CN102827902A - 一种化学-生物酶法组合制备2′-脱氧尿苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种化学-生物酶法组合制备2′-脱氧尿苷的方法，该方法采用“结晶诱导不对称转化”技术合成得到了单一α构型的核苷类药物中间体2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸，再利用这个中间体为底物，加入尿嘧啶，在尿苷磷酸化酶的作用下生物转化合成得到2′-脱氧尿苷。本发明化学-生物组合技术的应用，结合了化学法与生物法的优点，避免了各自的缺陷，收率高，适用于工业化生产，其中采用“结晶诱导不对称转化技术”可以得到供应充足，构型单一的2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸中间体，无需再进行分离纯化；生物转化过程采用高效、专一的尿苷磷酸化酶催化一步完成，其专一性强，转化率高，条件温和，环境友好。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种化学-生物酶法组合制备2′-脱氧尿苷的方法。
(二)背景技术
2′-脱氧尿苷属于核苷类似物，它在化学结构上与天然核苷有着不同程度的相似之处，在体内有以假乱真之效，从而干扰或直接作用于核酸的代谢过程，阻断蛋白质、核酸的生物合成，在抗肿瘤，抗病毒药物中具有非常重要的地位。同时是其他核苷类药物的重要中间体。
合成2′-脱氧尿苷的方法主要包括以下三种：
1、从天然产物中获得核苷，再经过化学结构修饰得到。但这种方法存在着原料不足的缺点，无法满足市场的需求。
2、化学全合成法，但此方法合成得到的往往是α/β混合构型的产物，而具有良好药效的往往是β构型的产物，同时化学合成过程中的糖苷化过程使用了大量昂贵有毒的化学试剂，环境污染严重。
3、核苷磷酸化酶生物转化法，此方法是采用其他天然的脱氧核苷为底物，在核苷磷酸化酶的作用下加入尿嘧啶与天然核苷的碱基进行交换，得到2′-脱氧尿苷。这种方法虽然条件温和，反应选择性高，但是同样存在原料不足的问题，且成本较高。
结晶诱导不对称转化技术是一项控制化学立体异构体的前沿技术。最早报道的例子是含有不对称构型的立体异构体的平衡体系转化成最稳定的非对映体近体形式。许多例子都显示结晶诱导不对称转化技术能得到最稳定的非对映异构体晶体，不管平衡体系中的含量如何，以混合物为基础 转化率可接近100％。结晶诱导不对称转化技术是热力学相平衡的结果，它是一个有效控制单一异构体的有效技术。它需要的一个重要条件是非对映体的转化速率比结晶速率快，另一个条件是其中一个对映体必须在合适的温度结晶。不对称合成的背景是结构包含对映异构体，而结晶诱导技术是一种得到单一异构体的直接实用的方法。
诱导结晶立体异构转化(CIST)根据原理可以分为两类：诱导结晶对映结构体转化(CIET)和更平常的诱导结晶非对映异构体转化(CIDT)。CIST的发现大部分基于意外。直到20世纪后期CIST才开始在不对称合成中被应用为一个设计因素。
对应异构体和非对应异构体的混合物表现出来不同的结晶行为是由于镜像的立体异构体能够结晶成聚集物(每个细胞有一个单的对映异构体的纯的对应异构体的机械混合物)，外消旋化合物(每种对映异构体在单元中以1∶1存在)，和立体(固体)溶液(有时候也叫假的外消旋物；两种对映异构体都是以非固定的比例存在于浓缩相中)。这些结晶行为的根本不同表现在这些固体的物理性质的不同(如熔点的不同和溶解度的不同)。同样地，非对映异构体可以以三种类似的形式结晶。通常，非对映异构体产生共晶混合物(这些化合物作为单独存在的实体结晶，像聚集物行为)。然而，非对映异构体有时候会结晶成外消旋类似物(两个结构相似的和形态上类似对应体过量的化合物)或者作为固体溶液(也经常叫做混合晶体；一种非对映异构体代替另一种没有很大地影响晶体结构)。CIDT仅在非对映异构体作为共晶混合物的时候是可行的。
核苷磷酸化酶广泛分布于动植物器官和微生物中，它参与胞内核苷代谢，在补救途径中催化核苷或脱氧核苷可逆磷酸化反应，提供核糖-1-磷酸，并释放出碱基，加入其他碱基可导致形成另一种新的核苷。
酶法合成核苷类药物的原理是利用微生物中产生的核苷磷酸化酶催化核苷、碱基转换反应，即由廉价供应的天然核苷为原料，将其核糖基进行化学修饰后作为核苷及供体，利用核苷磷酸化酶或脱氧核糖转移酶为酶源，天然的杂环碱基为核糖基受体，通过酶催化合成核苷及其类似物。此反应过程包括两个过程：
(脱氧)核苷1+磷酸＝(脱氧)核糖-1-磷酸+碱基2
(脱氧)核糖-1-磷酸+碱基1＝(脱氧)核苷2+磷酸
其中碱基1可以是嘌呤、嘧啶或其类似物。酶的来源可以是天然菌株，也可以是基因工程菌株。利用此反应可以合成多种核苷类似物，在实际工作中也可以仅通过第二部反应来合成所需物质。
酶的高效率、专一性及温和的反应条件使酶在生物体新陈代谢中发挥了巨大的作用，酶活力的调控使生命活动中各种反应得以有条不紊的进行。因此酶被广泛的应用于医药、食品、农业和化工产品的生产及研究。酶在合成过程中具有高度的化学、区域和对映体选择性，生产过程一般无毒、无污染、低耗能，是一种环境友好的合成方法，将为绿色化学作出贡献。
(三)发明内容
本发明所要解决的问题是化学法合成2′-脱氧尿苷是存在的无法得到单一异构体的问题，以及生物酶法合成过程中存在的原料不足以及高成本问题。
本发明采用的技术方案是：
一种化学-生物酶法组合制备2′-脱氧尿苷的方法，所述方法包括：
(1)以α/β混合构型的3′5′-O-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-D-核糖-1-氯 化物为原料，加入磷酸和4A分子筛，以三丁基胺为催化剂，-10～0℃(最佳反应温度为-5～-2℃)于氮气保护下反应16～24小时；本过程中需应严格控制水的含量，反应溶剂需先干燥除水。
(2)步骤(1)反应结束后，过滤除去分子筛，滤液蒸干得到糖浆状物质用四甲基二戊酮溶解后，水洗，取有机相在-15℃～10℃下加入环己胺搅拌反应(1～3h)至析出白色沉淀，过滤，滤饼依次用四甲基二戊酮和丙酮洗涤，真空干燥(45～60℃，4小时以上)得到3，5-O-二(4-苯甲酰氯)-2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二环己基胺盐；四甲基二戊酮用量以10mL/1g糖浆状物质为宜，水的用量为有机相的1～1.5倍最佳，萃取次数最好是3次。
(3)3，5-O-二(4-苯甲酰氯)-2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二环己基胺盐在弱碱溶液中于25℃～100℃下搅拌反应12h～72h脱除保护基，反应液浓缩、乙醇洗涤，真空干燥得到2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸盐；所述弱碱溶液为下列之一：环己胺甲醇溶液，氢氧化钠甲醇溶液，氢氧化钾水溶液或氢氧化钠水溶液；反应温度越高，其脱保护基的时间越短。
(4)2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸盐与尿嘧啶在尿苷磷酸化酶(UridinePhosphorylase，U Paes，EC 2.4.2.4)催化下，在pH值为6～8的磷酸盐缓冲液中、45～65℃下反应3～24小时，制得所述2′-脱氧尿苷。
核苷磷酸化酶(Nucleoside Phosphorylase，N Pase)广泛存在于动植物器官和微生物中，在机体的核苷代谢尤其是在补救途径中起着十分重要的作用，在进行核苷及其类似物的合成时，它能催化核苷或脱氧核苷的可逆磷酸化反应，能以核糖-1-磷酸为中间产物进行碱基交换，形成另一种新的核苷。核苷磷酸化酶分为3类：嘌呤核苷磷酸化酶(Pyrimidine Nucleoside Phosphorylase，PN Pase，EC 2.4.2.1)、尿苷磷酸化酶(Uridine Phosphorylase，U Paes，EC 2.4.2.4)和胸苷磷酸化酶(Thymidine Phosphorylase，T Paes，EC 2.4.2.3)。本发明中主要利用的是大肠杆菌中含有的尿苷磷酸化酶(Uridine Phosphorylase，U Paes，EC 2.4.2.4)。
本发明中生物转化可采用市购商品酶，也可以采用含有该酶的菌株如大肠杆菌、产气肠杆菌等的湿菌体，生物转化的最佳pH值是7，其转化温度优选55℃～65℃，反应时间优选为5h～8h，转化后的反应液采用高效液相色谱法检测2′-脱氧尿苷的含量，计算转化率。
本发明采用“结晶诱导不对称转化”技术合成得到了单一α构型的核苷类药物中间体2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸，为生物酶法合成提供了一个廉价，供应稳定的原料。再利用这个中间体为底物，加入尿嘧啶，在大肠杆菌核苷磷酸化酶的作用下生物转化合成得到2′-脱氧尿苷。其合成路线如下：
优选的，所述步骤(1)反应溶剂为乙腈，四甲基二戊酮或丙酮。
所述步骤(1)中三丁基胺优选为正三丁基胺，3′5′-O-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-D-核糖-1-氯化物与正三丁基胺的摩尔用量之比为1∶2～6。
本发明的有益效果主要体现在：化学-生物组合技术的应用，结合了化学法与生物法的优点，避免了各自的缺陷，收率高，适用于工业化生产，其中采用“结晶诱导不对称转化技术”可以得到供应充足，构型单一的2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸中间体，无需再进行分离纯化；生物转化过程采用高效、专一的尿苷磷酸化酶催化一步完成，其专一性强，转化率高，条件温和，环境友好。
(四)附图说明
图1为实施例1产物IR谱图；
图2为实施例1产物1H NMR谱图；
图3为实施例2产物IR谱图；
图4为实施例2产物1H NMR谱图；
图5为实施例3产物13C NMR谱图；
图6为实施例3产物1H NMR谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
正磷酸7.02g投入三角烧瓶，加入乙腈100mL，加入正三丁胺5.6mL，4A分子筛(上海嘉林分子筛有限公司)10g搅拌至磷酸溶解，低温 冷却至-5℃加入1-氯-3，5-二(O-对氯苯甲酰基)-2-脱氧-D-核糖8.5g在氮气保护下搅拌反应13h后，再加入正三丁胺16.0mL，继续反应8小时得到酒红色的透明液体，过滤除去分子筛，滤液蒸干得到红棕色糖浆状物质。糖浆状物质用120mL四甲基二戊酮溶解后，100mL水洗三次，所得有机相冷却至0℃，加入环己胺5.60mL搅拌反应0.5h析出白色沉淀，过滤，滤饼依次用四甲基二戊酮和丙酮洗涤，真空干燥得到白色固体12.78g，收率94.03％，纯度96.8％。其IR，1H NMR谱图见图1，图2，数据如下：
熔点mp：176-178℃；IR(KBr)：2942cm-1，2869cm-1，1723cm-1；
1H NMR：8.08(2H，ddd)，8.01(2H，ddd)，7.50(2H，ddd)，7.48(2H，ddd)，6.01(1H，ddd)，5.49(1H，ddd)，4.87(1H，ddd)，4.67(1H，dd)，4.61(1H，dd)，4.54(1H，dd)，2.92(2H，dd)，2.58(1H，dddd)，2.42(1H，dddd)，1.96(4H，m)，1.81(4H，m)，177(2H，m)。
实施例2：
3，5-O-二(4-苯甲酰氯)-2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二环己基胺盐7.02g溶于甲醇120mL，加入环己胺3.0mL，40℃搅拌反应24h，反应液浓缩，最终沉淀物用乙醇洗涤，真空干燥得到白色固体(3.46g，89.4％)。IR， 1H NMR谱图见图3，图4，数据如下：
熔点mp：166-167℃；IR(KBr)：2939cm-1，2853cm-1，2238cm-1，1630cm-1；
1H NMR：5.67(1H，dd)，4.14-4.07(2H，ddd)，3.60(1H，dd)，3.52(1H，dd)，3.07(2H，m)，2.28-2.23(1H，ddd)，1.99(1H，ddd)，1.89(4H，m)，1.71(4H，m)，1.57(2H，m)，1.29-1.21(8H，m)，1.12(2H，m)。
实施例3：
尿嘧啶0.120g，2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸盐0.432g，大肠杆菌ATCC8379湿菌体2.48g(菌种来源于广东省微生物所，冻干管菌种经过斜面活化培养后，接种至产酶培养基，产酶培养基组成为：蛋白胨10g/L；酵母浸出粉5g/L；氯化钠10g/L，pH 7.0，36℃、250r/min摇床中培养24h后离心，收集湿菌体并超声处理)，溶于50mL pH＝7的磷酸缓冲液中，恒温水浴65℃反应6h后，反应液稀释100倍后采用HPLC方法检测。
液相色谱条件：色谱柱，SB-C18 column(5μm，4.6×250mm)；检测波长：262；流动相：甲醇∶水＝9∶1；流速：0.8mL/min；进样量：20μL。
分离的到的2′-脱氧尿苷的13C NMR、1H NMR谱图见图5，图6，数据如下：
Mp：162-164℃；13C NMR(400MHz，D2O)：166.75，151.70，141.75，102.19，86.92，85.98，70.97，61.71，39.19；
1H NMR(400MHz，D2O)：7.75(1H，d)；6.10(1H，t)；5.80(1H，d)；4.38(1H，m)；3.95(1H，dd)；3.75(1H，dd)；3.67(1H，dd)；2.34(2H，m)。
Claims (3)
1.一种化学-生物酶法组合制备2′-脱氧尿苷的方法，所述方法包括：
(1)以α/β混合构型的3′5′-O-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-D-核糖-1-氯化物为原料，加入磷酸和4A分子筛，以三丁基胺为催化剂，-10～0℃于氮气保护下反应16～24小时；
(2)步骤(1)反应结束后，过滤除去分子筛，滤液蒸干得到糖浆状物质用四甲基二戊酮溶解后，水洗，取有机相在-15℃～10℃下加入环己胺搅拌反应至析出白色沉淀，过滤，滤饼依次用四甲基二戊酮和丙酮洗涤，真空干燥得到3，5-O-二(4-苯甲酰氯)-2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二环己基胺盐；
(3)3，5-O-二(4-苯甲酰氯)-2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二环己基胺盐在弱碱溶液中于25℃～100℃下搅拌反应12h～72h脱除保护基，反应液浓缩、乙醇洗涤，真空干燥得到2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸盐；所述弱碱溶液为下列之一：环己胺甲醇溶液，氢氧化钠甲醇溶液，氢氧化钾水溶液或氢氧化钠水溶液；
(4)2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸盐与尿嘧啶在尿苷磷酸化酶催化下，在pH值为6～8的磷酸盐缓冲液中、45～65℃下反应3～24小时，制得所述2′-脱氧尿苷。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)反应溶剂为乙腈，四甲基二戊酮或丙酮。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中三丁基胺为正三丁基胺，3′5′-O-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-D-核糖-1-氯化物与正三丁基胺的摩尔用量之比为1∶2～6。
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