JPS6396553A - 充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、核酸塩基を含有する化合物を、その塩基の特
異性、配列の順序および含有量に基づき。

液体クロマトグラフィーの手法により迅速に分離するた
めの、好適なりロマトグラフィー用充填剤に関する。

（従来の技術） ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸は、生化学、生物学、医学お
よび他の研究分野において極めて重要な物質であり、近
年、核酸成分である塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチドなどの、新規なあるいは改良
を加えた分析法および分離法の開発が望まれている。

核酸および核酸塩基を含有するポリマー、オリゴマーあ
るいはモノマーの分離・分析法としては。

逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル電気泳動およびゲル濾過などが一般によく用い
られている。逆相クロマトグラフィーによる分離機構は
、主として構成塩基と担体との疎水性相互作用の相違に
よるものであり、従って疎水性の差の小さい塩基間の分
離は困難であった。イオン交換クロマトグラフィーおよ
びゲル電気泳動に関しては、イオン性基である燐酸部分
の性質の差を用いた分離であり、従って重合度による分
離においてはよい性能を示すが、構成核酸塩基の種類あ
るいは特異性による分離は充分ではなかった。ゲル濾過
は分子の大きさによる担体との相互作用の相違によるも
のであり、微妙な差による分離は不可能であった。

以上より明らかなように、核酸塩基を含有するポリマー
、オリゴマーあるいはモノマーを、その構成塩基の種類
あるいは特異性に基づいて迅速かつ良好に分離・分析で
きる方法、あるいはその分離・分析法に適した分離剤は
ほとんどないのが現状である。

そこで本発明者等は、核酸塩基を含有する種々のポリマ
ーおよびオリゴマーを用いて、核酸塩基の分子内２分子
間相互作用について研究を行ってきた（Ｋ、　Ｔａｋｅ
ｍｏｔｏ、　Ｙ、　Ｉｎａｋｉ、八ｄｖ、　Ｐｏｌｙｍ
、　Ｓｃｉ、。

４１、１　（１９８３））。その中で、ワトソンークリ
ックの相補的塩基であるアデニンとチミン（あるいはウ
ラシル）、およびグアニンとシトシン、あるいはヒポキ
サンチンとシトシン間の特異的水素結合に基づ（分子間
相互作用は特に大きく、注目に値するものであった。従
って、これらの核酸塩基間の相補的水素結合を利用する
ことにより７種々の塩基の分離および／あるいは特定の
塩基の含有量の違いに基づく選択的な分離の可能性が考
えられる。

このような核酸塩基間の相互作用に基づく分離法として
は、既に下記のものがあるが、それぞれに問題があった
。近藤等は、固定相として核酸塩基をグラフトペンダン
トで含有するポリエチレンイミンをシリカゲルにコーテ
ィングしたものを液体クロマトグラフィーに応用して２
種々の塩基モノマーの分離に成功している（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋５ｕｐｐ１．、１０．１
２５　（１９８１））　−しかじ、これは単にコーティ
ングしたものであるため、固定相が溶出する恐れがあり
、従って分離物のコンタミの恐れ。

あるいは溶離条件の制限など問題があった。イオン交換
樹脂にヌクレオシド基を導入した例（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ＋　　８０＋　６６９
　（１９６４））もあるが、やはり、溶離条件の制限な
ど問題があった。

核酸塩基含有モノマーを重合したもの（Ｂｕｌｌ、Ｃｈ
ｅｍ。

Ｓｏｃ、　Ｊａｐａｎ、　４４．１７１８　（１９７１
））では１重合されて得られたポリマー中の核酸塩基含
有量の調整が不可能であり、また、得られたポリマーの
強度も充分ではなかった。また、清田等は、エポキシ基
を含有するシリカゲルに核酸塩基および／もしくはその
類縁化合物を導入することを開示している（特公昭５７
−２６８１８号）が、この場合、核酸塩基との結合が上
記エポキシ基に核酸塩基をスペーサーを介さずして直接
行われるため、塩基間相互作用に必要な官能基の少なく
とも一部がこの結合に関与することになり、従って良好
な塩基間相互作用がこれにより妨害され分離上問題があ
ると考えられる。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、核酸塩基を含有する化合物を
、その構成塩基組成および／あるいは特定の塩基の含有
量に基づいて、溶剤組成に関係なく。

簡単にしかも性能良く分離できる液体クロマトグラフィ
ー用充填剤を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 上記目的を達成するため２本発明のクロマトグラフィー
用充填剤は、担体に核酸塩基および／もしくはその類縁
化合物を結合せしめたクロマトグラフィー用充填剤であ
って、該結合が、一端にアミノ基を有する鎖状有機化合
物（八）の他端が該担体に結合してなるアミノ基含有担
体の該アミノ基と、一端にカルボキシル基またはその誘
導基を有する鎖状有機化合物（Ｂ）の他端が該核酸塩基
および／もしくはその類縁化合物に結合してなる核酸塩
基関連化合物の該カルボキシル基またはその誘導基との
、アミド結合であることを特徴とする。

すなわち９本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、剛
性の高い担体としてシリカゲルあるいはＣＰＧ　　（コ
ントロールされた細孔を有するガラス）を選び、この担
体側にはアミノ基を含有する鎖状有機化合物（スペーサ
ーグループＡとする）を結合せしめ、一方、核酸塩基に
はカルボキシル基またはその誘導基を含有する鎖状有機
化合物（スペーサーグループＢとする）を結合せしめ２
両者を。

該アミノ基と該カルボキシル基（またはその誘導基）と
の耐性の高いアミド結合〜ＮＨＣＯ−で結合させてなる
充填剤であり、これにより上記従来の問題を解決するこ
とが可能となった。本発明充填剤は、核酸塩基と担体と
の結合がアミド結合であり。

この結合は酸およびアルカリに強く、加水分解されにく
い。従って、核酸塩基含有化合物の分離・分析に使用さ
れる溶剤として、酸性あるいはアルカリ性を示すものも
可能であり２幅広い溶離条件に対応できる。なお上記核
酸塩基としては、核酸塩基のみならずその類縁化合物も
含まれ１例えばチミン、ウラシル、シトシン、アデニン
、グアニン、ヒポキサンチン、エトキシピリミジン、テ
オフィリン、６−メルカプトプリンおよび５−ハロピリ
ミジン等が好適に用いられる。

次に１本発明のクロマトグラフィー用充填剤の構造を模
式的に示す。

本発明では、核酸塩基の相補的水素結合に妨害を与えな
い位置に１例えば２−カルボキシエチル基のようなスペ
ーサーグループＢを結合せしめ。

次いでこれをスペーサーグループＢに付与されている官
能基（カルボキシル基）の反応性を用いて。

例えばアミノプロピル基のようなスペーサーグループＡ
が結合されたシリカゲルとアミド結合を介して結合せし
めることにより、核酸塩基モノマーユニットを含有する
液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。

反応のスキームを次に示した。

■１１ スペーサーグループＢとしては、２−カルボキシエチル
基以外にも２−メチル−２−カルボキシエチル基、カル
ボキシメチル基などを用いてもよい。

また、スペーサーグループＡとしては、アミノプロピル
基以外にもアミノエチル基、アミノイソプロピル基、ア
ミノブチル基など、スペーサーグループＢの官能基と（
アミド）結合できる官能基を有するものを用いることが
できる。一般にスペーサーグループＡおよびＢについて
は、官能基を有するアルキル基、アルケニル基、芳香属
系化合物などが好ましい。

上記スペーサーグループＡを担体に結合させるには、適
宜な担体１例えばシリカゲル、　ＣＰＧ等に。

一端にアミノ基を有し、他端に該担体と結合し得る基を
有する化合物１例えば３−アミノプロピルトリメトキシ
シラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−
（３−（）リメトキシシリル）プロピル）エチレンジア
ミンを反応させて行うことができ、または担体と鎖状有
機化合物を結合したのち、該鎖状有機化合物の一端に常
法によりアミノ基を導入することも可能である。また、
前記スペーサーグループＢを核酸塩基および／もしくは
その類縁化合物に結合するには２例えば一端にカルボキ
シル基またはその誘導体を有し２他端に上記核酸塩基等
と結合し得る基を有する化合物。

例えばエチルアクリレート、エチルメタクリレ−ト、フ
ロモ酢！エチル、ブロモプロピオン酸エチル等を用い、
これら化合物中の不飽和２重結合を上記核酸塩基等の反
応基と反応させることにより行うことができる。なお上
記反応に際して、核酸塩基やその類縁化合物の塩基間相
互作用ないしは相補的水素結合に妨害を与えない位置２
例えば。

ピリミジン骨格を有するチミン、ウラシル、シトシン等
の場合は１位もしくは５位、好ましくは１位の位置、ま
た、プリン骨格を有するアデニン。

グアニン、ヒポキサンチン等の場合は９位の位置に上記
化合物が結合するよう該化合物の反応性を調整したり２
反応条件を選定することが重要である。

上述のようにして得られた本発明液体クロマトグラフィ
ー用充填剤を用いることにより、これが酸およびアルカ
リに強いことから、より広範な溶剤組成の使用が可能と
なって幅広い溶離条件に対応でき、しかも塩基間相互作
用に基づいて核酸塩基含有化合物の選択分離を有効に行
なえることが判明した。

さらに本発明充填剤を用いた方法により、従来では固定
相として用いていたものがポリマーであったため、グラ
フト率の制御や固定相濃度のコントロール、すなわち９
分離性能を左右する核酸塩基の含有量、均一性の制御が
容易でないといった問題点をも同時に解決できた。これ
は１本発明充填剤では、結合せしめるものが低分子量で
あり。

立体障害が少なく、担体との反応の均一性が確保できた
ためと考えられる。従って１本発明によれば、担体中に
存在する固定相たる核酸塩基の含有量の調整が容易であ
ること、および、結合すべき固定相の分子量が小さいた
め担体の細孔内部にも結合できることから、大きな保持
量を有するクロマトグラフィー用充填剤を容易に得るこ
とができる。

（実施例） 以下に本発明を実施例に従って詳細に説明する。

以下に記載する実施例は本発明のいろいろな局面の実施
例を示すものであるが、特許請求の範囲に特に述べた範
囲を決して制限するものではない。

１１　：　４−　　　　　　　人　、奮　）ｔ−イ４、
−、ニ７１．Σま。

２成。

チミン２５．２２ｇ　（０，２ｍｏｌ）をエタノール８
００−中に分散し、触媒量の金属ナトリウムを加えた後
。

エチルアクリレート４３ｒｄ　（０，４ｍｏｌ）を還流
下、３時間にわたり滴下した。溶媒を減圧留去した後。

得られた沈澱をエタノールより再結晶化し、　３９．６
ｇの１−（２−カルボエトキシエチル）チミンを針状結
晶として得た。収率は９２％であった。得られた化合物
３９．６ｇは、６Ｎ塩酸中、３時間還流して加水分解し
、溶媒を減圧留去した。生成物を水より再結晶化し、　
２９．８ｇの１−（２−カルボキシエチル）チミン（ｍ
ｐ、　１７８〜１７９℃）を得た。収率は８７％であっ
た。

（Ａ−２）±圭ヱ？　　の５　エステルの入（Ａ−１）
項で得られた１−（２−カルボキシエチル）チミン１９
　ｇ　（０，１ｍｏｌ）を乾燥したピリジン４０〇−中
に分散し、ペンタクロロフェニルトリクロロ酢酸２３ｇ
（０，１ｍｏｌ）を加えた。２５℃で２日間撹拌シ、ヒ
リジンを６０℃で減圧留去した。エタノールよりの再結
晶化により、チミン誘導体のペンタクロロフェニルエス
テル（ｍｐ、　１７９〜１８０℃）カ収率９５％（３０
ｇ　）で得られた。

（Ａ−３）チミンを１む　２（Ｓｉ−Ｔ）の合ｊアミノ
プロピル化シリカゲル（粒径５μｍ）５ｇをＤＭＦ　１
０ｍ１ｌに浸した後、イミダゾールを少量加え、　（Ａ
−２）項で得られたチミン誘導体の活性エステル５　ｇ
　（１５，６ｍｍｏｌ）を添加し、７０℃で４８時間放
置した。反応後、　ＤＭＦ　、水、メタノール、エタノ
ール、アセトン、クロロホ、ルム、エーテルなどで充分
洗浄し２次にトルエン中ヘキサメチルジシラザンにより
２４時間処理した後、各種溶媒で洗浄し。

チミンを含む樹脂を得た。以上の反応式をまとめて次に
示した。

（以下余白） （Ｂ）ウーシルを４む１２（Ｓｉ−Ｕ）の人金威 ウラシル２２．４　ｇ　（０，２ｍｏ＋）をエタノール
８註０中に分散し，触媒量の金属ナトリウムを加えた後
。

エチルアクリレート４３ｄ　（０．４ｍｏｌ）を還流下
．３時間にわたり滴下した。溶媒を減圧留去した後。

得られた沈澱をエタノールより再結晶化し，　４２．８
ｇの１−（２−カルボエトキシエチル）ウラシルを針状
結晶として得た。収率は９９％であった。

得られた化合物４２．８ｇは，６Ｎ塩酸中．３時間還流
して加水分解し，溶媒を減圧留去した。生成物を水より
再結晶化し，　２９．２ｇの１−（２−カルボキシエチ
ル）ウラシル（ｍｐ．　１８３〜１８５℃）を得た。収
率は８０％であった。

（Ｂ−２）−りｊヨス四」引導　のゝ性エステルの入（
Ｂ−１）項で得られた１−（２〜カルボキシエチル）ウ
ラシル１８．４ｇ　（０．１ｍｏｌ）を乾燥したピリジ
ン４００ｍ１中に分散し，ペンタクロロフェニルトリク
ロロ酢酸２３　ｇ　（０．　１ｍｏｌ）を加えた。２５
℃で２日間攪拌し，ピリジンを６０℃で減圧留去した。

エタノールよりの再結晶化により，ウラシル誘導体のペ
ンタクロロフェニルエステル（ｍｐ．　１９７〜１９９
℃）が収率９７％（３０　ｇ　）で得られた。

（Ｂ−３）ウラシルを人む１ヒ（Ｓｔ−Ｕ）の人Ｊアミ
ノプロピル化シリカゲル（粒径５μｍ）５ｇをＤＭＦ　
ＩＭに浸した後，イミダゾールを少量加え，　（Ｂ−２
）項で得られたウラシル誘導体の活性エステル５　ｇ　
（１６．４ｍｍｏｌ）を添加し，　７０℃で４８時間放
置した。反応後，　ＤＭＦ　、水，メタノール、エタノ
ール、アセトン、クロロホルム、エーテルなどで充分洗
浄し１次にトルエン中ヘキサメチルジシラザンにより２
４時間処理した後，各種溶媒で洗浄し，下記の構造を有
するウラシル含有樹脂を得た。

（Ｃ）シトシン　１・　２（Ｓｉ−Ｃ）の入Ｎーアセチ
ルシトシン３０．０　ｇ　（０．２ｍｏｌ）をエタノー
ルＢｏｏ　１ｎ１中に分散し，触媒量の金属ナトリウム
を加えた後，エチルアクリレート４３ｍｇ　（０．４ｍ
ｏｌ）を還流下，３時間にわたり滴下した。溶媒を減圧
留去した後，得られた沈澱をエタノールより再結晶化し
，　４２．８ｇの１−（２−カルボエトキシエチル）Ｎ
−アセチルシトシンを針状結晶として得た。

収率は９４％であった。得られた化合物４２．８８はＩ
Ｎ水酸化ナトリウムで加水分解し，ＩＮ塩酸にてｐＨ５
に調整することにより結晶が得られ，これを水より再結
晶化し．　２９．２ｇの１−（２−カルボキシエチル）
Ｎ−アセチルシトシン（ｍｐ．　１８３〜１８５℃）を
得た。収率は８０％であった。

（Ｃ−２）　シトシン沃４　のゝ　エステルの入（Ｃ−
１）項で得られた１−（２−カルボキシエチル）Ｎ−ア
セチルシトシン１９　ｇ　（０．　１ｍｏｌ）を乾燥し
たピリジン４００−中に分散し，ｐ−ニトロフェニルト
リフルオロ酢酸２３　ｇ　（０，１ｍｏｌ）を加えた。

２５℃で２日間攪拌し、ピリジンを６０℃で減圧留去し
た。エタノールよりの再結晶化によりシトシン誘導体の
ｐ−ニトロフェニルエステル（ｍｐ、　１９８〜２００
°Ｃ）が収率９５％（４５，０ｇ　）で得られた。

（Ｃ−３）　シトシンを４む１日（Ｓｉ−Ｃ）のＡアミ
ノプロピル化シリカゲル（粒径５μｍ）５ｇをＤＭＦ　
１０ｍ１に浸した後、イミダゾールを少量加え、　（Ｃ
−２）項で得られたシトシンｍ８体の活性エステル５　
ｇ　（１０，６ｍｍｏｌ）を添加し、７０℃で４８時間
放置した。反応後、　ＤＭＦ　、水、メタノール、エタ
ノール、アセトン、クロロホルム、エーテルなどで充分
洗浄し９次にトルエン中へキサメチルジシラザンにより
２４時間処理した後、各種溶媒で洗浄し、下記の構造を
有するシトシン含有樹脂を得た。

暑 Ｈｇ （Ｄ）アデニンを４む１″（Ｓｉ−Ａ）の入アデニン２
７．０　ｇ　（０，２ｍｏｌ）をエタノール８００ｍ１
中に分散し、触媒量の金属ナトリウムを加えた後。

エチルアクリレート６４ｍ１　（０，６ｍｏｌ）を還流
下、３時間にわたり滴下した。溶媒を減圧留去した後。

得られた沈澱をエタノールより再結晶化し、　４３．４
ｇの９−（２−カルボエトキシエチル）アデニンを針状
結晶として得た。収率は９３％であった。

得られた化合物４３．４　ｇを乾燥したピリジンに分散
させ室温下、塩化ジフェニルホスフィノチオイル８１ｍ
１　（０，４ｍｏｌ）を添加し、２時間還流した。自然
冷却により析出したピリジン塩酸塩を、冷却下。

除去し、溶媒を減圧留去した。次にベンゼン２００−一
水１００−を加え攪拌し、不溶の白色結晶を濾別した。

有機相を無水硫酸ナトリウム上で一晩乾燥後、溶媒を留
去し、メタノール２００　ｄに溶解し。

しばら（加熱した。析出した白色粒状結晶を濾別後、濾
液から溶媒を留去し、エーテル２００−中で一晩攪拌す
ると、白色結晶のＮｂ−シフエニルホスフイノチオイル
ー９−（２−カルボエトキシエチル）アデニン（ｍｐ、
　１１７〜１１９℃）が６６ｇ得られた。収率は８０％
であった。

得られたＮｂ−シフエニルホスフイノチオイルー９−（
２−カルボエトキシエチル）アデニン６６ｇをジオキサ
ン５９ｍＪｉ中に分散し、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶Ｗ
１．２０　ｄを添加し、室温下、２０分間攪拌した。溶
液を約３０−まで濃縮し、ＩＮ塩酸水溶液によりｐＨ４
に調整した。生じた沈澱を濾取し、エタノールにより再
結晶化し、白色結晶のＮｂ−ジフェニルホスフィノチオ
イル−９−（２−カルボキシエチル）アデニン（ｍｐ、
　２１３〜２１５℃）を６１ｇ得た。収率は９８．５％
であった。

（Ｄ−２）アデニン悸λ　の２　エステルの入（Ｄ−１
）項で得られたＮｂ−シフエニルホスフイノチオイルー
９−（２−カルボキシエチル）アデニン５．０３ｇ　（
１１，釦ｍｏｌ）をピリジン１０ｍ１−　ＤＭＦ　１０
＋ｎｊ！混合溶媒に溶解し、水冷下、ジシクロへキシル
カルボジイミド（ＤＣＣ）２．７０　ｇ　（１３，１ｍ
ｍｏｌ）を添加した。０℃で２時間攪拌後、ｐ−二トロ
フェノール１．８２ｇを加え、室温で２０時間攪拌した
。溶媒を減圧留去し、クロロホルム３０−に溶解し、不
溶物を除去した。エーテル、シクロヘキサンで洗浄後。

アセトン３９ｍ１に溶解し、不溶のジシクロへキシルウ
レアを除去した。濾液を乾燥後、シクロヘキサン５０−
で洗浄し、アデニン誘導体のｐ−ニトロフェニルエステ
ル５．８５ｇを得た。収率は９０％であった。

（Ｄ−３）アー゛ニンをさむ”　（Ｓｔ−Ａ）　（７）
”アミノプロピル化シリカゲル（粒径５μｍ）５ｇをＤ
ＭＦ　１０−に浸した後、イミダゾールを少量加え、　
（Ｄ−２）項で得られたアデニン誘導体の活性エステル
５　ｇ　（１５，２ｍｍｏｌ）を添加し、７０℃で４８
時間放置した。反応後、　ＤＭＦ　、水、メタノール、
エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテルなどで
充分洗浄し１次にトリフルオロ酢酸でジフェニルホスフ
ィノチオイル基を除去し、続いてトルエン中ヘキサメチ
ルジシラザンにより２４時間処理した後、各種溶媒で洗
浄し、アデニンを含む樹脂を得た。以上の反応式をまと
めて次に示した。

（以下余白） Ｅ　ヒポキサンチンｆＡ−＋’　（Ｓｔ−ｔｌ）の人゛
９−（２−カルボキシエチル）アデニン４０．０　ｇ（
０，２ｍｏｌ）を４Ｎ塩酸４００ｍ１に溶解し、０゛Ｃ
で攪拌下、　０．５Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液４００−
を徐々に滴下した。２時間攪拌後、溶媒を減圧留去した
。

生成物は水より再結晶化し、　３７．０ｇの９−（２−
カルボキシエチル）ヒポキサンチン（ｍｐ、　２９０℃
分解）を針状結晶として得た。収率は８９％であった。

（Ｅ−２）ヒポキサンチンｌａｄ　　の活　エステルの
人、戊 （Ｅ−１）項で得られた９−（２−カルボキシエチル）
ヒポキサンチン２０．８　ｇ　（０，１ｍｏｌ）を乾燥
したピリジン４００ｒｎｌ中に分散し、ペンタクロロフ
ェニルトリクロロ酢酸４１．２　ｇ　（０，１ｍｏｌ）
を加えた。２５℃で２日間攪拌し、ピリジンを６０℃で
減圧留去した。エタノールよりの再結晶化により、ヒポ
キサンチン誘導体のペンタクロロフェニルエステルが収
率５０％（１１，４ｇ　）で得られた。

（Ｅ−３）　　ヒポキサンチンを４む１′′（Ｓｉ−■
）の入Ｊ”アミノプロピル化シリカゲル（粒径５μｍ）
５ｇをＤＭＦ　１０−に浸した後、イミダゾールを少量
加え、　（Ｅ−２）項で得られたヒポキサンチン誘導体
の活性エステル５　ｇ　（１１，０ｍｍｏｌ）を添加し
、７０℃で４８時間放置した。反応ｆｆｌ、　ＤＭＦ　
、水、メタノール。

エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテルなどで
充分洗浄し１次にトルエン中へキサメチルジシラザンに
より２４時間処理した後、各種溶媒で洗浄し、下記の構
造を有するヒポキサンチン含有樹脂を得た。

各核酸塩基の樹脂への担持は、ＩＲ（赤外吸収）スペク
トルにより確認した。

１２：モノヌクレオシドの＼ 実施例１で合成した充填剤（核酸塩基を含む樹脂）をス
テンレス製カラム（４，６Ｘ１５０ｍｍ　）にスラリー
法により充填し、高速液体クロマトグラフィー（東洋ソ
ーダＨＬＣ８０３Ｄ）により、モノヌクレオシドの分離
を試みた。溶離液にはメタノール単独溶媒を用い、温度
は４０℃、流速はｌｄ／分で行った。試料検出には２５
４ｎｍのＵＶ吸収を測定した。

第１図に、実施例１で得られた充填剤、すなわち担体に
核酸塩基を担持させた充填剤５ｉ−ＩＪ＋　５ｉ−Ｃ。

５ｔ−１１＋　５ｉ−Ｔおよび５ｔ−Ａにおける。モノ
ヌクレオシドの分離挙動を示した。比較のため＋Ｃｌ１
１−シリカゲル（００５）カラムを用いた場合の、同条
件下での分離結果も、第１図に示した。

−Ｍに、　００８等の逆相系カラムあるいはイオン交換
樹脂を用いたプリン誘導体およびピリミジン誘導体の分
離では、ピリミジン環よりもプリン環の方が疎水性が大
きいため、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、およびイ
ノシン（Ｉ）ｍ”６体が、シトシン（Ｃ）、ウラシル（
Ｕ）、およびチミン（Ｔ）誘導体よりも遅く溶出するこ
とが知られている。本実施例においても、水のような疎
水性相互作用が大きく関与するような溶媒では、　ＯＤ
Ｓで分離した場合。

Ｃ，Ｕ、　Ｇ、　Ａの順に保持時間が長くなっている。

一方、メタノールのような疎水性相互作用が小さく。

水素結合が大きく関与するような溶媒では、はとんど分
離されていない。

しかしながら、溶離液にメタノールを用いた場合でモ、
　５ｔ−Ｕで分離するとモノヌクレオシドはＴ。

Ｃ，Ａ、Ｇの順に溶離され、また５ｔ−ＣではＴ、　Ａ
、　Ｃ。

Ｇの順に、　５ｔ−ＨではＴ、　Ａ、　Ｃ，Ｇの順に、
　５ｔ−ＴではＴ、　Ｃ，Ｇ、への順に、　５ｔ−Ａで
はＣ，Ａ、　ＩＪ、　Ｇの順に溶離された。すなわち、
この溶離挙動は、メタノールのような水素結合が大きく
関与する溶媒の場合。

疎水性相互作用ではなく、水素結合力により分離されて
いることがわかる。

以上の結果より１本発明の核酸塩基を担持した樹脂（充
填剤）は、核酸塩基間の相補的水素結合を利用すること
により、ヌクレオシドを、有機溶媒中においてさえ、良
好に分離できる高性能の液体クロマトグラフィー用充填
剤であることがわかった。

・を例３：オリゴマーのゝ 実施例１で合成した充填剤（核酸塩基を含む樹脂）をス
テンレス製カラム（４，６Ｘ１５０ｍｍ　）にスラリー
法により充填し、高速液体クロマトグラフィー（東洋ソ
ーダｌ化Ｃ８０３Ｄ）により１表１に示したチミンある
いはアデニンを有するオリゴエチレンイミン誘導体の分
離を試みた。

（以下余白） 溶離液には、水−メタノール（５０１５０ｖ／ｖ）混合
溶媒を用い、温度は４０℃、流速は１−７分で行った。

試料検出には２５４ｎｍのＵＶ吸収を測定した。

第２図に実施例１で得られた充填剤、すなわち担体に核
酸塩基を担持させた充填剤５ｔ−Ｔおよび５ｉ−Ａにお
ける。オリゴマーの分離挙動を示した。比較のため＋Ｃ
ｌ１ｌ−シリカゲル（ＯＤＳ）カラムを用いた場合の、
同条件下での分離結果も第２図に示した。

−ａに、　ＯＤＳなどの逆相系カラムあるいはイオン交
換樹脂を用いたチミンｍ４体とアデニン誘導体との分離
では、ピリミジン環よりもプリン環の方が疎水性が大き
いため、アデニン誘導体がチミン誘導体よりも遅く溶出
することが知られている。

本実施例においても、　ＯＯＳで分離した場合、チミン
を有するオリゴエチレンイミン誘導体（Ｉｉｌ−Ｔ−ｎ
）よりもアデニンを有するオリゴエチレンイミン誘導体
（Ｅｌ〜Ａ−ｎ）の方が保持時間ｔＲが長くなっている
。しかしながら、各オリゴマーのピークはそれぞれ重な
っており、充分な分離性能を有してはいない。

これに対し５ｔ−Ａで分離した場合、アデニンのオリゴ
マーにおいても、よく保持されて分離できている。しか
し、　５ｔ−４の場合は、チミンのオリゴエチレンイミ
ン誘導体の方が、アデニンの同一量体のオリゴマーより
もよく保持されている。逆に。

５ｉ−Ｔの場合は、アデニンのオリゴマーが非常によく
保持されて分離できている。このことから、アデニン−
チミンの相補的核酸塩基間水素結合により、各オリゴマ
ーの分離が行われていることが明らかとなった。充填剤
５ｉ−Ａにおいて分離の温度を６０℃まで上げて分離測
定を行ったが、この温度ではチミンのオリゴマーとアデ
ニンのオリゴマーとの保持時間の逆転は見られなかった
。従って、核酸塩基間の特異的水素結合を切るためには
、さらに高温が必要であると考えられる。

以上の結果より２本発明の核酸塩基を保持した樹脂（充
填剤）は、核酸塩基間の相補的水素結合を利用すること
により、核酸塩基を含むオリゴマーを良好に分離できる
高性能の液体クロマトグラフィー用充填剤であることが
わかった。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、担体に核酸塩基および／
もしくはその関連化合物をアミド結合により結合せしめ
ることにより、核酸塩基間の相補的水素結合を利用して
２核酸塩基含有化合物を。

その構成塩基組成および／あるいは特定の塩基の含有量
に基づいて、溶剤組成に関係なく、簡単にしかも性能良
（分離できる。

↓−皿皿皇皿見笠脱皿 第１図は２本発明充填剤によるヌクレオシド混合物のク
ロマトグラムである。第２図は２本発明充填剤によるオ
リゴマー混合物のクロマトグラムである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、担体に核酸塩基および／もしくはその類縁化合物を
   結合せしめたクロマトグラフィー用充填剤であって、該
   結合が、一端にアミノ基を有する鎖状有機化合物（Ａ）
   の他端が該担体に結合してなるアミノ基含有担体の該ア
   ミノ基と、一端にカルボキシル基またはその誘導基を有
   する鎖状有機化合物（Ｂ）の他端が該核酸塩基および／
   もしくはその類縁化合物に結合してなる核酸塩基関連化
   合物の該カルボキシル基またはその誘導基との、アミド
   結合である、クロマトグラフィー用充填剤。 ２、前記核酸塩基および／もしくはその類縁化合物が、
   チミン、ウラシル、シトシン、アデニングアニン、ヒポ
   キサンチン、エトキシピリミジンチオフィリン、６−メ
   ルカプトプリンおよび５−ハロピリミジンから成る群よ
   り選択される特許請求の範囲第１項に記載のクロマトグ
   ラフィー用充填剤。 ３、前記担体がシリカゲルあるいはＣＰＧ（コントロー
   ルされた細孔を有するガラス）である特許請求の範囲第
   １項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。