JP3583781B2 - アフィニティークロマトグラフィーのためのヌクレオチド含有吸着材 - Google Patents
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Description
本発明は、親和性リガンドとしてヌクレオシド又はヌクレオチドを含むアフィニティークロマトグラフィーのための吸着材及びこれを作るための燐酸含有中間化合物及びその使用に関する。
種々の生物学的相互作用、例えば細胞認識の機構に対して種々の糖蛋白質が重要な役割を演じているが、これらはしばしばシアル酸を含んでいる。これら糖蛋白質のオリゴ糖成分はしばしば複雑な構造を有する。従って、有機化学の種々の方法によるそのようなオリゴ糖類の試験管内での合成は、例えば種々の保護基を導入し、除去する等のために極めて複雑である。通常、これらを天然物質から分離するのも同様に複雑である。従って試験管内での合成はいくつかの有機化学的工程といくつかの生化学的工程との組み合わせを必要とする。それら生化学的工程は、種々の酵素が保護基の導入を必要とすることなく特定の化学的構造を特定的な態様で作り出す能力を利用するものである。そのような反応には各種のグリコシルトランスフェラーゼからなる群より選択した種々の酵素が必要である。例えば、各種のシアル酸残基をシアリルトランスフェラーゼにより単糖類又はオリゴ糖類に結合させることができる。
それらグリコシルトランスフェラーゼ、例えばシアリル−、グリコシル−、アセチルグルコサミン−、ガラクトシル−、マンノシル−又はフコシル−トランスフェラーゼの単離はアフィニティークロマトグラフィーの助けにより最もよく行なうことができるが、その際親和性リガンドとして、固定化したヌクレオシド２燐酸、各種ヌクレオシド類、モノ又はオリゴヌクレオチド類を用いるのが好ましい。シアリルトランスフェラーゼについてはシチジン２燐酸（CDP）が好ましい親和性リガンドである。
ヌクレオシド含有親和性リガンドも、他の酵素類、例えばデヒドロゲナーゼ類、オキシダーゼ類、キナーゼ類又はトランスアミナーゼ類を濃縮、精製するのに適している。
従来技術のアフィニティークロマトグラフィー吸着材は、例えばアガロースのような多糖類を基礎支持材として含んでおり、これにスペーサとしてのアミノへキシル基を介してCDPが結合している。このスペーサは親和性リガンドの酵素との相互作用のために必要である。しかしながらこのスペーサは疎水性のために、望ましくない種々の相互作用が起こり、これが酵素の収率及びその活性を低下させる。従って、本発明の目的は、種々の酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼ類を精製するための改善されたヌクレオシド含有親和性支持体を提供することである。
ドイツ特許出願DE 43 10 964は、下記式Ｉ
（但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、炭素数が１〜５（C1〜C5）のアルキル基又は炭素数が６〜12（C6〜C12）のアリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数である）
の種々のモノマーがヒドロキシル基含有母材の上にグラフト重合されている活性化されたオキシラン含有支持体物質を開示している。これらの活性化された支持体物質から、それぞれが公知の方法の組合わせによりアフィニティークロマトグラフィー用の分離材を製造できることが見出された。得られる分離材は改善された種々の性質を有する。
本発明は、表面に種々のポリマーが共有結合的に結合しているヒドロキシル基含有基礎支持体を基礎構造として有するアフィニティークロマトグラフィー用分離材に関し、これは、
ａ）その基礎支持体が脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）その共有結合的に結合しているポリマーが末端のモノマー単位によりその基礎支持体に結合されており、
ｃ）それら各線状ポリマーは下記式IIのモノマー単位、すなわち
を含み、
但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨまたはCH3であり、
R4はＨ、炭素数が１〜５（C1〜C5）のアルキル基又は炭素数６〜12（C6〜C12）のアリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数であり、そして
１方の残基ＸはOHであって、他方の残基Ｘはヌクレオシド含有残基、例えば、ヌクレオシド２燐酸基、モノもしくはオリゴヌクレオチド基、またはヌクレオシド基である
ことを特徴とする。
特に好ましいいくつかの具体例において、そのヌクレオシド含有基Ｘは次の各化合物、すなわちCDP、UDP、GDP、AMP、ADP、ATP、シクロ−AMP（cyclo−AMP）の１つから導かれる。
本発明はこれら本発明に従う分離材をアフィニティークロマトグラフィーのために使用することに関する。
本発明はヌクレオシド含有分離材を製造するに当たり、下記の工程、すなわち
ａ）下記式Ｉ、すなわち
（但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、炭素数１〜５（C1〜C5）のアルキル基又は炭素数６〜12（C6−C12）のアリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数である）
のモノマー類をセリウム（IV）の関与のもとにヒドロキシル基含有基礎支持体の上にグラフト重合させ、
ｂ）上記工程ａ）からのエポキシド基含有支持体を、燐酸、燐酸のアルカリ金属塩又はアンモニアと反応させ、そして
ｃ）上記工程ｂ）において得られた生成物にヌクレオシド含有残基を導入する
各工程を特徴とする方法に関する。
好ましい具体例の１つにおいて工程ｂ）の反応は燐酸を用いて行なわれ、そのホスホリル化された支持体は次いで過剰の第３級アミン又はピリジンの添加により、アルキル化されたアンモニウム塩に転化される。このアンモニウム塩は脱水的な条件のもとにヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと反応させる。
もう１つの具体例において、工程ｂ）の反応はアンモニアを用いて行なわれる。次にそのヌクレオチド残基は、例えば６−クロロプリンリボシドの形で導入される。その得られたプリン誘導体は、例えば公知の方法により反応させて支持体に結合したAMP、ATP又は環状AMPの誘導体にすることができる。他のヌクレオシド含有化合物を与える類似の各種反応も知られている。
本発明は更に、表面に種々のポリマーが共有結合的に結合しているヒドロキシル基含有基礎支持体を基礎とするグラフトポリマーの燐酸エステル誘導体に関し、これは、
ａ）その基礎支持体が脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）その共有結合的に結合しているポリマーが末端のモノマー単位によりその基礎支持体に結合されており、
ｃ）それら各線状ポリマーは下記式IIIのモノマー単位、すなわち
を含み、
但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、炭素数１〜５（C1〜C5）のアルキル基又は炭素数６〜12（C6〜C12）のアリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数であり、そして
１方の残基ＹはOHであって、他方の残基ＹはPO4H2である
ことを特徴とする。
最後に本発明は、グラフトされたポリマーの新規な燐酸エステル誘導体を、本発明に従うアフィニティークロマトグラフィー用吸着材の製造のために、及び液体クロマトグラフィー用カチオン交換材として使用することに関する。
第１工程は、燐酸又はその塩をドイツ特許DE 43 10 964に記載されている活性化された支持体物質のエポキシド基と反応させてこれら支持体物質との燐酸モノエステル誘導体にすることを含むか、又はそれらのエポキシド基をアンモニアと反応させてそのヒドロキシアミン誘導体にする。その活性化された支持体物質の中のオキシラン基の含有量と反応条件（燐酸／燐酸エステルの量、反応時間及び温度）の選択とにより、その支持体物質の燐酸モノエステル誘導体の置換の度合いを調節することができる。アンモニアとの反応における置換度は類似の態様で変えることができる。いかなる過剰のオキシラン基も通常的な方法により、例えばメルカプトグリセリンとの反応により、又は希硫酸による処理によって除くことができる。
この方法により作られた燐酸モノエステル誘導体はまた、カチオン交換材として使用することもできる。
生化学において、ヌクレオシドの語はピリミジン塩基であるチミン、ウラシル及びシトシンの、及びプリン塩基であるグアニン及びアデニンのリボース又は２−デオキシリボースを含むＮ−グリコシド類を表わすのに用いられる。ヌクレオチドはこれらのヌクレオシドの燐酸エステルである。ヌクレオシド２燐酸はピロ燐酸結合を介して最初の燐酸残基と結合しているもう１つの燐酸残基を含む。オリゴヌクレオチドは、燐酸ジエステル結合により結合している同一であっても異なっていてもよい複数個のヌクレオチドを含む。本発明によれば、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの語は、上にあげた塩基の代りに、例えばヒポキサンチン、５−メチルシトシン又はＮ−２−メチルグアノシンのような他のプリン塩基又はピリミジン塩基が存在している化合物、又はそのリボース又は２−デオキシリボースが別な糖残基又はリビトール（ribitol）のような糖アルコールで置き換えられている化合物をも表わす。この種の類似の化合物は当業者によく知られている。全体として、これらの化合物は本発明によれば、ヌクレオシド含有化合物又はヌクレオシド含有残基の語により包括される。このようなヌクレオシド含有化合物の例は、アデノシン、AMP、ADP、ATP、シクロ−AMP、CDP、UDP、GDP、NAD（Ｈ）、NADP（Ｈ）、FMN又はFADである。
酸とアルコールとから水の除去によってエステル結合が作り出されるが、同様に、２つの燐酸化合物からピロ燐酸結合が作り出される。最も普通の脱水剤は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのようなカルボジイミド類を含む。1,1'−カルボニルジイミダゾールがこの目的のために好ましく用いられる。他の脱水方法は、酸ハロゲン化物や酸無水物のような活性化された中間化合物を使用する。このような方法の詳細及びその好適な変形態様は例えば、種々の一般的なハンドブック等から当業者に公知である。式IIIのモノマー単位を含む燐酸エステル誘導体と、ヌクレオチド類と、の間のピロ燐酸結合を形成させるためには、Biochim.Biophys.Acta 91,1ff（1964）第１頁以下のMichelsonの方法が好ましい。この方法では各燐酸エステルを、第３級アミンを用い、又は第４級アンモニウム水酸化物を用いて対応する第１塩に変える。このような関係において、トリ−ｎ−ブチルアミン又はメチルトリ−ｎ−オクチルアンモニウムヒドロキシドを使用するのが好ましい。
ヌクレオシド誘導体を作るための他の種々の合成方法が当業者に知られており、これらは適当な態様で、ドイツ特許DE 43 10 964より公知の活性化された支持体物質との反応に適用することができ、この場合にはこれらの支持体物質の燐酸誘導体又はアミノ誘導体を好ましい中間体として使用する。このような反応は、そのアミノ誘導体の６−クロロプリンリボシド、2',3'−イソプロピリデン−６−クロロプリンリボシド又は６−クロロAMPによるアルキル化を含む。後者の場合には、その支持体物質に結合したAMP誘導体が直接得られる。次いでその保護されていないリボシド化合物をYoshikawa、M.Yoshikawa等:TetrahedronLett.（1967）1967,5065、M.Yoshikawa及びT.Kato:（1967）Bull.Chem.Soc.Jpn.40,2849、K.Kusashio及びM.Yoshikawa:（1968）Bull.Chem.Soc.Jpn.41,142、M.Yoshikawa等：（1969）Bull.Chem.Soc.Jpn.42,3505に従いホスホリル化（phosphorylate）することができる。その2',3'−イソプロピリデン誘導体の保護基はその5'−トシル化の後で除去することができる。全ての場合に、その引き続く誘導体化反応はヌクレオシドの化学の通常的な方法により実施することができる。これらは、J.Ludwig（1981）Acta Biochim.Biophys.Acad.Sci.Hung.16,131−133のATP合成、或いは、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド又はカルボニルジイミダゾールのような脱水剤によるAMP誘導体からのピロ燐酸エステル又はトリ燐酸エステルの形成を含む。シクロAMP誘導体のような環状燐酸エステル誘導体を作ることもできる。あげることのできる別な文献の１例はH.Guilford等（1972）Chimica Scripta ２,165−170である。
当業者が以上の記述をその最も広い意味で用いることができるであろうことは言うまでもない。従って、好ましい具体例は単に記述的なものと解するべきであって、いかなる意味においても限定的な記載であると解するべきではない。
以上及び以下にあげる全ての出願、特許及び刊行物並びに1993年10月２日に提出された対応するドイツ特許出願DE 43 33 674の完全な開示は本願に参考文献として採用される。
以下の諸例は主題を更に詳細に説明しようとするものであり、これらの例は本発明の主題のなんらかの限定を構成するものではない。
実 施 例
例 １ Fractogel（登録商標）−TSK HW 65（ｓ）より出発するオキシランで活性化された支持体の調製
沈降させたFractogel（登録商標）−TSK HW 65（ｓ）の50mlと25mlの水との懸濁液に、室温において激しく撹拌しながら2gの硝酸アンモニウムセリウム（IV）（25mlの2MのHNO3の中に溶解した）と混合する。１分間後に、30mlのジオキサンの中の3gの2,3−エポキシプロピルメタクリレートの溶液を加える。撹拌を３時間継続する。次にこの反応懸濁液をまず最初蒸留水で、次いで0.05MのEDTA溶液で洗浄する。
例 ２ 燐酸基を含む支持体物質の合成
例１に従い作った5gの乾燥ゲルを20mlの水の中に懸濁させ、そして8mlの燐酸（85％）を加える。この懸濁液を室温において３ないし４時間振盪する。この反応生成物をガラスフリット（G3）で濾別し、そして水で中性まで洗浄する。
この反応生成物を次にpH7.5の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液の中の1mlのメルカプトグリセリンで振盪のもとに処理（室温、３日間）して未反応のオキシラン基を除去する。
次いでこの燐酸基含有支持体物質を水で完全に洗浄する。このものは支持体物質1g当たり30μモルの燐酸を含む。
例 ３ 高燐酸含量の燐酸基含有支持体物質の合成
燐酸との反応を15時間にわたり実施する以外は、例１に従い作った5gの乾燥ゲルを例２におけるのと同様に反応させた。得られた燐酸基含有支持体物質は支持体物質1g当たり40μモルの燐酸を含む。
例 ４ シチジン5'−ジ燐酸（CDP）で誘導体化された支持体物質の合成
工程１：誘導体化支持体物質のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩
例２からの湿潤した反応生成物を30mlの水の中に懸濁させ、トリ−ｎ−ブチルアミン0.5mlを加え、そしてこの混合物を室温で１時間振盪する。この生成物を次にガラスフリット（G2）で濾過し、そして50mlのアセトンで３回洗浄する。その固体残渣を250mlの丸底フラスコの中で真空（５ないし７トール）のもとに50℃において１夜乾燥する。
工程２:CMPのメチル−トリ−オクチルアンモニウム塩
4.2gのメチルトリオクチルアンモニウムクロリドを100mlのメタノールの中に溶解させ、そしてカラム〔DOWEX（登録商標）1X2、200〜400メッシュ、OH型〕により第４級塩基に変える。この溶液を250mlのメタノール中の3.23gのCMP懸濁液に加える。得られたCMPのメチルトリオクチルアンモニウム塩を濃縮する。
工程３：ピロ燐酸ジフェニルで活性化されたCMP
工程２からのCMPのメチルトリオクチルアンモニウム塩１ミリモルを7mlのジオキサンと3mlのN,N−ジメチルホルムアミドとの混合物の中に溶解させる。この溶液に湿分の排除のもとに0.3mlのジフェニルホスホリルクロリドと0.45mlのトリ−ｎ−ブチルアミンとを加え、そしてこの混合物を３時間振盪する。次いで溶媒を回転蒸発器の中で真空のもとに除去し、そしてその残渣を30mlのジエチルエーテルで処理する。この懸濁液を０℃に１時間冷却し、そしてそのエーテル相を傾瀉して捨てる。この残渣を真空中で乾燥させ、2mlのジオキサンの中に再溶解させ、そして再び真空中で乾燥させる。
工程４:CMP及び誘導体化された支持体物質のピロ燐酸誘導体
工程１からの誘導体化された支持体物質を30mlのピリジンの中に懸濁させ、この懸濁液に、10mlのピリジンの中の0.5ミリモルの、工程３からのジフェニルピロ燐酸誘導体化されたCMPの溶液を湿分の排除のもとに加え、そしてこの混合物を室温において１夜振盪する。この反応生成物をガラスフリット（G2）で濾別し、そして250mlのメタノール、100mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び1000mlの水で洗浄する。
得られた物質は湿潤質量1g当たり25μモルのシチジンを含む〔加水分解（1N HCl、110℃で２時間）し、次いで1N NaOHで中和した後267nmのUV吸収で測定〕。
例 ５ グアノシン5'−ジ燐酸（CDP）で誘導体化された支持体物質の合成
工程１：誘導体化支持体物質のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩
この工程の操作は例４の工程１のそれと同じである。
工程２:GMPのトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩
3gのGMP（遊離の酸）と1.1gのトリ−ｎ−ブチルアミンとを250mlのメタノール中でその溶液が透明になるまで加熱し、次にこの溶液を濃縮して乾固させる。
工程３：ピロ燐酸ジフェニルで活性化されたGMP
工程２からのGMPのトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩１ミリモルを7mlのジオキサンと3mlのN,N−ジメチルホルムアミドとの混合物の中に溶解させる。この溶液に湿分の排除のもとに0.3mlのジフェニルホスホリルクロリドと0.45mlのトリ−ｎ−ブチルアミンとを加え、そしてこの混合物を３時間振盪する。次いで溶媒を回転蒸発器の中で真空のもとに除去し、そしてその残渣を30mlのジエチルエーテルで処理する。この懸濁液を０℃に１時間冷却し、そしてそのエーテル相を傾瀉して捨てる。この残渣を真空中で乾燥させ、2mlのジオキサンの中に再溶解させ、そして再び真空中で乾燥させる。
工程４:GMP及び誘導体化された支持体物質のピロ燐酸誘導体
工程１からの誘導体化された支持体物質を30mlのピリジンの中に懸濁させ、この懸濁液に、10mlのピリジンの中の0.5ミリモルの、工程３からのジフェニルピロ燐酸誘導体化されたGMPの溶液を湿分の排除のもとに加え、そしてこの混合物を室温において１夜振盪する。この反応生成物をガラスフリット（G2）で濾別し、そして250mlのメタノール、100mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び1000mlの水で洗浄する。
得られた物質は湿潤重量1g当たり30μモルのグアノシンを含む〔加水分解（1N CHl、110℃で２時間）し、次いで1N NaOHで中和した後270nmのUV吸収で測定〕。
例 ６ アミノ含有支持体物質の合成
例１に従い作った乾燥ゲル35gを200mlの濃アンモニア水溶液の中で室温において５日間振盪する。この操作の間においてその反応の進行は次のようにして調べることができる。すなわちその反応混合物乾燥試料をピリジンとともに煮沸する。エポキシド基がまだ存在する間はその支持体は褐色から黄色への脱色を受ける。反応完結の後でその支持体は無色に留まる。
この反応生成物を次にG3フリットの上で濾別し、そしてメタノール及びアセトンで洗浄する。このものを次に真空（10〜15ミリバール）の中で60〜70℃において乾燥させる。
この反応生成物は1.3％の窒素含有量を有する。エタノール性ニンヒドリン溶液とともに加熱したときにこの支持体は紫色に変わる。
例 ７ プリンリボシド含有支持体物質の合成
例６に従い作ったアミノ誘導体36gを150mlのアブソリュートエタノール（absolute ethanol）の中に懸濁させ、そしてこの懸濁液を3.6gの６−クロロプリンリボシド及び3.6mlのトリエチルアミンとともに還流において15時間加熱する。
この反応生成物を次にG3フリットの上で濾別し、そしてメタノール及びアセトンで洗浄する。この反応生成物を丸底フラスコに移して真空（10〜15ミリバール）の中で60〜70℃において乾燥させる。
カップリング度は約97％である。
例 ８ AMP含有支持体物質（ホスホリル化はYoshikawaによる）の合成
例７からの生成物に125mlの無水の燐酸トリエチルを加え、そして新しく蒸留した1.8mlのオキシ塩化燐を０℃において撹拌しながら加える。この混合物を０℃において３時間、次いで４℃において１時間撹拌する。次に過剰のオキシ塩化燐を真空において（10〜15ミリバール）溜去する。
AMP誘導体を作るために、この反応懸濁液を10℃において撹拌しながら500mlの炭酸水素ナトリウム水溶液（50g/l）の中にゆっくりと流し込む。この操作においてpHは7.8から7.2に低下する。30分間の後、この生成物をG3フリットにより吸引のもとに濾別し、そして水で洗浄する。0.1N HCl水溶液によるこのフリットの上でのナトリウム塩の処理は遊離の後（支持体のAMP誘導体）を与え、このものはこのフリットの上で水、メタノール及びアセトンで洗浄し、そして真空中（10〜15ミリバール）で70℃において乾燥させる。
例 ９ シクロ−AMP含有支持体物質の合成
例８からの乾燥生成物を撹拌機と還流凝縮器とを含む装置の中で150mlの無水のピリジンの中に懸濁させ、そして5.4gのジシクロヘキシルカルボジイミドを加える。この混合物を還流において４時間加熱する。この生成物を次にG3フリットの上で吸引のもとに濾別し、そしてジクロロメタン、メタノール、熱メタノール（ジシクロヘキシルウレア溶出用）、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、1Mの第１燐酸カリウム（pH4）及び水で洗浄する。その湿潤ゲルは0.1MのNaClを加えて20％（v/v）の水性エタノールの中で貯蔵する。
例 10 ATP含有支持体物質〔ATPの合成はJ.Ludwig（1981）Acta Biochim.Biophys.Acad.Sci,Hung.16,131−133による〕の合成
例８からの生成物（塩素誘導体、すなわち加水分解の前）をピロ燐酸のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩と反応させる。
振盪しながら無水のDMFの中の0.5Mのピロ燐酸のビス−トリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩とトリ−ｎ−ブチルアミンとの混合物を加える。５分間激しく振盪した後でその懸濁液を1Mの炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（pH7.5）で加水分解し、そして0.5時間の後にその生成物をG3フリットにより、吸引しながら濾別して水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄する。
ATPの収率は約60％（Ｐ分析）である。
使用例 Ａ 牛初乳からのシアリルトランスフェラーゼの分離
Superformance（登録商標）カラム（I.D.1.6cm）に例４に従うCDP含有支持体物質10gを充填し、そして25％グリセロールを含むpH6.8のMES緩衝液10mMで平衡化させる。分娩に続く第１日目の牛初乳を遠心分離により脱脂し、そして同じ緩衝液に対して完全に透析する。約１リットルの透析した初乳を1ml/分の流量でカラムに通ずる。溶離は1.0MのNaClの段階的勾配で行なう。
シアリルトランスフェラーゼの活性はCMP−［14C］−シアル酸のラクトースへの転移により求める。この測定には50μｌのMES緩衝液（最終濃度:MES 50mM、MnCl2 10mM、pH6.8）、0.8Mラクトース10μｌ及びCMP−［14C］−シアル酸（0.05μCi）10μｌとともに37℃において15分間インキュベートする。この反応バッチを、pH7.0の氷冷した5mMの燐酸カリウム緩衝液１ミリリットルで停止させ、そしてDowex 1X8−200を含む1mlカラムの上でクロマトグラフにかける。このような条件のもとでCMP−［14C］−シアル酸はこのカラムの上に引き止められ、一方その生成物である［14C］−シアリルラクトースは不結合分画の中に分離することができる。
シアリルトランスフェラーゼの活性の１単位は１分間当たり［14C］−シアル酸の１μモルの転移と定義される。支持体物質のグラム当たり0.2Uのシアリルトランスフェラーゼが結合される。この結合容量は比較物質（BrCN−セファローゼに結合されたCDP）のそれよりも50％大きい。この結合活性は1.0M NaClを用いて収率75％で溶離されたが、一方比較物質は８％よりも大きくない回収率しか示さなかった（0.2M NaClで溶離）。
使用例 Ｂ 人母乳からの１−3/4−フコシルトランスフェラーゼの分離
1000mlの人母乳を遠心分離により脱脂し、そして４℃においてpH6.8の10mMのカコジル酸Na、10mMのMgCl2、20％グリセロールに対して完全に透析する。その転移酵素の予備精製は、記述された方法（Epponberger−Castori等:Glycoconjugate J.,６,pp.101−114,1990）によりFractogel（登録商標）SO3（E.Merck）の上でのクロマトグラフィーによって行なわれる。
フコシルトランスフェラーゼの活性の測定は基質としてGDP−［14C］−フコースを用いて例６と同様に行なう。
SO3クロマトグラフィーからの各活性分画は透析により脱塩し、そして例５に従うGDP支持体物質の上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この目的のために、Superformance（登録商標）カラム（I.D.1.0cm）に2mlの支持体物質を充填してpH6.8の、カコジル酸Na 10mM、MgCl2 10mM、20％グリセロールにより平衡化させる。試料の添加に続いてこのカラムを平衡化緩衝液で完全に洗浄し、そしてNaCl勾配（０〜1.5M NaCl、20カラム容積、0.2ml/分）で溶離させる。
収率は約450倍精製について約83％である。フコシルトランスフェラーゼはSDSゲル電気泳動における主バンドとして（MW 47kD）見ることができる。
種々の生物学的相互作用、例えば細胞認識の機構に対して種々の糖蛋白質が重要な役割を演じているが、これらはしばしばシアル酸を含んでいる。これら糖蛋白質のオリゴ糖成分はしばしば複雑な構造を有する。従って、有機化学の種々の方法によるそのようなオリゴ糖類の試験管内での合成は、例えば種々の保護基を導入し、除去する等のために極めて複雑である。通常、これらを天然物質から分離するのも同様に複雑である。従って試験管内での合成はいくつかの有機化学的工程といくつかの生化学的工程との組み合わせを必要とする。それら生化学的工程は、種々の酵素が保護基の導入を必要とすることなく特定の化学的構造を特定的な態様で作り出す能力を利用するものである。そのような反応には各種のグリコシルトランスフェラーゼからなる群より選択した種々の酵素が必要である。例えば、各種のシアル酸残基をシアリルトランスフェラーゼにより単糖類又はオリゴ糖類に結合させることができる。
それらグリコシルトランスフェラーゼ、例えばシアリル−、グリコシル−、アセチルグルコサミン−、ガラクトシル−、マンノシル−又はフコシル−トランスフェラーゼの単離はアフィニティークロマトグラフィーの助けにより最もよく行なうことができるが、その際親和性リガンドとして、固定化したヌクレオシド２燐酸、各種ヌクレオシド類、モノ又はオリゴヌクレオチド類を用いるのが好ましい。シアリルトランスフェラーゼについてはシチジン２燐酸（CDP）が好ましい親和性リガンドである。
ヌクレオシド含有親和性リガンドも、他の酵素類、例えばデヒドロゲナーゼ類、オキシダーゼ類、キナーゼ類又はトランスアミナーゼ類を濃縮、精製するのに適している。
従来技術のアフィニティークロマトグラフィー吸着材は、例えばアガロースのような多糖類を基礎支持材として含んでおり、これにスペーサとしてのアミノへキシル基を介してCDPが結合している。このスペーサは親和性リガンドの酵素との相互作用のために必要である。しかしながらこのスペーサは疎水性のために、望ましくない種々の相互作用が起こり、これが酵素の収率及びその活性を低下させる。従って、本発明の目的は、種々の酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼ類を精製するための改善されたヌクレオシド含有親和性支持体を提供することである。
ドイツ特許出願DE 43 10 964は、下記式Ｉ
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、炭素数が１〜５（C1〜C5）のアルキル基又は炭素数が６〜12（C6〜C12）のアリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数である）
の種々のモノマーがヒドロキシル基含有母材の上にグラフト重合されている活性化されたオキシラン含有支持体物質を開示している。これらの活性化された支持体物質から、それぞれが公知の方法の組合わせによりアフィニティークロマトグラフィー用の分離材を製造できることが見出された。得られる分離材は改善された種々の性質を有する。
本発明は、表面に種々のポリマーが共有結合的に結合しているヒドロキシル基含有基礎支持体を基礎構造として有するアフィニティークロマトグラフィー用分離材に関し、これは、
ａ）その基礎支持体が脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）その共有結合的に結合しているポリマーが末端のモノマー単位によりその基礎支持体に結合されており、
ｃ）それら各線状ポリマーは下記式IIのモノマー単位、すなわち
但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨまたはCH3であり、
R4はＨ、炭素数が１〜５（C1〜C5）のアルキル基又は炭素数６〜12（C6〜C12）のアリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数であり、そして
１方の残基ＸはOHであって、他方の残基Ｘはヌクレオシド含有残基、例えば、ヌクレオシド２燐酸基、モノもしくはオリゴヌクレオチド基、またはヌクレオシド基である
ことを特徴とする。
特に好ましいいくつかの具体例において、そのヌクレオシド含有基Ｘは次の各化合物、すなわちCDP、UDP、GDP、AMP、ADP、ATP、シクロ−AMP（cyclo−AMP）の１つから導かれる。
本発明はこれら本発明に従う分離材をアフィニティークロマトグラフィーのために使用することに関する。
本発明はヌクレオシド含有分離材を製造するに当たり、下記の工程、すなわち
ａ）下記式Ｉ、すなわち
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、炭素数１〜５（C1〜C5）のアルキル基又は炭素数６〜12（C6−C12）のアリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数である）
のモノマー類をセリウム（IV）の関与のもとにヒドロキシル基含有基礎支持体の上にグラフト重合させ、
ｂ）上記工程ａ）からのエポキシド基含有支持体を、燐酸、燐酸のアルカリ金属塩又はアンモニアと反応させ、そして
ｃ）上記工程ｂ）において得られた生成物にヌクレオシド含有残基を導入する
各工程を特徴とする方法に関する。
好ましい具体例の１つにおいて工程ｂ）の反応は燐酸を用いて行なわれ、そのホスホリル化された支持体は次いで過剰の第３級アミン又はピリジンの添加により、アルキル化されたアンモニウム塩に転化される。このアンモニウム塩は脱水的な条件のもとにヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと反応させる。
もう１つの具体例において、工程ｂ）の反応はアンモニアを用いて行なわれる。次にそのヌクレオチド残基は、例えば６−クロロプリンリボシドの形で導入される。その得られたプリン誘導体は、例えば公知の方法により反応させて支持体に結合したAMP、ATP又は環状AMPの誘導体にすることができる。他のヌクレオシド含有化合物を与える類似の各種反応も知られている。
本発明は更に、表面に種々のポリマーが共有結合的に結合しているヒドロキシル基含有基礎支持体を基礎とするグラフトポリマーの燐酸エステル誘導体に関し、これは、
ａ）その基礎支持体が脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）その共有結合的に結合しているポリマーが末端のモノマー単位によりその基礎支持体に結合されており、
ｃ）それら各線状ポリマーは下記式IIIのモノマー単位、すなわち
但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、炭素数１〜５（C1〜C5）のアルキル基又は炭素数６〜12（C6〜C12）のアリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数であり、そして
１方の残基ＹはOHであって、他方の残基ＹはPO4H2である
ことを特徴とする。
最後に本発明は、グラフトされたポリマーの新規な燐酸エステル誘導体を、本発明に従うアフィニティークロマトグラフィー用吸着材の製造のために、及び液体クロマトグラフィー用カチオン交換材として使用することに関する。
第１工程は、燐酸又はその塩をドイツ特許DE 43 10 964に記載されている活性化された支持体物質のエポキシド基と反応させてこれら支持体物質との燐酸モノエステル誘導体にすることを含むか、又はそれらのエポキシド基をアンモニアと反応させてそのヒドロキシアミン誘導体にする。その活性化された支持体物質の中のオキシラン基の含有量と反応条件（燐酸／燐酸エステルの量、反応時間及び温度）の選択とにより、その支持体物質の燐酸モノエステル誘導体の置換の度合いを調節することができる。アンモニアとの反応における置換度は類似の態様で変えることができる。いかなる過剰のオキシラン基も通常的な方法により、例えばメルカプトグリセリンとの反応により、又は希硫酸による処理によって除くことができる。
この方法により作られた燐酸モノエステル誘導体はまた、カチオン交換材として使用することもできる。
生化学において、ヌクレオシドの語はピリミジン塩基であるチミン、ウラシル及びシトシンの、及びプリン塩基であるグアニン及びアデニンのリボース又は２−デオキシリボースを含むＮ−グリコシド類を表わすのに用いられる。ヌクレオチドはこれらのヌクレオシドの燐酸エステルである。ヌクレオシド２燐酸はピロ燐酸結合を介して最初の燐酸残基と結合しているもう１つの燐酸残基を含む。オリゴヌクレオチドは、燐酸ジエステル結合により結合している同一であっても異なっていてもよい複数個のヌクレオチドを含む。本発明によれば、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの語は、上にあげた塩基の代りに、例えばヒポキサンチン、５−メチルシトシン又はＮ−２−メチルグアノシンのような他のプリン塩基又はピリミジン塩基が存在している化合物、又はそのリボース又は２−デオキシリボースが別な糖残基又はリビトール（ribitol）のような糖アルコールで置き換えられている化合物をも表わす。この種の類似の化合物は当業者によく知られている。全体として、これらの化合物は本発明によれば、ヌクレオシド含有化合物又はヌクレオシド含有残基の語により包括される。このようなヌクレオシド含有化合物の例は、アデノシン、AMP、ADP、ATP、シクロ−AMP、CDP、UDP、GDP、NAD（Ｈ）、NADP（Ｈ）、FMN又はFADである。
酸とアルコールとから水の除去によってエステル結合が作り出されるが、同様に、２つの燐酸化合物からピロ燐酸結合が作り出される。最も普通の脱水剤は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのようなカルボジイミド類を含む。1,1'−カルボニルジイミダゾールがこの目的のために好ましく用いられる。他の脱水方法は、酸ハロゲン化物や酸無水物のような活性化された中間化合物を使用する。このような方法の詳細及びその好適な変形態様は例えば、種々の一般的なハンドブック等から当業者に公知である。式IIIのモノマー単位を含む燐酸エステル誘導体と、ヌクレオチド類と、の間のピロ燐酸結合を形成させるためには、Biochim.Biophys.Acta 91,1ff（1964）第１頁以下のMichelsonの方法が好ましい。この方法では各燐酸エステルを、第３級アミンを用い、又は第４級アンモニウム水酸化物を用いて対応する第１塩に変える。このような関係において、トリ−ｎ−ブチルアミン又はメチルトリ−ｎ−オクチルアンモニウムヒドロキシドを使用するのが好ましい。
ヌクレオシド誘導体を作るための他の種々の合成方法が当業者に知られており、これらは適当な態様で、ドイツ特許DE 43 10 964より公知の活性化された支持体物質との反応に適用することができ、この場合にはこれらの支持体物質の燐酸誘導体又はアミノ誘導体を好ましい中間体として使用する。このような反応は、そのアミノ誘導体の６−クロロプリンリボシド、2',3'−イソプロピリデン−６−クロロプリンリボシド又は６−クロロAMPによるアルキル化を含む。後者の場合には、その支持体物質に結合したAMP誘導体が直接得られる。次いでその保護されていないリボシド化合物をYoshikawa、M.Yoshikawa等:TetrahedronLett.（1967）1967,5065、M.Yoshikawa及びT.Kato:（1967）Bull.Chem.Soc.Jpn.40,2849、K.Kusashio及びM.Yoshikawa:（1968）Bull.Chem.Soc.Jpn.41,142、M.Yoshikawa等：（1969）Bull.Chem.Soc.Jpn.42,3505に従いホスホリル化（phosphorylate）することができる。その2',3'−イソプロピリデン誘導体の保護基はその5'−トシル化の後で除去することができる。全ての場合に、その引き続く誘導体化反応はヌクレオシドの化学の通常的な方法により実施することができる。これらは、J.Ludwig（1981）Acta Biochim.Biophys.Acad.Sci.Hung.16,131−133のATP合成、或いは、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド又はカルボニルジイミダゾールのような脱水剤によるAMP誘導体からのピロ燐酸エステル又はトリ燐酸エステルの形成を含む。シクロAMP誘導体のような環状燐酸エステル誘導体を作ることもできる。あげることのできる別な文献の１例はH.Guilford等（1972）Chimica Scripta ２,165−170である。
当業者が以上の記述をその最も広い意味で用いることができるであろうことは言うまでもない。従って、好ましい具体例は単に記述的なものと解するべきであって、いかなる意味においても限定的な記載であると解するべきではない。
以上及び以下にあげる全ての出願、特許及び刊行物並びに1993年10月２日に提出された対応するドイツ特許出願DE 43 33 674の完全な開示は本願に参考文献として採用される。
以下の諸例は主題を更に詳細に説明しようとするものであり、これらの例は本発明の主題のなんらかの限定を構成するものではない。
実 施 例
例 １ Fractogel（登録商標）−TSK HW 65（ｓ）より出発するオキシランで活性化された支持体の調製
沈降させたFractogel（登録商標）−TSK HW 65（ｓ）の50mlと25mlの水との懸濁液に、室温において激しく撹拌しながら2gの硝酸アンモニウムセリウム（IV）（25mlの2MのHNO3の中に溶解した）と混合する。１分間後に、30mlのジオキサンの中の3gの2,3−エポキシプロピルメタクリレートの溶液を加える。撹拌を３時間継続する。次にこの反応懸濁液をまず最初蒸留水で、次いで0.05MのEDTA溶液で洗浄する。
例 ２ 燐酸基を含む支持体物質の合成
例１に従い作った5gの乾燥ゲルを20mlの水の中に懸濁させ、そして8mlの燐酸（85％）を加える。この懸濁液を室温において３ないし４時間振盪する。この反応生成物をガラスフリット（G3）で濾別し、そして水で中性まで洗浄する。
この反応生成物を次にpH7.5の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液の中の1mlのメルカプトグリセリンで振盪のもとに処理（室温、３日間）して未反応のオキシラン基を除去する。
次いでこの燐酸基含有支持体物質を水で完全に洗浄する。このものは支持体物質1g当たり30μモルの燐酸を含む。
例 ３ 高燐酸含量の燐酸基含有支持体物質の合成
燐酸との反応を15時間にわたり実施する以外は、例１に従い作った5gの乾燥ゲルを例２におけるのと同様に反応させた。得られた燐酸基含有支持体物質は支持体物質1g当たり40μモルの燐酸を含む。
例 ４ シチジン5'−ジ燐酸（CDP）で誘導体化された支持体物質の合成
工程１：誘導体化支持体物質のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩
例２からの湿潤した反応生成物を30mlの水の中に懸濁させ、トリ−ｎ−ブチルアミン0.5mlを加え、そしてこの混合物を室温で１時間振盪する。この生成物を次にガラスフリット（G2）で濾過し、そして50mlのアセトンで３回洗浄する。その固体残渣を250mlの丸底フラスコの中で真空（５ないし７トール）のもとに50℃において１夜乾燥する。
工程２:CMPのメチル−トリ−オクチルアンモニウム塩
4.2gのメチルトリオクチルアンモニウムクロリドを100mlのメタノールの中に溶解させ、そしてカラム〔DOWEX（登録商標）1X2、200〜400メッシュ、OH型〕により第４級塩基に変える。この溶液を250mlのメタノール中の3.23gのCMP懸濁液に加える。得られたCMPのメチルトリオクチルアンモニウム塩を濃縮する。
工程３：ピロ燐酸ジフェニルで活性化されたCMP
工程２からのCMPのメチルトリオクチルアンモニウム塩１ミリモルを7mlのジオキサンと3mlのN,N−ジメチルホルムアミドとの混合物の中に溶解させる。この溶液に湿分の排除のもとに0.3mlのジフェニルホスホリルクロリドと0.45mlのトリ−ｎ−ブチルアミンとを加え、そしてこの混合物を３時間振盪する。次いで溶媒を回転蒸発器の中で真空のもとに除去し、そしてその残渣を30mlのジエチルエーテルで処理する。この懸濁液を０℃に１時間冷却し、そしてそのエーテル相を傾瀉して捨てる。この残渣を真空中で乾燥させ、2mlのジオキサンの中に再溶解させ、そして再び真空中で乾燥させる。
工程４:CMP及び誘導体化された支持体物質のピロ燐酸誘導体
工程１からの誘導体化された支持体物質を30mlのピリジンの中に懸濁させ、この懸濁液に、10mlのピリジンの中の0.5ミリモルの、工程３からのジフェニルピロ燐酸誘導体化されたCMPの溶液を湿分の排除のもとに加え、そしてこの混合物を室温において１夜振盪する。この反応生成物をガラスフリット（G2）で濾別し、そして250mlのメタノール、100mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び1000mlの水で洗浄する。
得られた物質は湿潤質量1g当たり25μモルのシチジンを含む〔加水分解（1N HCl、110℃で２時間）し、次いで1N NaOHで中和した後267nmのUV吸収で測定〕。
例 ５ グアノシン5'−ジ燐酸（CDP）で誘導体化された支持体物質の合成
工程１：誘導体化支持体物質のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩
この工程の操作は例４の工程１のそれと同じである。
工程２:GMPのトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩
3gのGMP（遊離の酸）と1.1gのトリ−ｎ−ブチルアミンとを250mlのメタノール中でその溶液が透明になるまで加熱し、次にこの溶液を濃縮して乾固させる。
工程３：ピロ燐酸ジフェニルで活性化されたGMP
工程２からのGMPのトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩１ミリモルを7mlのジオキサンと3mlのN,N−ジメチルホルムアミドとの混合物の中に溶解させる。この溶液に湿分の排除のもとに0.3mlのジフェニルホスホリルクロリドと0.45mlのトリ−ｎ−ブチルアミンとを加え、そしてこの混合物を３時間振盪する。次いで溶媒を回転蒸発器の中で真空のもとに除去し、そしてその残渣を30mlのジエチルエーテルで処理する。この懸濁液を０℃に１時間冷却し、そしてそのエーテル相を傾瀉して捨てる。この残渣を真空中で乾燥させ、2mlのジオキサンの中に再溶解させ、そして再び真空中で乾燥させる。
工程４:GMP及び誘導体化された支持体物質のピロ燐酸誘導体
工程１からの誘導体化された支持体物質を30mlのピリジンの中に懸濁させ、この懸濁液に、10mlのピリジンの中の0.5ミリモルの、工程３からのジフェニルピロ燐酸誘導体化されたGMPの溶液を湿分の排除のもとに加え、そしてこの混合物を室温において１夜振盪する。この反応生成物をガラスフリット（G2）で濾別し、そして250mlのメタノール、100mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び1000mlの水で洗浄する。
得られた物質は湿潤重量1g当たり30μモルのグアノシンを含む〔加水分解（1N CHl、110℃で２時間）し、次いで1N NaOHで中和した後270nmのUV吸収で測定〕。
例 ６ アミノ含有支持体物質の合成
例１に従い作った乾燥ゲル35gを200mlの濃アンモニア水溶液の中で室温において５日間振盪する。この操作の間においてその反応の進行は次のようにして調べることができる。すなわちその反応混合物乾燥試料をピリジンとともに煮沸する。エポキシド基がまだ存在する間はその支持体は褐色から黄色への脱色を受ける。反応完結の後でその支持体は無色に留まる。
この反応生成物を次にG3フリットの上で濾別し、そしてメタノール及びアセトンで洗浄する。このものを次に真空（10〜15ミリバール）の中で60〜70℃において乾燥させる。
この反応生成物は1.3％の窒素含有量を有する。エタノール性ニンヒドリン溶液とともに加熱したときにこの支持体は紫色に変わる。
例 ７ プリンリボシド含有支持体物質の合成
例６に従い作ったアミノ誘導体36gを150mlのアブソリュートエタノール（absolute ethanol）の中に懸濁させ、そしてこの懸濁液を3.6gの６−クロロプリンリボシド及び3.6mlのトリエチルアミンとともに還流において15時間加熱する。
この反応生成物を次にG3フリットの上で濾別し、そしてメタノール及びアセトンで洗浄する。この反応生成物を丸底フラスコに移して真空（10〜15ミリバール）の中で60〜70℃において乾燥させる。
カップリング度は約97％である。
例 ８ AMP含有支持体物質（ホスホリル化はYoshikawaによる）の合成
例７からの生成物に125mlの無水の燐酸トリエチルを加え、そして新しく蒸留した1.8mlのオキシ塩化燐を０℃において撹拌しながら加える。この混合物を０℃において３時間、次いで４℃において１時間撹拌する。次に過剰のオキシ塩化燐を真空において（10〜15ミリバール）溜去する。
AMP誘導体を作るために、この反応懸濁液を10℃において撹拌しながら500mlの炭酸水素ナトリウム水溶液（50g/l）の中にゆっくりと流し込む。この操作においてpHは7.8から7.2に低下する。30分間の後、この生成物をG3フリットにより吸引のもとに濾別し、そして水で洗浄する。0.1N HCl水溶液によるこのフリットの上でのナトリウム塩の処理は遊離の後（支持体のAMP誘導体）を与え、このものはこのフリットの上で水、メタノール及びアセトンで洗浄し、そして真空中（10〜15ミリバール）で70℃において乾燥させる。
例 ９ シクロ−AMP含有支持体物質の合成
例８からの乾燥生成物を撹拌機と還流凝縮器とを含む装置の中で150mlの無水のピリジンの中に懸濁させ、そして5.4gのジシクロヘキシルカルボジイミドを加える。この混合物を還流において４時間加熱する。この生成物を次にG3フリットの上で吸引のもとに濾別し、そしてジクロロメタン、メタノール、熱メタノール（ジシクロヘキシルウレア溶出用）、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、1Mの第１燐酸カリウム（pH4）及び水で洗浄する。その湿潤ゲルは0.1MのNaClを加えて20％（v/v）の水性エタノールの中で貯蔵する。
例 10 ATP含有支持体物質〔ATPの合成はJ.Ludwig（1981）Acta Biochim.Biophys.Acad.Sci,Hung.16,131−133による〕の合成
例８からの生成物（塩素誘導体、すなわち加水分解の前）をピロ燐酸のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩と反応させる。
振盪しながら無水のDMFの中の0.5Mのピロ燐酸のビス−トリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩とトリ−ｎ−ブチルアミンとの混合物を加える。５分間激しく振盪した後でその懸濁液を1Mの炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（pH7.5）で加水分解し、そして0.5時間の後にその生成物をG3フリットにより、吸引しながら濾別して水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄する。
ATPの収率は約60％（Ｐ分析）である。
使用例 Ａ 牛初乳からのシアリルトランスフェラーゼの分離
Superformance（登録商標）カラム（I.D.1.6cm）に例４に従うCDP含有支持体物質10gを充填し、そして25％グリセロールを含むpH6.8のMES緩衝液10mMで平衡化させる。分娩に続く第１日目の牛初乳を遠心分離により脱脂し、そして同じ緩衝液に対して完全に透析する。約１リットルの透析した初乳を1ml/分の流量でカラムに通ずる。溶離は1.0MのNaClの段階的勾配で行なう。
シアリルトランスフェラーゼの活性はCMP−［14C］−シアル酸のラクトースへの転移により求める。この測定には50μｌのMES緩衝液（最終濃度:MES 50mM、MnCl2 10mM、pH6.8）、0.8Mラクトース10μｌ及びCMP−［14C］−シアル酸（0.05μCi）10μｌとともに37℃において15分間インキュベートする。この反応バッチを、pH7.0の氷冷した5mMの燐酸カリウム緩衝液１ミリリットルで停止させ、そしてDowex 1X8−200を含む1mlカラムの上でクロマトグラフにかける。このような条件のもとでCMP−［14C］−シアル酸はこのカラムの上に引き止められ、一方その生成物である［14C］−シアリルラクトースは不結合分画の中に分離することができる。
シアリルトランスフェラーゼの活性の１単位は１分間当たり［14C］−シアル酸の１μモルの転移と定義される。支持体物質のグラム当たり0.2Uのシアリルトランスフェラーゼが結合される。この結合容量は比較物質（BrCN−セファローゼに結合されたCDP）のそれよりも50％大きい。この結合活性は1.0M NaClを用いて収率75％で溶離されたが、一方比較物質は８％よりも大きくない回収率しか示さなかった（0.2M NaClで溶離）。
使用例 Ｂ 人母乳からの１−3/4−フコシルトランスフェラーゼの分離
1000mlの人母乳を遠心分離により脱脂し、そして４℃においてpH6.8の10mMのカコジル酸Na、10mMのMgCl2、20％グリセロールに対して完全に透析する。その転移酵素の予備精製は、記述された方法（Epponberger−Castori等:Glycoconjugate J.,６,pp.101−114,1990）によりFractogel（登録商標）SO3（E.Merck）の上でのクロマトグラフィーによって行なわれる。
フコシルトランスフェラーゼの活性の測定は基質としてGDP−［14C］−フコースを用いて例６と同様に行なう。
SO3クロマトグラフィーからの各活性分画は透析により脱塩し、そして例５に従うGDP支持体物質の上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この目的のために、Superformance（登録商標）カラム（I.D.1.0cm）に2mlの支持体物質を充填してpH6.8の、カコジル酸Na 10mM、MgCl2 10mM、20％グリセロールにより平衡化させる。試料の添加に続いてこのカラムを平衡化緩衝液で完全に洗浄し、そしてNaCl勾配（０〜1.5M NaCl、20カラム容積、0.2ml/分）で溶離させる。
収率は約450倍精製について約83％である。フコシルトランスフェラーゼはSDSゲル電気泳動における主バンドとして（MW 47kD）見ることができる。
Claims (11)
- ヒドロキシル基含有基礎支持体を基礎とし、表面にポリマーが共有結合的に結合しているアフィニティークロマトグラフィー用分離材において、
ａ）この支持体が脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）その共有結合的に結合しているポリマーが末端のモノマー単位によりその基礎支持体に結合されており、
ｃ）それら各線状ポリマーは下記式IIのモノマー単位、すなわち
を含み、
但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、（C1〜C5）−アルキル基又は（C6〜C12）−アリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数であり、そして１方の残基ＸはOHであって、
他方の残基Ｘはヌクレオシド含有残基である
ことを特徴とする、上記分離材。 - ヌクレオシド含有残基Ｘが下記式IVの残基、すなわち
であることを特徴とする、請求項１の分離材。 - ヌクレオシド含有残基Ｘが下記式Ｖの残基、すなわち
であることを特徴とする、請求項１の分離材。 - ヌクレオシド含有残基Ｘが下記式VIの残基、すなわち
であることを特徴とする、請求項１の分離材。 - ヌクレオシド含有残基Ｘが下記式VII、すなわち
においてｍが１、２又は３である残基であることを特徴とする、請求項１の分離材。 - ヌクレオシド含有残基Ｘが下記式VIIIの残基、すなわち
であることを特徴とする、請求項１の分離材。 - 請求の範囲１ないし６のうちの１つの特徴を有する分離材のアフィニティークロマトグラフィーのための使用。
- 請求の範囲１ないし６のうちの１つの特徴を有する分離材を製造するに当たり、下記の工程、すなわち
ａ）下記式Ｉ、すなわち
（但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、（C1〜C5）−アルキル基又は（C6〜C12）−アリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数である）
のモノマー類をセリウム（IV）イオンの関与のもとにヒドロキシル基含有基礎支持体の上にグラフトさせ、
ｂ）上記工程ａ）からのエポキシド基含有支持体を、燐酸、燐酸のアルカリ金属又はアンモニアとを反応させ、そして
ｃ）上記工程ｂ）において得られた生成物にヌクレオシド含有残基を導入する各工程を特徴とする方法。 - 表面にポリマーが共有結合的に結合しているヒドロキシル基含有基礎支持体を基礎とし、グラフトされた燐酸エステル誘導体において、
ａ）この支持体が脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）その共有結合的に結合しているポリマーが末端のモノマー単位によりその基礎支持体に結合されており、
ｃ）それら各線状ポリマーは下記式IIIのモノマー単位、すなわち
を含み、
但しこの式において
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、（C1〜C5）−アルキル基又は（C6〜C12）−アリール基であり、
ｎは１〜５のいずれかの整数であり、そして１方の残基ＹはOHであって、他方の残基ＹはPO4H2である
ことを特徴とするグラフトされた燐酸エステル誘導体。 - 請求項９の燐酸エステル誘導体の請求項 ２、３または４に記載の分離材の製造への使用であっ て、
請求項９に記載のグラフトされた燐酸エステル誘導体の 式IIIで示されるモノマー単位の一方のＹをOHとし、他 方を式IV、ＶまたはVIで示されるヌクレオシド含有残基 に変換して請求項２、３または４のいずれかに記載の分 離材を得ることを特徴とする分離材の製造方法への使 用。 - 請求の範囲９の燐酸エステル誘導体の液体クロマトグラフィーのためのカチオン交換材としての 使用。
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