CS277592B6

CS277592B6 - Dividing materials based on hydroxyl groups-containing carriers

Info

Publication number: CS277592B6
Application number: CS891981A
Authority: CS
Inventors: Werner Dr Muller; Joachim Dr Kinkel
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-30
Publication date: 1993-03-17
Also published as: JPH01310744A; DD283568A5; EP0337144B1; EP0337144A1; CN1036516A; US5453186A; AU618332B2; DE3811042A1; CS198189A3; JP3059443B2; AU3233189A; DE58901366D1; CA1330074C; CN1023298C

Description

Vynález se týká dělicích materiálů na základě nosičů obsahujících hydroxylové skupiny, jejichž povrch je potažen kovalentně vázanými polymery.

Dělicí materiály podle vynálezu se mohou použít k dělení makromolekul, obzvláště k frakcionování biopolymerů.

Dělení a čištění biologických makromolekul, jako například nukleových kyselin, proteinů, enzymů, subcelulárních jednotek, peptidů, monoklonálních antitělísek nebo celých buněk, má s ohledem na genetickou technologii a biotechnologii velký význam.

V literatuře jsou popsány některé dělicí metody pro biopolymery.

Je například známé, že se směsi nukleové kyseliny a proteinů mohou dělit ve vodném dvoj fázovém systému polyethylenglykol-dextran protiproudovým způsobem. /P.A.Albertson /1971/, 2. vyd., Almquist & Wiksoll, Stockholm/. Dále byl popsán v EP 0154246 fázový nosič pro dělicí chromatografií biopolymerů ve dvoj fázovém systému. Tyto fázové nosiče sestávají z neadsorpčních, ve fázovém systému nerozpustných základních částic, jejichž povrch je potažen pevně přilnavým materiálem /například chemicky vázaným polyakrylamidem/ s afinitou pro jednu z fází fázového systému.

K frakcionování biologických makromolekul je také známé použití ionexů. Obvyklé materiály sestávají z polymerů jako například polymethakrylátu, polystyrenu, agarózy, zesítěného dextranu nebo silikagelu, které nesou příslušné funkční skupiny.

Rozpouštěcí schopnost a vazebná kapacita těchto materiálů je však často velice neuspokojivá. Dále se dělené biomolekuly často denaturují nebo se neúplně eluují.

Úkolem předloženého vynálezu je vyvinout dělicí materiály pro frakcionování biopolymerů univerzálně použitelné v chromagerafii, které jsou zbaveny uvedených nedostatků, tj. umožňují při vyšší kapacitě zcela reverzibilně bez denaturace vázat dělené molekuly.

Neočekávaně bylo zjištěno, že dělicí materiály podle vynálezu splňují shora uvedené předpoklady a jsou vhodné pro frakcionování makromolekul, obzvláště biopolymerů. Přitom jsou tyto dělicí materiály universálně vhodné pro afinitní chromatografií, reverzní fáze nebo hydrofobni chromatografií nebo obzvláště vhodné pro ionexovou chromatografií.

Předmětem vynálezu jsou proto dělicí materiály na základě nosičů obsahujících hydroxylové skupi. , jejichž povrch je potažen kovalentně vázanými polymery, které se vyznačují tím, že základem polymerů jsou monomery vzorce 1'

CH_?=CR¹-C-X ² II · (I·) o

kde

R¹ znamená vodík nebo CH₃,

X znamená -OH nebo -NR²R³,

R² a R³ znamenají alkylovou, fenylovou, fénylalkylovou nebo alkylfenylovou skupinu až š 10 atomy 1 uhlíku v alkylové skupině, přičemž tyto skupiny mohou být jednou nebo vícenásobně substituovány alkoxyskupinou, kyanoskupinou, aminoskupinou, mono- nebo dialkylaminoskupinou, trialkylamoniovým zbytkem, karboxylovým zbytkem, zbytkem kyseliny sulfonové, acetoxy-zbytkem nebo acetamino-zbytkem, cyklický nebo bicyklický zbytek s 5 až 10 atomy uhlíku, kde jedna nebo více CH- nebo -CH₂-skupin jsou nahrazeny N nebo NH, N nebo NH a S, nebo N nebo NH a 0, nebo sulfonsulfid struktury

-/CH₂/_n-SO₂-/CH₂/_n-S/CH₂/_n OH S n = 2-6 a jeden ze zbytků R² a R³ může také znamenat vodík, přičemž R² a R³ jsou vzájemně tak sladěny, že buď oba zbytky jsou kyselé, nebo zásadité nebo jeden z nich je neutrální.

Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy dělicích materiálů na základě nosičů obsahujících hydroxylové skupiny, jejichž povrch je potažen kovalentně vázanými polymery, roubovanou polymerací za přítomnosti ceričitého iontu, při kterém se nosičové částice obsahující hydroxylové skupiny suspendují a polymerují v roztoku monomerů vzorce I'

CH₀=CR¹-C-X

II ď) o

kde

R¹ znamená H nebo CH₃,

X znamená -OH nebo -NR²R³,

R² a R³ znamenají alkylovou, fenylovou, fénylalkylovou nebo alkylfenylovou skupinu až s 10 atomy uhlíku v alkylové skupině, přičemž tyto skupiny mohou být jednou nebo vícenásobně substituovány alkoxyskupinou, kyanoskupinou, aminoskupinou, mono- nebo dialkylaminoskupinou, trialkylamoniovým zbytkem, karboxylovým zbytkem, zbytkem kyseliny sulfonové, acetoxyzbytkem nebo acetaminozbytkem, cyklický nebo bicyklický zbytek s 5 až 10 atomy uhlíku, kde jedna nebo více CH- nebo CH₂-skupin jsou nahrazeny N nebo NH, N nebo NH a S, nebo N nebo NH a 0, nebo sulfonsulfid struktury

-CH₂/_n-SO₂-/CH₂/_n-S/CH₂/_nOH S n = 2-6 a jeden ze zbytků R¹ a R² může také znamenat vodík, přičemž R² a R³ jsou tak vzájemně sladěny, že buď oba zbytky jsou kyselé, nebo zásadité nebo jeden z nich je neutrální.

Struktura dělicích materiálů podle vynálezu je podobná jako u fázových nosičů v EP 0154246. Jako protiklad ke zde popsaným materiálům mají u sloučenin podle vynálezů polymery na povrchu nosičových částic však jinou strukturu a vlastnosti. Materiály popsané v EP 015.4246 se především používají jako fázový nosič pro rozdělovači chromatografii ve dvoj fázovém systému a neobsahují žádné chromatografíčky aktivní skupiny. Naopak jsou materiály podle vynálezu chromatograficky aktivní a mohou se použít jako ionexy a také jako nosič pro afinitní chromatografii nebo hydrofobní chromatografii.

Dělicí materiály podle vynálezu sestávají z nosičových částic s hydroxylovými skupinami, na které je naroubován přes α - C-atomy hydroxylových skupin polymerní materiál, odvozený od monomerů vzorce I'.

Jako nosičové částice přicházejí v úvahu všechny obecně známé porézní a neporézní chromatografické nosiče, které mají na povrchu primární nebo sekundární, alifatické hydroxylové funkce.

Výhodné jsou například hydrofilni polymery na bázi akrylátů a methakrylátů, polymery na bázi polyvinylalkoholu, diolem substituované silikagely, polysacharidy na bázi agarózy, celulóza, celulozové deriváty nebo polymery na bázi dextranu. Mohou se však samozřejmě použít také jiné polymery nebo kopolymery na základě monomerů jako vinylových sloučenin, akrylamidu, meth/akrylové kyseliny nebo /meth/akrylnitrilu v hydroxylové formě.

Polymerní materiál, který je vázán přes α-C-Atomy hydroxylových skupin na nosičové částice, je založen na’monomerech vzorce I'. Tyto monomery představuj í /meth/akrylovou kyselinu /Y =-COOH/, derivát /meth/akrylové kyseliny /Y = -C-X/, , , Ó allylamin /Y =-CH₂NH₂, -CH₂NR²R^J/, /meth/akrylnitrii /Y = -CN/, akrolein /Y = -CHO/, vinylkarboxylát /Y = -OCOCHR⁵R⁶/.

Všechny tyto monomery představují ve vodném roztoku radikálově polymerovatelné látky s reverzibilně vázanými skupinami, které mohou být neutrální, kyselé nebo zásadité.

Jestliže se použijí jako monomery vinylkarboxylát CR⁺7_⁺⁺ =

CR¹-OCOXHR⁵R⁶ vzorce I’, převede se s výhodou získaný produkt potom na dělicí materiál s hydroxylovými skupinami. Toto převedení na hydroxylovou fázi se dosáhne známým slabě alkalickým nebo kyselým zmýdelněním. Například se může reakce provést methanolickým roztokem K₂CO₃ při teplotě místnosti, popisuje například Y. Tezuka et. al., v Macromol. Chem. 186, 685-694 /1985/.

Ve vzorcích 1', znamená R¹ s výhodou vodík, tzn., že jsou výhodné deriváty kyseliny'akrylové.

X znamená jak ve v jak ve vzorci I' - OH nebo -NR²R³, s výhodou -NR²R³.

Výhodné jsou přitom sloučeniny, ve kterých X znamená -NR²R³a jeden ze zbytků R² a R³ je vodík.

Zbytky R a/nebo R znamenají výhodně alkylovou, fenylovou, fenylalkylovou nebo alkylfenylovou skupinu, přičemž alkylová a/nebo fenylová skupina může být jednou nebo vícenásobně, s výhodou jednou nebo dvojnásobně, obzvláště výhodně jednou, substituovaná alkoxy-, kyano-, amino-, mono- nebo dialkylaminoskupinou, trialkylamoniovým zbytkem, karboxylovým zbytkem, zbytkem kyseliny sulfonové, acetoxy- nebo acetamino-zbytkem.

Zbytky R² a/nebo R₃ znamenají výhodně alkyl, alkoxyalkyl, kyanoalkyl, aminoalkyl, mono- nebo dialkylaminoalkyl, trialkyl-amoniumalkyl, karboxyalkyl nebo zbytek kyseliny sulfonové-alkyl až s 10 atomy uhlíku, s výhodou až se 6 atomy uhlíku, obzvláště výhodně až se 4 atomy uhlíku v alkylové skupině, které mohou být přímé nebo rozvětvené. R² a/nebo R³ znamenají výhodně methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, methoxymethyl, ethoxymethyl,

2-methoxyethyl, 2-,3- nebo 4-oxapenthyl, 2-, 3-, 4- nebo 5-oxahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- nebo 6-oxaheptyl, isopropyl, 2-butyl, isobutyl, 2-methylbutyl, isopentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl,

2-oxa-3-methylbutyl, 3-oxa-4-methylbutyl, 2-methyl-3-oxapentyl,

2-methyl-3-oxahexyl, dále také heptyl, oktyl, nonyl nebo decyl.

Dále jsou výhodné také alkylové skupiny, které jsou substituovány kyanoskupinou, karboxyskupinou nebo skupinou kyseliny sulfonové. Podle toho znamená R² a/nebo R³ výhodně kyanomethyí, kyanoethyl, kyanopropyl, kyanobutyl, kyanopentyl, kyanohexyl,

2-kyanopropyl, 2-kyanobutyl, karboxylmethyl, karboxylethyl, karboxylpropyl, karboxylisopropyl, karboxylbutyl, karboxylpentyl, karboxylhexyl, karboxyl-2-methylpropyl, karboxyl-2-methylbutyl, sulfonová kyselina - methyl, sulfonová kyselina-ethyl, sulfonová kyselina - propyl, sulfonová kyselina-butyl, sulfonová kyselina-pentyl, sulfonová kyselina-hexyl, sulfonová kyselina-2-methylpropyl, sulfonová kyselina-2-methylbutyl, sulfonová kyselina-3-methylbutyl, sulfonová kyselina-2-methylpentyl, sulfonová kyseselina-3-methylhexyl nebo sulfonová kyselina-2-ethylpentyl.

Dále jsou výhodné alkylové skupiny jednou substituované aminoskupinou, mono- nebo dialkylaminoskupinou nebo trialkylamonnou skupinou. Alkylové skupiny mohou přitom být stejné nebo rozdílné a mají až 10, s výhodou až 6 atomů uhlíku, obzvláště výhodně až 4 atomy uhlíku a znamenají s výhodou dimethylaminoethyl, diethylaminoethyl, methylaminoethyl, methylaminopropyl, dimethyláminopropyl, ethylaminoethyl, propylaminoethyl, propylaminopropyl, dipropylaminoethyl, dipropylaminobutyl, diethylaminoethyl, trimethylamoniumethyl, trimethylamoniumpropyl, trimethyl5 amoniumbutyl, triethylamoniummethyl, triethylamoniumpropyl, triethylamoniumethyl, aminoethyl, aminopropyl, aminobutyl nebo aminopentyl. Všechny tyto alkylové a substituované alkylové skupiny jsou také výhodné jako substituentý na fenylové skupině.

Výhodný pro R² a/nebo R³ je také sulfonsulfid struktury -/CH₂/n-SO₂-/CH₂/-S-/CH₂/_n OH s n = 2, 3, 4, 5 nebo 6, s výhodou 2, 3 nebo 4.

S výhodou znamená R² a/nebo R³ také fenylovou skupinu, která je s výhodou jednou substituovaná kyanoskupinou, kyanoalkylem, aminoskupinou, aminoalkylem, mono- nebo dialkylaminoskupinou, alkylem, alkoxyskupinou, alkoxyalkylem, mono- nebo dialkylaminoalkylem, trialkylamonnou skupinou nebo trialkylamoniumalkylem, karboxyskupinou, karboxyalkylem, zbytkem kyseliny sulfonové nebo sulfonovou kyselinou - alkylem. Výhodné významy těchto substituentů odpovídají dříve uvedeným výhodným alkylovým skupinám a substituovaným alkylovým skupinám. Substituent na fenylové skupině je s výhodou v p-poloze.

Také výhodným významem pro R² a/nebo R³ je p-acetoxyfenyl, p-aminofenyl nebo p-acetaminofenyl.

Pro R² a/nebo R³ je dále výhodná alkylfenylová nebo fenylalkylová skupina, přičemž také platí uvedené výhodné významy pro alkylovou, substituovanou alkylovou nebo substituovanou fenylovou skupinu.

Podle toho jsou například jako obzvláště výhodné následující substituované fenylové skupiny: 4-kyanofenyl, 4-alkylfenyl, 4-/N,N-dimethylamino/-fenyl, 4-/N,N-dialkylaminomethyl/-fenyl, 4-ethoxyfenyl, 4-ethoxyethylfenyl, 4-trialkylamoniumfenyl, 4-karboxylfenyl, 4-sulfonová kyselina-fenyl, fenylethyl, 4-/N-ethylamino/fenylpropyl nebo 4-kyanofenylethyl.

Dále jsou výhodné jednotky vzorce I', kde R² a/nebo R³ znamenají cyklický nebo bicyklický zbytek, který může být aromatický nebo nasycený, s 5 až 10 atomy uhlíku, přičemž jedna nebo více CH- nebo CH₂ skupin jsou nahrazeny N nebo NH, N nebo NH a S, nebo N nebo NH a 0.

R² a/nebo R³ znamenají proto s výhodou také pyridinový zbytek, imidazolylový zbytek, indolylový zbytek, dále s výhodou pyrrolový zbytek, pyrimidinový zbytek, pyrazinový zbytek, chinolinový zbytek, nebo isochinolinový zbytek.

R² a/nebo R³ mohou například také znamenat thiazolový, thiadiazolový, morfolinový, triazinový, pyperazinový, benzothiazolový, purinový, pyrazolový, triazolový, pyrrolidinový nebo isoxazólový zbytek.

Obzvláště výhodné jsou přitom aromatické, heterocyklické zbytky.

Zbytky R² a R³ musí, aby se získaly vhodné ionexy, být tak vzájemně sladěny, aby bud oba zbytky obsahovaly kyselou, nebo zásaditou skupinu nebo aby však jeden ze zbytků byl neutrální. Pro odborníka není žádnou obtíží skupiny příslušně sladit a tak sestavit vhodné zbytky pro R² a R³, podle funkce a zadání žádaného ionexu.

S výhodou je jeden z obou zbytků R² a R³ neutrální zbytek.

K přípravě materiálu podle vynálezu se nosičové částice obsahující hydroxylové skupiny suspendují v roztoku monomeru, s výhodou ve vodném roztoku. Naroubování polymerního materiálu probíhá jako obvyklá redox-polymerace za vyloučení kyslíku. Jako polymerační katalyzátor se použijí ceričité ionty, protože tento katalyzátor tvoří na povrchu nosičových částic radikálová místa, ze kterých začíná roubovaná polymerace monomerů. Délka a počet vznikajících řetězců se může upravit podle přání odborníkem nastavením koncentrace ceričité soli a monomeru.

Podrobnosti tohoto známého způsobu uvádí E. Mino a S. Kaizerman v J. of Polymer Science, sv. XXXI, č. 182 /1958/, 242-243.

K přípravě dělicích materiálů, které mají na povrchu vázán kopolymer, se jednoduše příslušné, rozdílné monomery vzorce 1' suspendují v roztoku.

K získání ionexů podle vynálezu se musí pro kopolymeraci monomery vzorce 1' zvolit tak, aby oba monomery obsahovaly bud zásaditou, nebo kyselou skupinu nebo jeden monomer byl neutrální.

Kromě toho platí pro výběr monomerů, které jsou vhodné pro kopolymeraci, obecná pravidla a podmínky, které může odborník vyčíst ze stavu techniky.

Velký počet použitelných monomerů vzorce 1' vede k velké paletě slabě zásaditých, slabě kyselých až silně kyselých nebo zásaditých ionexů a také nosičů pro afinitní chromatografií nebo hydrofobní chromatografií.

Materiály podle vynálezu jsou obzvláště vhodné pro frakcionování biopolymerů, jako například peptidů, proteinů, a nukleových kyselin.

Dále se mohou tyto materiály použít k dělení a čištění virů, buněčnatých částic, pro-karyontických nebo eukaryontických buněk a také proteinových komplexů.

Pro každý problém dělení se může při velkém počtu monomerů připravit optimální dělicí materiál, takže se mohou kombinovat účinky afinity s iontovými vazbami.

Jako ionexy jsou obzvláště vhodné dělicí materiály, které obsahují ve vzorci I-C-X, -CH₂NH₂ nebo -CH₂-NR²R³.

Materiály se skupinou-CHO ve vzorci I jsou obzvláště vhodné pro afinitní chromatografií.

Ukázalo se, že jsou připravitelné materiály podle vynálezu s daleko vyšší vazebnou kapacitou než obvyklé ionexy nebo obvyklé nosiče pro afinitní chromatografií.

Kromě toho je u těchto materiálů například zcela referzibilně vázána desoxyribononukleová kyselina a podle její velikosti se mohou oddělit restrikční fragmenty.

Velká přednost těchto nových ionexů spočívá v tom, že pohyblivostí naroubovaných řetězců polymeru má každá naplněná makromolekula příslušné protiskupiny v optimální vzdálenosti k matrici.

Kromě toho nevznikají žádné strukturální změny vázané makromolekuly, protože ionex se svými například zásaditými skupinami je v souladu s uspořádáním kyselých skupin makromolekul a ne naopak .

S materiálem podle vynálezu je možné získat různé dělicí materiály, které vzhledem ke struktuře a funkci jsou nové a jsou k dispozici k dělení makromolekul, obzvláště biopolymerů.

Následující příklady slouží k dalšímu objasnění vynálezu. V příkladech jsou použity jako výchozí materiály následující nosiče obsahující hydroxylovou skupinu:

Fractogel(S) TSK HW 65 /S/ - 5S/S/ - porézní směsný polymer na bázi vinylu, 1 m ekv. OH/g./Fy.E.Merck/

LiCHrospher^S)- Diol: diolem substituovaný silikagel /Fy. E. Marek/.

Příklad 1

Příprava slabě kyselého katexu^-x ml odsátého Fractogelu65 /s/ se suspenduje v roztoku 19 g kyseliny akrylové ve 150 ml vody, propláchne se argonem a za vyloučení kyslíku se přidá při 25 ’C 15 ml 0,4 M roztoku dusičnanu ceričitoamonného v 0,1 M kyseliny dusičné a míchá se 3 hodiny při stejné teplotě. Reakční produkt se odsaje, promyje vodou, potom 500 ml siřičitanu sodného v 10% kyselině octové, potom 500 ml 0,2 M roztoku NaOAc a nakonec opět vodou.

Produkt obsahuje 0,8 mvalu kyselých skupin na ml a váže 99 mg lysozymu na ml naplněného gelu z 20 mM fosforečnanu sodného jako pufru, pH 7,0, který se v 0,5 molu/1 NaCl ve fosforečnanu zcela opět x/olní.

Příklad 2

Příprava slabě zásaditého ionexu. x-x ₀

100 ml sedimentovaného LiChrospherkS/- Diol /1 000 A šíře pórů, 10 μπι velikost částic/ se promyje důkladně destilovanou vodou, 0,2 M roztokem NaOAc a opět vodou a suspenduje se v roztoku

104 g Ν,Ν-dimethylaminoethylakrylamidu /A/ v 700 ml vody /kyselíCS 277592 B6 nou dusičnou upraveno na pH 5,0/ v 1 000 ml. reakční nádobě s termostatovým pláštěm a temperuje se na 25 °C a vzdušný kyslík se vytěsní ze suspenze argonem. Přidá se 100 ml 0,4 M roztoku dusičnanu ceričitoamonného v 1 M HNO₃ za vyloučení vzduchu a suspenze se míchá při cca 200 UpM 3 hodiny lopatkovým míchadlem. Reakce se zastaví přístupem vzduchu, reakční produkt se odfiltruje, promyje se 500 ml vody, 500 ml 0,2 M Na₂SO₃ v 10% AcOH, potom se propláchne 500 ml 0,2 M NaOAC a promyje se vodou do neutrální reakce .

N-obsah: 1,1 %; vazebná kapacita pro albumin z hovězího séra:

mg/ml gelu /0,05 M Tris-pufr, pH 8,3/.

Příklad 3

Příprava zásaditého ionexu ₀

Roubovaná polymerace na LiChrospher^/- Diol /1 000 A šíře pórů, 10 μπι velikost částic/

Příprava se provádí analogicky podle příkladu 2; místo /A/ se však použije 123 g Ν,Ν-diethylaminoethyl-akrylamidu /B/. N-obsah: 0,5 %; vazebná kapacita pro albumin z hovězího séra:

mg/ml /0,05 M Tris-pufr, pH 8,3/.

Příklad 4

Příprava silně zásaditého ionexu zs\ _Q

Výchozí materiál: LiChrospher- Diol /1 000 A šíře pórů, μϊΐι velikost částic/

Příprava se provádí analogicky podle příkladu 2; místo /A/ se použije 113 g trimethylamoniumethyl-akrylamidu /C/.

N-obsah: 0,5 %; vazebná kapacita pro albumin z hovězího séra:

76,3 mg/ml gelu /0,05 M Tris-pufr, pH 8,3/.

Příklad 5

Příprava silně kyselého ionexu . x-\ o

Výchozí materiál: LiChrospherDiol /1 000 A síře pórů, μιη velikost částic/

Příprava se provádí analogicky podle příkladu 2; místo /A/ se použije 150 g 2-akrylamido-2-methylpropansulfonové kyseliny /D/. N:0,2 %; S: 0,2 %; vazebná kapacita pro lysozym:

mg/ml gelu /20 mM PO₄, pH 7,0/

Příklad 6

Příprava slabě zásaditého ionexu/->

Výchozí materiál: Fractogel\5/TSK HW 55/S/

Příprava se provádí analogicky podle příkladu 2; místo

LiChrospher (£)- Diol se použije 100 ml Fractogelu®a 60 g Ν,N-dimethylaminoethyl-akrylamidu /Á/.

N: 5,31 %; vazebná kapacita pro albumin z hovězího séra:

mg/ml gelu /0,05 M Tris, pH 8,3/.

Příklad 7

Příprava zásaditého ionexu /~\

Výchozí materiál: FractogelTSK HW 65 /M/

Příprava se provádí analogicky podle příkladu 2;

místo /A/ se použije 123 g Ν,Ν-diethylaminoethyl-akrylamidu.

N: 2,5 %; vazebná kapacita pro albumin z hovězího séra:

mg/ml gelu /0,05 M Tris-pufr, pH 8,3/.

Příklad 8

Příprava silně zásaditého ionexu^

Výchozí materiál: Fractogel TSK HW 65/M/ 100 ml

113 g trimethylamoniumethylakrylamidu

Příprava se provádí podle příkladu 2.

N: 3,80 %; vazebná kapacita pro albumin z hovězího séra:

154 mg/ml gelu /0,05 M Tris-pufr, pH 8,3/.

Příklad 9

Analogicky podle příkladu 2 se připraví z 100 ml Fractogelu TSK HW 65/S/ a 150 g 2-akrylamido-2-methylpropansulfonové kyseliny silně kyselý ionex.

N: 0,5 %; S: 0,7 %; vazebná kapacita pro lysozym:

mg/ml gelu /20 mM PO₄, pH 7,0/.

V předchozích příkladech znamená

Tris: Tris /hydroxymethyl/aminomethan.HC1 a PO₄: fosforečnan sodný - pufr.

Příklad 10

Analogicky podle příkladu 1 se připraví Cyano-Fractogel, •vhodný pro chromatografií s reverzní fází, reakcí 100 ml

Fractogelu®TSK HW 65/S/ a 60 g akrylnitrilu.

Obsah N: 8,9 %.

Příklad 11

Analogicky podle příkladu 2 se připraví ze 100 ml LiChrospheru ®- Diolu /1 000 A šíře pórů a 10 μιη velikost částic/,

39,2 g akroleinu a 50 g N-methylakrylamidu smíšenou roubovanou polymerací aldehydová fáze pro chromatografií primárních aminů nebo pro fixaci primárních aminů a proteinů pro afinitní chromatograf ii.

Příklad 12 •T\ Analogicky podle příkladu 1 se připraví ze 100 ml Fractogelu dx TSK HW 65/s/ a 160 mg allylaminu aminová fáze.

Obsah N: 0,55 %.

Příklad 13

Analogicky podle příkladu 2 se připraví ze 100 ml sedimentovaného LiChrospherCS)- Diolu /1 000 A šíře pórů a 10 pm velikost částic/ a 36 g vinyl-acetátu acetoxy-fáze, která se může převést methanolickým roztokem K₂CO₃ - při teplotě místnosti na hydroxylovou fázi /srov. Y. Tezuka et al., Macromol. Chem. 186, 685-694 /1985//.

Příklad 14

Analogicky podle příkladu 2 se připraví ze 100 ml sedimentovaného LiChrospher(5) - Diolu /1 000 A šíře pórů, 10 μπι velikost částic/ a 140 g'vinylenkarbonátu fáze, která se může převést mírně alkalickým nebo kyselým zmýdelněním snadno na žádanou hydroxylovou fázi.

Následující příklady se týkají příkladů použití.

Příklad A

Frakcionace DNA-restrikčních fragmentů

Zásaditý ionex připravený podle příkladu 2 se naplní do kolony Superformance(R)/50 x 10 mm, výrobce: E.Merck/ ve 20 mM Tris-HCl, pH 6,5, ekvilibruje se stejným pufrem při 2 ml/min, přidají se tři absorpční jednotky /260 nm/ restrikčních fragmentů z pDSl - plasmidu o délce 11, 18, 31, 45, 80, 85, 87, 222, 262,

267, 270, 314, 434, 458, 587 a 657. Při následující eluci NaCl gradientem /0-1 MNaCl/ v ekvilibračním pufru při 1 ml/min. se získá velice dobré oddělení jednotlivých restrikčních fragmentů. Příklad B

Frakcionace kozího séra

Materiál připravený v příkladu 8 se naplní do kolony Superformance®/50 x 10 mm/, ekvilibruje se 20 nM Tris-HCl, pH 8,3, přidá se 50 μΐ séra ve 250 μΐ pufru a eluuje se lineárním gradientem 0 až 500 mM Na₂SO₄ ve stejném pufru. Získá se dobré oddělení globulinu od albuminu.

Příklad C

Dělení β-laktoglobulinu A a B

Materiál připravený podle

Superformance® /50 x 10 mm/, příkladu 3 se naplní do kolony ekvilibruje se 20 mM Na-P0₄, pH

6,8, přidá se 0,6 mg prodejné směsi β-laktoglobulinu A a ve 100 μΐ pufru a eluuje se gradientem /50 ml/ 0 až 500 mM Na₂SO₄/lineárně/ v daném pufru.

Příklad D

Frakcionace tekutiny z břišní dutiny myší s monoklonálním antitělískem.

Materiál připravený podle příkladu 3 se naplní do kolony

Superformance(R) /50 x 10 mm/, ekvilibruje se 20 mM Tris-HCl, pH

8,3, přidá se 1,5 ml tekutiny z břišní dutiny v 4,5 ml pufru a eluuje se gradientem /100 ml/ 0 až 250 mM Na₂SO₄ ve výchozím pufru.

Příklad E

Frakcionace imunogl obul inu z lidského séra

1. Materiál připravený v příkladu 5 se naplní do kolony SuperformanceC^) /50 x 10 mm/, ekvilibruje se 10 mM NaOAc/HOAc, pH 5,0, přidá se 3,5 mg IgG a eluuje se NaCl gradientem /100 ml, 0 až 1 M/ ve stejném pufru. Získá se poměrně dobrá frakcionace.

2. Frakcionace podle bodu 1 za použití materiálu připraveného v příkladu 9.

3. Frakcionace IgG podle bodu 1 na obvyklém SP-Fractogelu 650/s/. Získaný eluční profil neukazuje přitom téměř žádnou frakcionaci.

Z těchto pokusů vyplývá, že při použití obvyklého materiálu následuje horší oddělení než při použití ionexů podle vynálezu.

Příklad F

Silně kyselý ionex připravený podle příkladu 5 se naplní do kolony Superformancet® /50 x 10 mm/, ekvilibruje se 10 mM NaOAc/AcOH, pH 5,0, přidá se 100 μΐ tekutiny z břišní dutiny a eluuje se NaCl gradientem /50 ml 0 až 500 mM NaCl/. Získá se dobré oddělení imunoglobulinu s monoklonálním antitělískem.

Ze shora uvedených příkladů je zřejmé, že s ionexy podle vynálezu se dosáhne velice dobrých výsledků dělení a tyto materiály jsou obzvláště vhodné pro dělení biopolymerů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

CR'R -CR¹

I γ

/1/

1. Dělicí materiály na základě nosičů obsahujících hydroxylové skupiny, jejichž povrch je potažen kovalentně vázanými polymery, vyznačující se tím, že polymery mají stejné nebo rozdílné opakující se jednotky vzorce 1' kde

R¹ je vodík nebo CH₃

Y je -C-X-, -CN, -CHO, li

O

-OH, -CH₂-NH₂ nebo -CH₂NR²R³,

R'a R znamenají vodík nebo CH₃ a jestliže Y = -OH, může jeden ze zbytků R' a R také být -OH,

X znamená OR⁴,

R² a R³ znamenají alkylovu, fenylovou, fenylaikylovou nebo alkylfenylovou skupinu až s 10 .atomy uhlíku v alkylové skupině, přičemž tyto skupiny mohou být jednou nebo vícenásobně substituovány alkoxyskupinou, kyanoskupinou, aminoskupinou, mononebo dialkylaminoskupinou, trialkylamoniovým zbytkem, karboxylovým zbytkem, zbytkem kyseliny sulfonové, acetoxy-zbytkem nebo acetamino -zbytkem,

- cyklický nebo bicyklický zbytek s 5 až 10 atomy uhlíku, kde jedna nebo více CH- nebo CH₂-skupin jsou nahrazeny N nebo NH, N nebo NH a S, nebo N nebo NH a O, nebo sulfonsulfid struktury -/CH₂/_n-SO₂-/CH₂/_n-S/CH₂/_n OH s n = -2-6 a jeden ze zbytků R² a R³ může také znamenat vodík, přičemž R² a R³ jsou vzájemně tak sladěny, že bud oba zbytky jsou kyselé, nebo zásadité nebo jeden nebo oba zbytky jsou neutrální, n je 2 až 100 a R⁴ znamená alkylovou, fenylovu, fenylaikylovou nebo alkylfenylovou skupinu až s 10 atomy uhlíku v alkylové skupině, přičemž tyto skupiny mohou být jednou nebo vícenásobně substituovány alkoxyskupinou, kyanoskupinou, karboxylovým zbytkem, zbytkem.kyseliny sulfonové nebo acetoxy - zbytkem.
2. Dělicí materiály podle bodu 1, vyznačující se tím, že Y ve vzorci I je - CH₂NH₂ nebo -CH₂NR²R³, přičemž R² a R³ mají význam uvedený v bodu 1.
3. Dělicí materiály podle bodu 1, vyznačující se tím, že Y ve vzorci I je -CN, -CHO nebo -OH.
4. Způsob přípravy dělicích materiálů na základě nosičů obsahujících hydroxylové skupiny, jejichž povrch je potažen kovalentně vázanými polymery podle bodu 1, roubovanou polymeraci za přítomnosti ceričitých iontů, vyznačující se tím, že se nosičové částice obsahující hydroxylové skupiny suspendují a polymerují v roztoku monomerů vzorce II

CR⁺R⁺⁺ = CR¹-Y /11/ kde R¹, R⁺ a R⁺⁺ znamenají H nebo CH³,

Y znamená -C-X, -CN, -CHO, -OCOCHR⁵R⁶,

II o

-CH₂NH₂ nebo -CH₂NR²R³,

X znamená OR⁴,

R a R znamenají alkylovou, fenylovou, fenylalkylovou nebo alkylfenylovou skupinu až s 10 atomy uhlíku v alkylové skupině, přičemž tyto skupiny mohou být jednou nebo vícenásobně substituovány alkoxyskupinou, kyanoskupinou, aminoskupinou, mono- nebo dialkylaminoskupinou, trialkylamoniovým zbytkem, karboxylovým zbytkem, zbytkem kyseliny sulfonové, acetoxyzbytkem nebo acetaminozbytkem, cyklický nebo bicyklický zbytek s 5 až 10 atomy uhlíku, kde jedna nebo více CH- nebo CH₂~skupin jsou nahrazeny N nebo NH, N nebo NH a S, nebo N nebo NH a 0, nebo sulfonsulfid struktury -/CH₂/_n-SO₂-/CH₂/_n-S/CH₂/_n OH s n = 2-6 a jeden ze zbytků R¹ a R² může také znamenat vodík, přičemž R² a R³ jsou tak vzájemně sladěny, že buď oba zbytky jsou kyselé, nebo zásadité nebo jeden nebo oba zbytky jsou neutrální.

R⁴ znamená alkylovou, fenylovou, fenylalkylovou nebo alkylfenylovou skupinu s až 10 atomy uhlíku v alkylové skupině, přičemž tyto skupiny mohou být jednou nebo vícenásobně substituovány alkoxyskupinou, kyanoskupinou, karboxylovou skupinou, zbytkem kyseliny sulfonové nebo acetoxy-zbytkem, a

R⁵ a R⁶ znamenají vodík nebo alkylovou skupinu až s 5 atomy uhlíku a/nebo vzorce III

R+ R¹ \ / /111/

C - C ' /

o. ,0 kde R⁺ a Rf znamenají H nebo CH₃ a popřípadě se takto získaný produkt převede na dělicí mate riál s hydroxylovými skupinami.
5. Způsob přípravy dělicích materiálů podle bodu 4, vyznačující se tím, že se kopolymerují rozdílné monomery vzorce II a/nebo

III.
6. Dělicí materiály na základě nosičů obsahujících hydroxylové skupiny, jejichž povrch je potažen kovalentně vázanými polymery, podle bodu 1, vyznačující se tím, že základem polymerů jsou monomery vzorce 1' ch₂=cr¹-c-x /1'/ kde

R¹ znamená vodík nebo CH₃,

X znamená -OH nebo -NR²R³,

R² a R³ znamenají alkylovou, fenylovou, fenylaikylovou nebo alkylfenylovou skupinu až s 10 atomy 1 uhlíku v alkylové skupině, přičemž tyto skupiny mohou být jednou nebo vícenásobně substituovány alkoxyskupinou, kyanoskupinou, aminoskupinou, mono- nebo dialkylaminoskupinou, trialkylamoniovým zbytkem, karboxylovým zbytkem, zbytkem kyseliny sulfonové, acetoxy-zbytkem nebo acetamino-zbytkem, cyklický nebo bicyklický zbytek s 5 až 10 atomy uhlíku, kde jedna nebo více CH- nebo -CH₂-skupin jsou nahrazeny

N nebo NH, N nebo NH a S, nebo N nebo NH a O, nebo sulfonsulfid struktury -/CH₂/_n-SO₂-/CH₂/_n-S/CH₂/_n OH s n = 2-6 a jeden ze zbytků R² a R³ může také znamenat vodík, přičemž R² a R³ jsou vzájemně tak sladěny, že bud oba zbytky jsou kyselé, nebo zásadité nebo jeden z nich je neutrální.

vyznačující se tím, že X ve

Dělicí materiály podle bodu 6, vyznačující se tím, že X ve vzorci 1' je NR², přičemž R² a R³ znamenají alkyl, alkoxyalkyl, kyanoalkyl, aminoalkyl, mono- nebo dialkylaminoalkyl, trialkylamoniumalkyl, karboxyalkyl, sulfonová kyselina-alkyl až s 10 atomy uhlíku v alkylové skupině, nesubstituovaný fenyl nebo substituovaný alespoň jednou alkylovou skupinou, alkoxyskupinou, alkoxyalkylovou skupinou, kyanoskupinou, kyanoalky8 lovou skupinou, aminoalkylovou skupinou, aminoskupinou, mononebo dialkylamino skupinou, mono- nebo dialkylaminoalkylovou skupinou, trialkylamoniovou skupinou, trialkylamoniumalkylovou skupinou, karboxyskupinou, karboxyalkylovou skupinou, skupinou sulfonové kyseliny, sulfonová kyselina - alkylovou skupinou, acetoxyskupinou nebo acetaminoskupinou až s 10 atomy uhlíku v alkylové skupině, cyklický nebo bicyklický zbytek s 5 až 10 atomy uhlíku, přičemž jedna nebo více OH- nebo CH₂ skupin jsou nahrazeny N nebo NH, N. nebo NH a S, nebo N nebo NH a O, nebo sulfonsulfid struktury -/CH₂/_n-SO₂-/CH₂/_n-S-/CH₂/_n OH s n =

2-6 a jeden . ze zbytků R² a R³ může také znamenat vodík, přičemž R² a R³ jsou vzájemně tak sladěny, že buď oba zbytky jsou kyselé nebo zásadité, nebo jeden z nich je neutrální.
9. Dělicí materiály podle bodů 6 až 8, vyznačující se tím, že polymer je kopolymer založený na monomeru vzorce I.
10. Způsob přípravy dělicích materiálů na základě nosičů obsahujících hydroxylové skupiny, jejichž povrch je potažen kovalentně vázanými polymery podle bodu 6, roubovanou polymerací za přítomnosti ceričitých iontů, vyznačující se tím, že se nosičové částice obsahující hydroxylové skupiny suspendují a polymerují v roztoku monomerů vzorce I'

CH-^CR^C-X /1’/

II o

η kde R znamena H nebo CH₃,

X znamená -OH nebo -NR²R³, o o _x

R a R znamenají alkylovou, fenylovou, fenylalkylovou nebo alkylfenylovou skupinu až s 10 atomy uhlíku v alkylové skupině, přičemž tyto skupiny mohou být jednou nebo vícenásobně substituovány alkoxyskupinou, kyanoskupinou, aminoskupinou, mono- nebo dialkylaminoskupinou, trialkylamoniovým zbytkem, karboxylovým zbytkem, zbytkem kyseliny sulfonové, acetoxyzbytkem nebo acetaminozbytkem, cyklický nebo bicyklický zbytek s 5 až 10 atomy uhlíku, kde jedna nebo více CH- nebo CH₂-skupin jsou nahrazeny N nebo NH, N nebo NH a S, nebo N nebo NH a O, nebo sulfonsulfid struktury -(CH₂)_n-SO₂-(CH₂)_n-S(CH₂)_nOH s n = 2-6 a jeden ze zbytků R¹ a R² může také znamenat vodík, přičemž R² a R³ jsou tak vzájemně sladěny, že buď oba zbytky jsou kyselé, nebo zásadité nebo jeden z nich je neutrální.
11.Použití dělicích materiálů podle kteréhokoliv z bodů 1 pro frakcionaci biopolymerů.

až 3
12.Použití dělicích materiálů podle kteréhokoliv z bodů 1 pro afinitní nebo ionexovou chromatografii.

až 3
13.Použití dělicích materiálů podle kteréhokoliv z bodů 6 pro frakcionaci biopolymerů.

až 9
14.Použití dělicích materiálů podle kteréhokoliv z bodů 6 pro afinitní nebo ionexovou chromatografii.