JPH04228075A - 全核酸中の特定の核酸断片の抽出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸（ＤＮＡ）溶液ま
たは核酸混合液から特定の核酸断片を抽出する方法に関
する。

【０００２】

【従来技術と発明が解決すべき課題】今日、遺伝子工学
の発達に伴い、医学、農学を始め、様々な分野で特定の
核酸配列を抽出、分離することが必要とされる場合が増
加している。既知の塩基配列を含有する特定の核酸断片
を、核酸溶液から抽出する方法として以下に述べる手法
が知られている（細胞工学、第８巻、Ｎｏ．７，１９８
９）。即ち、まず目的とする核酸断片の塩基配列から、
２０〜３０塩基からなるプローブ用配列を２，３ケ所決
定する。この配列に基いてプローブを合成し、共有結合
によりその末端をゲルや膜等の担体に結合させ、固定化
プローブを作成する。一方、所望の核酸断片を含んでい
るＤＮＡを他のＤＮＡと共に細胞から採取し、次いでこ
れを熱変性させる。熱変性したＤＮＡと固定化プローブ
を混合し、ハイブリダイゼーションを行なった後、遠心
分離により、ハイブリダイズした固定化プローブを回収
する。回収した固定化プローブを熱処理し、所望の核酸
断片を含むＤＮＡを電気泳動にかけて目的とするＤＮＡ
の分子量を示すＤＮＡを回収することにより精製する。

【０００３】上記の方法は、下記の問題点を有する。 １．固定化プローブは、所望の核酸断片の配列の一部を
利用したものであるので、重複する可能性があり、効率
が悪く、簡便性に欠け、かつ、既知配列の核酸に限定さ
れるので汎用性に乏しい。２．固定化プローブと採取Ｄ
ＮＡとのハイブリダイゼーションは１回に限定されてい
るので、精度が低い。３．電気泳動による核酸断片の回
収は操作が煩雑な上、時間がかかる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来
方法の問題点を解消することを目的として鋭意検討した
結果、所望の核酸配列が特定の制限酵素による切断端を
有する核酸断片として切断されるように選択した制限酵
素で全核酸を消化処理し、これら切断端の各々に異なる
ＤＮＡリンカーを連結し、各リンカーに相補的な固定化
プローブを順次用いてリンカーとプローブとのハイブリ
ダイゼーションを２回行うことにより、所望の核酸配列
を含有する核酸断片を効率良く抽出することができるこ
とを見い出し、本発明を完成した。

【０００５】即ち、本発明は、全核酸中の特定の核酸配
列を包含する核酸断片を抽出する方法であって、該所望
の核酸断片を特定の制限酵素切断端を有する断片として
切断する様に選択された、２種またはそれ以上の制限酵
素で全核酸配列を切断して核酸断片混合物を得ると共に
、所望の核酸断片のそれぞれの断端に結合する相異なる
２種のリンカーを調製し、該リンカーと上記核酸断片混
合物とを反応させ、得られた反応液に、いずれか１方の
リンカーと相補的な固定化プローブを加えてハイブリダ
イゼーションを行い、ハイブリダイズした核酸断片を分
離した後、該核酸断片に、もう１方のリンカーと相補的
な固定化プローブを加えて再びハイブリダイゼーション
を行い、ハイブリダイズした核酸断片を分離することか
らなる方法を提供するものである。

【０００６】以下、本発明をより詳細に説明する。本明
細書中、全核酸とは、単一のＤＮＡのみならず、細胞か
ら採取したＤＮＡ混合物をも指す。なお、本明細書中、
核酸とＤＮＡとを同一の意義を有する語句としても用い
る。所望の核酸配列とは、１個のＤＮＡ中の１部、また
は全体の両者を指す。所望の核酸配列を包含する核酸断
片とは、該所望の核酸配列のみで構成される断片、およ
びリンカー等が付加しているが、目的とする核酸配列の
活性等は何等影響を受けていない核酸断片を指す。

【０００７】本発明の新規な核酸断片抽出法は、以下の
各工程からなる。 ｉ）　　抽出したい核酸断片を決定する。 ｉｉ）　　採取した１種またはそれ以上のＤＮＡを、目
的とする核酸断片を得るために選択した制限酵素で処理
する。この場合、核酸断片の５’および３’末端の組み
合わせが独特（ユニーク）なものとなるように、制限酵
素を選択することが好ましい。 ｉｉｉ）　　処理溶液に、所望の核酸断片の両端の制限
酵素切断端に特異的に結合する２種のリンカーを加える
。これらリンカーは相互に異なるものである。 ｉｖ）　　核酸連結酵素を加えてそれぞれの断端に各リ
ンカーを連結する。 ｖ）　　加えた２種のリンカーに相補的なプローブを支
持体に固定化してなる固定化プローブを調製する。 ｖｉ）　　ｉｖ）で得た溶液の核酸を変性させる。 ｖｉｉ）　　ｖｉ）の溶液に、ｖ）で調製した一方のリ
ンカーに相補的な固定化プローブを加えて放置し、ハイ
ブリダイゼーションを行なう。 ｖｉｉｉ）　　固定化プローブ相を回収し、変性処理を
行ない、ハイブリダイズした核酸を回収する。

【０００８】ｉｘ）　　ｖｉｉｉ）で得た核酸に対して
、ｖ）で調製したもう一方のリンカーに相補的な固定化
プローブを用い、上記工程ｖｉ）、ｖｉｉ）およびｖｉ
ｉｉ）を行なう。本発明方法で用いるリンカーとは、１
本鎖または２本鎖の核酸リンカーであって、特定の制限
酵素により生じた切断部位とアニーリングし得る特異的
な塩基配列をその末端に有するものである。リンカーと
して用い得る核酸には、次のものが含まれる。 （１）　　天然の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、あるいは
ＲＮＡ（切断または変性等の処理されたものを含む）。 （２）　　ＤＮＡ合成装置等で化学的に合成したＤＮＡ
またはＲＮＡ。又、そのようなリンカーは当業者既知の
方法で合成することができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ合成装置を用い、
添付の指示書に従って合成すればよい。全核酸配列中の
所望の核酸断片を得るために選択した特定の制限酵素が
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩであれば、用いるリンカーＤ
ＮＡは以下の塩基配列を有するものとすることもできる
。

【０００９】本発明方法に用いる固定化プローブ用のプ
ローブは、予め定められた塩基配列を有するリンカーに
相補的な核酸が主である。それら核酸には、以下のもの
が含まれる。 （１）　　天然の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、あるいは
ＲＮＡ（切断または変性等の処理されたものを含む）。 （２）　　ＤＮＡ合成装置等で化学的に合成したＤＮＡ
またはＲＮＡ。 （３）　　天然または合成の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ
またはＲＮＡであって、支持体との結合用に官能基を導
入したもの。従って、プローブを得るには、ＤＮＡリン
カーの一部または全部と相補的なＤＮＡを合成すること
もできる。その場合、プローブに用いるＤＮＡは１本鎖
でも２本鎖でもよい。２本鎖の場合には、固定化後、変
性させてもよい。また、プローブの５’末端又は３’末
端には、一般に用いる担体との結合に好都合な配列を連
結する［例えば、本実施例記載のアミノリンクＩＩ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．社供給
）］。固定化プローブ用の支持担体は、粒子や膜から選
択する。

【００１０】具体例として、例えば、ナイロンメンブラ
ン、ニトロセルロースメンブラン、ポリテトラフルオロ
エチレンメンブラン、ポリエチレンメンブラン等、天然
または合成有機高分子メンブラン（膜状体）を挙げるこ
とができる。ニトロセルロースのように有機高分子（例
；　セルロース）を化学的に処理し、改質して得たメン
ブランも含む。

【００１１】また、不溶性担体としては、グラファイト
、多孔質ガラス、シリカ等の無機高分子メンブラン（膜
状体）、アルミニウム、アパタイト等の金属メンブラン
、アルミナ、窒化珪素等のセラミックスメンブラン、食
塩等の結晶を挙げることができる。さらに、これらの表
面を化学的、物理的に表面処理することで改質されたも
のも含む。

【００１２】さらに、不溶性担体としては、ナイロン、
ニトロセルロース、セルロース、ポリテトラフルオロエ
チレン、ポリエチレン等の有機高分子粒子、またはグラ
ファイト、多孔質ガラス、シリカ等の無機高分子粒子、
アルミニウム、アパタイト等の金属粒子、アルミナ等の
セラミックス粒子などを面状にしきつめたものを挙げる
ことができ、また、これら有機高分子は、例えば酸化、
還元、加水分解などの化学的処理、例えばプラズマ照射
などの物理的処理で改質したもの、無機高分子粒子、金
属粒子、セラミックス粒子は、例えばイオンプレーティ
ングなどの物理的、化学的に表面処理を行うことで改質
されたものも含む。

【００１３】また、不溶性担体としては、アガロースゲ
ル、ポリアクリルアミドゲルや各種膜状体に溶液を含ま
せたもの等、その性状がゲル状のものを挙げることがで
きる。また、ゲル状のもの以外に、乾燥状態のもの、高
粘度のものも用いることができる。粒子の不溶性担体の
場合、試料溶液中での拡散のさせやすさ、遠心分離によ
る回収のしやすさから０．１μｍ〜５００μｍ、さらに
好ましくは１μｍ〜１００μｍの粒径のものがよい。し
かし、拡散等による試料と固定化プローブとの反応性お
よび遠心分離等の固定化プローブの回収が可能であれば
、これ以外の粒径の粒子でも良い。プローブを担体に結
合させる方法も既知であり、通常の条件を用いて行うこ
とができる。

【００１４】プローブを担体に固定化する方法は、プロ
ーブおよび担体の両者の化学的修飾の種類によって異な
り、例えば、次のような各種の方法を用いることができ
る。（１）　　核酸または支持体上の水酸基（主として
ジオール基）をトリフルオロエタンスルフォニルクロラ
イド（以下、トレシルクロライドと略記）（Ｋ．Ｎｉｌ
ｌｓｏｎａｎｄ　　Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｈ，　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ，　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　
１０２，　４４９，１９８１）、ＣＮＢｒ（Ｒ．Ａｘｅ
ｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　２１４，　
１３０２，　１９６７）、トリクロロトリアジン（Ｔ．
Ｈ．Ｆｉｎｌａｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，　Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，　８７，　７７，　１９７８）、エピ
クロロヒドリン（Ｉ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　　ｅｔ　　
ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　８５，　１０９１
，　１９７９）、ビスオキシラン（Ｌ．Ｓｕｎｄｂｅｒ
ｇ　　ａｎｄ　　Ｊ．Ｐｏｒａｔｈ，　Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ．，　９０，　８７，　１９７４）、ジビニ
ルスルホン酸（Ｊ．Ｐｏｒａｔｈ，　Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．，　３４，　２７，　１９７４）、ベンゾキ
ノン（Ｊ．Ｂｒａｎｄｔ　ｅｔ　　ａｌ．，　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，　３８６，　１
９６，　１９７５）、カルボニルジイミダゾール（Ｇ．
Ｓ．Ｂｅｔｈｅｌｌ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２５４，　２５７２，　１９７９）など
で活性化し、支持体上、または核酸の主としてアミノ基
と結合させる。

【００１５】（２）　　プローブまたは担体上の主とし
てカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を水溶性カルボジイ
ミド等のカルボジイミド（Ａ．Ｔｅｎｇｂｌａｄ，　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，　１９９，２９７，　１９８１；
　Ｍ．Ｆｕｎａｂａｓｈｉ　　ｅｔ　　ａｌ．，　Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１２６，　４１４，　１９
８２）または２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−
１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（Ｇ．Ｓａｃｃ
ｏｍａｎｉ　　ｅｔ　　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．，　２５６，　１２４０５，　１９８１；　Ｂ．Ｂｅ
ｌｌｅｕａｕ　　ａｎｄ　　Ｇ．Ｍａｌｅｋ，　Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，　９０，　１６５１，　１９
６８）で活性化し、支持上またはＤＮＡの主としてアミ
ノ基（−ＮＨ２）と縮合結合させる。

【００１６】（３）　　従来の非特異的または末端とは
限らない状態で支持体に結合した核酸に、所望のＤＮＡ
をＤＮＡリガーゼ（連結酵素）を用いて結合させる。 （４）　　担体上およびプローブのヒドラジド基とアル
デヒド基、またはヒドラジド基とカルボキシル基を用い
て結合させる。ヒドラジド基とアルデヒド基の場合は、
混合するとヒドラゾン結合を形成する。これを還元操作
を行うと共有結合化する（Ｊｏｎａｔｈａｎ　　Ｎ．Ｋ
ｒｅｍｓｋｙ　　ｅｔａｌ．，　上掲文献参照）。ヒド
ラジドとカルボキシル基の場合は、（２）のようにカル
ボジイミド等を用いる。

【００１７】（５）　　プローブおよび担体上に互いに
親和力のある物質を導入し（例えば、ビオチンとアビジ
ン）、その親和力に基づいて固定化を行う（Ｊｏｎａｔ
ｈａｎ　　Ｎ．Ｋｒｅｍｓｋｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，　
上掲文献参照）。 （６）　　プローブと担体上のチオール基どうしを活性
化、固定化する（Ｋ．Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ　　ｅ
ｔ　　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，　１３３，　
５７３，　１９７３）。 （７）　　プローブと担体上のアミノ基どうしをブロモ
アセタミド法にて結合させる（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓ
ａｓ，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２４５，　３０
５９，　１９７０）。 （８）　　プローブと担体を非特異的吸着、静電吸着等
により結合させる。以下に、プローブと担体を結合させ
る手順を以下により詳細に例示する。

【００１８】一本鎖ＤＮＡの末端を化学的に修飾する場
合 一本鎖ＤＮＡとしては、その末端に１もしくはそれ以上
の余分のヌクレオチド分子を含んでいるか、あるいは一
本鎖ＤＮＡの末端にあるヌクレオチド分子が化学的修飾
を受けているものを用いれば、該余分のヌクレオチドま
たは化学的修飾を受けたヌクレオチドを介して支持体上
への結合を行うことができる。１）　まず、末端に固定
化に適した官能基（例えば、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ）を
導入した一本鎖ＤＮＡを調製する。ＤＮＡを合成する場
合、その合成自体は、市販のＤＮＡ合成装置［例えば、
ＡＢＩ社製３９１型ＰＣＲ−ＭＡＴＥ］を使用し、常法
によって行うことができる。官能基の導入は、例えば、
次のような方法で行うことができる。

【００１９】（１）　　アミノリンク２（ＡＢＩ社製）
の導入以下の反応式にしたがい、ＤＮＡ合成装置を使っ
て、ヘキシルアミノ基をＤＮＡ末端に導入することがで
きる（ＡＢＩ社のＵｓｅｒ　　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，　Ｎ
ｏ．４９，　Ａｕｇｕｓｔ　　１９８８、参照）。

【化１】

【００２０】（２）

【化２】 で示されるリンカーを、ＤＮＡ合成装置（例えば、ＡＢ
Ｉ社製Ａ−３９１ＥＰＰＣＲ−ＭＡＴＥ）を用いてＤＮ
Ａ末端に導入し、これを処理することにより、このリン
カー末端を反応性のあるアルデヒド基またはカルボキシ
基に導き、さらにアルデヒド基の場合は、ビチオンのヒ
ドラジド化合物と反応させることにより、アビジンと特
異的に結合して複合体を形成し得るビチオンを導入する
ことができる（Ｊｏｎａｔｈａｎ　　Ｎ．Ｋｒｅｍｓｋ
ｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄ
　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　１９８７，　Ｖｏｌ．１５，
　ｐ．２８９１〜参照）。

【００２１】（３）　　ＤＮＡ合成装置を用い、アミノ
基をもつ塩基のヌクレオチド１〜数１０個を相補部分の
ＤＮＡ末端に付加する。 （４）　　ターミナルトランスフェラーゼにより、支持
体との結合に適した塩基、またはその反応性誘導体をＤ
ＮＡ末端に導入する（Ｄｅｕｇ　　Ｇ．ａｎｄ　　Ｗｕ
　　Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，　Ｖｏｌ．１００，　ｐ．９６〜１１６，　１
９８３、参照）。

【００２２】２）　次に、１）で得た一本鎖ＤＮＡの相
補鎖を１）と同様の合成装置を用いて調製し、両者をア
ニーリングさせて、二本鎖ＤＮＡとする。 ３）　上で得た二本鎖ＤＮＡを含む溶液に固定化用支持
体を加え、両者を結合させる。 ４）　上で得た固定化二本鎖ＤＮＡを２．４Ｍテトラエ
チルアンモニウムクロライド水溶液、適宜希釈した１０
×ＳＳＣ（１．５Ｍ　　ＮａＣｌおよび０．１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム；　ｐＨ７．０）、０．１〜２ＭＮａＣ
ｌ水溶液等の塩溶液中、熱（約４０℃以上）またはアル
カリを加えることにより変性させ、遠心して固相と液相
を分離することにより、固定化一本鎖ＤＮＡを得る。な
お、２）以下の操作を経ずして官能基を導入した一本鎖
ＤＮＡを直接支持体と混合し固定化する事により固定化
一本鎖ＤＮＡを得る事もできる。

【００２３】二本鎖ＤＮＡをそのまま、あるいは末端を
化学的に修飾して用いる場合 二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１もしくはそれ以上のヌクレ
オチド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡは、そのままあ
るいは化学的な修飾を施した後、支持体に末端で結合さ
せることができるので、上記の工程３）以降の操作を施
せば、上と同様の目的を達成することができる。このよ
うな二本鎖ＤＮＡは、次のようにして調製することがで
きる。

【００２４】（１）　　ターミナルトランスフェラーゼ
を使用して、片方のＤＮＡ鎖の末端にのみ支持体との結
合に適した塩基またはその反応性誘導体を導入する。 （２）　　末端に一本鎖部分ができるように制限酵素で
切断する。 （３）　　官能基を持つＤＮＡ分子と、二本鎖ＤＮＡを
ＤＮＡリガーゼにより結合させる。例えば、二本鎖ＤＮ
Ａの両端の切断端が異なる配列を持つように２種の制限
酵素で処理する。そこで、一方の切断端に特異的に結合
できる配列を有する官能基を有するＤＮＡを加え、そこ
にＤＮＡリガーゼを作用させることにより目的ＤＮＡ断
片の末端に官能基を導入できる。この場合、除去したい
方の鎖の５’末端を脱リン酸化しておいてもよい。即ち
、目的とする二本鎖ＤＮＡの一端だけが出た長い二本鎖
ＤＮＡを調製し、この状態で脱リン酸化酵素により５’
末端を脱リン酸化し、その後二本鎖ＤＮＡを切断して目
的断片をつくると一方の５’末端は脱リン酸化されたも
のができる。

【００２５】（４）　　二本鎖ＤＮＡの３’末端−ＯＨ
基にトリクロロトリアジン基を導入することでＯＨ基を
活性化する。５’末端−ＯＨ基には、（３）で述べた脱
リン酸化を行い−ＯＨ基を露出させトリクロロトリアジ
ンを反応させて活性化する。３’末端の−ＯＨ基と５’
末端の−ＯＨ基では、反応性が５’末端の方が良いため
、５’末端−ＯＨ基を特異的に活性化できる。

【００２６】ＤＮＡリンカーと結合した所望の核酸断片
と固定化プローブとのハイブリダイゼーションの後、ハ
イブリダイズした固定化プローブは、１）遠心分離、２
）濾過、３）沈降分離、４）上澄液の除去などにより回
収することができる。ハイブリダイズした固定化プロー
ブから、所望の核酸断片を回収するために行なう変性処
理としては、１）加熱変性処理（通常、温度６０〜９５
℃）、２）アルカリ変性処理（通常、ＮａＯＨを終濃度
約１規定（１Ｎ）まで加える）、３）ホルムアミド、尿
素などを添加することからなる変性処理などが挙げられ
、これらを適宜組合せることもできる。

【００２７】上記のごとく、本発明方法と従来法の相違
点は、所望の核酸配列を含む核酸断片がその両末端に特
定の制限酵素による断端を有するものであり、これら両
末端に導入された相異なるリンカーの各々と相補的な２
種のプローブを順次用い、該所望の核酸断片を２回ハイ
ブリダイゼーションすることにある。従って、本発明方
法によれば、予め選択した特定のリンカーと相補性を有
するプローブを用いるので、特異性が高く、しかも相異
なる２種のリンカーの各々に相補的なプローブにより、
ハイブリザイゼーションを２回行うために精度が高く、
得られる核酸断片の純度も高い。その結果、簡便な操作
で効率良く行うことができる。しかも、リンカーとプロ
ーブとのハイブリダイゼーションに基づくので目的のＤ
ＮＡ断片の塩基配列に左右されず、反応条件の設定も容
易である。このことは、本発明方法を用いて塩基配列が
不明なＤＮＡ断片を抽出することができることを示唆し
ている。さらにまた、本発明方法によれば、電気泳動等
の繁雑で時間のかかる手段を用いずに、核酸断片を回収
することができる。以下に実施例を挙げて本発明をより
具体的に説明する。

【００２８】

【実施例】実施例１　　ｐＢＲ３２２からＥｃｏＲＩ−
ＰｓｔＩ断片（塩基対）の抽出 本実施例では所望の核酸断片（以下、Ａと表す）が、大
腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２の一部である場合の
、本発明方法によるＡの抽出例を示す。１）Ａを含有す
る核酸断片の両端の制限酵素切断部位の決定と切断ｐＢ
Ｒ３２２の制限酵素地図は公知であり、これを添付の第
１図に示す。図中、斜線部は、所望の核酸部分Ａを表す
。 また、使用酵素による切断部位は□で囲んで示されてい
る。この制限酵素地図から、Ａの両端を制限酵素Ｐｓｔ
ＩおよびＥｃｏＲＩで切断できること、およびＡにはＳ
ａｌＩ、ＢａｌＩおよびＰｖｕＩＩ部位が存在しないこ
とから、これら５種の制限酵素でｐＢＲ３２２を処理す
れば、両端にＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ切断端を持った断片
は、Ａの他に生成しないことがわかる。そこで、以下に
述べる様に、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、Ｐ
ｓｔＩ、ＰｖｕＩＩおよびＢａｌＩで処理し、Ａを含む
核酸断片の混合物を得た。

【００２９】使用した制限酵素は全て宝酒造社供給のも
のである。まず以下の組成の反応液１を３７℃で１時間
反応させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止する
。フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾燥
させる。

【００３０】次いで、上記乾燥ＤＮＡを水１６μｌに溶
かし、下記の組成の反応液２中で３７℃において１時間
反応させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止する
。フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾燥
させる。

【００３１】上で得た乾燥ＤＮＡを水３５μｌに溶かし
、下記の組成の反応液３中で３７℃において１時間反応
させた後、６０℃で５分間処理して反応を停止する。 フェノール抽出し、エタノール沈殿に付した後、乾燥さ
せる。

【００３２】２）ＤＮＡリンカーの調製２ａ）ＥｃｏＲ
Ｉリンカーの調製 以下の配列を有するＥｃｏＲＩリンカーを合成する。 ＥｃｏＲＩリンカー ５’　ＧＣＡＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＴＧ　　　
　　３’３’　ＣＧＴＴＧＧＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＡＡ
ＣＴＴＡＡ　５’これら２種の相補的な１本鎖ＤＮＡは
、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＤＮＡ合
成装置（３９１　ＰＣＲ−ＭＡＴＥ　ＥＰ型）を用い、
添付の使用手引書の記載に従って合成した。次いで、合
成したＤＮＡを該使用手引書に記載の切り出し、精製法
で精製した。

【００３３】精製した１本鎖ＤＮＡ（いずれも水中、１
μｇ／μｌ）を５μｌずつ混合し、３０℃で１時間放置
してアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡとする。次いで、
得られた２本鎖ＤＮＡの５’末端をりん酸化する。りん
酸化は以下の反応液４中で、３７℃で１時間反応させた
後、６５℃で５分間処理して反応を停止することで行っ
た

【００３４】２ｂ）ＰｓｔＩリンカーの調製以下の配
列を有するＰｓｔＩＩリンカーを合成する。 ＰｓｔＩリンカー ５’　ＴＴＣＣＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧ
ＣＡ　３’３’　ＡＡＧＧＣＡＴＡＣＣＧＴＡＣＧＧＡ
ＧＧＧ　　　　　５’１本鎖ＤＮＡの合成、精製、アニ
ーリング、りん酸化等は上記２ａ）と同様である。

【００３５】３）Ａを含むＤＮＡ断片とリンカーの結合
１）で調製したｐＢＲ３２２消化物（ＤＮＡ断片混合物
）中の所望のＤＮＡ断片に２）で調製したリンカーを連
結する。タカラＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製
）を用いる。ＤＮＡ断片混合物をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および１ｍＭＥＤＴＡ
）２０μｌに溶かし下記の反応液５中、１６℃で一夜反
応させた後、エタノール沈殿に付し、乾固させる。 　　注）Ａ液およびＢ液はタカラＤＮＡライゲーション
キットに付属の反応液である。

【００３６】４）固定化プローブの調製以下の塩基配列
で示される４種のプローブＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ　
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＤＮＡ合成装置（３９１　Ｐ
ＣＲ−ＭＡＴＥ　ＥＰ型）を用い、添付の使用手引書の
記載に従って合成した。各プローブの５’末端には、担
体に連結するためのアミノリンクＩＩ（ＤＮＡリンカー
）を組み込んだ。プローブ１：Ｈ２Ｎ〜（アミノリンク
ＩＩ）〜ＧＣＡＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＴＧプロ
ーブ２：ＣＧＴＴＧＧＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＡＡＣＴＴ
ＡＡ（アミノリンクＩＩ）−ＮＨ２プローブ３：Ｈ２Ｎ
〜（アミノリンクＩＩ）〜ＴＴＣＣＧＴＡＴＧＧＣＡＴ
ＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡプローブ４：ＡＡＧＧＣＡＴＡ
ＣＣＧＴＡＣＧＧＡＧＧＧ（アミノリンクＩＩ）−ＮＨ
２プローブ１および２はＥｃｏＲＩリンカーと相補的で
あり、プローブ３および４はＰｓｔＩリンカーと相補的
である。これらプローブ１〜プローブ４を別個にゲルに
固定化する。固定化は以下の要領でおこなう。

【００３７】（１）　　ゲルの活性化 トレシルクロライド（トリフルオロエタンスルフォニル
クロライド、以下トレシルという）（Ｋ＆Ｋ社製または
Ｆｌｕｋａ社製）はｐＨ３以上では水により分解される
ので、以下の操作はドライボックスまたは乾燥窒素を満
たした無菌パック等を用い、水の混入を避けて行う。ア
セトン、ピリジンをあらかじめモレキュラーシーブで３
日間以上脱水しておく。１０ｍｌの蓋付き丸底フラスコ
に脱水アセトン１．５ｍｌ、ピリジン１００μｌおよび
スターラーチップを入れる。

【００３８】他方、ゲル［Ｓｈｉｍｐａｃｋ　ｄｉｏｌ
　３００（Ｓｈｉｍａｚｕ）］１ｇを、＃５ガラスフィ
ルター上で吸引しながら脱水アセトン５０ｍｌにより素
早く洗浄し、直ぐに上記丸底フラスコに入れる。次いで
、フラスコを氷浴で冷却し（約０℃）、乾燥窒素を送り
込みながら、激しい撹拌下にトレシル（ゲル１ｇあたり
トレシル２００μｌ）をほぼ１分間で滴下する。滴下終
了後、丸底フラスコに蓋をし、スターラーの速度を落と
してゲルの破砕をさけつつ、約０℃で２０分間反応を継
続する。反応後、ゲルをガラスフィルター上に移し、ア
セトン、アセトン＋５ｍＭ　ＨＣｌ（１：１）、５ｍＭ
　ＨＣｌで順次、洗浄する。さらに乾燥アセトン３０ｍ
ｌで洗浄した後、乾燥窒素を満たしたビニール袋をフィ
ルターの口にあて、ほぼ１時間吸引してゲルを完全に乾
燥させる。

【００３９】（２）　　ゲルへのプローブの固定化プロ
ーブＤＮＡを濃アンモニア水で切り出し、５５℃で１０
時間保持した後、脱保護する。減圧下に濃縮乾固し、１
０ｍＭ　ＴＥＡＡ（酢酸トリエチルアミン）バッファー
２００μｌに溶かす。エーテル抽出により保護基を除去
した後、再度濃縮乾固する。これをカプリングバッファ
ー（０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．５）１８０μｌに溶かす。（１）で調製した活性
化ゲル１００ｍｇを１．５ｍｌエッペンドルフチューブ
にとり、上記プローブＤＮＡと混合する。穏やかに撹拌
しながら、２５℃で２４時間保持すると、プローブＤＮ
Ａはゲルに固定化される。反応終了後、２０００ｒｐｍ
で５分間遠心してゲルを上清から分離し、固定化プロー
ブを得る。

【００４０】５）所望の核酸断片と固定化プローブのハ
イブリダイゼーション ａ）上記３）で得た、リンカーと結合した所望のＤＮＡ
を含有するＤＮＡ断片混合物を２．４Ｍテトラエチルア
ンモニウムクロライド１００μｌに溶かす。 ｂ）７０℃で１分間変性処理を行う。 ｃ）固定化プローブ１（５ｍｇ）を加え、２０℃で１０
分間放置する。 ｄ）遠心分離により（２０００ｒｐｍ、１５秒）ハイブ
リダイズした固定化プローブ１を沈澱させ、上清を別の
エッペンドルフチューブに取る。 ｅ）固定化プローブ相を２．４Ｍテトラエチルアンモニ
ウムクロライド５０μｌで洗浄し、再度２０００ｒｐｍ
、１５秒間の遠心によりプローブ相を回収する。上清は
上記ｄ）のエッペンドルフチューブに加える。 ｆ）ｅ）で分離した固定化プローブ相に２．４Ｍテトラ
エチルアンモニウムクロライド（１００μｌ）を加えて
懸濁し、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２００
０ｒｐｍ、１５秒間の遠心により固定化プローブとＤＮ
Ａを分離する。上清を回収する。

【００４１】ｇ）ｆ）で回収した上清に固定化プローブ
４（５ｍｇ）を加えて２０℃で１０分間放置する。 ｈ）２０００ｒｐｍで１５秒遠心し、上清を除去する。 ｉ）ｈ）で分離した固定化プローブ相に２．４Ｍテトラ
エチルアンモニウムクロライド（１００μｌ）を加えて
懸濁したのち２０００ｒｐｍで１５秒間遠心し、固定化
プローブを回収する。 ｊ）ｉ）で回収した固定化プローブに、２．４Ｍテトラ
エチルアンモニウムクロライド（１００μｌ）を加えて
懸濁した後、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２
０００ｒｐｍ、１５秒間の遠心により固定化プローブか
ら上清を分離する。上清を回収し、サンプル１とする。 ｋ）上記ｅ）の上清を７０℃で１分間変性処理した後、
固定化プローブ２（５ｍｇ）を加え、２０℃で１０分間
放置する。 ｌ）２０００ｒｐｍで１５秒間遠心し、上清を除去する
。

【００４２】ｍ）回収した固定化プローブ相を２．４Ｍ
テトラエチルアンモニウムクロライド１００μｌで洗浄
し、再度２０００ｒｐｍ、１５秒間の遠心によりプロー
ブ相を回収する。上清は除去する。 ｎ）回収した固定化プローブ相に２．４Ｍテトラエチル
アンモニウムクロライド（１００μｌ）を加えて懸濁し
、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０００ｒｐ
ｍ、１５秒間の遠心により上清を回収する。 ｏ）上記ｎ）で回収した上清に固定化プローブ３（５ｍ
ｇ）を加えて２０℃で１０分間放置する。 ｐ）２０００ｒｐｍで１５秒遠心し、固定化プローブを
回収して２．４Ｍテトラエチルアンモニウムクロライド
１００μｌにより洗浄し、再度２０００ｒｐｍで１５秒
間遠心し、固定化プローブを回収する。これを、２．４
Ｍテトラエチルアンモニウムクロライド１００μｌに懸
濁した後、７０℃で１０分間加熱して変性処理し、２０
００ｒｐｍ、１５秒間の遠心により上清を回収する。こ
れをサンプル２とする。

【００４３】６）ＤＮＡ断片の同定および純度の測定５
）で得たサンプル１および２を混合し、７０℃で１０分
間処理した後、２０℃で３０分間放置し、試料とする。 試料２μｌを２％アガロースゲル電気泳動にかけると、
約７９０〜８００ｂｐの位置に単一のバンドが認められ
た。他方、試料を回収したＤＮＡの量で確認した。すな
わち、エチジウムブロマイド染色により、回収されたＤ
ＮＡ量は１４５ｎｇであることが確認された。

【００４４】一方、使用したｐＢＲ３２２（１μｇ）に
含まれているＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ　ＤＮＡ断片の理論
量は１７３ｎｇであるので、ＤＮＡ断片の回収率は以下
の式から８０％と計算された。

【化３】 ＊：７５２はＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片に含まれるヌク
レオチド数であり、７９５はリンカーを付けた該断片の
ヌクレオチド数である。これらの結果は目的の核酸断片
Ａが回収されたことを示すものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　ｐＢＲ３２２の完全な制限酵素地図を示す
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　全核酸中の特定の核酸配列を包含する
   核酸断片を抽出する方法であって、該所望の核酸断片を
   特定の制限酵素切断端を有する断片として切断する様に
   選択された、２種またはそれ以上の制限酵素で全核酸配
   列を切断して核酸断片混合物を得ると共に、所望の核酸
   断片のそれぞれの断端に結合する相異なる２種のリンカ
   ーを調製し、該リンカーと上記核酸断片混合物とを反応
   させ、得られた反応液に、いずれか１方のリンカーと相
   補的な固定化プローブを加えてハイブリダイゼーション
   を行い、ハイブリダイズした核酸断片を分離した後、該
   核酸断片に、もう１方のリンカーと相補的な固定化プロ
   ーブを加えて再びハイブリダイゼーションを行い、ハイ
   ブリダイズした核酸断片を分離することからなる方法。