JP3044819B2 - 全核酸中の特定の核酸断片の抽出法 - Google Patents
全核酸中の特定の核酸断片の抽出法Info
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- JP3044819B2 JP3044819B2 JP3113062A JP11306291A JP3044819B2 JP 3044819 B2 JP3044819 B2 JP 3044819B2 JP 3113062 A JP3113062 A JP 3113062A JP 11306291 A JP11306291 A JP 11306291A JP 3044819 B2 JP3044819 B2 JP 3044819B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸(ＤＮＡ)溶液また
は核酸混合液から特定の核酸断片を抽出する方法に関す
る。
は核酸混合液から特定の核酸断片を抽出する方法に関す
る。
【０００２】
【従来技術と発明が解決すべき課題】今日、遺伝子工学
の発達に伴い、医学、農学を始め、様々な分野で特定の
核酸配列を抽出、分離することが必要とされる場合が増
加している。既知の塩基配列を含有する特定の核酸断片
を、核酸溶液から抽出する方法として以下に述べる手法
が知られている(細胞工学、第８巻、Ｎo．７,１９８
９)。即ち、まず目的とする核酸断片の塩基配列から、
２０〜３０塩基からなるプローブ用配列を２，３ケ所決
定する。この配列に基いてプローブを合成し、共有結合
によりその末端をゲルや膜等の担体に結合させ、固定化
プローブを作成する。一方、所望の核酸断片を含んでい
るＤＮＡを他のＤＮＡと共に細胞から採取し、次いでこ
れを熱変性させる。熱変性したＤＮＡと固定化プローブ
を混合し、ハイブリダイゼーションを行なった後、遠心
分離により、ハイブリダイズした固定化プローブを回収
する。回収した固定化プローブを熱処理し、所望の核酸
断片を含むＤＮＡを電気泳動にかけて目的とするＤＮＡ
の分子量を示すＤＮＡを回収することにより精製する。
の発達に伴い、医学、農学を始め、様々な分野で特定の
核酸配列を抽出、分離することが必要とされる場合が増
加している。既知の塩基配列を含有する特定の核酸断片
を、核酸溶液から抽出する方法として以下に述べる手法
が知られている(細胞工学、第８巻、Ｎo．７,１９８
９)。即ち、まず目的とする核酸断片の塩基配列から、
２０〜３０塩基からなるプローブ用配列を２，３ケ所決
定する。この配列に基いてプローブを合成し、共有結合
によりその末端をゲルや膜等の担体に結合させ、固定化
プローブを作成する。一方、所望の核酸断片を含んでい
るＤＮＡを他のＤＮＡと共に細胞から採取し、次いでこ
れを熱変性させる。熱変性したＤＮＡと固定化プローブ
を混合し、ハイブリダイゼーションを行なった後、遠心
分離により、ハイブリダイズした固定化プローブを回収
する。回収した固定化プローブを熱処理し、所望の核酸
断片を含むＤＮＡを電気泳動にかけて目的とするＤＮＡ
の分子量を示すＤＮＡを回収することにより精製する。
【０００３】上記の方法は、下記の問題点を有する。
１．固定化プローブは、所望の核酸断片の配列の一部を
利用したものであるので、重複する可能性があり、効率
が悪く、簡便性に欠け、かつ、既知配列の核酸に限定さ
れるので汎用性に乏しい。２．固定化プローブと採取Ｄ
ＮＡとのハイブリダイゼーションは１回に限定されてい
るので、精度が低い。３．電気泳動による核酸断片の回
収は操作が煩雑な上、時間がかかる。
１．固定化プローブは、所望の核酸断片の配列の一部を
利用したものであるので、重複する可能性があり、効率
が悪く、簡便性に欠け、かつ、既知配列の核酸に限定さ
れるので汎用性に乏しい。２．固定化プローブと採取Ｄ
ＮＡとのハイブリダイゼーションは１回に限定されてい
るので、精度が低い。３．電気泳動による核酸断片の回
収は操作が煩雑な上、時間がかかる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来
方法の問題点を解消することを目的として鋭意検討した
結果、所望の核酸配列が特定の制限酵素による切断端を
有する核酸断片として切断されるように選択した制限酵
素で全核酸を消化処理し、これら切断端の各々に異なる
ＤＮＡリンカーを連結し、各リンカーに相補的な固定化
プローブを順次用いてリンカーとプローブとのハイブリ
ダイゼーションを２回行うことにより、所望の核酸配列
を含有する核酸断片を効率良く抽出することができるこ
とを見い出し、本発明を完成した。
方法の問題点を解消することを目的として鋭意検討した
結果、所望の核酸配列が特定の制限酵素による切断端を
有する核酸断片として切断されるように選択した制限酵
素で全核酸を消化処理し、これら切断端の各々に異なる
ＤＮＡリンカーを連結し、各リンカーに相補的な固定化
プローブを順次用いてリンカーとプローブとのハイブリ
ダイゼーションを２回行うことにより、所望の核酸配列
を含有する核酸断片を効率良く抽出することができるこ
とを見い出し、本発明を完成した。
【０００５】即ち、本発明は、所望の核酸配列を含有す
る核酸断片を全核酸から抽出する方法であって、 （Ａ）該核酸断片の５’および３’末端に、予め定めら
れた相異なる制限酵素切断端を形成し得る２種の相異な
る制限酵素と、 （Ｂ）上記（Ａ）とは異なる制限酵素であって、該所望
の核酸配列を含有する核酸断片がその制限酵素に対応す
る制限部位を含んでいない１またはそれ以上の制限酵素
からなる制限酵素の組合せで全核酸を切断して核酸断片
混合物を得ると共に、該所望の核酸配列を含有する核酸
断片の両切断端のそれぞれに結合する相異なる２種のリ
ンカーを調製し、該リンカーと上記核酸断片混合物とを
反応させ、得られた反応液に、いずれか１方のリンカー
と相補的な固定化プローブを加えてハイブリダイゼーシ
ョンを行い、ハイブリダイズした核酸断片を分離した
後、該核酸断片に、もう１方のリンカーと相補的な固定
化プローブを加えて再びハイブリダイゼーションを行
い、ハイブリダイズした核酸断片を分離することからな
る方法を提供するものである。
る核酸断片を全核酸から抽出する方法であって、 （Ａ）該核酸断片の５’および３’末端に、予め定めら
れた相異なる制限酵素切断端を形成し得る２種の相異な
る制限酵素と、 （Ｂ）上記（Ａ）とは異なる制限酵素であって、該所望
の核酸配列を含有する核酸断片がその制限酵素に対応す
る制限部位を含んでいない１またはそれ以上の制限酵素
からなる制限酵素の組合せで全核酸を切断して核酸断片
混合物を得ると共に、該所望の核酸配列を含有する核酸
断片の両切断端のそれぞれに結合する相異なる２種のリ
ンカーを調製し、該リンカーと上記核酸断片混合物とを
反応させ、得られた反応液に、いずれか１方のリンカー
と相補的な固定化プローブを加えてハイブリダイゼーシ
ョンを行い、ハイブリダイズした核酸断片を分離した
後、該核酸断片に、もう１方のリンカーと相補的な固定
化プローブを加えて再びハイブリダイゼーションを行
い、ハイブリダイズした核酸断片を分離することからな
る方法を提供するものである。
【０００６】以下、本発明をより詳細に説明する。本明
細書中、全核酸とは、単一のＤＮＡのみならず、細胞か
ら採取したＤＮＡ混合物をも指す。なお、本明細書中、
核酸とＤＮＡとを同一の意義を有する語句としても用い
る。所望の核酸配列とは、１個のＤＮＡ中の１部、また
は全体の両者を指す。所望の核酸配列を包含する核酸断
片とは、該所望の核酸配列のみで構成される断片、およ
びリンカー等が付加しているが、目的とする核酸配列の
活性等は何等影響を受けていない核酸断片を指す。
細書中、全核酸とは、単一のＤＮＡのみならず、細胞か
ら採取したＤＮＡ混合物をも指す。なお、本明細書中、
核酸とＤＮＡとを同一の意義を有する語句としても用い
る。所望の核酸配列とは、１個のＤＮＡ中の１部、また
は全体の両者を指す。所望の核酸配列を包含する核酸断
片とは、該所望の核酸配列のみで構成される断片、およ
びリンカー等が付加しているが、目的とする核酸配列の
活性等は何等影響を受けていない核酸断片を指す。
【０００７】本発明の新規な核酸断片抽出法は、以下の
各工程からなる。 i) 抽出したい核酸断片を決定する。 ii) 採取した１種またはそれ以上のＤＮＡを、目的と
する核酸断片を得るために選択した制限酵素で処理す
る。この場合、核酸断片の５'および３'末端の組み合わ
せが独特（ユニーク）なものとなるように、制限酵素を
選択することが好ましい。 iii) 処理溶液に、所望の核酸断片の両端の制限酵素切
断端に特異的に結合する２種のリンカーを加える。これ
らリンカーは相互に異なるものである。 iv) 核酸連結酵素を加えてそれぞれの断端に各リンカ
ーを連結する。 v) 加えた２種のリンカーに相補的なプローブを支持体
に固定化してなる固定化プローブを調製する。 vi) iv)で得た溶液の核酸を変性させる。 vii) vi)の溶液に、v)で調製した一方のリンカーに相
補的な固定化プローブを加えて放置し、ハイブリダイゼ
ーションを行なう。 viii) 固定化プローブ相を回収し、変性処理を行な
い、ハイブリダイズした核酸を回収する。
各工程からなる。 i) 抽出したい核酸断片を決定する。 ii) 採取した１種またはそれ以上のＤＮＡを、目的と
する核酸断片を得るために選択した制限酵素で処理す
る。この場合、核酸断片の５'および３'末端の組み合わ
せが独特（ユニーク）なものとなるように、制限酵素を
選択することが好ましい。 iii) 処理溶液に、所望の核酸断片の両端の制限酵素切
断端に特異的に結合する２種のリンカーを加える。これ
らリンカーは相互に異なるものである。 iv) 核酸連結酵素を加えてそれぞれの断端に各リンカ
ーを連結する。 v) 加えた２種のリンカーに相補的なプローブを支持体
に固定化してなる固定化プローブを調製する。 vi) iv)で得た溶液の核酸を変性させる。 vii) vi)の溶液に、v)で調製した一方のリンカーに相
補的な固定化プローブを加えて放置し、ハイブリダイゼ
ーションを行なう。 viii) 固定化プローブ相を回収し、変性処理を行な
い、ハイブリダイズした核酸を回収する。
【０００８】ix) viii)で得た核酸に対して、v)で調製
したもう一方のリンカーに相補的な固定化プローブを用
い、上記工程vi)、vii)およびviii)を行なう。本発明方
法で用いるリンカーとは、１本鎖または２本鎖の核酸リ
ンカーであって、特定の制限酵素により生じた切断部位
とアニーリングし得る特異的な塩基配列をその末端に有
するものである。リンカーとして用い得る核酸には、次
のものが含まれる。 (１) 天然の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、あるいはＲＮ
Ａ(切断または変性等の処理されたものを含む)。 (２) ＤＮＡ合成装置等で化学的に合成したＤＮＡまた
はＲＮＡ。又、そのようなリンカーは当業者既知の方法
で合成することができる。例えば、Ａpplied Ｂiosyste
ms社製のＤＮＡ合成装置を用い、添付の指示書に従って
合成すればよい。全核酸配列中の所望の核酸断片を得る
ために選択した特定の制限酵素がＥcoＲＩおよびＰstＩ
であれば、用いるリンカーＤＮＡは以下の塩基配列を有
するものとすることもできる。
したもう一方のリンカーに相補的な固定化プローブを用
い、上記工程vi)、vii)およびviii)を行なう。本発明方
法で用いるリンカーとは、１本鎖または２本鎖の核酸リ
ンカーであって、特定の制限酵素により生じた切断部位
とアニーリングし得る特異的な塩基配列をその末端に有
するものである。リンカーとして用い得る核酸には、次
のものが含まれる。 (１) 天然の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、あるいはＲＮ
Ａ(切断または変性等の処理されたものを含む)。 (２) ＤＮＡ合成装置等で化学的に合成したＤＮＡまた
はＲＮＡ。又、そのようなリンカーは当業者既知の方法
で合成することができる。例えば、Ａpplied Ｂiosyste
ms社製のＤＮＡ合成装置を用い、添付の指示書に従って
合成すればよい。全核酸配列中の所望の核酸断片を得る
ために選択した特定の制限酵素がＥcoＲＩおよびＰstＩ
であれば、用いるリンカーＤＮＡは以下の塩基配列を有
するものとすることもできる。
【０００９】本発明方法に用いる固定化プローブ用のプ
ローブは、予め定められた塩基配列を有するリンカーに
相補的な核酸が主である。それら核酸には、以下のもの
が含まれる。 (１) 天然の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、あるいはＲＮ
Ａ(切断または変性等の処理されたものを含む)。 (２) ＤＮＡ合成装置等で化学的に合成したＤＮＡまた
はＲＮＡ。 (３) 天然または合成の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまた
はＲＮＡであって、支持体との結合用に官能基を導入し
たもの。従って、プローブを得るには、ＤＮＡリンカー
の一部または全部と相補的なＤＮＡを合成することもで
きる。その場合、プローブに用いるＤＮＡは１本鎖でも
２本鎖でもよい。２本鎖の場合には、固定化後、変性さ
せてもよい。また、プローブの５'末端又は３'末端に
は、一般に用いる担体との結合に好都合な配列を連結す
る[例えば、本実施例記載のアミノリンクＩＩ(Ａpplied
Ｂiosystems Ｉnc.社供給)]。固定化プローブ用の支持
担体は、粒子や膜から選択する。
ローブは、予め定められた塩基配列を有するリンカーに
相補的な核酸が主である。それら核酸には、以下のもの
が含まれる。 (１) 天然の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、あるいはＲＮ
Ａ(切断または変性等の処理されたものを含む)。 (２) ＤＮＡ合成装置等で化学的に合成したＤＮＡまた
はＲＮＡ。 (３) 天然または合成の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまた
はＲＮＡであって、支持体との結合用に官能基を導入し
たもの。従って、プローブを得るには、ＤＮＡリンカー
の一部または全部と相補的なＤＮＡを合成することもで
きる。その場合、プローブに用いるＤＮＡは１本鎖でも
２本鎖でもよい。２本鎖の場合には、固定化後、変性さ
せてもよい。また、プローブの５'末端又は３'末端に
は、一般に用いる担体との結合に好都合な配列を連結す
る[例えば、本実施例記載のアミノリンクＩＩ(Ａpplied
Ｂiosystems Ｉnc.社供給)]。固定化プローブ用の支持
担体は、粒子や膜から選択する。
【００１０】具体例として、例えば、ナイロンメンブラ
ン、ニトロセルロースメンブラン、ポリテトラフルオロ
エチレンメンブラン、ポリエチレンメンブラン等、天然
または合成有機高分子メンブラン(膜状体)を挙げること
ができる。ニトロセルロースのように有機高分子(例;
セルロース)を化学的に処理し、改質して得たメンブラ
ンも含む。
ン、ニトロセルロースメンブラン、ポリテトラフルオロ
エチレンメンブラン、ポリエチレンメンブラン等、天然
または合成有機高分子メンブラン(膜状体)を挙げること
ができる。ニトロセルロースのように有機高分子(例;
セルロース)を化学的に処理し、改質して得たメンブラ
ンも含む。
【００１１】また、不溶性担体としては、グラファイ
ト、多孔質ガラス、シリカ等の無機高分子メンブラン
(膜状体)、アルミニウム、アパタイト等の金属メンブラ
ン、アルミナ、窒化珪素等のセラミックスメンブラン、
食塩等の結晶を挙げることができる。さらに、これらの
表面を化学的、物理的に表面処理することで改質された
ものも含む。
ト、多孔質ガラス、シリカ等の無機高分子メンブラン
(膜状体)、アルミニウム、アパタイト等の金属メンブラ
ン、アルミナ、窒化珪素等のセラミックスメンブラン、
食塩等の結晶を挙げることができる。さらに、これらの
表面を化学的、物理的に表面処理することで改質された
ものも含む。
【００１２】さらに、不溶性担体としては、ナイロン、
ニトロセルロース、セルロース、ポリテトラフルオロエ
チレン、ポリエチレン等の有機高分子粒子、またはグラ
ファイト、多孔質ガラス、シリカ等の無機高分子粒子、
アルミニウム、アパタイト等の金属粒子、アルミナ等の
セラミックス粒子などを面状にしきつめたものを挙げる
ことができ、また、これら有機高分子は、例えば酸化、
還元、加水分解などの化学的処理、例えばプラズマ照射
などの物理的処理で改質したもの、無機高分子粒子、金
属粒子、セラミックス粒子は、例えばイオンプレーティ
ングなどの物理的、化学的に表面処理を行うことで改質
されたものも含む。
ニトロセルロース、セルロース、ポリテトラフルオロエ
チレン、ポリエチレン等の有機高分子粒子、またはグラ
ファイト、多孔質ガラス、シリカ等の無機高分子粒子、
アルミニウム、アパタイト等の金属粒子、アルミナ等の
セラミックス粒子などを面状にしきつめたものを挙げる
ことができ、また、これら有機高分子は、例えば酸化、
還元、加水分解などの化学的処理、例えばプラズマ照射
などの物理的処理で改質したもの、無機高分子粒子、金
属粒子、セラミックス粒子は、例えばイオンプレーティ
ングなどの物理的、化学的に表面処理を行うことで改質
されたものも含む。
【００１３】また、不溶性担体としては、アガロースゲ
ル、ポリアクリルアミドゲルや各種膜状体に溶液を含ま
せたもの等、その性状がゲル状のものを挙げることがで
きる。また、ゲル状のもの以外に、乾燥状態のもの、高
粘度のものも用いることができる。粒子の不溶性担体の
場合、試料溶液中での拡散のさせやすさ、遠心分離によ
る回収のしやすさから０．１μm〜５００μm、さらに好
ましくは１μm〜１００μmの粒径のものがよい。しか
し、拡散等による試料と固定化プローブとの反応性およ
び遠心分離等の固定化プローブの回収が可能であれば、
これ以外の粒径の粒子でも良い。プローブを担体に結合
させる方法も既知であり、通常の条件を用いて行うこと
ができる。
ル、ポリアクリルアミドゲルや各種膜状体に溶液を含ま
せたもの等、その性状がゲル状のものを挙げることがで
きる。また、ゲル状のもの以外に、乾燥状態のもの、高
粘度のものも用いることができる。粒子の不溶性担体の
場合、試料溶液中での拡散のさせやすさ、遠心分離によ
る回収のしやすさから０．１μm〜５００μm、さらに好
ましくは１μm〜１００μmの粒径のものがよい。しか
し、拡散等による試料と固定化プローブとの反応性およ
び遠心分離等の固定化プローブの回収が可能であれば、
これ以外の粒径の粒子でも良い。プローブを担体に結合
させる方法も既知であり、通常の条件を用いて行うこと
ができる。
【００１４】プローブを担体に固定化する方法は、プロ
ーブおよび担体の両者の化学的修飾の種類によって異な
り、例えば、次のような各種の方法を用いることができ
る。(１) 核酸または支持体上の水酸基(主としてジオー
ル基)をトリフルオロエタンスルフォニルクロライド(以
下、トレシルクロライドと略記)(Ｋ．Ｎillsonand
Ｋ．Ｍosbach, Ｂiochem, Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun.,
１０２, ４４９,１９８１)、ＣＮＢr(Ｒ．Ａxen et a
l., Ｎature, ２１４, １３０２, １９６７)、トリクロ
ロトリアジン(Ｔ．Ｈ．Ｆinlay et al., Ａnal．Ｂio
chem., ８７, ７７, １９７８)、エピクロロヒドリン
(Ｉ．Ｍatsumoto et al., Ｊ．Ｂiochem., ８５, １
０９１, １９７９)、ビスオキシラン(Ｌ．Ｓundberg a
nd Ｊ．Ｐorath, Ｊ．Ｃhromatogr., ９０, ８７, １
９７４)、ジビニルスルホン酸(Ｊ．Ｐorath, Ｍeth．Ｅ
nzymol., ３４, ２７, １９７４)、ベンゾキノン(Ｊ．
Ｂrandt et al., Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta., ３８
６, １９６, １９７５)、カルボニルジイミダゾール
(Ｇ．Ｓ．Ｂethell et al.,Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.,２５
４, ２５７２, １９７９)などで活性化し、支持体上、
または核酸の主としてアミノ基と結合させる。
ーブおよび担体の両者の化学的修飾の種類によって異な
り、例えば、次のような各種の方法を用いることができ
る。(１) 核酸または支持体上の水酸基(主としてジオー
ル基)をトリフルオロエタンスルフォニルクロライド(以
下、トレシルクロライドと略記)(Ｋ．Ｎillsonand
Ｋ．Ｍosbach, Ｂiochem, Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun.,
１０２, ４４９,１９８１)、ＣＮＢr(Ｒ．Ａxen et a
l., Ｎature, ２１４, １３０２, １９６７)、トリクロ
ロトリアジン(Ｔ．Ｈ．Ｆinlay et al., Ａnal．Ｂio
chem., ８７, ７７, １９７８)、エピクロロヒドリン
(Ｉ．Ｍatsumoto et al., Ｊ．Ｂiochem., ８５, １
０９１, １９７９)、ビスオキシラン(Ｌ．Ｓundberg a
nd Ｊ．Ｐorath, Ｊ．Ｃhromatogr., ９０, ８７, １
９７４)、ジビニルスルホン酸(Ｊ．Ｐorath, Ｍeth．Ｅ
nzymol., ３４, ２７, １９７４)、ベンゾキノン(Ｊ．
Ｂrandt et al., Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta., ３８
６, １９６, １９７５)、カルボニルジイミダゾール
(Ｇ．Ｓ．Ｂethell et al.,Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.,２５
４, ２５７２, １９７９)などで活性化し、支持体上、
または核酸の主としてアミノ基と結合させる。
【００１５】(２) プローブまたは担体上の主としてカ
ルボキシル基(−ＣＯＯＨ基)を水溶性カルボジイミド等
のカルボジイミド(Ａ．Ｔengblad, Ｂiochem．Ｊ., １
９９,２９７, １９８１; Ｍ．Ｆunabashi et al., Ａ
nal．Ｂiochem., １２６, ４１４, １９８２)または２
−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１,２−ジヒド
ロキノリン(ＥＥＤＱ)(Ｇ．Ｓaccomani et al., Ｊ．
Ｂiochem., ２５６, １２４０５, １９８１; Ｂ．Ｂell
euau and Ｇ．Ｍalek, Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc., ９
０, １６５１, １９６８)で活性化し、支持上またはＤ
ＮＡの主としてアミノ基(−ＮＨ2)と縮合結合させる。
ルボキシル基(−ＣＯＯＨ基)を水溶性カルボジイミド等
のカルボジイミド(Ａ．Ｔengblad, Ｂiochem．Ｊ., １
９９,２９７, １９８１; Ｍ．Ｆunabashi et al., Ａ
nal．Ｂiochem., １２６, ４１４, １９８２)または２
−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１,２−ジヒド
ロキノリン(ＥＥＤＱ)(Ｇ．Ｓaccomani et al., Ｊ．
Ｂiochem., ２５６, １２４０５, １９８１; Ｂ．Ｂell
euau and Ｇ．Ｍalek, Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc., ９
０, １６５１, １９６８)で活性化し、支持上またはＤ
ＮＡの主としてアミノ基(−ＮＨ2)と縮合結合させる。
【００１６】(３) 従来の非特異的または末端とは限ら
ない状態で支持体に結合した核酸に、所望のＤＮＡをＤ
ＮＡリガーゼ(連結酵素)を用いて結合させる。 (４) 担体上およびプローブのヒドラジド基とアルデヒ
ド基、またはヒドラジド基とカルボキシル基を用いて結
合させる。ヒドラジド基とアルデヒド基の場合は、混合
するとヒドラゾン結合を形成する。これを還元操作を行
うと共有結合化する(Ｊonathan Ｎ．Ｋremsky etal.,
上掲文献参照)。ヒドラジドとカルボキシル基の場合
は、(２)のようにカルボジイミド等を用いる。
ない状態で支持体に結合した核酸に、所望のＤＮＡをＤ
ＮＡリガーゼ(連結酵素)を用いて結合させる。 (４) 担体上およびプローブのヒドラジド基とアルデヒ
ド基、またはヒドラジド基とカルボキシル基を用いて結
合させる。ヒドラジド基とアルデヒド基の場合は、混合
するとヒドラゾン結合を形成する。これを還元操作を行
うと共有結合化する(Ｊonathan Ｎ．Ｋremsky etal.,
上掲文献参照)。ヒドラジドとカルボキシル基の場合
は、(２)のようにカルボジイミド等を用いる。
【００１７】(５) プローブおよび担体上に互いに親和
力のある物質を導入し(例えば、ビオチンとアビジン)、
その親和力に基づいて固定化を行う(Ｊonathan Ｎ．Ｋ
remsky et al., 上掲文献参照)。 (６) プローブと担体上のチオール基どうしを活性化、
固定化する(Ｋ．Ｂrocklehurst et al., Ｂiochem．
Ｊ., １３３, ５７３, １９７３)。 (７) プローブと担体上のアミノ基どうしをブロモアセ
タミド法にて結合させる(Ｐ．Ｃuatrecasas, Ｊ．Ｂio
l．Ｃhem., ２４５, ３０５９, １９７０)。 (８) プローブと担体を非特異的吸着、静電吸着等によ
り結合させる。以下に、プローブと担体を結合させる手
順を以下により詳細に例示する。
力のある物質を導入し(例えば、ビオチンとアビジン)、
その親和力に基づいて固定化を行う(Ｊonathan Ｎ．Ｋ
remsky et al., 上掲文献参照)。 (６) プローブと担体上のチオール基どうしを活性化、
固定化する(Ｋ．Ｂrocklehurst et al., Ｂiochem．
Ｊ., １３３, ５７３, １９７３)。 (７) プローブと担体上のアミノ基どうしをブロモアセ
タミド法にて結合させる(Ｐ．Ｃuatrecasas, Ｊ．Ｂio
l．Ｃhem., ２４５, ３０５９, １９７０)。 (８) プローブと担体を非特異的吸着、静電吸着等によ
り結合させる。以下に、プローブと担体を結合させる手
順を以下により詳細に例示する。
【００１８】一本鎖ＤＮＡの末端を化学的に修飾する場
合 一本鎖ＤＮＡとしては、その末端に１もしくはそれ以上
の余分のヌクレオチド分子を含んでいるか、あるいは一
本鎖ＤＮＡの末端にあるヌクレオチド分子が化学的修飾
を受けているものを用いれば、該余分のヌクレオチドま
たは化学的修飾を受けたヌクレオチドを介して支持体上
への結合を行うことができる。１) まず、末端に固定化
に適した官能基(例えば、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ)を導入
した一本鎖ＤＮＡを調製する。ＤＮＡを合成する場合、
その合成自体は、市販のＤＮＡ合成装置[例えば、ＡＢ
Ｉ社製３９１型ＰＣＲ−ＭＡＴＥ]を使用し、常法によ
って行うことができる。官能基の導入は、例えば、次の
ような方法で行うことができる。
合 一本鎖ＤＮＡとしては、その末端に１もしくはそれ以上
の余分のヌクレオチド分子を含んでいるか、あるいは一
本鎖ＤＮＡの末端にあるヌクレオチド分子が化学的修飾
を受けているものを用いれば、該余分のヌクレオチドま
たは化学的修飾を受けたヌクレオチドを介して支持体上
への結合を行うことができる。１) まず、末端に固定化
に適した官能基(例えば、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ)を導入
した一本鎖ＤＮＡを調製する。ＤＮＡを合成する場合、
その合成自体は、市販のＤＮＡ合成装置[例えば、ＡＢ
Ｉ社製３９１型ＰＣＲ−ＭＡＴＥ]を使用し、常法によ
って行うことができる。官能基の導入は、例えば、次の
ような方法で行うことができる。
【００１９】(１) アミノリンク２(ＡＢＩ社製)の導入 以下の反応式にしたがい、ＤＮＡ合成装置を使って、ヘ
キシルアミノ基をＤＮＡ末端に導入することができる
(ＡＢＩ社のＵser Ｂulletin, Ｎo．４９, Ａugust
１９８８、参照)。
キシルアミノ基をＤＮＡ末端に導入することができる
(ＡＢＩ社のＵser Ｂulletin, Ｎo．４９, Ａugust
１９８８、参照)。
【化１】
【００２０】(２）
【化２】 で示されるリンカーを、ＤＮＡ合成装置（例えば、ＡＢ
Ｉ社製Ａ−３９１ＥＰＰＣＲ−ＭＡＴＥ)を用いてＤＮ
Ａ末端に導入し、これを処理することにより、このリン
カー末端を反応性のあるアルデヒド基またはカルボキシ
基に導き、さらにアルデヒド基の場合は、ビチオンのヒ
ドラジド化合物と反応させることにより、アビジンと特
異的に結合して複合体を形成し得るビチオンを導入する
ことができる(Ｊonathan Ｎ．Ｋremsky et al., Ｎu
cleic Ａcid Ｒesearch １９８７, Ｖol．１５, p．
２８９１〜参照)。
Ｉ社製Ａ−３９１ＥＰＰＣＲ−ＭＡＴＥ)を用いてＤＮ
Ａ末端に導入し、これを処理することにより、このリン
カー末端を反応性のあるアルデヒド基またはカルボキシ
基に導き、さらにアルデヒド基の場合は、ビチオンのヒ
ドラジド化合物と反応させることにより、アビジンと特
異的に結合して複合体を形成し得るビチオンを導入する
ことができる(Ｊonathan Ｎ．Ｋremsky et al., Ｎu
cleic Ａcid Ｒesearch １９８７, Ｖol．１５, p．
２８９１〜参照)。
【００２１】(３) ＤＮＡ合成装置を用い、アミノ基を
もつ塩基のヌクレオチド１〜数１０個を相補部分のＤＮ
Ａ末端に付加する。 (４) ターミナルトランスフェラーゼにより、支持体と
の結合に適した塩基、またはその反応性誘導体をＤＮＡ
末端に導入する(Ｄeug Ｇ．and Ｗu Ｒ.,Ｍethods
in Ｅnzymology, Ｖol．１００, p．９６〜１１６, １
９８３、参照)。
もつ塩基のヌクレオチド１〜数１０個を相補部分のＤＮ
Ａ末端に付加する。 (４) ターミナルトランスフェラーゼにより、支持体と
の結合に適した塩基、またはその反応性誘導体をＤＮＡ
末端に導入する(Ｄeug Ｇ．and Ｗu Ｒ.,Ｍethods
in Ｅnzymology, Ｖol．１００, p．９６〜１１６, １
９８３、参照)。
【００２２】２) 次に、１)で得た一本鎖ＤＮＡの相補
鎖を１)と同様の合成装置を用いて調製し、両者をアニ
ーリングさせて、二本鎖ＤＮＡとする。 ３) 上で得た二本鎖ＤＮＡを含む溶液に固定化用支持体
を加え、両者を結合させる。 ４) 上で得た固定化二本鎖ＤＮＡを２．４Ｍテトラエチ
ルアンモニウムクロライド水溶液、適宜希釈した１０×
ＳＳＣ(１．５Ｍ ＮaＣlおよび０．１５Ｍクエン酸ナ
トリウム; pＨ７．０)、０．１〜２ＭＮaＣl水溶液等の
塩溶液中、熱(約４０℃以上)またはアルカリを加えるこ
とにより変性させ、遠心して固相と液相を分離すること
により、固定化一本鎖ＤＮＡを得る。なお、２）以下の
操作を経ずして官能基を導入した一本鎖ＤＮＡを直接支
持体と混合し固定化する事により固定化一本鎖ＤＮＡを
得る事もできる。
鎖を１)と同様の合成装置を用いて調製し、両者をアニ
ーリングさせて、二本鎖ＤＮＡとする。 ３) 上で得た二本鎖ＤＮＡを含む溶液に固定化用支持体
を加え、両者を結合させる。 ４) 上で得た固定化二本鎖ＤＮＡを２．４Ｍテトラエチ
ルアンモニウムクロライド水溶液、適宜希釈した１０×
ＳＳＣ(１．５Ｍ ＮaＣlおよび０．１５Ｍクエン酸ナ
トリウム; pＨ７．０)、０．１〜２ＭＮaＣl水溶液等の
塩溶液中、熱(約４０℃以上)またはアルカリを加えるこ
とにより変性させ、遠心して固相と液相を分離すること
により、固定化一本鎖ＤＮＡを得る。なお、２）以下の
操作を経ずして官能基を導入した一本鎖ＤＮＡを直接支
持体と混合し固定化する事により固定化一本鎖ＤＮＡを
得る事もできる。
【００２３】二本鎖ＤＮＡをそのまま、あるいは末端を
化学的に修飾して用いる場合 二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１もしくはそれ以上のヌクレ
オチド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡは、そのままあ
るいは化学的な修飾を施した後、支持体に末端で結合さ
せることができるので、上記の工程３)以降の操作を施
せば、上と同様の目的を達成することができる。このよ
うな二本鎖ＤＮＡは、次のようにして調製することがで
きる。
化学的に修飾して用いる場合 二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１もしくはそれ以上のヌクレ
オチド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡは、そのままあ
るいは化学的な修飾を施した後、支持体に末端で結合さ
せることができるので、上記の工程３)以降の操作を施
せば、上と同様の目的を達成することができる。このよ
うな二本鎖ＤＮＡは、次のようにして調製することがで
きる。
【００２４】(１) ターミナルトランスフェラーゼを使
用して、片方のＤＮＡ鎖の末端にのみ支持体との結合に
適した塩基またはその反応性誘導体を導入する。 (２) 末端に一本鎖部分ができるように制限酵素で切断
する。 (３) 官能基を持つＤＮＡ分子と、二本鎖ＤＮＡをＤＮ
Ａリガーゼにより結合させる。例えば、二本鎖ＤＮＡの
両端の切断端が異なる配列を持つように２種の制限酵素
で処理する。そこで、一方の切断端に特異的に結合でき
る配列を有する官能基を有するＤＮＡを加え、そこにＤ
ＮＡリガーゼを作用させることにより目的ＤＮＡ断片の
末端に官能基を導入できる。この場合、除去したい方の
鎖の５'末端を脱リン酸化しておいてもよい。即ち、目
的とする二本鎖ＤＮＡの一端だけが出た長い二本鎖ＤＮ
Ａを調製し、この状態で脱リン酸化酵素により５'末端
を脱リン酸化し、その後二本鎖ＤＮＡを切断して目的断
片をつくると一方の５'末端は脱リン酸化されたものが
できる。
用して、片方のＤＮＡ鎖の末端にのみ支持体との結合に
適した塩基またはその反応性誘導体を導入する。 (２) 末端に一本鎖部分ができるように制限酵素で切断
する。 (３) 官能基を持つＤＮＡ分子と、二本鎖ＤＮＡをＤＮ
Ａリガーゼにより結合させる。例えば、二本鎖ＤＮＡの
両端の切断端が異なる配列を持つように２種の制限酵素
で処理する。そこで、一方の切断端に特異的に結合でき
る配列を有する官能基を有するＤＮＡを加え、そこにＤ
ＮＡリガーゼを作用させることにより目的ＤＮＡ断片の
末端に官能基を導入できる。この場合、除去したい方の
鎖の５'末端を脱リン酸化しておいてもよい。即ち、目
的とする二本鎖ＤＮＡの一端だけが出た長い二本鎖ＤＮ
Ａを調製し、この状態で脱リン酸化酵素により５'末端
を脱リン酸化し、その後二本鎖ＤＮＡを切断して目的断
片をつくると一方の５'末端は脱リン酸化されたものが
できる。
【００２５】(４) 二本鎖ＤＮＡの３'末端−ＯＨ基に
トリクロロトリアジン基を導入することでＯＨ基を活性
化する。５'末端−ＯＨ基には、(３)で述べた脱リン酸
化を行い−ＯＨ基を露出させトリクロロトリアジンを反
応させて活性化する。３'末端の−ＯＨ基と５'末端の−
ＯＨ基では、反応性が５'末端の方が良いため、５'末端
−ＯＨ基を特異的に活性化できる。
トリクロロトリアジン基を導入することでＯＨ基を活性
化する。５'末端−ＯＨ基には、(３)で述べた脱リン酸
化を行い−ＯＨ基を露出させトリクロロトリアジンを反
応させて活性化する。３'末端の−ＯＨ基と５'末端の−
ＯＨ基では、反応性が５'末端の方が良いため、５'末端
−ＯＨ基を特異的に活性化できる。
【００２６】ＤＮＡリンカーと結合した所望の核酸断片
と固定化プローブとのハイブリダイゼーションの後、ハ
イブリダイズした固定化プローブは、１)遠心分離、２)
濾過、３)沈降分離、４)上澄液の除去などにより回収す
ることができる。ハイブリダイズした固定化プローブか
ら、所望の核酸断片を回収するために行なう変性処理と
しては、１)加熱変性処理(通常、温度６０〜９５℃)、
２)アルカリ変性処理(通常、ＮaＯＨを終濃度約１規定
(１Ｎ)まで加える)、３)ホルムアミド、尿素などを添加
することからなる変性処理などが挙げられ、これらを適
宜組合せることもできる。
と固定化プローブとのハイブリダイゼーションの後、ハ
イブリダイズした固定化プローブは、１)遠心分離、２)
濾過、３)沈降分離、４)上澄液の除去などにより回収す
ることができる。ハイブリダイズした固定化プローブか
ら、所望の核酸断片を回収するために行なう変性処理と
しては、１)加熱変性処理(通常、温度６０〜９５℃)、
２)アルカリ変性処理(通常、ＮaＯＨを終濃度約１規定
(１Ｎ)まで加える)、３)ホルムアミド、尿素などを添加
することからなる変性処理などが挙げられ、これらを適
宜組合せることもできる。
【００２７】上記のごとく、本発明方法と従来法の相違
点は、所望の核酸配列を含む核酸断片がその両末端に特
定の制限酵素による断端を有するものであり、これら両
末端に導入された相異なるリンカーの各々と相補的な２
種のプローブを順次用い、該所望の核酸断片を２回ハイ
ブリダイゼーションすることにある。従って、本発明方
法によれば、予め選択した特定のリンカーと相補性を有
するプローブを用いるので、特異性が高く、しかも相異
なる２種のリンカーの各々に相補的なプローブにより、
ハイブリザイゼーションを２回行うために精度が高く、
得られる核酸断片の純度も高い。その結果、簡便な操作
で効率良く行うことができる。しかも、リンカーとプロ
ーブとのハイブリダイゼーションに基づくので目的のＤ
ＮＡ断片の塩基配列に左右されず、反応条件の設定も容
易である。このことは、本発明方法を用いて塩基配列が
不明なＤＮＡ断片を抽出することができることを示唆し
ている。さらにまた、本発明方法によれば、電気泳動等
の繁雑で時間のかかる手段を用いずに、核酸断片を回収
することができる。以下に実施例を挙げて本発明をより
具体的に説明する。
点は、所望の核酸配列を含む核酸断片がその両末端に特
定の制限酵素による断端を有するものであり、これら両
末端に導入された相異なるリンカーの各々と相補的な２
種のプローブを順次用い、該所望の核酸断片を２回ハイ
ブリダイゼーションすることにある。従って、本発明方
法によれば、予め選択した特定のリンカーと相補性を有
するプローブを用いるので、特異性が高く、しかも相異
なる２種のリンカーの各々に相補的なプローブにより、
ハイブリザイゼーションを２回行うために精度が高く、
得られる核酸断片の純度も高い。その結果、簡便な操作
で効率良く行うことができる。しかも、リンカーとプロ
ーブとのハイブリダイゼーションに基づくので目的のＤ
ＮＡ断片の塩基配列に左右されず、反応条件の設定も容
易である。このことは、本発明方法を用いて塩基配列が
不明なＤＮＡ断片を抽出することができることを示唆し
ている。さらにまた、本発明方法によれば、電気泳動等
の繁雑で時間のかかる手段を用いずに、核酸断片を回収
することができる。以下に実施例を挙げて本発明をより
具体的に説明する。
【００２８】
【実施例】実施例１ pＢＲ３２２からＥcoＲＩ−Ｐst
Ｉ断片(塩基対)の抽出 本実施例では所望の核酸断片(以下、Ａと表す)が、大腸
菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２の一部である場合の、
本発明方法によるＡの抽出例を示す。１）Ａを含有する
核酸断片の両端の制限酵素切断部位の決定と切断ｐＢＲ
３２２の制限酵素地図は公知であり、これを添付の第１
図に示す。図中、斜線部は、所望の核酸部分Ａを表す。
また、使用酵素による切断部位は□で囲んで示されてい
る。この制限酵素地図から、Ａの両端を制限酵素ＰstＩ
およびＥcoＲＩで切断できること、およびＡにはＳal
Ｉ、ＢalＩおよびＰvuＩＩ部位が存在しないことから、
これら５種の制限酵素でpＢＲ３２２を処理すれば、両
端にＰstＩとＥcoＲＩ切断端を持った断片は、Ａの他に
生成しないことがわかる。そこで、以下に述べる様に、
pＢＲ３２２をＥcoＲI、ＳalＩ、ＰstI、ＰvuIIおよび
ＢalIで処理し、Ａを含む核酸断片の混合物を得た。
Ｉ断片(塩基対)の抽出 本実施例では所望の核酸断片(以下、Ａと表す)が、大腸
菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２の一部である場合の、
本発明方法によるＡの抽出例を示す。１）Ａを含有する
核酸断片の両端の制限酵素切断部位の決定と切断ｐＢＲ
３２２の制限酵素地図は公知であり、これを添付の第１
図に示す。図中、斜線部は、所望の核酸部分Ａを表す。
また、使用酵素による切断部位は□で囲んで示されてい
る。この制限酵素地図から、Ａの両端を制限酵素ＰstＩ
およびＥcoＲＩで切断できること、およびＡにはＳal
Ｉ、ＢalＩおよびＰvuＩＩ部位が存在しないことから、
これら５種の制限酵素でpＢＲ３２２を処理すれば、両
端にＰstＩとＥcoＲＩ切断端を持った断片は、Ａの他に
生成しないことがわかる。そこで、以下に述べる様に、
pＢＲ３２２をＥcoＲI、ＳalＩ、ＰstI、ＰvuIIおよび
ＢalIで処理し、Ａを含む核酸断片の混合物を得た。
【００２９】使用した制限酵素は全て宝酒造社供給のも
のである。まず以下の組成の反応液１を３７℃で１時間
反応させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止す
る。フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾
燥させる。
のである。まず以下の組成の反応液１を３７℃で１時間
反応させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止す
る。フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾
燥させる。
【００３０】次いで、上記乾燥ＤＮＡを水１６μlに溶
かし、下記の組成の反応液２中で３７℃において１時間
反応させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止す
る。フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾
燥させる。
かし、下記の組成の反応液２中で３７℃において１時間
反応させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止す
る。フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾
燥させる。
【００３１】上で得た乾燥ＤＮＡを水３５μlに溶か
し、下記の組成の反応液３中で３７℃において１時間反
応させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止する。
フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾燥さ
せる。
し、下記の組成の反応液３中で３７℃において１時間反
応させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止する。
フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾燥さ
せる。
【００３２】２）ＤＮＡリンカーの調製 ２a）ＥcoＲＩリンカーの調製 以下の配列を有するＥcoＲＩリンカーを合成する。ＥcoＲＩリンカー 5' GCAACCATGCCTAAGTTTG 3' 3' CGTTGGTACGGATTCAAACTTAA 5' これら２種の相補的な１本鎖ＤＮＡは、Ａpplied Ｂios
ystems社のＤＮＡ合成装置(３９１ ＰＣＲ−ＭＡＴＥ
ＥＰ型）を用い、添付の使用手引書の記載に従って合成
した。次いで、合成したＤＮＡを該使用手引書に記載の
切り出し、精製法で精製した。
ystems社のＤＮＡ合成装置(３９１ ＰＣＲ−ＭＡＴＥ
ＥＰ型）を用い、添付の使用手引書の記載に従って合成
した。次いで、合成したＤＮＡを該使用手引書に記載の
切り出し、精製法で精製した。
【００３３】精製した１本鎖ＤＮＡ(いずれも水中、１
μg／μl)を５μlずつ混合し、３０℃で１時間放置して
アニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡとする。次いで、得ら
れた２本鎖ＤＮＡの５'末端をりん酸化する。りん酸化
は以下の反応液４中で、３７℃で１時間反応させた後、
６５℃で５分間処理して反応を停止することで行った
μg／μl)を５μlずつ混合し、３０℃で１時間放置して
アニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡとする。次いで、得ら
れた２本鎖ＤＮＡの５'末端をりん酸化する。りん酸化
は以下の反応液４中で、３７℃で１時間反応させた後、
６５℃で５分間処理して反応を停止することで行った
【００３４】２b）ＰstＩリンカーの調製 以下の配列を有するＰstＩＩリンカーを合成する。ＰstＩリンカー 5' TTCCGTATGGCATGCCTCCCTGCA 3' 3' AAGGCATACCGTACGGAGGG 5' １本鎖ＤＮＡの合成、精製、アニーリング、りん酸化等
は上記２a)と同様である。
は上記２a)と同様である。
【００３５】３）Ａを含むＤＮＡ断片とリンカーの結合 １)で調製したpＢＲ３２２消化物(ＤＮＡ断片混合物)中
の所望のＤＮＡ断片に２)で調製したリンカーを連結す
る。タカラＤＮＡライゲーションキット(宝酒造製)を用
いる。ＤＮＡ断片混合物をＴＥ緩衝液(１０mＭ Ｔris−
ＨＣl、pＨ８.０および１mＭＥＤＴＡ)２０μlに溶かし
下記の反応液５中、１６℃で一夜反応させた後、エタノ
ール沈殿に付し、乾固させる。 注）Ａ液およびＢ液はタカラＤＮＡライゲーションキ
ットに付属の反応液である。
の所望のＤＮＡ断片に２)で調製したリンカーを連結す
る。タカラＤＮＡライゲーションキット(宝酒造製)を用
いる。ＤＮＡ断片混合物をＴＥ緩衝液(１０mＭ Ｔris−
ＨＣl、pＨ８.０および１mＭＥＤＴＡ)２０μlに溶かし
下記の反応液５中、１６℃で一夜反応させた後、エタノ
ール沈殿に付し、乾固させる。 注）Ａ液およびＢ液はタカラＤＮＡライゲーションキ
ットに付属の反応液である。
【００３６】４）固定化プローブの調製 以下の塩基配列で示される４種のプローブＤＮＡを、Ａ
pplied Ｂiosystems社のＤＮＡ合成装置(３９１ ＰＣＲ
−ＭＡＴＥ ＥＰ型)を用い、添付の使用手引書の記載に
従って合成した。各プローブの５'末端には、担体に連
結するためのアミノリンクＩＩ(ＤＮＡリンカー)を組み
込んだ。プローブ１：Ｈ2Ｎ〜(アミノリンクＩＩ)〜GCA
ACCATGCCTAAGTTTGプローブ２：CGTTGGTACGGATTCAAACTTA
A(アミノリンクＩＩ)−ＮＨ2プローブ３：Ｈ2Ｎ〜(アミ
ノリンクＩＩ)〜TTCCGTATGGCATGCCTCCCTGCAプローブ
４：AAGGCATACCGTACGGAGGG(アミノリンクＩＩ)−ＮＨ2
プローブ１および２はＥcoＲＩリンカーと相補的であ
り、プローブ３および４はＰstＩリンカーと相補的であ
る。これらプローブ１〜プローブ４を別個にゲルに固定
化する。固定化は以下の要領でおこなう。
pplied Ｂiosystems社のＤＮＡ合成装置(３９１ ＰＣＲ
−ＭＡＴＥ ＥＰ型)を用い、添付の使用手引書の記載に
従って合成した。各プローブの５'末端には、担体に連
結するためのアミノリンクＩＩ(ＤＮＡリンカー)を組み
込んだ。プローブ１：Ｈ2Ｎ〜(アミノリンクＩＩ)〜GCA
ACCATGCCTAAGTTTGプローブ２：CGTTGGTACGGATTCAAACTTA
A(アミノリンクＩＩ)−ＮＨ2プローブ３：Ｈ2Ｎ〜(アミ
ノリンクＩＩ)〜TTCCGTATGGCATGCCTCCCTGCAプローブ
４：AAGGCATACCGTACGGAGGG(アミノリンクＩＩ)−ＮＨ2
プローブ１および２はＥcoＲＩリンカーと相補的であ
り、プローブ３および４はＰstＩリンカーと相補的であ
る。これらプローブ１〜プローブ４を別個にゲルに固定
化する。固定化は以下の要領でおこなう。
【００３７】（１） ゲルの活性化 トレシルクロライド(トリフルオロエタンスルフォニル
クロライド、以下トレシルという)(Ｋ＆Ｋ社製またはＦ
luka社製)はｐＨ３以上では水により分解されるので、
以下の操作はドライボックスまたは乾燥窒素を満たした
無菌パック等を用い、水の混入を避けて行う。アセト
ン、ピリジンをあらかじめモレキュラーシーブで３日間
以上脱水しておく。１０mlの蓋付き丸底フラスコに脱水
アセトン１．５ml、ピリジン１００μlおよびスターラ
ーチップを入れる。
クロライド、以下トレシルという)(Ｋ＆Ｋ社製またはＦ
luka社製)はｐＨ３以上では水により分解されるので、
以下の操作はドライボックスまたは乾燥窒素を満たした
無菌パック等を用い、水の混入を避けて行う。アセト
ン、ピリジンをあらかじめモレキュラーシーブで３日間
以上脱水しておく。１０mlの蓋付き丸底フラスコに脱水
アセトン１．５ml、ピリジン１００μlおよびスターラ
ーチップを入れる。
【００３８】他方、ゲル[Ｓhimpack diol ３００(Ｓhim
azu)]１gを、＃５ガラスフィルター上で吸引しながら脱
水アセトン５０mlにより素早く洗浄し、直ぐに上記丸底
フラスコに入れる。次いで、フラスコを氷浴で冷却し
(約０℃)、乾燥窒素を送り込みながら、激しい撹拌下に
トレシル（ゲル１gあたりトレシル２００μl)をほぼ１
分間で滴下する。滴下終了後、丸底フラスコに蓋をし、
スターラーの速度を落としてゲルの破砕をさけつつ、約
０℃で２０分間反応を継続する。反応後、ゲルをガラス
フィルター上に移し、アセトン、アセトン＋５mＭ ＨＣ
l(１：１)、５mＭ ＨＣlで順次、洗浄する。さらに乾燥
アセトン３０mlで洗浄した後、乾燥窒素を満たしたビニ
ール袋をフィルターの口にあて、ほぼ１時間吸引してゲ
ルを完全に乾燥させる。
azu)]１gを、＃５ガラスフィルター上で吸引しながら脱
水アセトン５０mlにより素早く洗浄し、直ぐに上記丸底
フラスコに入れる。次いで、フラスコを氷浴で冷却し
(約０℃)、乾燥窒素を送り込みながら、激しい撹拌下に
トレシル（ゲル１gあたりトレシル２００μl)をほぼ１
分間で滴下する。滴下終了後、丸底フラスコに蓋をし、
スターラーの速度を落としてゲルの破砕をさけつつ、約
０℃で２０分間反応を継続する。反応後、ゲルをガラス
フィルター上に移し、アセトン、アセトン＋５mＭ ＨＣ
l(１：１)、５mＭ ＨＣlで順次、洗浄する。さらに乾燥
アセトン３０mlで洗浄した後、乾燥窒素を満たしたビニ
ール袋をフィルターの口にあて、ほぼ１時間吸引してゲ
ルを完全に乾燥させる。
【００３９】（２） ゲルへのプローブの固定化 プローブＤＮＡを濃アンモニア水で切り出し、５５℃で
１０時間保持した後、脱保護する。減圧下に濃縮乾固
し、１０mＭ ＴＥＡＡ(酢酸トリエチルアミン)バッファ
ー２００μlに溶かす。エーテル抽出により保護基を除
去した後、再度濃縮乾固する。これをカプリングバッフ
ァー(０.２Ｍ ＮaＨＣＯ3、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ７.５)
１８０μlに溶かす。（１）で調製した活性化ゲル１０
０mgを１.５mlエッペンドルフチューブにとり、上記プ
ローブＤＮＡと混合する。穏やかに撹拌しながら、２５
℃で２４時間保持すると、プローブＤＮＡはゲルに固定
化される。反応終了後、２０００rpmで５分間遠心して
ゲルを上清から分離し、固定化プローブを得る。
１０時間保持した後、脱保護する。減圧下に濃縮乾固
し、１０mＭ ＴＥＡＡ(酢酸トリエチルアミン)バッファ
ー２００μlに溶かす。エーテル抽出により保護基を除
去した後、再度濃縮乾固する。これをカプリングバッフ
ァー(０.２Ｍ ＮaＨＣＯ3、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ７.５)
１８０μlに溶かす。（１）で調製した活性化ゲル１０
０mgを１.５mlエッペンドルフチューブにとり、上記プ
ローブＤＮＡと混合する。穏やかに撹拌しながら、２５
℃で２４時間保持すると、プローブＤＮＡはゲルに固定
化される。反応終了後、２０００rpmで５分間遠心して
ゲルを上清から分離し、固定化プローブを得る。
【００４０】５）所望の核酸断片と固定化プローブのハ
イブリダイゼーション a）上記３)で得た、リンカーと結合した所望のＤＮＡを
含有するＤＮＡ断片混合物を２.４Ｍテトラエチルアン
モニウムクロライド１００μlに溶かす。 b）７０℃で１分間変性処理を行う。 c）固定化プローブ１(５mg)を加え、２０℃で１０分間
放置する。 d）遠心分離により(２０００rpm、１５秒)ハイブリダイ
ズした固定化プローブ１を沈澱させ、上清を別のエッペ
ンドルフチューブに取る。 e）固定化プローブ相を２.４Ｍテトラエチルアンモニウ
ムクロライド５０μlで洗浄し、再度２０００rpm、１５
秒間の遠心によりプローブ相を回収する。上清は上記d)
のエッペンドルフチューブに加える。 f）e)で分離した固定化プローブ相に２.４Ｍテトラエチ
ルアンモニウムクロライド(１００μl)を加えて懸濁
し、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００rp
m、１５秒間の遠心により固定化プローブとＤＮＡを分
離する。上清を回収する。
イブリダイゼーション a）上記３)で得た、リンカーと結合した所望のＤＮＡを
含有するＤＮＡ断片混合物を２.４Ｍテトラエチルアン
モニウムクロライド１００μlに溶かす。 b）７０℃で１分間変性処理を行う。 c）固定化プローブ１(５mg)を加え、２０℃で１０分間
放置する。 d）遠心分離により(２０００rpm、１５秒)ハイブリダイ
ズした固定化プローブ１を沈澱させ、上清を別のエッペ
ンドルフチューブに取る。 e）固定化プローブ相を２.４Ｍテトラエチルアンモニウ
ムクロライド５０μlで洗浄し、再度２０００rpm、１５
秒間の遠心によりプローブ相を回収する。上清は上記d)
のエッペンドルフチューブに加える。 f）e)で分離した固定化プローブ相に２.４Ｍテトラエチ
ルアンモニウムクロライド(１００μl)を加えて懸濁
し、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００rp
m、１５秒間の遠心により固定化プローブとＤＮＡを分
離する。上清を回収する。
【００４１】g）f)で回収した上清に固定化プローブ４
(５mg)を加えて２０℃で１０分間放置する。 h）２０００rpmで１５秒遠心し、上清を除去する。 i）h)で分離した固定化プローブ相に２.４Ｍテトラエチ
ルアンモニウムクロライド(１００μl)を加えて懸濁し
たのち２０００rpmで１５秒間遠心し、固定化プローブ
を回収する。 j）i)で回収した固定化プローブに、２.４Ｍテトラエチ
ルアンモニウムクロライド(１００μl)を加えて懸濁し
た後、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００
rpm、１５秒間の遠心により固定化プローブから上清を
分離する。上清を回収し、サンプル１とする。 k）上記e)の上清を７０℃で１分間変性処理した後、固
定化プローブ２(５mg)を加え、２０℃で１０分間放置す
る。 l）２０００rpmで１５秒間遠心し、上清を除去する。
(５mg)を加えて２０℃で１０分間放置する。 h）２０００rpmで１５秒遠心し、上清を除去する。 i）h)で分離した固定化プローブ相に２.４Ｍテトラエチ
ルアンモニウムクロライド(１００μl)を加えて懸濁し
たのち２０００rpmで１５秒間遠心し、固定化プローブ
を回収する。 j）i)で回収した固定化プローブに、２.４Ｍテトラエチ
ルアンモニウムクロライド(１００μl)を加えて懸濁し
た後、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００
rpm、１５秒間の遠心により固定化プローブから上清を
分離する。上清を回収し、サンプル１とする。 k）上記e)の上清を７０℃で１分間変性処理した後、固
定化プローブ２(５mg)を加え、２０℃で１０分間放置す
る。 l）２０００rpmで１５秒間遠心し、上清を除去する。
【００４２】m）回収した固定化プローブ相を２.４Ｍテ
トラエチルアンモニウムクロライド１００μlで洗浄
し、再度２０００rpm、１５秒間の遠心によりプローブ
相を回収する。上清は除去する。 n）回収した固定化プローブ相に２.４Ｍテトラエチルア
ンモニウムクロライド(１００μl)を加えて懸濁し、７
０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００rpm、１
５秒間の遠心により上清を回収する。 o）上記n)で回収した上清に固定化プローブ３（５mg)を
加えて２０℃で１０分間放置する。 p）２０００rpmで１５秒遠心し、固定化プローブを回収
して２.４Ｍテトラエチルアンモニウムクロライド１０
０μlにより洗浄し、再度２０００rpmで１５秒間遠心
し、固定化プローブを回収する。これを、２.４Ｍテト
ラエチルアンモニウムクロライド１００μlに懸濁した
後、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００rp
m、１５秒間の遠心により上清を回収する。これをサン
プル２とする。
トラエチルアンモニウムクロライド１００μlで洗浄
し、再度２０００rpm、１５秒間の遠心によりプローブ
相を回収する。上清は除去する。 n）回収した固定化プローブ相に２.４Ｍテトラエチルア
ンモニウムクロライド(１００μl)を加えて懸濁し、７
０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００rpm、１
５秒間の遠心により上清を回収する。 o）上記n)で回収した上清に固定化プローブ３（５mg)を
加えて２０℃で１０分間放置する。 p）２０００rpmで１５秒遠心し、固定化プローブを回収
して２.４Ｍテトラエチルアンモニウムクロライド１０
０μlにより洗浄し、再度２０００rpmで１５秒間遠心
し、固定化プローブを回収する。これを、２.４Ｍテト
ラエチルアンモニウムクロライド１００μlに懸濁した
後、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００rp
m、１５秒間の遠心により上清を回収する。これをサン
プル２とする。
【００４３】６）ＤＮＡ断片の同定および純度の測定
５)で得たサンプル１および２を混合し、７０℃で１０
分間処理した後、２０℃で３０分間放置し、試料とす
る。試料２μlを２％アガロースゲル電気泳動にかける
と、約７９０〜８００bpの位置に単一のバンドが認めら
れた。他方、試料を回収したＤＮＡの量で確認した。す
なわち、エチジウムブロマイド染色により、回収された
ＤＮＡ量は１４５ngであることが確認された。
５)で得たサンプル１および２を混合し、７０℃で１０
分間処理した後、２０℃で３０分間放置し、試料とす
る。試料２μlを２％アガロースゲル電気泳動にかける
と、約７９０〜８００bpの位置に単一のバンドが認めら
れた。他方、試料を回収したＤＮＡの量で確認した。す
なわち、エチジウムブロマイド染色により、回収された
ＤＮＡ量は１４５ngであることが確認された。
【００４４】一方、使用したpＢＲ３２２(１μg)に含ま
れているＥcoＲＩ−ＰstＩ ＤＮＡ断片の理論量は１７
３ngであるので、ＤＮＡ断片の回収率は以下の式から８
０％と計算された。
れているＥcoＲＩ−ＰstＩ ＤＮＡ断片の理論量は１７
３ngであるので、ＤＮＡ断片の回収率は以下の式から８
０％と計算された。
【化３】 ＊：７５２はＥcoＲＩ−ＰstＩ断片に含まれるヌクレオ
チド数であり、７９５はリンカーを付けた該断片のヌク
レオチド数である。これらの結果は目的の核酸断片Ａが
回収されたことを示すものである。
チド数であり、７９５はリンカーを付けた該断片のヌク
レオチド数である。これらの結果は目的の核酸断片Ａが
回収されたことを示すものである。
【図１】 pＢＲ３２２の完全な制限酵素地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 所望の核酸配列を含有する核酸断片を全
核酸から抽出する方法であって、 （Ａ）該核酸断片の５’および３’末端に、予め定めら
れた相異なる制限酵素切断端を形成し得る２種の相異な
る制限酵素と、 （Ｂ）上記（Ａ）とは異なる制限酵素であって、該所望
の核酸配列を含有する核酸断片がその制限酵素に対応す
る制限部位を含んでいない１またはそれ以上の制限酵素
からなる制限酵素の組合せで全核酸を切断して核酸断片
混合物を得ると共に、該所望の核酸配列を含有する核酸
断片の両切断端のそれぞれに結合する相異なる２種のリ
ンカーを調製し、該リンカーと上記核酸断片混合物とを
反応させ、得られた反応液に、いずれか１方のリンカー
と相補的な固定化プローブを加えてハイブリダイゼーシ
ョンを行い、ハイブリダイズした核酸断片を分離した
後、該核酸断片に、もう１方のリンカーと相補的な固定
化プローブを加えて再びハイブリダイゼーションを行
い、ハイブリダイズした核酸断片を分離することからな
る方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3113062A JP3044819B2 (ja) | 1990-05-17 | 1991-05-17 | 全核酸中の特定の核酸断片の抽出法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-127702 | 1990-05-17 | ||
| JP12770290 | 1990-05-17 | ||
| JP3113062A JP3044819B2 (ja) | 1990-05-17 | 1991-05-17 | 全核酸中の特定の核酸断片の抽出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04228075A JPH04228075A (ja) | 1992-08-18 |
| JP3044819B2 true JP3044819B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=26452088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3113062A Expired - Fee Related JP3044819B2 (ja) | 1990-05-17 | 1991-05-17 | 全核酸中の特定の核酸断片の抽出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3044819B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6123899A (en) * | 1998-10-15 | 2000-05-01 | Toyo Kohan Co. Ltd. | Supports for immobilizing dna or the like |
-
1991
- 1991-05-17 JP JP3113062A patent/JP3044819B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04228075A (ja) | 1992-08-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |