CN101921296B - 一种5’-核苷酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种5’-核苷酸的制备方法，步骤为：将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在-30℃-20℃的温度下接触使核苷进行磷酸化，得到5’-核苷酸；所述的核苷与催化剂的重量比是100∶0.5-1.5。该方法可以制得高纯度和高收率的5’-核苷酸，缩短了核苷磷酸化反应的时间，使在核苷酸纯化时杂质的去除更加容易，降低后处理难度。
Description
技术领域
本发明涉及核苷磷酸化的方法，尤其是在悬浮反应液中加入催化剂，提高核苷5’位羟基磷酸化的选择性，抑制副产物的生成。
背景技术
核苷酸在农业、食品和医药行业有着广泛的用途。尤其是在婴儿食品和医药领域的应用中，有着不可替代的功能。在医药领域，临床实验表明，核苷酸参与人体代谢，促进内脏器官改进和恢复，改善骨髓造血功能，可作为治疗癌症病毒的辅助药物，是一种非常重要的医药原料。除在医药行业应用外，在精细化工及食品行业中核酸类物质也有重要作用。核酸类物质作为化妆品的成分之一，有护肤、防皱等功效。核酸类物质用做植物营养添加剂，使用后可以明显提高水稻、大豆等农作物的产量，最高增产可以达40％。用于动物的饲养可以提高动物的增重率及饲料使用率，料耗明显降低。5″-核苷酸用途广泛，与人们的生活息息相关，研究其不同的合成路径对医药，食品，农业等都有着非常重要的意义。目前核苷酸制备生成方法有：化学合成法、微生物发酵法、酶解法以及酶催化法，分别是从不同的角度研究了核苷酸的合成，但也各有利弊。化学法，主要是以核苷为原料进行常规磷酸化反应。当核苷如肌苷或鸟苷用三氯氧磷在磷酸三乙酯存在下磷酸化时，在得到所需的5’-单核苷酸的同时会产生2’位磷酸酯、3’位磷酸酯、二磷酸酯、嘌呤和其他副产物。这是因为核苷磷酸化虽然主要发生在5’位羟基，但是2’位羟基和3’位羟基也同时进行了磷酸化，这样就产生了2’位磷酸酯、3’位磷酸酯杂质。并且还存在其他副反应。因为副反应多，杂质多，所以提纯困难，纯度低，收率低(US3413282，1968)。微生物发酵法，主要是利用微生物菌株的生物合成途径来生产核苷酸，副产物少，成本低，但此法的应用受到微生物特性的很大限制。酶解法，酶解法生产核苷酸是历史最长、技术最成熟的生产方法，已成为制备各种天然核苷酸的经典方法，但是此法由于反应器的膜易堵塞而且膜反应器维护费用高，故不适用于大规模工业生产。酶催化方法，同时具有微生物法的产物单一，成本低的优点，又有化学法的作用范围广泛的特点，正受到越来越多的重视。此法的不足之处在于对酶的筛选工作量很大，同时酶的底物作用范围也有一定的限制。
发明内容
针对上述缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种高纯度、高收率的5’-核苷酸的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种5’-核苷酸的制备方法，步骤为：将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在-30℃-20℃的温度下接触使核苷进行磷酸化，得到5’-核苷酸；所述的核苷与催化剂的重量比是100∶0.5-1.5。
进一步：在上述5’-核苷酸的制备方法中，所述的核苷是肌苷、鸟苷中的一种或两种。所述的磷酸三低级烷酯是磷酸三甲酯、磷酸三乙酯中的一种或两种。所述的催化剂是四氮唑、间氯过氧化苯甲酸中的一种或两种。所述的磷酸化试剂是三聚磷酸钠STP、五氧化二磷P2O5、磷酸H3PO4、三氯氧磷POCl3中的一种或几种，或者这些物质的全部。
与现有的核苷酸的制备方法相比，本发明将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在-30℃-20℃的温度下接触，以对所述的核苷进行磷酸化，由此得到5’-核苷酸。本发明磷酸化反应周期短，只需要3-5小时，而常规磷酸化反应需要5-7小时。本发明磷酸化反应收率高达到95％～98％，常规磷酸化反应收率85％～90％。因此，本发明磷酸化反应副反应少，副产物少，容易纯化，从而可以生产出高纯度、高收率的5’-核苷酸。
具体实施方式
本发明的主旨是将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在-30℃-20℃的温度下接触，以对所述的核苷进行磷酸化，由此得到5’-核苷酸。按照本发明，可以制得高纯度和高收率的5’-核苷酸，缩短了核苷磷酸化反应的时间，使在核苷酸纯化时杂质的去除更加容易，降低后处理难度。下面结合实施例对本发明的内容作进一步详述，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定，制备过程中各个原材料的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。
比较例1
比较例采用背景技术US3413282，1968中的方法。
在500ml三口瓶中投入100g肌苷，加入1400g磷酸三乙酯，搅拌降温到-10℃，缓慢加入130g三氯氧磷，6小时后，取样检测，高效液相色谱目标产物峰保留时间与5’-肌苷酸标准品保留时间一致，按照高效液相色谱法计算5’-肌苷酸收率89.5％。
用高效液相色谱仪进行目标产物保留时间与标准品保留时间比较，鉴定目标产物，以及目标产物高效液相色谱法定量分析的方法和条件如下(下面的比较例和实施例应用相同的方法和条件)：
标准品：5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸(sigma公司)
仪器：高效液相色谱仪(Agilent 1200)
柱：BDS C184.6mmx250mm
流动相：0.5％磷酸二氢钾溶液
流速：1.2ml/秒
比较例2
在500ml三口瓶中投入100g鸟苷，加入1500g磷酸三乙酯，搅拌降温到-10℃，缓慢加入140g三氯氧磷，6小时后，取样检测，高效液相色谱目标产物峰保留时间与5’-鸟苷酸标准品保留时间一致，按照高效液相色谱法计算5’-鸟苷酸收率86.8％。
实施例1
在500ml三口瓶中投入100g肌苷，加入1400g磷酸三乙酯，搅拌，加入0.5g四氮唑和0.5g间氯过氧化苯甲酸，降温到-10℃，缓慢加入130g三氯氧磷，3小时后，取样检测，高效液相色谱目标产物峰保留时间与5’-肌苷酸标准品保留时间一致，按照高效液相色谱法计算5’-肌苷酸收率97.2％。
实施例2
在500ml三口瓶中投入100g鸟苷，加入1500g磷酸三乙酯，搅拌，加入0.5g四氮唑和0.5g间氯过氧化苯甲酸，降温到-10℃，缓慢加入140g三氯氧磷，3小时后，取样检测，高效液相色谱目标产物峰保留时间与5’-鸟苷酸标准品保留时间一致，按照高效液相色谱法计算5’-鸟苷酸收率96.8％。
Claims (3)
1.一种5’-核苷酸的制备方法，步骤为：
将核苷悬浮于由磷酸三低级烷酯组成的有机溶剂中，加入催化剂，然后将所得的悬浮液与磷酸化试剂在-30℃-20℃的温度下接触使核苷进行磷酸化，得到5’-核苷酸；所述的核苷与催化剂的重量比是100∶0.5-1.5；
所述的催化剂是四氮唑、间氯过氧化苯甲酸中的一种或两种；
所述的磷酸三低级烷酯是磷酸三甲酯、磷酸三乙酯中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的5’-核苷酸的制备方法，其特征在于：所述的核苷是肌苷、鸟苷中的一种或两种。
3.根据权利要求2所述的5’-核苷酸的制备方法，其特征在于：所述的磷酸化试剂是三聚磷酸钠STP、五氧化二磷P2O5、磷酸H3PO4、三氯氧磷POCl3中的一种或几种。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| JP特开昭51-141884A 1976.12.07 |
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