CN104293867A - 一种2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，所述的方法为：以2’-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐和5-氟尿嘧啶为底物，以产嘧啶核苷磷酸化酶的菌株经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以pH值为6.5～8.5的磷酸缓冲液为反应介质，在45～65℃条件下进行转化反应，反应结束后，获得2’-脱氧-5-氟尿苷；本发明方法2’-脱氧-5-氟尿苷的转化率达到了79.36％，一步酶促合成，条件温和，反应时间短，并且避免了底物脱氧核糖供体来源不足、价格昂贵的问题；应用全细胞进行催化，无需进行酶的分离纯化，反应结束后菌体回收方便，有利于工业规模化生产。

Description

一种2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法

(一)技术领域

本发明涉及一种2’-脱氧-5-氟尿苷的合成方法，特别涉及一种2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法。

(二)背景技术

5-氟尿嘧啶首次合成于1957年，目前仍用于治疗多种恶性肿瘤，但是其自身毒性较大、扩散能力较弱和抗药性限制了5-氟尿嘧啶的使用。2’-脱氧-5-氟尿苷为其前体药物，具有低细胞毒性和易于在体内被吸收的优点，它通过抑制胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶，阻断尿嘧啶脱氧核苷酸转变成胸腺嘧啶核苷酸，影响DNA的合成，从而起到抗病毒复制和抗肿瘤的作用。

曹萌萌等报道了化学法合成2’-脱氧-5-氟尿苷的改进工艺，以氟尿嘧啶为起始原料，经硅醚化、缩合、溴化、氢化和皂化等工艺(如图1所示)，最后得总收率为34.31％。采用该合成路线收率较低，且需使用有毒化学试剂，对环境及人身均有不利影响，不符合现在倡导的绿色友好化学的主题。

朱仁发等报道了以5-氟尿嘧啶核苷为原料，经丙酰溴酰化溴代得2’-溴代-3’,5’-O-二丙酰基-5-氟尿嘧啶核苷，然后氢化得产物2’-脱氧2’,5’-O-二丙酰基-5-氟尿嘧啶核苷，最后经皂化合成2’-脱氧-5-氟尿苷，总收率为72.0％，其合成流程如图2所示。采用该合成方法能获得较高的产物收率，但以5-氟尿苷作为原料，生产成本高，反应中使用的H2也具有一定的危险性，回收中间产物用于下一步反应也需大量使用有机溶剂，同样会对环境造成污染。

而周长林等曾报道利用产核苷磷酸化酶的游离大肠杆菌细胞进行发酵培养，研究中发现在培养基中添加1.0mg/L底物脱氧尿苷可以使菌体核苷磷酸化酶的活力提高11.0％，而加入另一种底物5-FU时细胞的生长受到抑制。以脱氧尿苷和5-氟尿嘧啶为原料合成2’-脱氧-5-氟尿苷，产物2’-脱氧-5-氟尿苷的转化率可达50％，浓度约为9mmol/L。

综上所述，作为一种开发较早，研究较为透彻的一种核苷类药物，2’-脱氧-5-氟尿苷仍然在肿瘤的临床用药上占据一席之地，对其如何高效生产的研究是有意义的。采用化学法进行合成，无论是采用全合成路线还是半合成路线，均存在着需要进行基团保护、大量使用有机溶剂，以及产物构型需要拆分等问题。而采用生物法进行合成，从其结构上来说与天然核苷的差异较小，不存在无法被核苷磷酸化酶识别的问题，反应过程条件温和，无需使用各种有机试剂，无需进行基团保护，工艺简单，并且反应产物构型单一，无需进行复杂的结构拆分，收率高等。但酶法同样存在着问题，比如在反应中由底物核苷分解产生的碱基会竞争酶的作用位点，对产物合成造成干扰，以及后续的分离纯化由于反应液中同时存在着未反应的底物核苷、碱基，核苷分解生产的碱基以及所需的产物，并且这些物质在结构上较相似，造成分离难度较大。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，以解决现有化学及酶法合成中转化率低、脱氧核糖供体来源不足等问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，所述的方法为：以2’-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐和5-氟尿嘧啶为底物，以产嘧啶核苷磷酸化酶的菌株经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以pH值为6.5～8.5的磷酸缓冲液为反应介质，在45～65℃条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得2’-脱氧-5-氟尿苷；所述催化剂是将产嘧啶核苷磷酸化酶的菌株经种子培养后接种至含诱导剂的发酵培养基中进行发酵培养获得的，所述诱导剂为腺苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷或胞嘧啶。

本发明所述2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法的方程式为(1为2’-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐，2为5-氟尿嘧啶，3为2’-脱氧-5-氟尿苷)：

进一步，所述2’-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐的初始浓度为20～40mmol/L缓冲液，所述5-氟尿嘧啶的初始浓度为20～120mmol/L缓冲液，所述催化剂的用量以湿菌体质量计为100～120g/L缓冲液。

进一步，所述产核苷磷酸化酶的菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)CCTCC AB 205442，购自中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC AB 205442。

进一步，所述诱导剂的添加终浓度为5～25mmol/L发酵培养基(优选15mmol/L)。

进一步，所述诱导剂优选为腺苷(9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤)、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷。

进一步，本发明所述催化剂按如下步骤制备：

(1)斜面培养

将产嘧啶核苷磷酸化酶的菌株(优选蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CCTCC AB 205442)接种至LB斜面培养基，在35℃培养24h，获得斜面菌体；所述每升斜面培养基的组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂，加蒸馏水至1L，pH为7.0；

(2)种子培养

挑取斜面菌体接种至种子培养基，在35℃、180rpm条件下培养16h，获得种子液；所述每升种子培养基的组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加蒸馏水至1L，pH为7.0；

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度1％的接种量接种至含终浓度15mmol/L诱导剂的发酵培养基，在35℃、180rpm条件下发酵培养24h，离心，收集沉淀用生理盐水洗涤3次，即获得湿菌体；所述每升发酵培养基组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，3.65g胞苷，加蒸馏水至1L，pH为7.0。

进一步，本发明所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液进行柱层析，以C18填料作为分离介质，以体积浓度10％甲醇水溶液作为洗脱剂进行分离，TLC跟踪检测，展开剂为二氯甲烷:甲醇:乙酸＝9:1:0.1(体积比)，同时采用紫外(254nm)及百里酚显色跟踪检测反应是否完全，收集含目标组分的洗脱液，即为2’-脱氧-5-氟尿苷。

本发明所述的缓冲液为磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液等中的一种或者几种的混合，浓度为15～75mmol/L。

本发明使用的产嘧啶核苷磷酸化酶可以是任何来源的，只要微生物能生产有效量的嘧啶核苷磷酸化酶即可。高温条件(优选为45～65℃)下反应可以有效地抑制磷酸酯酶对底物2’-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐的降解，但温度过高(大于65℃)对2’-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐的稳定性亦有不利影响。本发明优选为芽孢杆菌，在细菌基础培养基上添加氮源、碳源或者表面活性剂、产酶促进剂、诱导剂(优选为核苷类似物)等都可以有效的提高酶活。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明所述2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法使2’-脱氧-5-氟尿苷(以脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐物质的量计量)的转化率达到了79.36％，一步酶促合成，条件温和，反应时间短，并且避免了底物脱氧核糖供体来源不足、价格昂贵的问题；应用全细胞进行催化，无需进行酶的分离纯化，反应结束后菌体回收方便，有利于工业规模化生产。

(四)附图说明

图1为2’-脱氧-5-氟尿苷现有的工艺流程图。

图2为2’-脱氧-5-氟尿苷的化学合成工艺流程图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：催化剂的制备

(1)斜面培养

将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CCTCC AB 205442接种至LB斜面培养基，在35℃培养24h，获得斜面菌体；所述每升斜面培养基的组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂，加蒸馏水至1L，pH为7.0；

(2)种子培养

挑取斜面菌体接种至种子培养基，在35℃、180rpm条件下培养16h，获得种子液；所述每升种子培养基的组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加蒸馏水至1L，pH为7.0；

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度1％的接种量接种至含终浓度4.005g/L(15mmol/L)腺苷诱导剂的发酵培养基，在35℃、180rpm条件下诱导培养24h，离心，收集沉淀用生理盐水洗涤3次，即获得湿菌体；所述每升发酵培养基组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加蒸馏水至1L，pH为7.0。同样条件下，以不含诱导剂的发酵培养基进行培养，获得的湿菌体作为对照。

实施例2-4

将实施例1步骤(3)中腺苷分别改为终浓度3.66g/L(15mmol/L)尿嘧啶核苷(实施例2)、终浓度3.65g/L(15mmol/L)胞嘧啶核苷(实施例3)、终浓度1.665g/L(15mmol/L)胞嘧啶(实施例4)作为诱导剂，其他操作同实施例1，分别获得湿菌体。

实施例5

反应体系：pH 7.0的磷酸钾缓冲液10ml，20mmol/L缓冲液的脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐，20mmol/L缓冲液的5-氟尿嘧啶，1.0g实施例1制备的湿菌体；在55℃转化反应4h，反应过程中采用TLC法跟踪检测，展开剂为二氯甲烷:甲醇:乙酸＝9:1:0.1(体积比)，同时采用紫外(254nm)及百里酚显色跟踪检测至反应完全；

转化率的检测：反应结束后，取转化反应液在10000rpm离心，取上清液加上述磷酸钾缓冲液(pH7.0)稀释20倍后过0.45μm水膜(混合纤维素滤膜)，滤液采用HPLC测定5-氟脱氧尿苷的生成量，转化率以脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐的物质的量计量，以实施例1方法中不加腺苷诱导剂获得的湿菌体作为空白对照，同时在相同条件下以实施例2-4所述方法制备的湿菌体进行转化反应，结果见表1所示。

HPLC分析条件：检测器：岛津SPD-20A；色谱柱：菲罗门Hydro-rp(4.6mm*250mm)，流动相：体积浓度10％甲醇水溶液，流速：0.80mL/min，检测波长：260nm，进样量：10μl，温度：室温。

产物的分离纯化：反应结束后，将反应液进行柱层析，以C18为填料，使用的玻璃柱直径为15mm，装填高度为30cm，装填体积为约为53mL。上样量为200mg，以体积浓度10％甲醇水溶液作为洗脱剂，5mL/管进行收集，TLC法跟踪反应液中的三种主要物质脱氧核糖-1-磷酸盐、5-氟尿嘧啶、2’-脱氧-5-氟尿苷的洗脱，并收集产物2’-脱氧-5-氟尿苷对应的洗脱样，旋蒸，加少量甲醇重结晶后收集晶体，即获得2’-脱氧-5-氟尿苷。

表1 诱导剂对于核苷磷酸化酶的诱导作用

从表1可知，以上4种诱导剂对于核苷磷酸化酶均有一定诱导作用，其中以腺苷、尿苷、胞苷的诱导效果较好，胞嘧啶的诱导效果不明显。

实施例6

反应体系：pH 7.0的磷酸钾缓冲液10ml，25mmol/L缓冲液的脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐，75mmol/L缓冲液的5-氟尿嘧啶，1.0g实施例3制备的湿菌体；其他操作同实施例5，经HPLC分析得该条件下的转化率为70.27％。

实施例7

反应体系：pH8.5的磷酸钾缓冲液10ml，30mmol/L缓冲液的脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐，90mmol/L缓冲液的5-氟尿嘧啶，1.2g实施例3制备的湿菌体；60℃恒温振荡3h。其他操作同实施例5，经HPLC分析得该条件下的转化率为73.15％。

实施例8

反应体系：pH 8.0的磷酸钾缓冲液10ml，40mmol/L脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐，120mmol/L 5-氟尿嘧啶，1.2g实施例3制备的湿菌体；55℃恒温振荡3h，其他操作同实施例5，经HPLC分析得该条件下的转化率为78.73％。

Claims (7)

1.一种2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述的方法为：以2’-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐和5-氟尿嘧啶为底物，以产嘧啶核苷磷酸化酶的菌株经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以pH值为6.5～8.5的磷酸缓冲液为反应介质，在45～65℃条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得2’-脱氧-5-氟尿苷；所述催化剂是将产嘧啶核苷磷酸化酶的菌株经种子培养后接种至含诱导剂的发酵培养基中进行发酵培养获得的，所述诱导剂为腺苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷或胞嘧啶。

2.如权利要求1所述2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述2’-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐的初始浓度为20～40mmol/L缓冲液，所述5-氟尿嘧啶的初始浓度为20～120mmol/L缓冲液，所述催化剂的用量以湿菌体质量计为100～120g/L缓冲液。

3.如权利要求1所述2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述产核苷磷酸化酶的菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CCTCC AB205442。

4.如权利要求1所述2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述诱导剂的添加终浓度为5～25mmol/L发酵培养基。

5.如权利要求1所述2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述诱导剂为腺苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷。

6.如权利要求1～5之一所述2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述催化剂按如下步骤制备：

(1)斜面培养

将产嘧啶核苷磷酸化酶的菌株接种至LB斜面培养基，在35℃培养24h，获得斜面菌体；所述每升斜面培养基的组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂，加蒸馏水至1L，pH为7.0；

(2)种子培养

挑取斜面菌体接种至种子培养基，在35℃、180rpm条件下培养16h，获得种子液；所述每升种子培养基的组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加蒸馏水至1L，pH为7.0；

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度1％的接种量接种至含终浓度15mmol/L诱导剂的发酵培养基，在35℃、180rpm条件下发酵培养24h，离心，收集沉淀用生理盐水洗涤3次，即获得湿菌体；所述每升发酵培养基组成为：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加蒸馏水至1L，pH为7.0。

7.如权利要求1～5之一所述2’-脱氧-5-氟尿苷的微生物合成方法，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液进行柱层析，以C18填料作为分离介质，以体积浓度10％甲醇水溶液作为洗脱剂进行分离，TLC跟踪检测，收集含目标组分的洗脱液，即为2’-脱氧-5-氟尿苷。