーの共重合体が好ましい。（４）の改善の目的では、多官能ビニルモノマーの割合を５重量％以上としたものが好ましく、１５〜３０重量％がより好ましい。上記（１）から（３）の特性の改善の目的では、充分な量のカルボン酸基の導入、及びアミノ基を有するジカルボン酸化合物が導入されたポリアクリル酸の固定のための官能基、特に好ましくはエポキシ基を確保するために、多官能性ビニルモノマーの割合は５０重量％以下とすることが好ましく、１５〜３０重量％がより好ましい。

例えば、グリシジルメタクリレート等のエポキシ基を有する単官能性ビニルモノマーと、多官能ビニルモノマーとの共重合体であれば、エポキシ基を直接利用する、あるいはエポキシ基を加水分解して開環し、水溶性の多価アルコール等で親水化を行うことにより水酸基化する等が可能である。
エポキシ基を有していない共重合体であれば、例えばエピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル等の多官能エポキシ化合物等を用いてエポキシ基を導入した後、上記と同様に反応させることが可能である。

本発明のカチオン交換体は、その表面に、カチオン交換基としてのカルボン酸基が導入されるとともに、アミノ基を有するジカルボン酸化合物がアミド結合により導入されたポリアクリル酸が固定されているものである。例えば、まず表面のエポキシ基を利用してポリアクリル酸等のポリカルボン酸ポリマーを導入し、カルボジイミド等の縮合剤を用いてアミノ基を有するジカルボン酸を、表面に導入したポリカルボン酸ポリマーに導入することで得られる。
上記（１）〜（３）及び（５）の特性を改善するために、アミノ基を有するジカルボン酸化合物がポリアクリル酸のカルボキシル基とアミド結合することにより導入されたポリアクリル酸としては、重量平均分子量が５、０００〜２０、０００の範囲のものが好ましく、５、０００〜１０，０００以下がより好ましい。分子量が小さいと（１）〜（３）の特性の改善効果が小さく、分子量が大すぎると、操作圧が上昇して、（５）の特性の改善効果が小さくなる。

アミノ基を有するジカルボン酸化合物がアミド結合により導入されたポリアクリル酸は、予めポリアクリル酸にアミノ基を有するジカルボン酸化合物を導入した後、粒子に導入することも可能である。導入効率の面からは、粒子にあらかじめポリアクリル酸を導入後、アミノ基を有するジカルボン酸化合物をカルボジイミド等のアミド化縮合剤を用いて、粒子表面の該ポリアクリル酸に導入する方法が好適である。この方法によれば、操作圧がさらに低減するという効果も得られる。
アミノ基を有するジカルボン酸化合物としては、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸を用いることが好適である。

アミノ基を有するジカルボン酸化合物は、カルボン酸のアミド化縮合剤を用いてポリアクリル酸に導入可能である。導入効率の面からは、ポリアクリル酸を粒子に導入した後、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモリホニウム クロリドの様なアミド化縮合剤を用い、アミノ基を有するジカルボン酸が溶解可能である有機溶媒／水混合の溶媒を用いて、直接アミノ基を有するジカルボン酸を導入することが好適である。
有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール等の水溶性アルコール類、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホアミド、クロロホルム等が挙げられる。

また、アミノ基を有するジカルボン酸は有機溶媒へ難溶であるため、アミド化縮合剤としては、水溶媒中での縮合が可能な、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモリホニウム クロリドを用いる方法が好適である。
また、アミノ基を有するジカルボン酸は一般的に有機溶媒へ難溶であるため、水溶媒中での縮合が可能である、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＷＳＣともいう。）等の水溶性カルボジイミドを用いる方法も好適である。カルボジイミドを用いる場合は、アミノ基を有するジカルボン酸化合物の重合を禁止するため、ポリアクリル酸のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド等の活性エステル型とした後、活性エステルと、アミノ基を有するジカルボン酸化合物とを反応させることがさらに好適である。

ポリアクリル酸もしくはアミノ基を有するジカルボン酸化合物が導入されたポリアクリル酸を粒子に導入する場合は、ポリアクリル酸の有するカルボキシル基と反応可能である官能基を粒子に付与し、結合させることにより達成できる。
カルボキシル基と反応可能である官能基としては、アミノ基、水酸基、エポキシ基等を挙げることができる。
アミノ基を有する粒子を用いた場合には、前記カルボジイミド等のアミド化縮合剤を用いる方法、水酸基を有する粒子を用いた場合には、加熱により脱水縮合する方法、またエポキシ基を有する粒子を用いた場合にはアルカリ触媒下で結合させる方法を例示できる。
アミノ基を有する粒子を用いた場合のアミド化縮合剤としては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモリホニウム クロリド、ＷＳＣ等が挙げられる。さらに、エポキシ基を有する粒子を用いた場合のアルカリ触媒としては、水酸化ナトリウム、ピリジン等が挙げられる。

反応はポリアクリル酸を溶解可能である溶媒中で実施することも可能であるが、ポリアクリル酸を揮発可能な溶媒に溶解し、粒子を分散した後、エバポレータ―等で溶媒を留去後、加熱によりポリアクリル酸のカルボン酸と粒子の有する官能基とを結合させる方法が、必ずしも触媒等を必要とせず、ポリアクリル酸を導入することが可能であり、簡便さ、導入効率の面から好適である。

ポリアクリル酸もしくはアミノ基を有するジカルボン酸化合物がアミド結合により導入されたポリアクリル酸と官能基を有する粒子とを、溶媒を留去した後、加熱して結合させる方法においては、粒子の有する官能基として水酸基又はエポキシ基を使用することが、反応条件が穏やかであり好適である。
具体的には、粒子に対して２〜１０重量％、好ましくは５〜１０重量％のポリアクリル酸もしくはアミノ基を有するジカルボン酸化合物が導入されたポリアクリル酸を水に溶解した後、溶液のｐＨを５〜１０、好ましくは６〜８に調製し、所定量の粒子を分散後、水を留去した後に加熱するのが好ましい。加熱温度は、粒子の官能基が水酸基の場合、１６０〜２００℃が好ましく、官能基がエポキシ基の場合、１１０〜１５０℃が好ましく、１時間以上加熱するのが好ましい。

ポリアクリル酸又はアミノ基を有するジカルボン酸化合物が導入されたポリアクリル酸の非多孔性粒子への固定量は、（５）の改善を目的として、カチオン交換体のカチオン交換容量が、５〜５０μ当量／ｍＬ（ｍｅｑ／Ｌ）、好ましくは２０〜４０当量／ｍＬ（ｍｅｑ／Ｌ）となる範囲で調整することが好ましい。このような固定化量の制御により、低操作圧性を備えたカチオン交換体を実現できる。

粒子の有する官能基としてエポキシ基を用いた場合には、ポリアクリル酸の固定に用いられなかったエポキシ基が残存していると、測定試料の回収率が低下する場合がある。そのためには、エポキシ基との反応が可能である化合物を用いて、残存するエポキシ基を、充てん剤と試料とのイオン交換に悪影響を及ぼさない化学構造に変換することが推奨される。エポキシ基と反応が可能である化合物としては、水、エチレングリコール、グリセリン、グルコース等の水酸基を有する多価アルコール類、ベタイン構造を与える、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、タウリン等のアミノ酸類、チオール基を有するメルカプト酢酸等を例示できる。
反応形態としては、残存するエポキシ基が試料と相互作用ができなくなれば良く、大過剰のエポキシ基に導入する化合物を用い、一般的な反応条件下で、必要に応じて触媒を用いることができる。

上記のように製造された本発明のカチオン交換体は、実質的に非多孔性粒子の表面に、アミノ基を有するジカルボン酸化合物が導入されたポリアクリル酸が固定されており、例えば液体クロマトグラフィー用のカラムに充填して、抗体、グリコヘモグロビンを含む種々のタンパク質等の生体試料の分離、精製に使用することが可能である。

以下、実施例により本発明のカチオン交換体を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定して解釈されるものではない。

［非多孔性基材の作製］
日本特許公開２００１−２７１６号に記載された方法（シード重合法）により、非多孔性粒子を製造した。
ベンジルメタクリレート３０ｇ及びメルカプト酢酸２−エチルヘキシル１．５ｇを５００ｍＬ三つ口フラスコに入れて混合し、イオン交換水を３００ｇ投入した。次いで、フラスコ内にマグネティック撹拌子を入れ、７２℃に設定したオイルバスに浸し、窒素導入管を設置して、１５０ｒｐｍで撹拌した。これとは別に、５０ｍＬ容器に過硫酸カリウム０．９ｇ及びイオン交換水３０ｇを計り取り溶解した。３０分経過後、三つ口フラスコに設置したゴム栓から、過硫酸カリウム水溶液を注射器で投入した。回転数を３００ｒｐｍとしてソープフリー乳化重合を実施した。２時間重合を継続した後、凝集分を取り除いてシード溶液を回収した。シード溶液の固形分含有率は、５．１６重量％であり、体積平均粒子径（Ｄ５０）は電子顕微鏡による測定で０．４８μｍであった。

メタクリル酸２，３エポキシプロピル６４ｇ、二メタクリル酸エチレン１６ｇ、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（商品名Ｖ−６５、和光純薬社製）０．２ｇ及びドデシル硫酸ナトリウム０．２ｇを３００ｍＬフラスコに計量し、マグネティック撹拌子を入れ、マグネティックスタラーで混合した。さらに、イオン交換水を１００ｍＬ加え、マグネティックスタラーで撹拌しながら超音波ホモジナイザーで乳化した。次いで、前記調製したシード溶液１０．７４ｇ（固形分量０．５５４ｇ）及び５０ｍＬの４重量％濃度のポリビニルアルコール水溶液を加え、１分間よく撹拌し、静置した。室温下で３０分放置後、６０℃に設定した水浴に静置し、２時間重合を行った。得られた重合液をガラスフィルターでろ過し、温水、アセトン、温水の順で洗浄して、非多孔性粒子を得た。

得られた非多孔性粒子を５００ｍＬセパラブルフラスコに入れ、イオン交換水を３００ｍＬ加え、９０℃に設定したオイルバスに浸し、撹拌しながら２４時間加熱することにより、粒子の有するエポキシ基の加水分解を行った。エポキシ基を加水分解した後の非多孔性粒子は、電子顕微鏡観察により観察したところ、体積平均粒子径が２．３μｍの揃った粒子であった。

得られた非多孔性粒子１００ｇ（水サクションドライ）、エピクロロヒドリン１０３ｇ及びイオン交換水１００ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに入れ、４５℃に設定した水浴に浸し、撹拌した。これとは別に、４８重量％水酸化ナトリウム水溶液を８８ｇ計量し、ディスポーザブル注射器に入れ、シリンジポンプに設置し、０．５ｍＬ／分の速度でセパラブルフラスコに撹拌しながら投入した。投入した後、反応を２時間継続し、反応物をガラスフィルターでろ過し、水、アセトンの順で洗浄し、通風乾燥して、エポキシ化非多孔性粒子（エポキシ当量８４０μ当量／ドライゲル（ｇ））を得た。なお、この粒子の有する細孔径はポリエチレングリコール換算で分子量２００以下であり、１０Å以下であった。

実施例１
＜ポリアクリル酸の導入＞
ポリアクリル酸（重量平均分子量５０００、和光純薬工業社製）０．７５ｇをイオン交換水５０ｍＬに溶解し、２Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８に調整した。次いで、エポキシ化非多孔性粒子１０ｇを投入し、超音波水浴で分散した後、２００ｍＬナスフラスコに入れ、エバポレータ―にて、水分を留去した。その後、１３０℃に設定したオーブンにナスフラスコを入れ、３時間加熱した後、ナスフラスコ中に５０ｍＬのイオン交換水を加えて粒子を分散した。ガラスフィルターを用いてろ過した後、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム及びイオン交換水の順で粒子を洗浄した。ジオキサン−塩酸法により、未反応エポキシ基が５５０μ当
量／ドライゲル（ｇ）確認された。

水に分散した粒子をオートクレープ中で１４０℃、３時間加熱することにより残存エポキシ基に水を付加させた。ジオキサン−塩酸法によるエポキシ基量は２０μ当量／ドライゲル（ｇ）以下となった。
粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水の順で洗浄し、０．０１Ｎ水酸化ナトリムを用いて滴定したところ、２５μ当量／ｍＬのイオン交換容量が確認された。

＜アスパラギン酸の導入＞
上記粒子のイオン交換水サクションドライを４．５ｇ計量し、４０ｍＬの遠心管に投入し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ モリホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳと記載する）（ｐＨ５．５）を用いて、３回遠心ろ過により溶媒置換した。さらに１０ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（ｐＨ５．５）を加え粒子を分散した。さらに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５４０ｍｇを加え、分散した。ＷＳＣ（ペプチド研社製）２２４ｍｇを５ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（ｐＨ５．５）に溶解し、投入後素早く撹拌した。１時間静置後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）で５回遠心ろ過により洗浄した。その後、１４ｍｍｏｌ／Ｌ濃度、ｐＨ６．５に調整したアスパラギン酸溶液２０ｍＬを投入し、分散した後、１晩静置した。得られた粒子のイオン交換容量は２７μ当量／ｍＬであった。

得られたカチオン交換体は、１０％のイオン交換水を分散液として、４．６ｍｍ内径×１００ｍｍ長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填した。得られたカラムを使用して、下記条件下で、液体クロマトグラフィーを実施して、モノクローナル抗体の分離性能を測定した。カチオン交換体の操作圧は、溶離液Ａを流速０．６ｍＬ／分で送液した時の操作圧とした。

液体クロマトグラフィー条件
溶離液Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ （ｐＨ５．５）
溶離液Ｂ：０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ｉｎ ２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ （ｐＨ５．５）
グラジエント：３７〜５７％溶離液Ｂ直線グラジエント、６０分
流速：０．６ｍＬ／分
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
対象：モノクローナル抗体 １／１０溶離液Ａ希釈液 １０μＬ
クロマトグラムは図１に示したとおりであり、比較例と比較して保持が強く、異性体間の分離性能にも優れていることが分かった。酸性側溶出ピーク１から塩基性側溶出ピーク２までの溶出時間差は１７．１分であり、広い選択性を示した。操作圧は１３．０ＭＰａと低操作圧であった。

さらに下記条件下で、液体クロマトグラフィーを実施してグリコヘモグロビンの分離性能を測定した。
液体クロマトグラフィー条件
溶離液Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）
溶離液Ｂ：０．２０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌＯ４を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）
グラジエント：０〜１００％溶離液Ｂ直線グラジエント、１０分
流速：０．６ｍＬ／分
検出：ＵＶ４１５ｎｍ
対象：ＨｂＡ１ｃキャリブレータ２（東ソー社製） ５μＬ
クロマトグラムは図３に示したとおりであり、比較例と比較し異性体の分離に優れていることが分かった。

実施例２
実施例１の＜ポリアクリル酸の固定＞と同様な方法で、ポリアクリル酸を固定した後、下記の方法でアスパラギン酸を導入した。

＜アスパラギン酸の導入＞
粒子のイオン交換水サクションドライを４．５ｇ計量し、２０ｍＬのエタノール水を加え粒子を分散した。さらに１４ｍｍｏｌ／Ｌ濃度、ｐＨ７．０に調整したアスパラギン酸水溶液２０ｍＬ、４−（４，６−ジメトキシー１，３，５―トリアジンー２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物を６０ｍｇ加え、分散した。室温にて１時間３０分攪拌した後、イオン交換水で３回遠心ろ過により洗浄した。さらに０．５Ｎ水酸化ナトリウムで３回、０．５Ｎ塩酸で３回遠心ろ過により洗浄した粒子をイオン交換水サクションドライゲルとして回収した。得られた粒子のイオン交換容量は３２μ当量／ｍＬであった。

得られたカチオン交換体は、１０％のイオン交換水を分散液として、４．６ｍｍ内径×１００ｍｍ長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填した。得られたカラムを使用して、実施例１と同様な条件で液体クロマトグラフィーを実施してモノクローナル抗体の分離性能を測定した。カチオン交換体の操作圧は、溶離液Ａを流速０．６ｍＬ／分で送液した時の操作圧とした。
クロマトグラムは図１、図２（比較例４とあわせて、溶出時間を補正した拡大比較図）に示した。比較例と比較して保持が強く、異性体間の分離性能にも優れていることが分かった。酸性側溶出ピーク１から塩基性側溶出ピーク２までの溶出時間差は２０．３分であり、広い選択性を示した。操作圧は１７．０ＭＰａと低かった。

実施例３
実施例１の＜ポリアクリル酸の固定＞と同様な方法で、ポリアクリル酸を導入後、下記の方法でグルタミン酸を導入した。

＜グルタミン酸の導入＞
粒子のイオン交換水サクションドライを４．５ｇ計量し、２０ｍＬのエタノール水を加え粒子を分散した。さらに１４ｍｍｏｌ／Ｌ濃度、ｐＨ７．０に調整したグルタミン酸水溶液２０ｍＬ、４−（４，６−ジメトキシー１，３，５―トリアジンー２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物を６０ｍｇ加え、分散した。室温にて１時間３０分攪拌した後、イオン交換水で３回遠心ろ過により洗浄した。さらに０．５Ｎ水酸化ナトリウムで３回、０．５Ｎ塩酸で３回遠心ろ過により洗浄した粒子をイオン交換水サクションドライゲルとして回収した。得られた粒子のイオン交換容量は２９μ当量／ｍＬであった。

得られたカチオン交換体は、１０％のイオン交換水を分散液として、４．６ｍｍ内径×１００ｍｍ長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填した。得られたカラムを使用して、実施例１と同様な条件で液体クロマトグラフィーを実施してモノクローナル抗体の分離性能を測定した。カチオン交換体の操作圧は、溶離液Ａを流速０．６ｍＬ／分で送液した時の操作圧とした。
クロマトグラムは図１に示したとおりであり、比較例と比較して保持が強く、異性体間の分離性能にも優れていることが分かった。酸性側溶出ピーク１から塩基性側溶出ピーク２までの溶出時間差は２５．９分であり、広い選択性を示した。操作圧は１９．０ＭＰａと低操作圧であった。

比較例１
非多孔性基材の作製で得られたエポキシ化非多孔性粒子を水に分散し、オートクレープ中で１４０℃、３時間加熱することによりエポキシ基をジオール基に変換した。サクションドライの粒子４．５ｇを８ｇのイオン交換水に分散し、３．０ｇのα―クロロ酢酸ナトリウムを加え溶解、分散した。さらに４８重量％水酸化ナトリウムを２．７ｇ加え、５５℃に設定したウォーターバス中で２時間振盪した。得られた粒子をガラスフィルターにて０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム及びイオン交換水の順で粒子を洗浄した。得られた粒子のイオン交換容量は３６μ当量／ｍＬであった。実施例１と同様に液体クロマトグラフィー用カラムに充填し、測定条件を実施例１と同様に実施し、モノクローナル抗体の分離性能を比較した。
クロマトグラムは図１に示したとおりであり、保持が弱く、ブロードなピークとなり異性体間の分離性能が悪いものであった。酸性側溶出ピーク１から塩基性側溶出ピーク２までの溶出時間差は５．２分であり、実施例１よりも選択性の低いものであった。操作圧は１５．０ＭＰａと低操作圧であった。

比較例２
比較例１で作製したカチオン交換体粒子を用い、実施例１の＜アスパラギン酸の導入＞と同じ操作を行い、アスパラギン酸が導入されたカチオン交換体を得た。得られた粒子のイオン交換容量は３４μ当量／ｍＬであった。実施例１と同様に液体クロマトグラフィー用カラムに充填し、測定条件を実施例１と同様に実施し、モノクローナル抗体の分離性能を比較した。
クロマトグラムは図１に示したとおりであり、保持が弱く、異性体間の分離性能も十分ではないものであった。酸性側溶出ピーク１から塩基性側溶出ピーク２までの溶出時間差は４．４分であり、実施例１よりも選択性の低いものであった。操作圧は１８．０ＭＰａと比較的低操作圧であった。

比較例３
９ｇのアスパラギン酸を０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用い、ｐＨ１２．８に調整した水溶液に、非多孔性基材の作製で得られたエポキシ化粒子３ｇを投入し、５０℃で２時間、水浴中で加熱し、エポキシ基にアスパラギン酸が導入されたカチオン交換体を得た。得られた粒子のイオン交換容量は４２μ当量／ｍＬであった。実施例１と同様に液体クロマトグラフィー用カラムに充填し、測定条件を実施例１と同様に実施し、モノクローナル抗体の分離性能を比較した。
クロマトグラムは図１に示したとおりであり、保持が弱く、異性体間の分離性能も十分ではなかった。酸性側溶出ピーク１から塩基性側溶出ピーク２までの溶出時間差は５．４分であり、実施例１よりも選択性の低いものであった。操作圧は１４．０ＭＰａと比較的低操作圧であった。

比較例４
実施例１の＜ポリアクリル酸の固定＞の操作のみを行ったカチオン交換体を用いて、実施例１と同様に液体クロマトグラフィー用カラムに充填し、測定条件を実施例１と同様にして、モノクローナル抗体の分離性能を比較した。クロマトグラムは図１及び図２（実施例２とあわせて、溶出時間を補正した拡大比較図）に示したとおりである。比較例１、２と比較して、保持は強くなり、異性体間の分離性能も改善されていた。しかし酸性側溶出ピーク１から塩基性側溶出ピーク２までの溶出時間差は１３．６分であり、実施例１及び２よりも選択性の低いものであった。操作圧は３０．０ＭＰａと高い操作圧となった。
また、実施例１と同様にグリコヘモグロビンの分離性能を比較した。クロマトグラムは図３に示したとおりであり、異性体の分離性能は不十分であった。

本発明のカチオン交換体は、広範囲の分野における液体クロマトグラフィー用のカチオン交換体として有用であり、特に、抗体、グリコヘモグロビンを含む種々のタンパク質等の生体試料の分離、精製に利用される。
なお、２０１３年３月２９日に出願された日本特許出願２０１３−０７５０２０号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (11)

1. 非多孔性粒子の表面に、アミノ基を有するジカルボン酸化合物がアミド結合により導入されたポリアクリル酸が固定されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
2. 前記非多孔性粒子が、体積平均粒子径５μｍ以下を有する、シリカ、ジルコニア若しくはアルミナの無機基材、又は架橋多糖若しくはビニル系モノマー架橋重合体の有機基材である請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
3. 前記有機基材が、単官能性ビニルモノマーと多官能性ビニルモノマーの架橋重合体である、請求項２に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
4. 前記ポリアクリル酸は、重量平均分子量が５、０００以上２０、０００以下である、請求項１乃至３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
5. 前記アミノ基を有するジカルボン酸化合物が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である請求項１乃至４のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
6. イオン交換容量が、１０〜５０μ当量／ｍＬである請求項１乃至５のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。
7. 請求項１乃至６のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体の製造方法であり、非多孔性粒子が有する官能基と、ポリアクリル酸に含まれるカルボン酸とを反応させて、非多孔性粒子の表面にポリアクリル酸を固定し、かかる固定されたポリアクリル酸とアミノ基を有するジカルボン酸化合物とを反応させることを特徴とする製造方法。
8. 請求項１乃至６のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体の製造方法であり、非多孔性粒子が有する官能基と、アミノ基を有するジカルボン酸化合物が導入されたポリアクリル酸とを反応させて、非多孔性粒子の表面に上記ポリアクリル酸を固定することを特徴とする製造方法。
9. 請求項１乃至６のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を充填して成る液体クロマトグラフィー用カラム。
10. 請求項９に記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用い、イオン交換クロマトグラフィーにより抗体の電荷異性体を測定する方法。
11. 請求項９に記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用い、イオン交換クロマトグラフィーによりグリコヘモグロビンを測定する方法。

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