CN1147501C - 核苷酸的生产方法 - Google Patents
核苷酸的生产方法Info
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Abstract
本发明为一种核苷酸的生产方法，包括将POCl3加到磷酸三甲酯和核苷悬浮液中，加入焦磷酸后上GJ01树脂柱，洗脱得三磷酸核苷盐，GJ01树脂柱的制备包括将明胶加入去离子水中，再依次加入过氧化苯甲酰，汽油和二氧六环，苯乙烯、二乙烯苯、加温，过筛取白球，将白球氯甲基化后再叔胺化，过筛即得产品。本发明工艺简单，收率高，产品纯度高，适于规模化生产。
Description
技术领域：
本发明与以核苷为原料合成核苷酸的工艺有关，尤其与核苷酸的大规模合成工艺有关。
背景技术：DNA复制的基础物质是5′-核苷三磷酸(简称核苷酸)。Yoskihawa等用POCl3将核苷磷酰化得到以5′-二氯磷酸核苷为主的产物。随后Slotjn等在中性水溶液，氨水及乙醇溶液中处理得到5′-核苷单磷酸盐、3′，5′-核苷环磷酸等一系列产物。Ludwig发现5′-二氯磷酸核苷可以在中性无水DMF溶液中与过量的焦磷酸三正丁铵反应生成核苷三磷酸。
已知的核苷酸合成方法主要有：
1、Ott法，以5′-核苷单磷酸三正丁铵盐与过量的1，1′-羰二酰咪唑于室温下反应1hr，活化生成5′-核苷单磷酰咪唑。未反应的1，1′-羰二酰咪唑用甲醇除去。生成的5′-核苷单磷酰咪唑与焦磷酸盐反应生成5′-核苷三磷酸。
反应产物用DEAE阴离子纤维树脂层析柱分离纯化。采用0-0.4mol碳酸三乙铵进行梯度洗脱，所得核苷酸三乙铵盐用甲醇溶解，加入高氯酸钠转型成钠盐。
2、Ludwig法，0.26mmol POCl3，加入到0.5ml磷酸三甲酯和0.20mmol核苷悬浮液中，0℃搅拌1.5hr。反应混合物中加入2m1 0.5M焦磷酸三正丁铵盐的DMF溶液和0.2ml Bu3N，迅速剧烈搅拌。一分钟后加入pH＝7.5的碳酸三乙铵缓冲液水解。反应产物用DEAE纤维树脂层析分离，洗脱剂为碳酸三乙铵盐，0-0.4mol梯度洗脱，得核苷酸三乙铵盐。
已知方法的缺点：
Ott法工艺流程复杂，必须首先制得5′-核苷单磷酸铵盐，使用二次层析分离，而且采用DEAE纤维树脂层析分离，工艺难以放大，很难获得高纯度产品，必须用高压液相色谱再次分离纯化。
Ludwig法反应简单，但采用DEAE树脂分离同样难以放大，只能放大到1g范围之内，且收率极低，只有5％左右；另外，核苷酸用于DNA的复制，要求不含焦磷酸盐，因为焦磷酸能够络合Caz+、Mgz+、而Caz+、Mgz+是DNA聚合酶的辅助因子，所以产品中若有焦磷酸盐存在将影响DNA聚合酶的催化活性。此方法使用过多的焦磷酸丁铵盐，必须使用HPLC分离去除焦磷酸盐，而HPLC难以放大且成本相当高。
发明内容：本发明的目的是提供一种工艺简单，可以大规模合成核苷酸，产品收率高、纯度高，生产成本低的核苷酸的生产方法。
本发明是这样实现的：
本发明核苷酸的生产方法，包括将POCl3加到磷酸三甲酯和核苷悬浮液中反应，反应混合物中加入焦磷酸盐，搅拌后上树脂柱分离纯化，用碳酸盐溶液梯度洗脱得三磷酸核苷盐。其特征在于所述的树脂柱为离子交换树脂GJ01柱，GJ01柱的制备方法如下：
(1)将明胶加入去离子水中，加热搅拌至50-70℃，形成0.5-1.0％重量的明胶水溶液；
(2)在明胶水溶液中依次加入0.5-1.0％重量的过氧化苯甲酰，10-20％重量的汽油和二氧六环，10-30％重量的苯乙烯，1-5％重量的二乙烯苯，每隔一段时间取样观察颗粒大小及硬度，待颗粒变硬，升温至70-90℃并保温5-10小时，过滤，水洗涤，晾干，过筛取100-120目白球；
(3)将白球氯甲基化，1-5公斤白球加入2-3倍重量的氯甲甲醚浸泡溶胀1-3小时；
(4)将溶胀白球搅拌升温至30-60℃；
(5)加入白球重量10-50％的氯化锌，继续搅拌2-6小时，过滤，丙酮洗涤，真空干燥，过筛收取100-120目氯甲基化树脂；
(6)将1-5公斤氯甲基化树脂加入1-5倍重量的40％二乙醇胺水溶液和1-4倍重量的二氧六环混合物中，常温搅拌10-24小时，过滤，丙酮洗涤，水洗，干燥，过筛收取100-120目GJ01树脂。
本发明在使用前将GJ01树脂柱预处理，其方法为：将1公斤GJ01树脂和1500毫升水装入直径9厘米层析柱，浸泡24小时，用双蒸水洗涤1次，盐酸，氢氧化钠各洗涤一次，再用双蒸水洗涤后备用。
本发明焦磷酸盐为0.1-0.5M的焦磷酸三乙铵，其与磷酸三甲酯的体积比为1-5∶2-4。
本发明焦磷酸三乙铵的制备方法如下：
(1)将焦磷酸钠溶于双蒸水，得2.0-6.0％浓度的焦磷酸钠水溶液，
(2)将溶液通过20-100公斤的Dowex50(酸型)离子交换柱，水洗，使钠离子与氢离子发生交换，生成焦磷酸，合并收集液，
(3)将收集液减压浓缩，
(4)在浓缩液中加入1-4倍体积的三乙胺，反应得焦磷酸三乙铵，蒸干，加入无水DMF至1-4倍体积。
本发明三磷酸核苷的制备方法如下：
(1)将核苷0.5-1mol悬浮于2.00-4.0升磷酸三甲酯中，搅拌，冰水浴冷却10-40分种后，缓慢加入40-120毫升POCl3搅拌1-4小时生成以5′-单磷酸核苷为主的混合物，
(2)加入0.1-0.5M焦磷酸三乙铵1-5升，强烈搅拌10-120分钟，生成以5′-三磷酸核苷为主的混合物，
(3)加入0.5-1.5M碳酸氢铵水溶液2-6升，减压蒸馏至干，加500-10000毫升水溶液，
(4)将水溶液上GJ01柱，首先用5-10升水洗涤，再用0-0.8M的碳酸氢铵水溶液梯度洗脱，收集产品流份，减压蒸馏至晶体析出，过滤，洗涤干燥得三磷酸核苷铵盐，
(5)将三磷酸核苷铵盐溶于1000-4000毫升双蒸水，通过1000-2000毫升Dowex50(钠离子型)离子交换柱，并用1000-2000毫升双蒸水洗涤，合并流出液，减压蒸馏，冷冻干燥，得白色三磷酸核苷钠盐。
本发明可使用等当量的焦磷酸盐加入悬浮液中。
本发明的(1)中的核苷为0.54mol，磷酸三甲酯为2.8升，冰水浴冷却时间为20分钟，加入POCl3，磷酸三甲酯为2.8升，冰水浴冷却时间为20分钟，加入POCl3为60毫升，强烈搅拌时间为50分钟，(3)中加入1M碳酸氢铵水溶液3升，加入1000毫升水溶解，(4)中上GJ01柱首先用10升水洗涤，再用0-0.2M的碳酸氢铵水溶液梯度洗脱，(5)中将三磷酸核苷铵盐溶于3000毫升双蒸水，通过1000毫升Dowex50离子交换柱，并用1000毫升双蒸水洗涤。
本发明核苷为2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷或2′-脱氧鸟苷或2′-脱氧胞苷或腺苷或尿苷或鸟苷或胞苷或2′、3′-双脱氧腺苷或2′、3′-双脱氧胸苷或2、3′-双脱氧鸟苷或2′、3′-双脱氧胞苷或碱基结构修饰的2′-脱氧核苷或碱基结构修饰的核苷或碱基结构修饰的2′、3′-双脱氧核苷。
本发明与已知的合成方法相比，具有简便、高效、适于规模化等优点。核苷和POCl3在磷酸三甲酯溶剂系统中反应，形成5′-单磷酰化产物，然后与等当量焦磷酸盐反应并延长三磷酸化时间生成核苷酸，产品用自行研制的大孔弱碱离子交换树脂吸附并用磷酸氢铵溶液梯度洗脱。经31P核磁共振检测，产品中不含焦磷酸盐、5′-核苷单磷酸及5′-核苷二磷酸。产品数量以百克计，收率在10-15％左右。
与已知方法比较本发明有以下主要特点：
1，本发明为大规模合成核苷酸工艺，产品数量以百克计；而巳知方法只适应小规模合成，其产品仅以mg、ug计；
2，采用改进的Ludwig法，反应投料比、反应温度及反应时间都有所不同。使用等当量的焦磷酸盐，延长三磷酸化的时间化获得较高的收率。由于焦磷酸使用量小，为下一步的分离纯化带来了方便。
3，反应物不是用碳酸三乙铵缓冲液水解，而是用碳酸氢铵溶液水解；
4，产品采用自行研制的大孔弱碱性阴离子交换树脂吸附，并用0-00.8M的碳酸氢铵溶液作梯度洗脱分离纯化核苷酸，经过一次分离纯化即可获得产品。
5，用Dowex50强酸阳离子交换树脂进行离子转型获得核苷酸钠盐。
附图说明：
如下是本发明的附图。
图1为本发明的生产流程图。
图2为制备离子交换树脂GJ01的工艺流程图。
具体实施方式 如下是本发明的实施例：
实施例1：dATP的制备
1、焦磷酸三乙铵的制备：
将4.5公斤能从市场上购得的焦磷酸钠(100mol)溶于100升双蒸水，通过Dowex50(50公升，酸型)离子交换柱，100升水洗，合并收集液。减压浓缩至10升，加三乙胺10升，蒸干，加无水DMF至40升，配制成0.25M的溶液于4℃保存备用。
2、离子交换树脂GJ01的制备：
100-120目白球：400克明胶加入40公斤去离子水中，加热搅拌至70℃，待明胶全部溶解，依次加入400克过氧化苯甲酰、8公斤汽油和二氧六环、10公斤苯乙烯、2公斤二乙烯苯(含量50％)，每隔10分钟取样观察颗粒大小及硬度，并调解搅拌速度。待颗粒变硬，升温至90℃并保温8小时。过滤，水洗涤，晾干，过筛取100-120目白球备用。
氯甲基化：5公斤100-120目白球加入15公斤氯甲甲醚，浸泡溶液2小时，搅拌升温至50℃，加入2300克氯化锌，继续搅拌4小时，过滤，丙酮洗涤，真空干燥，过筛收取100-120目氯甲基化树脂。氯含量15％。
叔胺化：1公斤氯甲基化树脂加入5公斤40％(重量浓度)二乙醇胺水溶液和4公斤二氧六环混合物中，常温搅拌12小时，过滤，丙酮洗涤，水洗，干燥，过筛收取100-120目GJ10树脂。
3、GJ10柱的预处理：
1公斤GJ10树脂和1500毫升水装入直径9厘米层析柱，浸泡24小时，3000毫升双蒸水洗涤1次，3000毫升2N盐酸，2N氢氧化钠各洗涤一次，3000毫升双蒸水洗涤后备用。
4、dATP的制备：
2′-脱氧腺苷(135克，0.54mol)悬浮于2.8升磷酸三甲酯中，搅拌并用冰水浴冷却。20分钟后，于反应混合物中慢慢加入60毫升POCl3，继续搅拌2小时。加入0.25M焦磷酸三乙铵(2000毫升)，强烈搅拌50分钟后，倒入1M碳酸氢铵水溶液(3升)，减压蒸馏至干，加1000毫升水溶解，上GJ10柱，首先用10升水洗涤，再用0-0.2M的碳酸氢铵水溶液梯度洗脱，收集产品流份，减压蒸馏至晶体析出，放置12小时，过滤，洗涤干燥得28克dATP铵盐。将25克dATP铵盐溶于3000毫升双蒸水，通过1000毫升Dowex(钠离子型)离子交换柱，并用1000毫升双蒸水洗涤，合并流出液，减压蒸馏，冷却干燥，得白色dATP钠盐(29.5克，收率10.2％)。纯度＞98％(HPLC法)；
31P-NMR(D2O+NaOD)：-8.734(d，J＝19Hz)；-10.302(d，J＝18Hz)；-19.102(t＝J＝18Hz)。
实施例2：dTTP的制备：′
工艺同dATP，2′-脱氧胸苷用量122克，收率15％；纯度＞98％(HPLC法)；31P-NMR(D2O+NaOD)：-8.347(d，J＝19Hz)；-10.829(d，∫＝19Hz)；-21.238(t，J＝19Hz)。
实施例3：dGTP的制备：
工艺同dATP，2′-脱氧鸟苷用量144克，收率10％；纯度＞98％(HPLC法)；
31P-NMR(D2O+NaOD)：-8.356(d，J＝19Hz)；-10.735(d，J＝19Hz)；-21.646(t，J＝19Hz)。
实施例4：dCTP
工艺同dATP，2′-脱氧乌苷用量144克，收率10％；纯度＞98％(HPLG法)；
31P-NMR(D2O+NaOD)：-8.694(d，J＝20Hz)；-10.934(d，J＝200Hz)；-21.818(t，J＝20Hz)。
Claims (8)
1、一种核苷酸的生产方法，包括将POCl3加到磷酸三甲酯和核苷悬浮液中反应，反应混合物中加入焦磷酸盐，搅拌后上树脂柱分离纯化，用碳酸盐溶液梯度洗脱得三磷酸核苷盐，其特征在于所述的树脂柱为离子交换树脂GJ01柱，GJ01柱的制备方法如下：
(1)将明胶加入去离子水中，加热搅拌至50-70℃，形成0.5-1.0％重量的明胶水溶液；
(2)在明胶水溶液中依次加入0.5-1.0％重量的过氧化苯甲酰，10-20％重量的汽油和二氧六环，10-30％重量的苯乙烯，1-5％重量的二乙烯苯，每隔一段时间取样观察颗粒大小及硬度，待颗粒变硬，升温至70-90℃并保温5-10小时，过滤，水洗涤，晾干，过筛取100-120目白球；
(3)将白球氯甲基化，1-5公斤白球加入2-3倍重量的氯甲醚浸泡溶胀1-3小时；
(4)将溶胀白球搅拌升温至30-60℃；
(5)加入白球重量10-50％的氯化锌，继续搅拌2-6小时，过滤，丙酮洗涤，真空干燥，过筛收取100-120目氯甲基化树脂；
(6)将1-5公斤氯甲基化树脂加入1-5倍重量的40％二乙醇胺水溶液和1-4倍重量的二氧六环混合物中，常温搅拌10-24小时，过滤，丙酮洗涤，水洗，干燥，过筛收取100-120目GJ01树脂。
2、根据权利要求1所述的核苷酸的生产方法，其特征在于在使用前将GJ01树脂柱预处理，其方法为：将1公斤GJ01树脂和1500毫升水装入直径9厘米层析柱，浸泡24小时，用双蒸水洗涤1次，盐酸，氢氧化钠各洗涤一次，再用双蒸水洗涤后备用。
3、根据权利要求1所述的核苷酸的生产方法，其特征在于使用与核苷悬浮液相比的等当量的焦磷酸盐加入悬浮液中。
4、根据权利要求1所述的核苷酸的生产方法，其特征在于所说的焦磷酸盐为0.1-0.5M的焦磷酸三乙铵，其与磷酸三甲酯的体积比为1-5∶2-4。
5、根据权利要求4所述的核苷酸的生产方法，其特征在于焦磷酸三乙铵的制备方法如下：
(1)将焦磷酸钠溶于双蒸水，得2.0-6.0％浓度的焦磷酸钠水溶液，
(2)将溶液通过20-100公斤的Dowex50酸型离子交换柱，水洗，使钠离子与氢离子发生交换，生成焦磷酸，合并收集液，
(3)将收集液减压浓缩，
(4)在浓缩液中加入1-4倍体积的三乙胺，反应得焦磷酸三乙铵，蒸干，加入无水DMF至1-4倍体积。
6、根据权利要求1或2或3或4或5所述的核苷酸的生产方法，其特征在于所说的核苷酸为三磷酸核苷，其制备方法如下：
(1)将核苷0.5-1mol悬浮于2.0-4.0升磷酸三甲酯中，搅拌，冰水浴冷却10-40分种后，缓慢加入40-120毫升POCl3搅拌1-4小时生成以5′-单磷酸核苷为主的混合物，
(2)加入0.1-0.5M焦磷酸三乙铵1-5升，强烈搅拌10-120分钟，生成以5′-三磷酸核苷为主的混合物，
(3)加入0.5-1.5M碳酸氢铵水溶液2-6升，减压蒸馏至干，加500-1000毫升水溶解，
(4)将水溶液上GJ01柱，首先用5-10升水洗涤，再用0-0.8M的碳酸氢铵水溶液梯度洗脱，收集产品流份，减压蒸馏至晶体析出，过滤，洗涤干燥得三磷酸核苷铵盐，
(5)将三磷酸核苷铵盐溶于1000-4000毫升双蒸水，通过1000-2000毫升Dowex50钠离子型离子交换柱，并用1000-2000毫升双蒸水洗涤，合并流出液，减压蒸馏，冷冻干燥，得白色三磷酸核苷钠盐。
7、根据权利要求6所述的核苷酸的生产方法，其特征在于(1)中的核苷为0.54mol，磷酸三甲酯为2.8升，冰水浴冷却时间为20分钟，加入POCl3为60毫升，强烈搅拌时间为60分钟，(3)中加入1M碳酸氢铵水溶液3升，加入1000毫升水溶解，(4)中上GJ01柱首先用10升水洗涤，再用0-0.2M的碳酸氢铵水溶液梯度洗脱，(5)中将三磷酸核苷酸盐溶于3000毫升双蒸水，通过1000毫升Dowex50离子交换柱并用1000毫升双蒸水洗涤。
8、根据权利要求7所述的核苷酸的生产方法，其特征在于所说的核苷为2′-脱氧腺苷或2′-脱氧胸苷或2′-脱氧鸟苷或2′-脱氧胞苷或腺苷或尿苷或鸟苷或胞苷或2′、3′-双脱氧腺苷或2′-3′-双脱氧胸苷或2′、3′-双脱氧鸟苷或2′、3′-双脱氧胞苷或碱基结构修饰的2′-脱氧核苷或碱基结构修饰的核苷或碱基结构修饰的2′、3′-双脱氧核苷。
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