CN113862316A - 一种生物转化合成5-氟尿嘧啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物转化合成5‑氟尿嘧啶的方法，属于生物发酵技术领域。该工艺利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将5‑氟胞嘧啶一步转化为5‑氟尿嘧啶。与其他工艺相比，本发明反应体系为纯化水、合成液中各个组分明确，利用该方法得到的5‑氟尿嘧啶易提取，产品质量高，成本低廉且易操作适合工业化，成品含量≥99.9％，具有明显市场竞争力。
Description
技术领域
本发明属于医药合成中生物发酵技术领域，涉及5-氟尿嘧啶的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成5-氟尿嘧啶的方法。
背景技术
克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌，主要包括肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5-0.8×1-2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。
具有O抗原与K抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。
5-氟尿嘧啶为抗嘧啶类药物，为白色或类白色的结晶或结晶性粉末。须经过酶转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。此酶的作用可能把甲酰四氢叶酸的一碳单位也转移给脱氧尿嘧啶核苷酸一磷酸合成胸腺嘧啶核苷一酸。同时对RNA的合成也有一定抑制作用。临床上用于多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌等的治疗有效，尤对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效，可静脉或腔内注射，口服吸收不完全。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从5-氟胞嘧啶直接转化为5-氟尿嘧啶仍然没有突破性进展。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿嘧啶，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。
本发明技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程见附图1。
微生物信息：本发明所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.16111。
保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。
一、菌体制备
1.1菌体活化及产酶培养
菌种：Klebsiella michiganensis(密西根克雷伯氏菌)
菌株保藏号：CGMCC16111
活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH7.0；
培养条件：38℃，200rpm，12h；
菌体发酵培养基：酵母膏150g/L、玉米浆50g/L、氯化钠15g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.8g/L、pH7.0；
培养条件：38℃，DO≥20％，12-24h；
1.2菌体收集
产酶培养液微滤的湿菌体溶液，用pH＝7.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤一次，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。
二、固定化酶制备
2.1提酶
利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。
超声处理条件：菌悬液配方：Tris-Hcl 50mN、EDTA5mN、pH＝8.0、菌体浓度60％
破碎条件：1600W、35℃、30min
离心条件：7000rpm、30min
2.2活化树脂
(1)水洗
称量适量的新树脂用纯化水洗至无混浊(5-8次)，然后抽滤后用适量PBS缓冲液浸泡5-10h。
(2)戊二醛交联
抽滤除掉PBS缓冲液，然后加入10倍体积0.5％戊二醛溶液，25℃水浴搅拌12-15h。
(3)水洗
交联后树脂抽滤除去戊二醛溶液，然后用纯化水洗干净后待用。
2.3酶联
活化树脂与酶量按照1:1.5比例混匀，20℃水浴搅拌12-15h，然后水洗至中性待用。
三、酶促反应
3.1反应体系配制
5-氟胞嘧啶50-250g/L；固定化酶量10-100g/L；
反应体系：纯化水
3.2反应条件
待反应体系配制完成后，将反应温度控制在45-65℃范围内，控制搅拌速度为100-200rpm反应12-24h，然后抽滤得合成液，待进行目的产物提取工序。
四、产品提取
4.1粗品制备
酶促反应结束后，抽滤得到5-氟尿嘧啶合成液，旋蒸浓缩，降温结晶抽滤得到5-氟尿嘧啶粗品。
4.2粗品精制
检测5-氟尿嘧啶粗品中产物含量，按照粗品中5-氟尿嘧啶含量采用适量碱和乙醇/水热溶，抽滤后得精品溶液，然后降温结晶、抽滤或离心得5-氟尿嘧啶湿品。
4.3产品干燥
将5-氟尿嘧啶湿品干燥后进行质量检验，检验合格后即5-氟尿嘧啶成品。
进一步地，在上述技术方案中，该工艺反应体系为纯化水，以5-氟胞嘧啶为底物一步合成目标产物5-氟尿嘧啶，成本低廉环保易操作适合工业化。
进一步地，在上述技术方案中，提取工序中，该工艺该工艺产物积累浓度最高达1mol/L以上，固定化酶与反应液易分离，产物易提取，收率高(≥95％)。
发明有益效果
1菌种
该工艺首次利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源固定化酶促转化5-氟胞嘧啶合成5-氟尿嘧啶，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。
2反应体系
该工艺使用反应体系为纯化水，以5-氟胞嘧啶为底物酶促合成产物5-氟尿嘧啶，成本低廉、环保、易操作，易于工业化。
3固定化酶
该工艺利用细胞破碎离心后粗酶液直接与活化后活性树脂载体结合，使脱氨酶固定于树脂载体上，工艺简单，固定化酶可以长时间保持活力(连续使用10天以上，转化率保持在99％以上)，固定化树脂载体可以回收重复利用，成本低廉、易操作，易于工业化。
4生产效率高
与文献报道相比，利用该工艺生产5-氟尿嘧啶反应速度快且转化率高，底物转化率达到99％以上，目的产物浓度最高达1mol/L以上，酶与反应液易分离，产物易提取，收率高(≥95％)，操作简单，易于工业化。
5环保
该工艺所以酶型式为固定化酶，利用纯化水为反应体系，连续高效转化合成5-氟尿嘧啶，大大提高酶的利用率，既降低成本，又减少了废液排放量；另外，该工艺使用碱乙醇和碱水为溶剂提取目的产物，溶剂可重复套用，实现了零排放，环保且适合工业化。
6产品质量高
与其他工艺相比，利用该工艺生产5-氟尿嘧啶由于反应体系为纯化水、合成液中各个组分非常明确，产物易分离，产品质量好，成品含量≥99.9％。
附图说明
图1为生物法合成5-氟尿嘧啶工艺流程图；
图2为温度对菌体培养的影响；
图3为pH值对菌体培养的影响；
图4为培养时间对菌体生长的影响；
图5为温度对转化率的影响；
图6为pH值对转化率的影响；
图7为底物浓度对转化率的影响；
图8为反应时间对转化率的影响；
图9为酶量对转化率的影响。
具体实施例
实施例1
1菌体培养条件优化
1.1最适培养温度的确定
将培养20h种子培养液按5％接种量接种于菌体发酵培养基中，DO≥20％条件下，分别在28-42℃温度范围不同温度条件下培养20h，测定菌体浓度和活力(图2)。结果显示，在28-38℃培养温度范围内菌体量和酶活性都随培养温度升高而增加，高于38℃菌体活力变化不明显或有所下降，但菌体生长量开始明显下降。因而最适菌体培养温度为38℃左右。
1.2最适培养pH值的确定
将培养20h种子培养液按5％接种量接种于菌体发酵培养基中，培养温度38℃，DO≥20％条件下，考察不同pH值条件下培养20h，检测菌体浓度和活力(图3)。结果显示，菌体生长的较适合pH值范围为7.0-7.5，低于或高于此范围对菌体生长量和转化活力影响都比较大，因而选择7.0为最适培养pH值。
1.3培养时间对菌体生长的影响
以接种量5％接种于发酵培养基中，培养温度38℃，pH7.0，定时取样测定培养过程中菌体浓度与活力的变化(图4)。结果显示，发酵液菌体浓度在小于16h范围内增加迅速，培养16h以后变化不明显；在培养最初的12h菌体活力随着培养时间延长而迅速提高，表现为与菌体生长呈平行关系，培养时间达到16h之后，菌体活力均达到最高，呈现一平台期。因而适宜的培养时间为16h以上。
2转化反应条件优化
在初始反应体系基础上进行合成5-氟尿嘧啶反应条件优化试验，包括对酶量、底物浓度、pH值、温度及反应时间等条件的优化，以期达到提高底物转化率和降低成本的目的。
2.1温度对转化反应的影响
利用初始反应体系，在不同温度条件下进行转化合成反应20h，测定目的产物含量，计算转化率。结果显示(图5)，在较宽的温度范围内，上述反应体系都可以将底物转化为目的产物，在30-50℃温度范围内，随温度升高转化效率不断提高，在50℃时达到最大值；进一步升高温度，转化率开始下降，高于60℃后转化率迅速下降，说明过高温度导致酶活失活严重，不利于转化反应。因而选择转化温度为50℃左右。
2.2 pH值对转化反应的影响
利用上述反应体系，调整合成液pH值，进行转化反应20h，测定目的产物含量，计算不同pH条件下底物转化率(图6)，结果显示，底物转化率在pH值6.5-8.0范围内达到最大值，pH值过高或过低转化率都迅速降低。因而选择最适pH值7.5左右。
2.3最适底物浓度的确定
在上述反应体系中，考察不同底物浓度下转化反应20h，测定目的产物含量，计算转化率，结果显示(图7)。底物浓度小于1.5mol/L的范围内时，转化率变化不明显，而大于1.5mol/L之后，转化率开始明显下降。根据上述结果，在底物转化率变化不大的情况下提高底物浓度，能够达到提高生产效率，降低生产成本的目的，因而选择较适底物浓度范围为1.0-1.5mol/L。
2.4最适反应时间的确定
在上述优化的反应条件下，测定不同转化时间的产物浓度，计算转化率，结果显示(图8)。随时间延长，产物不断积累，底物转化率随反应时间延长快速增加，反应时间达到24小时之后产物浓度变化不明显。因而收获产物的适宜时间可选择为24小时以后。
2.5最适酶量的确定
在上述最适反应条件下，在5-60g/L固定化酶量范围内考察酶量对转化率的影响。结果显示(图9)，在5-30g/L范围内，转化率随酶量的增加而快速增加，大于40g/L以后变化不明显。由于固定化酶可以重复利用，为提高生产效率，因而选择大于40g/L为较适用酶量。
实施例2
生物转化合成5-氟尿嘧啶工艺放大(100L)
2.1菌体制备
2.1.1菌体活化及产酶培养
菌种：Klebsiella michiganensis(密西根克雷伯氏菌)
保藏编号：CGMCC16111
活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH7.0；
培养条件：38℃，200rpm，12h
菌体发酵培养基：酵母膏150g/L、玉米浆50g/L、氯化钠15g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.8g/L、pH7.0；
培养条件：38℃，DO≥20％，12-24h
2.1.2菌体收集
产酶培养液微滤的湿菌体溶液，用pH 7.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤一次，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。
2.2固定化处理
2.2.1提酶
利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。
超声处理条件：菌悬液配方：Tris-Hcl 50mN、EDTA5mN、pH8.0、菌体浓度60％；
破碎条件：1600W 35℃30min
离心条件：7000rpm 30min
2.2活化树脂
(1)水洗
称量适量的新树脂用纯化水洗至无混浊(5-8次)，然后抽滤后用适量PBS缓冲液浸泡5-10h。
(2)交联
抽滤除掉PBS缓冲液，然后加入10倍体积0.5％戊二醛溶液，25℃水浴搅拌12-15h。
(3)水洗
交联后树脂抽滤出去戊二醛溶液，然后用纯化水洗干净后待用。
2.3酶联
活化树脂与酶量按照1:1.5比例混匀，20℃水浴搅拌12-15h，然后水洗至中性待用。
实施例3
转化反应
3.1反应体系配制
5-氟胞嘧啶15Kg；固定化酶量50Kg；纯化水100Kg；
3.2反应条件
将反应温度控制在50℃，搅拌速度控制100-200rpm反应24h后，抽滤得到5-氟尿嘧啶合成液，然后进行下一步产物提取。
3.3产物提取
3.3.1粗品制备
将上一步抽滤得到5-氟尿嘧啶合成液，依次进行旋蒸浓缩、降温结晶，然后抽滤干燥后得14.5Kg粗品。
3.3.2精制
检测粗品中产物含量，按照粗品中5-氟尿嘧啶含量采用3倍粗品质量氢氧化钠/乙醇水热溶，抽滤后得到精品溶液，降温结晶、抽滤或离心得到5-氟尿嘧啶湿品，干燥后得14.25Kg。
3.3.3质检
精制后产品经检测产品合格，含量99.92％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.利用密西根克雷伯氏菌合成5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于：以5-氟胞嘧啶为原料，利用密西根克雷伯氏菌转化合成5-氟尿嘧啶。
2.根据权利要求1所述合成5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于：所述密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为Klebsiella michiganensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16111。
3.根据权利要求1所述合成5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于：转化合成过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取。
4.根据权利要求3所述合成5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于：菌体制备包括菌体活化、产菌培养和菌体收集。
5.根据权利要求3所述合成5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于：固定化酶制备包括提酶、活化树脂和酶联。
6.根据权利要求3所述合成5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于：酶促反应操作包括：将5-氟胞嘧啶和固定化酶在纯化水反应体系中反应，抽滤得合成液，进行产品提取。
7.根据权利要求6所述合成5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于：所述5-氟胞嘧啶为50-250g/L，固定化酶量为10-100g/L；反应在45-65℃水浴进行。
8.根据权利要求3所述合成5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于：产品提取包括粗品制备、粗品精制和产品干燥。
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