JP2004504829A - 二本鎖核酸の一方の鎖を単離するための方法 - Google Patents
二本鎖核酸の一方の鎖を単離するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離するための方法およびキットを提供する。この方法は、従来のＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡの二重鎖およびヘテロ二重鎖間の、動力学的および熱力学的安定性における差異を利用し、このヘテロ二重鎖の一方の鎖は、ＰＮＡのような、正味の正に荷電した骨格または正味の中性骨格を有する核酸塩基ポリマーである。二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離する方法であって、該方法は、（ｉ）第一鎖および第二鎖を含む二本鎖標的核酸を、該第一鎖が該第二鎖から解離し、そして競合オリゴとハイブリダイズして第一鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖を形成する条件下で、該第一鎖にハイブリダイズし得る該競合オリゴと接触させる工程；ならびに（ｉｉ）該ヘテロ二重鎖または該解離した第二鎖を単離する工程、を包含する。
Description
【０００１】
（１．発明の分野）
本発明は、二本鎖核酸の一方の鎖を単離するための組成物および方法に関する。
【０００２】
（２．背景）
分子生物学の分野の多くの技術が、標的核酸を、この標的核酸を分析、捕捉、単離および／または検出するために、支持体結合しているかまたは溶液相の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる工程を含む。このような技術は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定（例えば、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７；Ａｎｓｏｒｇｅら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５９３−４６０２；Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２３９９−２４１２；Ｓｍｉｔｈら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：６７４−６７９；Ｐｒｏｂｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：３３６−３４１を参照のこと）（ここで、標識されたプライマーまたは未標識のプライマーが、標的の一方の鎖にアニールし、そして２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチドターミネーターの存在下で酵素的に伸長される（Ｃａｒｒｉｌｈｏ、２０００、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：５５−６５およびＫｈｅｔｅｒｐａｌ＆Ｍａｔｈｉｅｓ、１９９９、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：３１Ａ−３７Ａもまた参照のこと））から、アレイベースの遺伝子発現、遺伝子型決定、遺伝子マッピングおよび核酸配列決定アッセイ（例えば、米国特許第５，２０２，２３１号、同第５，６９５，９４０号および同第５，５２５，４６４号、ＷＯ９５／０９２４８、Ｋｈｒａｐｋｏら、１９９１、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ １：３７５−３８８；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、１９９２、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：１００８−１０１７；Ｐｅａｓｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５０２２−５０２６を参照のこと；当該分野において一般に使用される種々のアレイベースのアッセイの総説については、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ＆Ｆｕｒｔａｄｏ、１９９９、Ａｎａｌｙｓｔ １２４：１１３３−１１３６；Ｒｏｃｋｅｔｔ＆Ｄｉｘ、２０００、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ３０：１５５−１７７；Ｇｒａｎｊｅａｕｄら、１９９９、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２１：７８１−７９０；Ｌｉｐｓｃｕｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１（補遺１）：２０−２４；ＤｅＲｉｓｉ＆Ｉｙｅｒ、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１：７６−７９；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ、１９９８、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．２０：１１１−１２３；Ｃａｓｅ−Ｇｒｅｅｎら、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４０４−４１０；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−１７４；ｄｅ Ｓａｉｚｉｅｕら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４５−４８；およびＭａｒｓｈａｌｌ＆Ｈｏｄｇｓｏｎ、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２７−３１を参照のこと）の範囲にわたる。
【０００３】
標的核酸が一本鎖である場合、オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションは、比較的容易に生じる。しかし、標的核酸が二重鎖である場合、２つの標的鎖の再結合は、特に、これらのアッセイにおいて一般に使用される高塩のストリンジェントの条件下で、標的とオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーションと強力に競合し、そして通常は完全に競合する。
【０００４】
あいにく、標的核酸は、一本鎖形態ではほとんど入手可能でない。実際、ほとんどの標的核酸は二本鎖である。例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムフラグメントおよびｃＤＮＡは、二本鎖である。さらに、目的の特定の核酸の分析可能な量を生成するために、最も一般的に使用される増幅技術の１つである、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第二版、１９８９、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）は、二本鎖のアンプリコン（ずなわち、標的核酸）を生成する。
【０００５】
一本鎖標的核酸を生成するための現在の方法としては、二重鎖標的の一方の鎖のエンドヌクレアーゼ消化（例えば、Ｈａｎｎｏｎら、１９９３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：４２１−４２７を参照のこと）、非対称的ＰＣＲ増幅（例えば、ＳｔｕｒｚｌおよびＲｏｔｈ、１９９０、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１６４−１６９を参照のこと）、Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する二本鎖ＰＣＲアンプリコンのインビトロ転写による、一本鎖ＲＮＡ標的の生成（例えば、ＹａｎｇおよびＭｅｌｅｒａ、１９９２、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：９２２−９２７を参照のこと）およびＭ１３を用いるクローニング（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）が挙げられる。これらの方法の各々は、その一般的な適用可能性を制限する、そして／またはアッセイの時間および経費を有意に増大させるかのいずれかである有意な欠点を有する。
【０００６】
従って、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイーゼションを含むアッセイ（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型配列決定反応、ならびにアレイベースのマッピング、遺伝子型決定、発現および配列決定適用）のために、二本鎖標的核酸の一方の鎖を生成および単離する単純な方法についての必要性が、当該分野に存在したままである。
【０００７】
（３．発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、二本鎖標的核酸の一方の鎖を捕捉または単離するための方法を提供する。この方法は、一部、イオン強度の異なる条件下での核酸二重鎖の形成の熱力学的安定性および／または動力学が、二重鎖の鎖を含むヌクレオシド内結合の性質に依存するという観察に基づく。例えば、天然の二本鎖ＤＮＡの存在ならびにＤＮＡおよびＲＮＡが生理学的な条件下でホモ二重鎖およびハイブリッド二重鎖を形成する能力によって示されるように、類似した電荷のヌクレオチド内結合を有する一本鎖核酸（例えば、負に荷電した糖リン酸ジエステル結合を有するＤＮＡおよびＲＮＡ）間に形成される二重鎖は、生理学的なイオン強度（約１００ｍＭ ＮａＣｌ）、温度（約３７℃）およびｐＨ（約ｐＨ７．２）の条件下で比較的安定である。しかし、低イオン強度（約１０ｍＭ以下のＮａＣｌ）の条件下で、このようなＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡの二重鎖は、解離する傾向がある（例えば、Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８を参照のこと）。任意の特定の理論によって束縛されることを意図しないが、低イオン強度の条件で観察される解離は、負に荷電した糖リン酸ジエステル核酸塩基内結合によって引き起こされる、鎖内の静電的反発力に起因すると考えられる。
【０００８】
対照的に、二重鎖の一方の鎖が、従来のＤＮＡまたはＲＮＡであり、かつ他方の鎖が、正味の非荷電骨格または正味の正に荷電した骨格を有する核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ）であるヘテロ二重鎖は、低イオン強度の条件（例えば、同上を参照のこと）で、非常に安定である。実際、約０ｍＭと１０ｍＭとの間のＮａＣｌ濃度で、そして５００ｍＭの高さの濃度でさえ、このようなヘテロ二重鎖は、その対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡの二重鎖（同上）よりも有意に安定である。
【０００９】
さらに、これらのヘテロ二重鎖の形成は、低イオン強度の同じ条件下で、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡの二重鎖の形成よりも動力学的に有利である。動力学におけるこれらの観察された差異は、ヘテロ二重鎖の長さとは無関係である。例えば、比較的長いＤＮＡ／ＤＮＡ標的二重鎖（例えば、１００ｂｐ以上）は、代表的に、実質的にいかなるイオン強度でも、短いＰＮＡ／ＤＮＡへテロ二重鎖（例えば、２０ｂｐ以下）よりも熱力学的に安定であるが、このＤＮＡ／ＤＮＡ標的二重鎖が解離し、かつ低イオン強度（例えば、１０ｍＭ ＮａＣｌ未満）の条件下で、短い相補的ＰＮＡと同等に接触している場合、このＰＮＡ／ＤＮＡへテロ二重鎖の形成は、ＤＮＡ標的鎖の再アニーリングまたは再結合よりも、動力学的に有利である。この系は平衡にまでもたらされるだけなので、ＰＮＡは、相補的ＤＮＡ標的鎖によって置換される。
【００１０】
本発明の方法は、容易かつ効果的に二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離するために、これらの観察された動力学的および熱力学的安定性の差異を利用する。一般に、本方法は、二本鎖標的核酸を、二本鎖標的の一方の鎖にハイブリダイズし得る一本鎖の競合オリゴヌクレオチド（「競合オリゴ」）と接触させる工程を包含する。この競合オリゴは、負に荷電した核酸塩基内結合（例えば、ネイティブな糖リン酸ジエステル）、正に荷電した核酸塩基内結合（例えば、糖グリコシルまたは正のアミド）および／または非荷電の核酸塩基内結合（例えば、中性アミドまたはモルホリノホスホラミデート）の組み合わせを含む核酸アナログであり、その結果、この競合オリゴは、所望の使用ｐＨおよび使用温度（代表的には、ｐＨ６〜９および２０〜４０℃）で、正味の正の電荷または正味の中性の電荷を有する。好ましくは、この競合オリゴは、非荷電の核酸塩基内結合から完全に構成され、必要に応じて３〜４個の正の内結合を含む。競合オリゴの核酸塩基配列は、二本鎖標的の一方の鎖の一部に対して少なくとも部分的に相補的であり、その結果、この競合オリゴは、その相補的標的鎖にハイブリダイズし得る。
【００１１】
標的核酸は、標的鎖が互いに解離し、かつ競合オリゴがその相補的標的鎖にハイブリダイズして、標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖および解離した標的鎖を形成する傾向がある条件下で、この競合オリゴと接触させられる。次いで、二本鎖標的の所望の鎖は、標準的な単離技術および／または捕捉技術を使用して、解離した標的鎖またはヘテロ二重鎖のいずれかを単離することによって、簡便に回収され得る。
【００１２】
この系がヘテロ二重鎖および／または解離した鎖を単離する前に平衡に達することが可能であるか否かは、代表的には、二本鎖標的および標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の、そのアッセイ条件下での熱力学的安定性に依存し、続いて、この熱力学的安定性は、それぞれの標的二重鎖およびへテロ二重鎖の相対的な核酸塩基長に依存する。一般に、（熱融解温度すなわちＴｍによって示されるような）標的二重鎖の熱力学的安定性が、ヘテロ二重鎖の熱力学的安定性よりも有意に高い場合、この系は、平衡に達することが不可能であるはずである。この熱力学的安定性が逆である場合、またはこれらがほぼ等しい場合、この系は、平衡に達することが可能であり得る。例えば、この競合オリゴが標的核酸の長さと（核酸塩基単位で）ほぼ等しい長さのものである場合、このヘテロ二重鎖は、代表的には、再結合または再アニールした標的よりも熱力学的に安定であるので、この系は、所望の標的鎖を単離する前に平衡に達することが可能であり得る。しかし、再結合または再アニールした標的が、ヘテロ二重鎖よりも熱力学的に安定である例において（例えば、競合オリゴが標的よりも有意に短い場合）、標的核酸の所望の鎖は、この系が平衡に達する前に単離されるべきである。
【００１３】
二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離する方法は、種々の代替の様式で実行され得る。１つの実施形態において、この二本鎖標的は、二本鎖標的が安定である（すなわち、標的の鎖が容易に解離しない）条件下で競合オリゴと接触させられる。接触後、次いで、この混合物の条件は、標的鎖の解離および競合オリゴとその相補的標的鎖との間のハイブリダイゼーションを促進するように変更される。
【００１４】
この条件は、一工程で変更され得るか、あるいは２つ以上の工程で変更され得る。一工程が使用される場合、新しい条件は、標的鎖の解離および標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の形成に同時に有利であるべきである。二工程のプロセスが使用される場合、これらの条件は、最初に標的鎖の解離を促進するように変更され、その後、標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の形成を促進するように再び変更される。
【００１５】
これらの条件はまた、循環され得る。例えば、接触後、サンプルの温度は、２以上の異なる温度の間を循環され得る。１つの簡便な実施形態において、接触後、サンプルの温度は、二本鎖標的の熱融解温度（Ｔｍ）を上回り、かつヘテロ二重鎖のＴｍを下回る温度まで上昇され得る。次いで、サンプルの温度は、この温度とヘテロ二重鎖のＴｍを上回る第二の温度との間で循環され得る。ヘテロ二重鎖形成のより速い動力学を利用する循環時間を選択することによって、温度循環を使用して、二本鎖標的の解離およびヘテロ二重鎖の効率的な形成を駆動し得る。
【００１６】
別の実施形態において、二本鎖標的核酸の鎖は、競合オリゴとの接触の前に解離される。二重鎖標的を解離するために使用される条件（「変性条件」）は、標的解離および標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖形成に同時に有利であり得、それによって、条件のさらなる変更についての必要性を排除する。あるいは、標的鎖：競合オリゴ二重鎖形成を好みも促進もしない変性条件が使用され得、そしてこの条件は、ヘテロ二重鎖形成を促進するために、接触後に変更される。温度循環は、以前に記載されたように、効率的なヘテロ二重鎖形成を駆動するために使用され得る。
【００１７】
二本鎖標的を解離し、そして標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖を形成するために使用される方法に関わらず、解離した標的鎖およびへテロ二重鎖は、互いに分離され得、そして所望の標的鎖は、引き続く使用のために回収される。
【００１８】
解離した標的鎖および標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖は、実質的に任意の技術を使用して互いに分離され得る。例えば、解離した鎖およびヘテロ二重鎖は、ゲル電気泳動によって分離され得、それぞれのバンドの一方または両方がゲルから切り出され、そして核酸が切り出されたバンドから溶出される。あるいは、解離した標的鎖およびヘテロ二重鎖は、捕捉によって互いに分離され得る。捕捉によって分離される場合、所望の標的鎖または所望でない標的鎖のいずれかが、捕捉され得る。所望の標的鎖が捕捉される場合、これは、引き続く使用のために解離および回収され得る。所望でない標的鎖を捕捉することは、所望の標的鎖を残し、この所望の標的鎖は、引き続く使用のために、さらなる精製を伴うかまたは伴わないかのいずれかで回収され得る。
【００１９】
１つの実施形態において、解離した標的鎖は、捕捉部分（例えば、ビオチン、固体支持体または捕捉配列）を含む相補的オリゴヌクレオチド捕捉プローブにハイブリダイズし得、そしてハイブリダイズした複合体は捕捉部分によって単離される。好ましくは、この相補的捕捉プローブはまた、正味の正の電荷または正味の中性の電荷を有する核酸塩基内結合を含み、その結果、解離した標的鎖は、標的鎖の再結合も再アニーリングも促進しない条件下で捕捉され得る。捕捉後、この複合体は解離され得、そしてこの標的鎖はこの複合体から単離され得る。
【００２０】
あるいは、この標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖は、捕捉によって単離される。一つの簡便な実施形態において、競合オリゴヘテロ二重鎖は、捕捉部分（例えば、ビオチン、捕捉配列または固相支持体）を含み、そして、このヘテロ二重鎖は、捕捉部分によって解離した標的鎖から単離される。例えば、競合オリゴが、ビオチン捕捉部分を含む場合、このヘテロ二重鎖は、このサンプルを固定化したストレプトアビジンに接触させることによって、例えば、このサンプルをストレプトアビジンで被覆したビーズで充填したカラムを通過させることによって、または、このサンプルをストレプトアビジンで被覆した磁性ビーズ（磁石によって取り出され得る）と接触させることによって、解離された標的鎖から単離され得る。この競合オリゴは、捕捉配列を含む場合、このヘテロ二重鎖は、解離された標的鎖から相補性捕捉プローブ（これはまた、ビオチンのような捕捉部分または固相支持体を含む）を介して単離され得る。この捕捉プローブは、ＲＮＡオリゴマーもしくはＤＮＡオリゴマーなどであり得るか、また、競合オリゴのように、この捕捉プローブは、このアッセイのｐＨおよび温度において正味で正に荷電しているか、または正味で電荷的に中性である骨格を含み得る。この競合オリゴは、固相支持体捕捉部分を含む場合、このヘテロ二重鎖は、例えば、濾過、デカントなどによって、解離された標的鎖から単離され得る。この固相支持体が磁性である場合、このヘテロ二重鎖は、磁石によって簡便に単離され得る。
【００２１】
別の実施形態において、このヘテロ二重鎖は、このヘテロ二重鎖と三重鎖を形成することが可能な捕捉プローブを使用する捕捉によって単離される。好ましくは、この三重鎖捕捉プローブは、修飾され、上述したようなビオチンまたは固相支持体のような捕捉部分を含む。１つの簡便な実施形態において、この三重鎖捕捉プローブは、ＰＮＡである（例えば、米国特許第５，９８６，０５３号；同第５，６４１，６２５号；および同第５，５３９，０８２号（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００２２】
別の局面において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。一般に、このキットは、目的の標的核酸の一つの鎖の少なくとも一部分に相補性である競合オリゴおよび二重鎖標的の解離のため、ならびに標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の形成を与えるために有用な緩衝液を含む。このキットはまた、解離された標的鎖もしくはヘテロ二重鎖のいずれか、またはその両方を単離するための捕捉プローブまたは他の手段を含み得る。この競合オリゴは、上述したような標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の捕捉を容易にするための捕捉部分を使用して必要に応じて修飾され得る。あるいは、このキットは、この競合オリゴを修飾するために有用な試薬、捕捉プローブまたはその両方を捕捉部分と共にさらに含み得る。
【００２３】
本発明の方法およびキットに従って単離された標的鎖は、当該分野で周知の技術を使用してさらに操作され得る。例えば、この単離された鎖は、続くＰＣＲ増幅におけるテンプレートとして、ハイブリダイゼーションによる液相および／またはアレイに基づく配列決定、マッピング、遺伝子発現、遺伝子型決定アッセイのための標的として、またはサンガー型の配列決定反応におけるテンプレートとして使用され得る。
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、二本鎖標的核酸塩基のうちの一方の鎖の単離のための、迅速、効率的、かつ特異的な方法を提供する。このアッセイのｐＨおよび温度においてこの核酸塩基が正味で正に荷電するかまたは正味で電荷的に中性である骨格に結合する競合オリゴヌクレオチドを使用することによって、本発明は、従来のＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、およびＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に比較して核酸ヘテロ二重鎖の観察された有益な速度論的および／または熱動力学的な特性を利用して、これまでに利用可能であった方法に比べ有意な利点を提供する二本鎖標的核酸のうちの一方の鎖を単離するための方法を提供する。
【００２４】
以下でより詳細に議論されるように、正に荷電した核酸塩基内結合および／または非荷電の核酸塩基内結合を有する一本鎖核酸塩基ポリマーは、当該分野で公知である。荷電していない核酸塩基ポリマーの１つの型は、当該分野において通常、「ポリアミド核酸」または「ＰＮＡ」と呼称され、これは、中性のポリアミド骨格に連結された一連の核酸塩基を含む。一方の鎖が非荷電核酸塩基ポリマー（例えば、ＰＮＡ）であるヘテロ二重鎖核酸の形成速度論および熱力学的安定性は、両方の鎖が負の糖リン酸ジエステル核酸塩基内結合を有する（すなわち、負に荷電している）対応する二重鎖（例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖）から完全に別個のものである。大変重要なことに、ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡのヘテロ二重鎖は、広範な緩衝液条件にわたって、これらに対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも有意に熱安定性である（Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８）。さらに，ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖の形成は、同じ範囲の緩衝条件において速度論的に好ましい。低イオン強度（例えば、１０ｍＭ以下のＮａＣｌ）の条件下で、形成の好ましい速度論は、（Ｔｍで測定されるような）熱力学的な安定性に依存しない。例えば、いくつかの例において、この標的核酸二重鎖は、実質的に全てのイオン強度で特定のヘテロ二重鎖より熱安定性である（例えば、長い１００ｂｐの標的二重鎖 対 短い２０ｂｐのヘテロ二重鎖）。この例においてでさえ、低イオン強度の条件下で、ヘテロ二重鎖の形成は、より熱安定性の二重鎖の形成よりも速度論的に好ましい。従って、１００ｂｐの解離された標的が、低イオン強度条件下で２０核酸塩基の相補性ＰＮＡと接触される場合、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖形成は、標的鎖の再アニーリングまたは再会合よりも速度論的に好ましい。
【００２５】
操作の特定の理論のいずれかによって拘束されることが意図しないが、ＰＮＡ骨格は非荷電であるので上で議論されたＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖の観察される好ましい速度論的および／または熱力学的な特性は、このヘテロ二重鎖の２つの鎖の間におけるホスホジエステルの静電的な反発がないことに部分的に起因すると考えられる。この理論は、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖および対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖が、１Ｍ ＮａＣｌを超えるイオン強度においてほぼ等しい熱安定性を有していることを示す実験によって支持される（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３，前出）。
【００２６】
ヘテロ二重鎖とこの対応する二重鎖との間の観察された速度論的および／または熱安定性的な差異は、極度に低いイオン強度から低いイオン強度の条件において、最も明白である。例えば、１０ｍＭ ＮａＣｌにおいて、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖ドデカマーの熱融解温度（Ｔｍ）は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＴｍよりも３０℃を超えて高いことが見出された。しかし、これらの差異は、中程度のイオン強度においてでさえ、観察される。例えば、１００ｍＭ ＮａＣｌにおいても、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖ドデカマーは、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも有意に高い（おおよそ２０℃高い）のＴｍを有する（Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３，前出）。
【００２７】
ＰＮＡはまた、核酸塩基の相補性配列を含む二本鎖ＤＮＡを侵害する能力を有する（例えば、Ｎｉｅｌｓｏｎら，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１９７−２００；Ｐｅｆｆｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０６４８−１０６５２；Ｃｈｅｒｎｙら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１６６７−１６７０を参照のこと）。このＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対を介して相補鎖にハイブリダイズするが、他方の鎖は置換される。二本鎖ＤＮＡは、ＰＮＡの相補性部分よりも実質的に長い場合、この置換された鎖は、Ｄ−ループを形成し得る（同書参照のこと）。従って、二本鎖標的が安定である生理学的条件においてでさえ、ＰＮＡは、これらの相補鎖にハイブリダイズする傾向がある。
【００２８】
以下により詳細に議論されるように、本出願人らは、相補的な二本鎖核酸に侵入するＰＮＡの傾向ならびにＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖とＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖との間に観察された速度論的および／または熱安定的な差異を調べて、標的核酸の二本鎖のうちの一本鎖を効率的、迅速、かつ容易に単離し得ることを発見した。
【００２９】
一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡと安定な二重鎖を形成するか、またはＤＮＡと安定な三重鎖を形成するＰＮＡの能力は、一本鎖核酸または二本鎖核酸の精製についての数多くの用途において調べられた。例えば、ポリヒスチジンテイルに連結されたＰＮＡを使用して、一本鎖メッセンジャーＲＮＡをニッケルカラム上で精製し得た（Ｏｒｕｍら，１９９５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４７２−４８０を参照のこと）。この方法において、インビトロで転写された一本鎖のｍＲＮＡを、２Ｍの尿素、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（登録商標）を含有する緩衝液中でＲＮＡ−ポリヒスチジン結合体に接触させ、そしてこのｍＲＮＡ−ＰＮＡ−ポリヒスチジン複合体を、サンプルをニッケルカラムを通過させることによって捕捉した。
【００３０】
二本鎖ヒトゲノムＤＮＡを、ビオチン標識ＰＮＡを使用して生物学的なサンプルから精製した（Ｓｅｅｇｅｒら，１９９７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：５１２−５１７；Ｂｏｆｆａら．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１９０１−１９０５を参照のこと）。例えば、転写的に活性である二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントは、Ｄ−ループを形成するための核酸塩基配列（ＣＴＧ）７を含むＰＮＡの侵入およびハイブリダイゼーションによって単離された（Ｂｏｆｆａら，前出を参照のこと）。別の実施形態において、二本鎖ゲノムＤＮＡは、Ｔ７配列を含むビオチン標識ＰＮＡとハイブリダイゼーションすることによってヒト血液から単離された（Ｓｅｅｇｅｒら，前出）。この標識されたＰＮＡは、二本鎖のゲノムＤＮＡ中のＡ７配列と高い親和性の三重鎖を形成した。両方の例において、ＰＮＡ上のビオチン標識を使用して、ストレプトアビジン被覆した磁性ビーズ上でＤ−ループまたは三重鎖ハイブリッドを捕捉した。
【００３１】
ＰＮＡ核酸ハイブリダイゼーションを使用する一塩基変異を検出するための技術もまた、記載される（Ｉｇｌｏｉ，１９９９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７９８−８０８； Ｉｇｌｏｉ，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８５６２−８５６７を参照のこと）。例えば、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的なＰＮＡを、重合に先だってネイティブのポリアクリルアミドゲル溶液に添加した。相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドがゲル上で泳動された場合、これは、ゲルマトリクスに固定された（非荷電であるために、移動しない）ＰＮＡ分子にハイブリダイズした。このＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドの移動は、ハイブリダイズしない、非相補的なコントロールＤＮＡオリゴヌクレオチドの移動に比べて遅かった。他の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合もまた、このゲル上で泳動した。これらのオリゴヌクレオチドの各々は、ＰＮＡと単一塩基のミスマッチを含んだ。このゲルの泳動温度を調節することによって、このＰＮＡが、完全な相補性オリゴヌクレオチドのみにハイブリダイズし、従ってこの完全な相補性オリゴヌクレオチドの移動を遅くすることを引き起し得る。ミスマッチしたオリゴヌクレオチドの移動は遅れず、従って、単一塩基対のミスマッチの検出を可能にする。
【００３２】
ＰＮＡをさらに使用して、ＰＣＲ反応における核酸の増幅を阻害した（例えば、米国特許第５，９７２，６１０号を参照のこと）。この方法において、サンプル中の増幅が所望されない核酸に相補的なＰＮＡは、その核酸にハイブリダイズされ、それによって効率的にその増幅をブロックする。
【００３３】
ついには、標識されたＰＮＡは、標準的なサザンハイブリダイゼーションブロットの代りに使用され、標的核酸を検出した（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０−１４６７５を参照のこと）。この方法において、標識されたＰＮＡを、変性された標的ＤＮＡに添加した。この混合物を、サイズ分離のために電気泳動システムに直接的にロードした。このＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、電気泳動の間、結合したままであった。電気泳動およびメンブレンへのブロッティング後に、この標識されたハイブリッドは、標識されたオリゴヌクレオチドをメンブレンに結合した標的ＤＮＡにハイブリダイズすることなしに、標準的な化学発光技術を使用して検出される。
【００３４】
しかし、本発明とは違って、上記の技術は、ＰＮＡ／ＤＮＡ（またはＰＮＡ／ＲＮＡ）ヘテロ二重鎖とＤＮＡ／ＤＮＡ（またはＤＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＲＮＡ）二重鎖との間の速度論および／または熱安定性の差異を活用し、二本鎖の標的核酸のうちの一方の鎖を単離することはない。
（５．１ 略語および取り決め）
特定の核酸塩基配列を含む標的核酸および競合オリゴを称するために本明細書中の全体および図面にわたる略語は、従来の１文字略記である。大文字は、標的核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（例えば、ＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列）を表し、そして小文字は、競合オリゴ配列（例えば、ＰＮＡ配列）を表す。従って、標的核酸中に含まれる場合、天然に存在するコード核酸塩基は、以下のように略記される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）。競合オリゴ配列に含まれる場合、この天然に存在するコード核酸塩基は、以下のように略記される：アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）。
【００３５】
また別段特定されない限り、一連の１文字略記として表現される標的核酸配列は、５’→３’の方向で表現される。５’末端および３’末端を有する競合オリゴ配列はまた、５’→３’の方向で表現される。アミノ末端およびカルボキシ末端を有する競合オリゴ配列（例えば、ＰＮＡ）は、カルボキシからアミノへの方向で表現される。
【００３６】
（５．２ 本発明）
二本鎖標的核酸のうちの一方の鎖を単離するための本発明に従う一般的な方法は、図１に例示される。図１を参照して、目的の二本鎖標的核酸３は、競合オリゴヌクレオチド（競合オリゴ）４と接触される。この二本鎖標的３は、第一鎖１および第二鎖２含み、そして競合オリゴ４は、第一鎖１の少なくとも一部分に相補性である。図１において、相補領域は、標的核酸の内部の配列として示されるが、後でしめされるように、この相補性領域は、一方または両方の末端の領域に存在し得る。この標的３と競合オリゴ４は、第一鎖１および第二鎖２への二本鎖標的３の解離を、第一鎖１および第二鎖２への二本鎖標的３の解離および競合オリゴ４と第一鎖１との間のハイブリダイゼーションを好む条件下で接触され、それによって、解離された第二鎖２および第一鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖５を生じる。標的３および競合オリゴ４が接触される条件は、標的鎖３の解離とヘテロ二重鎖５の形成を同時に好み得るか、またはこの条件は、第一鎖および第二鎖の解離ならびにヘテロ二重鎖５の形成を達成するための工程において修飾され得、これは、より詳細に以下で議論される。標的３は、第一鎖１および第二鎖２への二本鎖標的３の解離の前、それと同時、またはその後に、競合オリゴ４とそれぞれ接触され得る。
【００３７】
図１および本明細書中全体において、「第一鎖」および「第二鎖」という表現を使用して、二本鎖標的核酸の特定の鎖をいう。これらの表現は、完全に任意であり、そして個々の標的鎖を同定し、そして／または議論するための簡便な手段として単に使用されることが理解される。構造的、機能的、情報的または他の特徴の特性が、これらの表現によって与えられることを意図しない。例えば、二本鎖標的核酸は、遺伝子または遺伝子の部分であり、この「第一鎖」は、コード鎖または非コード鎖のいずれかであり得る。従って、「第一鎖」および「第二鎖」という表現は、二本鎖標的の二つの鎖を互いに区別することを単に容易にし、そして本発明を記載する際の補助として単独で使用され、これは、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００３８】
さらに、本明細書は、種々の異なる型の核酸二重鎖に対して言及する。本明細書中で使用される場合、「ヘテロ二重鎖」という表現は、その表現が本明細書中で定義されるように、少なくとも１つの鎖が競合オリゴである二本鎖核酸をいう。例えば、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とＰＮＡ鎖との間に形成された二重鎖（それぞれＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡ）は、本明細書中で「ヘテロ二重鎖」と称される。ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡを含む全ての他の二本鎖核酸は、「二重鎖」と呼称される。両方の鎖が、ＤＮＡであるか、または両方の鎖がＲＮＡである二重鎖は、「ホモ二重鎖」と称される。一方の鎖がＤＮＡでありかつ他方の鎖がＲＮＡである二重鎖は、「ハイブリッド二重鎖」と呼称される。以下でより詳細に議論されるように、本発明に従う二重鎖標的核酸は、「二重鎖」である。
【００３９】
（５．２．１ 二本鎖標的核酸）
この名称に含意されるように、この二本鎖標的核酸は、最小でも、鎖の間の塩基対形成相互作用を介して互いに結合する二つの鎖を含む。従って、本発明の二本鎖標的核酸は、例えば、ｔＲＮＡのような、鎖内の塩基対相互作用による二本鎖である領域を有する一本鎖核酸から区別されるべきである。この二本鎖標的は、３以上の鎖を含むか、または三本鎖である領域を含み得るが、好ましくは含まない。
【００４０】
二本鎖標的核酸は、平滑末端を有し得（例えば、鎖の各々が同じ数の核酸塩基の数を含む場合）、また、これは、一方の末端または両方の末端で一本鎖である領域を含み得る（例えば、より長い核酸から接着末端を残すエンドヌクレアーゼで切出される場合）。好ましくは、一本鎖のオーバーハングのいずれかが、全長の二本鎖標的と比較して相対的に短く、そして代表的には、１〜８ヌクレオチドの範囲である。
【００４１】
二本鎖標的核酸の各鎖は、完全にデオキシリボヌクレオチドからなり得、完全にリボヌクレオチドからなり得、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの混合物からなり得る。従って、この二本鎖標的は、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡホモ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＲＮＡ／ＲＮＡホモ二重鎖であり得る。さらに、各鎖は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含み得る。天然でのこれらの利用可能性およびＰＣＲ増幅産物の遍在性に起因して、この二本鎖標的核酸は、代表的には、二本鎖のＤＮＡ（ＤＮＡ／ＤＮＡホモ二重鎖）（例えば、単離された遺伝子または遺伝子フラグメントあるいはＰＣＲ増幅産物（「ＰＣＲアンプリコン」））である。
【００４２】
二本鎖標的の鎖は、天然に存在するコード核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ）または修飾もしくは合成された核酸塩基、あるいは、両方の組み合わせであり得る。標的核酸が構成され得る一般的に修飾されたかまたは合成された核酸塩基としては、以下が挙げられる：３−メチルウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ソロウラシル（ｔｈｏｒｏ ｕｒａｃｉｌ）、５−ヨードウラシル、６−ジメチルアミノプリン、６−メチルアミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノ−８−ブロモプリン、イノシン、５−メチルシトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシン。標的核酸が構成され得る、修飾されたかまたは合成された核酸塩基のさらなる非限定的な例は、Ｆａｓｍａｎ，ＣＲＣ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８５，３８５−３９２頁；Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ’ｓ Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（これらの全ては、このような核酸塩基の構造、特性、および調製を記載する刊行物に対する参照を提供する）に見出され得る。
【００４３】
当業者に認識されるように、上記の修飾されたかまたは合成された核酸塩基のうちの多くは、天然に存在するコード核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣならびにＵを用いて、ワトソン−クリック塩基対相互作用を形成し得る。しかし、以下でより詳細に説明されるように、本発明の特定の実施形態において、他の核酸塩基（例えば、天然に存在するコード核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧならびにＵおよび通常の修飾核酸塩基）とワトソン−クリック塩基対を形成し得ないが、互いに非標準（すなわち、非ワトソン−クリック）塩基対を形成し得る二本鎖標的合成核酸塩基を中に含むことが所望され得る。これらの特性を有する核酸塩基は、本明細書中で「非標準合成」核酸塩基と呼称される。このような非標準合成核酸塩基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イソグアニン（ｉｓｏ−Ｇ）、イソシトシン（ｉｓｏ−Ｃ）、キサンチン（Ｘ）、カッパ（ｋａｐｐａ）（Ｋ）、核酸塩基Ｈ、核酸塩基Ｊ、核酸塩基Ｍおよび核酸塩基Ｎ（米国特許第６，００１，９８３号を参照のこと）。これらの非標準合成核酸塩基は、互いに塩基対をつくり、以下の非標準塩基対を形成する：イソ−Ｃ・イソ−Ｇ、Ｋ・Ｘ、Ｈ・ＪおよびＭ・Ｎ。これらの非標準塩基対の各々は、三つの水素結合を有する。さらなる非標準合成核酸塩基およびこれらの合成のための方法、およびこれらを核酸に取り込むための方法は、米国特許第５，４３２，２７２号、同第５，９６５，３６４号および同第６，００１，９８３号（これらの開示は、本明細書中で参考として援用され得る）に見出される。
【００４４】
標的核酸の鎖の骨格は、代表的には、「ネイティブ」の糖リン酸ジエステル内結合から全体が構成されるが、これらは、１以上の修飾された分子内結合（例えば、１以上の糖ホスホロチオエート、糖ホスホロジチオエート、糖ホスホロアミデート、または他の修飾分子内結合）を含み得る。標的核酸を含み得る修飾核酸塩基内結合ならびにこれらの合成方法のさらなる例は、例えば、Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ９０（４）：５４４−５８４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１（３）：１６５−１８６に見出され得る。
【００４５】
本発明の方法が、ヘテロ二重鎖形成の速度論的利益および／または熱力学的利益を利用するとき、このアッセイのｐＨおよび温度において、二本鎖標的核酸のいずれの鎖もが、正味に正に荷電しするかまたは正味で電荷的に中性である核酸塩基内結合（すなわち、骨格）の組み合わせを含むべきでないことを理解する。一方または両方の鎖が、正味で正電荷を保持しているか、または正味に電荷的に中性である骨格を保持している標的は、本発明の方法に従って効率よく解離され、そして競合オリゴにハイブリダイズされるためには高すぎる熱的安定性を有する傾向がある。従って、二本鎖標的の鎖の各々は、１以上の正に荷電したか、または非荷電である核酸塩基内結合を含み得、これらの分子内結合を含む鎖は、このアッセイのｐＨおよび温度で正味で負の電荷を有するはずである。好ましくは、この二本鎖標的核酸の各鎖はネイティブ糖リン酸ジエステル骨格を有する。
【００４６】
二本鎖標的核酸は、人工的に構築され得るかまたは天然から単離され得る。人工的に構築された二本鎖標的核酸の非制限的な例としては、異なる供給源由来の核酸を１つの核酸（例えば、人工的に構築されたプラスミド）へスプライシングすることによって作製されるキメラ核酸、ＲＮＡ鋳型からインビトロで逆転写されたｃＤＮＡ配列、ＰＣＲまたは他の増幅技術を使用して作製されたアンプリコン、および化学的に合成された核酸が挙げられる。天然に存在する二本鎖標的核酸の非制限的な例としては、天然に存在するプラスミドまたはその一部、ゲノムＤＮＡまたはその一部、および細胞以下の細胞小器官に由来するＤＮＡが挙げられ、これらの全てが、先に単離または精製することなく、本発明の方法において使用され得るか、または、好ましくは、当該分野で公知の方法を使用して本発明を用いる使用のために単離されそして調製される。
【００４７】
二本鎖標的核酸は、実質上、数十から数百、数千、またはそれを超える長さの任意の数の塩基対であり得る。例えば、二本鎖標的核酸は、完全な遺伝子、いくつかの遺伝子、または染色体全体でさえあり得る。しかし、本発明を実行することは、サンプル中に存在する標的分子の少なくとも一部の鎖の完全な解離を必要とするので、当業者は、二本鎖標的核酸が、好ましくは、効率的な鎖の解離を可能にする十分な長さであり得ることを理解する。解離の程度および解離が達成され得る条件は、部分的に、核酸塩基組成（例えば、Ｃ＋Ｇ含有）に依存するが、本発明における使用のための標的核酸は、代表的に、約３０と２０００の間の塩基対長、好ましくは、約４０と５００の間の塩基対長、およびより好ましくは、約６０と約２００の間の塩基対長である。標的核酸分子が、例えば、遺伝子全体よりも長い場合、これは、超音波処理、剪断、およびエンドヌクレアーゼ消化のような従来の技術を使用して好ましいサイズに簡便にフラグメント化され得る。特定のフラグメントは、単離され得、そして本明細書中に記載される方法において標的として使用され得るか、またはフラグメント化産物全体は、精製することなく使用され得る。
【００４８】
標的核酸分子は、ハイブリダイゼーション後のさらなる精製または当業者に明らかであるような他の目的のために、例えば、標的と競合オリゴとの間のハイブリダイゼーションを検出するために使用され得るレポーター基またはレポーター部分を含むように改変され得る。有用なレポーター基としては、放射性同位体、非放射性同位体、光を発光する部分（例えば、発蛍光団）および化学発光する部分、光を吸収する部分（例えば、発色団）、第２のレポーター基に結合し得るリガンド（例えば、ビオチン）、比色反応を生成し得る酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ジゴキシゲニン）などが挙げられる。
【００４９】
あるいは、標的核酸は、競合オリゴとの接触を伴う解離した標的核酸の鎖の捕捉および／または単離を容易にする部分を含むように改変され得る。種々のこのような部分は、捕捉プローブを使用する本発明の実施形態と組み合わせて、上記議論され、そして例えば、ビオチンのような結合分子、固体支持体、および捕捉配列を含む。これらの部分のいずれかは、標的核酸に含まれ得る。好ましくは、標的の唯一の鎖は、このような部分を含み得るか、または各鎖は、異なる部分を含み得、その結果、異なる部分は、お互いから解離鎖を容易に分離または単離するように使用され得る。
【００５０】
このようなレポーター部分および／または捕捉部分を核酸に取り込むための方法および試薬は、このようなレポーター基を検出するための方法と同様に、当該分野で周知である。使用される実際のレポーター部分および／または捕捉部分は、もちろん、所望の用途、標的核酸の質、および当業者に明らかな他の要因に依存する。
【００５１】
二本鎖核酸の核酸塩基配列は、排他的にネイティブな配列であり得るか（すなわち、標的が得られる生物から排他的に由来する）、排他的に操作された配列であり得るか、またはネイティブ配列および操作された配列の混合物であり得る。排他的にネイティブな配列を有する標的の例としては、天然に存在する生物から単離された標的核酸などが挙げられ得る。ネイティブな配列および操作された配列の両方を含む標的配列の例としては、制限酵素部位、認識配列（例えば、ジップコード（ｚｉｐ−ｃｏｄｅ）、ユニバーサルプライミング部位など）を含むように操作されたＰＣＲアンプリコンが挙げられる。標的の操作された部位は、内部配列であってもよいし、一方の末端もしくは両方の末端に存在してもよい。
【００５２】
本発明の１つの実施形態において、二本鎖標的核酸は、１つ以上の操作されたテイル配列を含む。本明細書中で使用される場合、「テイル配列」は、二本鎖標的核酸の１つの鎖の末端に位置する公知の核酸塩基配列のストレッチである。標的の鎖のいずれかまたは両方は、同じまたは異なるテイル配列を含み得、そしてこれらは、いずれかの末端または両方の末端に含まれ得る。代表的に、このテイル配列は、競合オリゴに対して完全に相補的であり、そしてこの標的核酸の内部配列に対して非相補的である。このテイル配列は、二本鎖標的核酸の解離鎖の捕捉を容易にするために使用され得るか、または図２および３に示される競合オリゴのハイブリダイゼーションのために使用され得る。
【００５３】
好ましい実施形態において、テイル配列は、上記のように、非標準合成核酸塩基から構成される。図２を参照すると（これは、非標準合成核酸塩基から構成される２つのテイル配列（６および７）を含む標的核酸を用いる本発明の方法を例示する）、非標準テイル配列が使用される場合、競合オリゴはまた、非標準合成核酸塩基を含む。これらの非標準合成核酸塩基は、ワトソン−クリック塩基対を形成しないので、競合オリゴ１４は、第１の鎖１１のテイル配列のみにハイブリダイズし得る。従って、非標準合成テイル配列を利用することは、当業者に明らかな他の利点と同様に、減少した交差反応性の利点を提供する。
【００５４】
テイル配列は、当該分野で公知の任意の技術を使用して標的配列に付加され得るか、または標的核酸内に操作され得る。例えば、テイル配列は、当該分野で周知であるようなＰＣＲ増幅（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）において適切なＰＣＲプライマーを使用することによって付加され得る。この方法に従って、目的の核酸の一方の末端に相補的な配列をその３’末端に有するＰＣＲプライマーが選択される。このプライマーの５’末端は、テイル配列を含む。目的の核酸の他方の末端に相補的な配列をその３’末端に有する第２のプライマーが選択される。これらの２つのプライマーは、目的の核酸を増幅するために使用される。得られた単位増幅配列は、その末端にテイル配列を有する標的核酸を含む。
【００５５】
テイル配列はまた、標準的なクローニング技術を使用して付加され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。例えば、テイル配列を含む合成二本鎖ポリヌクレオチドは、接着末端を含むように操作され得るか、または制限酵素で切断され得、接着末端を残す。目的の核酸は、相補的な接着末端を残す制限酵素で切断され得る。次いで、制限消化されたポリヌクレオチドおよび目的の核酸は、テイル配列を含む標的核酸を作製するように共に連結され得る。あるいは、二本鎖ポリヌクレオチドおよび目的の核酸分子が、各々平滑末端を有する場合、これらは、制限酵素を用いる消化なしで、共に連結され得る。平滑末端はまた、これらが適切な位置に適切な制限部位を含む場合、平滑末端を作製する制限酵素を使用して、二本鎖の目的の核酸および／またはポリヌクレオチドに基づいて作製され得る。
【００５６】
非標準合成核酸塩基から構成されるテイル配列はまた、標準的なクローニング技術を使用して簡便に得られ得る。この方法に従って、一本鎖突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）または接着末端を有する合成二本鎖ポリヌクレオチドは、相補的な突出または接着末端を有する目的の二本鎖核酸に連結される。ポリヌクレオチドの二重鎖領域は、非標準合成テイル配列を含み、そしてこの突出は、天然のコード化ヌクレオチドを含む。突出するオリゴヌクレオチドを目的の二本鎖核酸にアニーリングすることは、非標準合成テイル配列を含む標準核酸を生じる従来の手段に従って連結され得る複合体を生じる。あるいは、非標準合成核酸塩基を含むテイル配列は、公知の技術に従って、適切な非標準合成ヌクレオシド三リン酸を用いる酵素的ギャップ充填反応を使用して調製され得る。
【００５７】
テイル配列を標的核酸に導入する他の方法は、当業者に明らかである。
【００５８】
テイル配列は、任意の数のヌクレオチド長であり、そして任意の核酸塩基組成を含み得るが、代表的に、関連条件下で効率的なハイブリダイゼーションを可能にする長さおよび組成である。好ましくは、テイル配列は、５と５０の間のヌクレオチド、およびより好ましくは、７と２０の間のヌクレオチドを含み得、そして以前に記載されるように、非標準合成核酸塩基から構成される。天然に存在するコード化ヌクレオチドおよび／または改変核酸塩基から構成される場合、Ｃ＋Ｇ含量は、重要ではなく、そしてかなり広い範囲にわたって変化し得る。
【００５９】
テイル配列は、多数の所望の特徴（例えば、より強力なハイブリダイゼーションのための高いＧ−Ｃ含量、より識別力のあるハイブリダイゼーションのための高い配列複雑性、操作を容易にするための多数の制限酵素認識部位など）を同時に有するように設計され得る。特定の用途のための適切な特徴を有するテイル配列は、当業者に明らかである。テイル配列の使用は、有利である。なぜなら、これは、当該分野で周知であるハイブリダイゼーション技術の使用を介して、これを含む核酸の鎖の同定、精製、および／または単離を可能にするからである。複数の異なるテイル配列の使用は、二本鎖標的核酸の鎖の複雑な操作を可能にする。好ましい非標準合成核酸塩基から構成されるテイル配列は、天然に存在するコード化核酸塩基とのそれらの直交性が、次のハイブリダイゼーション工程の間、ハイブリダイゼーション交差反応性を減少させるので、特に有利である。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、二本鎖標的核酸は、ユニバーサルテイル配列を含む。本明細書中で使用される場合、「ユニバーサルテイル配列」は、多数の異なる用途について、これを有用にする特徴を含む、テイル配列である。一般的に、ユニバーサルテイル配列は、十分に長くかつ複雑であり、その結果、これは、天然に存在する可能性が低く（すなわち、１８〜５０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドのオーダーで）、従って、生物から単離された核酸に相補的であると予想されない。これらが標準的なワトソン−クリック塩基対を形成できないことに起因して、非標準合成ユニバーサルテイル配列を含むユニバーサルテイル配列は、生物から単離された核酸と容易にハイブリダイズしない。従って、このような非標準合成核酸塩基から構成されるテイル配列は、代表的に、特異性を損なうことなく、ワトソン−クリック塩基対を形成し得る核酸塩基から構成されるテイル配列よりも短い。従って、６〜８核酸塩基ほどの短いこれらの非天然合成核酸塩基から構成される高度に特異的なユニバーサルテイル配列が、容易に設計され得る。
【００６１】
標的核酸中にユニバーサルテイル配列を含むことは、標的の所望の鎖の操作および単離を容易にする。同じユニバーサルテイル配列が、複数の二本鎖標的核酸の各々に付加される場合、各標的の所望の鎖は、同じ「ユニバーサル」相補的競合オリゴを使用して単離され得る。従って、標的核酸中にユニバーサルテイル配列を含むことは、個々の適用について特有の競合オリゴを合成する必要性を除去する。ユニバーサルテイル配列に相補的な単一のユニバーサル競合オリゴは、任意の標的核酸の１つの鎖を単離するために使用され得る。ユニバーサルテイル配列を含む標的は、以前に記載されるように、当業者に明らかなように、または標準的なクローニング技術を介して、「ユニバーサル」プライマーを使用して、ＰＣＲ反応中で容易に作製され得る。
【００６２】
例えば、ユニバーサルテイル配列を含む二本鎖標的を作製するために、その３’末端に標的核酸に相補的なヌクレオチド配列およびその５’末端にユニバーサルテイル配列を有する、「ユニバーサル」ＰＣＲプライマーが合成され得る。目的の鋳型核酸および別の適切なプライマーのＰＣＲ増幅は、ユニバーサルテイル配列を含む標的核酸分子を生成する。
【００６３】
好ましい実施形態において、二本鎖標的核酸分子は、各々の末端にテイル配列を含む。このような標的核酸は、一般に、以下の構造（Ｉ）：
５’−ＴＡＩＬ１ −ＳＥＱＵＥＮＣＥ −ＴＡＩＬ２ −３’
３’−ＴＡＩＬ１’−ＳＥＱＵＥＮＣＥ’−ＴＡＩＬ２’−５’
を有し、ここで、「ＴＡＩＬ１」は、第１の必要に応じてユニバーサルなテイル配列を示す；「ＴＡＩＬ２」は、第２の必要に応じてユニバーサルなテイル配列を示す；「ＳＥＱＵＥＮＣＥ」は、目的の核酸（すなわち、標的生物由来の核酸）に対応するかまたは目的の核酸から得られるかもしくは由来するヌクレオチド配列を示す；「ＴＡＩＬ１’」は、ＴＡＩＬ１に相補的な配列を示す；「ＴＡＩＬ２’」は、ＴＡＩＬ２に相補的な配列を示す；およびＳＥＱＵＥＮＣＥ’は、ＳＥＱＵＥＮＣＥに相補的な配列を示す。構造（Ｉ）において、種々のＴＡＩＬとＳＥＱＵＥＮＣＥとの間のダッシュは、共有結合を示す。ＴＡＩＬ１およびＴＡＩＬ２の配列は、同じであっても良いし異なっていてもよい。好ましくは、ＴＡＩＬ１およびＴＡＩＬ２は、異なるユニバーサルテイル配列である。
【００６４】
二本鎖標的核酸が構造（Ｉ）に従う構造である本発明の例示的な実施形態は、図２に示される。図２を参照すると、標的核酸１３は、それぞれ、第１鎖の１１および第２鎖の１２を含む。第１鎖１１は、第１の５’テイル配列６および第２の異なる３’テイル配列７を含む。示されるように、テイル配列は、非標準合成核酸塩基から構成されるが、他の核酸塩基（例えば、天然に存在するコード化核酸塩基）が使用され得る。標的１３は、競合オリゴ１４と接触され得、これは、第１のテイル配列６に相補的な第１の核酸塩基配列６’および第２のテイル配列７に相補的な第２の核酸塩基配列７’を含む。標的１３および競合オリゴ１４は、標的１３が解離しそして第１鎖１１が競合オリゴ１４とハイブリダイズする条件下で接触され、解離した第２鎖１２、環状ヘテロ二重鎖１５および三重複合体１６を形成する。１つ以上の第１鎖１１が三重複合体１６の一本鎖部分とハイブリダイズするより高次の複合体がまた、形成し得るが、示さない。種々の異なる分子１５、１６および１２のいずれかまたは全てが、以下により詳細に説明されるように、お互いから単離され得、そして二本鎖標的１３の鎖がそこから単離され得る。例えば、解離した鎖１２は、１２の一部に相補的な捕捉プローブを用いて容易に単離され得る。
【００６５】
（５．２．２ 競合オリゴ）
競合オリゴは、アッセイのｐＨおよび温度において正味の正電荷を有するかまたは正味で電荷的に中性である骨格に共有結合した一連の核酸塩基を含む。標的核酸と組み合わせて、以前に記載されるように、競合オリゴを含む核酸塩基は、天然に存在するコード化核酸塩基、改変核酸塩基、合成核酸塩基もしくは非標準合成核酸塩基、またはこれらの核酸塩基のいずれかの組み合わせであり得る。競合オリゴの核酸塩基についての唯一の必要条件は、これらが標的核酸の領域を含む核酸塩基と共に塩基対を形成し得ることである。例えば、競合オリゴが、天然に存在するコード化核酸塩基から構成される標的核酸の領域とハイブリダイズするように設計される場合、競合オリゴは、ワトソン−クリック型塩基対を形成し得る核酸塩基の相補的な配列を含むべきである。競合オリゴが、例えば、好ましい非標準合成核酸塩基から構成されるユニバーサルテイル配列とハイブリダイズするように設計される場合、競合オリゴヌクレオチドは、非標準合成核酸塩基の相補的な配列を含むべきである。必要とされる相補性の程度は、後の節においてより完全に議論される。
【００６６】
核酸塩基を結合する骨格は、４つの基準を満たす、当該分野で公知の任意のポリマーであり得る。第１に、競合オリゴ中でインキュベートされる場合、骨格は、アッセイのｐＨおよび温度（代表的にｐＨ６〜ｐＨ８および約２０℃〜約４０℃）において正味の正電荷または正味で電荷的に中性を有するべきである。第２に、骨格は、核酸塩基の共有結合に敏感であるべきである。第３に、共有結合した核酸塩基の形状（すなわち、これらの間の距離およびお互いに対するこれらの配向）は、これらが相補的な核酸鎖の核酸塩基と塩基対形成することを可能にするべきである。好ましくは、共有結合した核酸塩基の形状は、天然の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）における核酸塩基の構造に近い。第４に、この骨格は、競合オリゴと相補的な核酸鎖との間のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に可撓性であるべきである。
【００６７】
単独または組み合わせて使用される場合、上記基準を満たす骨格を有する競合オリゴを生じる種々の核酸塩基内結合が当該分野で公知である。例えば、正電荷の糖−グアニジル内結合を有する核酸塩基ポリマーが、米国特許第６，０１３，７８５号および第５，６９６，２５３号（Ｄａｇａｎｉ，１９９５，Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ４−５：１１５３；Ｄｅｍｐｅｙら、１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：６１４０−６１４１もまた参照のこと）において記載される。糖が２’−デオキシリボースであるアナログは、「ＤＮＧ」と称され、ここで、糖がリボースであるアナログは、「ＲＮＧ」と称される。アルキルアミン側鎖を有する正電荷のポリアミド骨格を有する核酸塩基ポリマーの例は、米国特許第５，７８６，４６１号；米国特許第５，７６６，８５５号；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，５３９，０８２号およびＷＯ９８／０３５４２（Ｈａａｉｍａら、１９９６、Ａｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ．ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ ３５：１９３９−１９４２；Ｌｅｓｎｉｋら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ．１６：１７７５−１７７９；Ｄ’Ｃｏｓｔａら、１９９９、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：１５１３−１５１６，Ｎｉｅｌｓｏｎ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５もまた参照のこと）において記載されテイル。
【００６８】
非電荷のポリアミド骨格を有する核酸塩基ポリマーはまた、当該分野で記載されテイル。例えば、非電荷のポリアミド骨格を有する核酸塩基ポリマーは、ＷＯ９２／２０７０２および米国特許第５，５３９，０８２号において記載されテイル。非電荷のモルホリノ−ホスホラミデート骨格を有する核酸塩基ポリマーは、米国特許第５，６９８，６８５号；米国特許第５，４７０，９７４号；米国特許第５，３７８，８４１号および米国特許第５，１８５，１４４号（Ｗａｇｅｓら、１９９７、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１１１６−１１２１もまた参照のこと）において記載されテイル。
【００６９】
競合オリゴを含み得るさらなる核酸塩基内結合としては、ペプチドベースの核酸模倣内結合（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号を参照のこと）、カルバメート分子内結合（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ＆Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，１９８７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２を参照のこと）、アミド分子内結合（例えば、Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，１９９４，Ｓｙｎｌｅｔｔ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ，１９９４：１３７を参照のこと）、メチルヒドロキシアミン分子内結合（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６を参照のこと）、３’−チオホルムアセタル分子内結合（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照のこと）およびスルファメート分子内結合（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照のこと）ならびに前出の標的核酸と組み合わせて考察された種々の改変された分子内結合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
種々の分子内結合に関する上に列挙された参考文献の全ては、本明細書中に参考として援用される。以前に考察されるように、競合オリゴの骨格は、使用の意図されるｐＨおよび温度において正味の正電荷または正味で電荷的に中性を有するべきである。当業者は、競合オリゴ骨格の正味の電荷が正である限り、正味の正電荷を有する競合オリゴが、負に荷電した核酸塩基内結合（例えば、ネイティブな糖ホスホジエステイル分子内結合）を含み得ることを理解する。このことは、大部分の正電荷の分子内結合を含むことによって達成され得る。
【００７１】
正味の正電荷の競合オリゴを使用する場合、骨格の電荷の大きさが大きすぎないことを保証するために注意すべきである。電荷が大きすぎる場合、競合オリゴの標的核酸との相互作用は、本質的にイオン性であり、そして競合オリゴは、その配列特異性を失う傾向がる（すなわち、この競合オリゴは、イオン交換樹脂として作用する傾向がある）。ほとんどの長さの競合オリゴについて、配列特異性は、骨格の正電荷が約５〜６を超えないことを保証することによって容易に保持され得る。好ましくは、骨格の正電荷は、約１〜３を超えるべきではない。
【００７２】
競合オリゴ骨格が、それが正味の正電荷を有するように、正電荷の分子内結合を含む場合、他の核酸塩基内結合は、好ましくは、中性分子内結合（例えば、中性ポリアミド分子内結合もしくは中性モルホリノホルラミデート分子内結合またはその組み合わせ）である。このような中性分子内結合の使用は、競合オリゴが糖ホスホジエステイル分子内結合のような負電荷の核酸塩基内結合を含むヘテロ二重鎖を用いて経験され得る局所的な鎖間での電荷−電荷反発力を回避または減少する。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、競合オリゴは、中性核酸塩基内結合（例えば、以前に記載されるような中性アミド分子内結合およびモルホリノ−ホスホラミデート分子内結合）を含み、そして必要に応じて、約１から約３〜４の正電荷の分子内結合を含む。中性分子内結合は、全て同じであっても良いし、またはこれらは異なっていても良い。例えば、競合オリゴは、いくつかのモルホリノホスホラミド分子内結合およびいくつかの中性アミド分子内結合を含み得る。各クラス内で、種々のモルホリノ−ホスホラミデート分子内結合および中性アミド分子内結合はまた、同じであっても良いし異なっていても良い。必要に応じて正電荷の分子内結合もまた、同じであっても良いし異なっていても良い。
【００７４】
本発明の特に好ましい実施形態において、競合オリゴは、中性ポリアミド核酸（「ＰＮＡ」）である。本明細書中で使用される場合、「ＰＮＡ」は、非荷電のポリアミド骨格を介して共に結合された核酸塩基のポリマーをいう。ＰＮＡ骨格は、核酸塩基が結合し得そして上に議論された基準を満たす、任意の骨格の非環式のアキラルなかつ中性のポリアミドであり得る。本発明において有用なＰＮＡは、例えば、米国特許第５，５３９，０８２号およびＷＯ９２／２０７０２において記載され、これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。ポリアミド骨格を形成するアミノ酸は、同一であっても良いし、異なっていても良い。特に好ましいＰＮＡは、核酸塩基がＮ−（２−アミノエチル）−グリシン骨格に結合したＰＮＡ（すなわち、ペプチド様アミド結合ユニット（例えば、米国特許第５，７１９，２６２号；Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９２，ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００を参照のこと））である。このような特に好ましいＮ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡの部分的な構造は、以下の式（ＩＩ）：
【００７５】
【化１】
で示され、ここで：
ｎは、以下により完全に議論されるように、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡの長さを定義する整数であり；
各Ｂは、独立して、核酸塩基であり；そして
Ｒは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、各Ｒ’は、独立して、水素または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、好ましくは、水素である。
【００７６】
当業者に理解されるように、本明細書中に記載される競合オリゴ（例えば、好ましいＰＮＡ、核酸塩基（天然であるか、改変されているか、合成であるかに関わらない））は、その核酸塩基が標的核酸の所望の鎖と塩基対形成するのを可能にする配向で、骨格に付着される。天然核酸塩基および改変核酸塩基について、これは、天然では同じ位置（すなわち、アデニン、グアニンおよびイノシンについてＮ９位、そしてチミン、シトシン、ウラシル、ジヒドロウリジン（Ｄ）、プソイドウリジン（Ψ）についてはＮ１位など）に見出されている。非標準的合成核酸塩基もまた、代表的に、ピリミジン非標準的合成塩基についてＮ１を、そしてプリン非標準的合成塩基についてはＮ９位を介して、骨格に付着される（例えば、米国特許第６，００１，９８３号、同第５，９６５，３６４号を参照のこと）。他の核酸塩基についての付着点は、当業者に明らかである。
【００７７】
競合オリゴは、当該分野で周知の多数の従来方法のうちのいずれかを用いて合成され得る。使用される方法は、一部、選択される特定の核酸塩基内結合（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）に依存する。特定の連結を含むオリゴを合成するための方法は、連結の各特定の型に関連して列挙している種々の特許および刊行物（上記）に提供される。例えば、正に荷電した糖グアニジル内結合を含む競合オリゴを合成するための適切な方法は、米国特許第６，０１３，７８５号および米国特許第５，６９６，２５３号に記載される。正に荷電したアミド内結合を含む競合オリゴを合成するための適切な方法は、米国特許第５，７８６，４６１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７１９，２６２号およびＷＯ ９８／０３５４２に記載される。天然のモルホリノ内結合を含む競合オリゴを合成するための適切な方法は、米国特許第５，１８５，４４４号および同第５，１４２，０４７号に記載される。天然のアミド内結合を含む競合オリゴ（例えば、特に好ましいＮ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡ）を合成するための適切な方法は、米国特許第５，５３９，０８２号およびＷＯ ９２／２０７０２に記載される。上記に列挙した特許および刊行物の全ては、参考として本明細書中に援用される。異なる分子内結合（ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）の組み合わせを含む競合オリゴが、上記に列挙した方法の慣用的な改変および／または周知の方法によって合成され得る。
【００７８】
競合オリゴは、所望のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で二本鎖標的核酸の第１鎖の領域または一部にハイブリダイズし得なければならない。従って、競合オリゴは、特定の適用の必要条件に依存して、標的の第１鎖の領域または一部に対して少なくとも部分的に相補的でなければならない。相補性領域は、図１に例示されるような標的間配列であり得るか、または例えば、図２に例示されるように１つ以上の末端標的配列であり得る。「相補性」によって、競合オリゴの核酸塩基が標的鎖の核酸塩基と塩基対を形成することを意味する。天然に存在するコード核酸塩基および多くの改変塩基または合成塩基について、塩基対形成相互作用は、通常のワトソン−クリック法則に従う。しかし、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号および同第５，９６５，３６４号に記載される非標準的合成核酸塩基（例えば、塩基イソ−Ｃ、イソ−Ｇ、Ｋ、Ｘ、Ｈ、Ｊ、ＭおよびＮ）は、非標準的（すなわち、ワトソン−クリックではない）塩基対を形成する。これらの非標準的塩基は、代表的に、以下のように互いに塩基対になる：イソ−Ｃ・イソ−Ｇ、Ｋ・Ｘ、Ｈ・Ｊ、およびＭ・Ｎ（各塩基対は、代表的に３つの水素結合を有する）。さらなる非標準的合成塩基についての塩基対形成スキームは、米国特許第５，４３２，２７２号、図４に例示される。これらの塩基対形成相互作用（標準的なワトソン−クリックであるか非標準的ワトソン−クリックであるかに関わらず）は、本明細書中に使用される「相補性」という用語の範囲内に入ることが意図される。
【００７９】
相補性の程度は、アッセイの性質に依存する。例えば、多型二本鎖標的核酸のメンバーのうちの各メンバーから一方の鎖を単離することが望ましい場合、競合オリゴは、設計によって、非相補的領域（代表的に、多型を含む領域周辺に作製される）を有し得る。従って、相補性の程度は、その方法の成功に重要ではなく、必要とされることは、その所望の結果を達成するのに十分な程度の相補性である。多くの適用に関して（例えば、多数の異なる標的核酸間から別個の標的核酸の一方の鎖を単離することが望ましい場合）、競合オリゴの配列は、好ましくは、二本鎖標的の所望の鎖の領域または一部に完全に相補的である。この実施形態において、競合オリゴは、好ましくは、特徴的である標的の領域または一部に完全に相補的であり、それによって、多数の標的核酸から標的核酸の相補鎖の特異的な単離を可能にする。従って、相補性の程度は、所望の適用に依存し、そして当業者に明らかである。
【００８０】
標的核酸が１つ以上のテイル（ｔａｉｌ）配列を含む実施形態（例えば、図２および図３に例示される実施形態）において、競合オリゴの配列は、好ましくは、標的のテイル配列に完全に相補的である。標的核酸が２つの末端テイル配列を含む実施形態において、競合オリゴは、図２および図３に例示されるように、好ましくは、一方が第１のテイル配列に完全に相補的であり、そしてもう一方が第２のテイル配列に完全に相補的である、２つの配列を含む。
【００８１】
当業者は、多くの競合オリゴ、とりわけ、特に好ましいＮ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡが、平行配向または逆平行配向のいずれかで相補的ＤＮＡまたは相補的ＲＮＡとハイブリダイズし得ることを、認識する（例えば、Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８を参照のこと）。ＰＮＡのカルボキシル末端がＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端に向かって指向される場合、およびＰＮＡのアミノ末端がＤＮＡまたはＲＮＡの３’末端に向かって指向される場合、配向は逆平行であるといわれる。平行配向において、ＰＮＡのカルボキシル末端およびアミノ末端は、ＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端および３’末端に関して逆方向である。従って、当業者は、競合オリゴの核酸塩基配列が、標的核酸との平行ハイブリダイゼーションまたは逆平行ハイブリダイゼーションのいずれが所望されるかに依存することを認識する。逆平行配向でのハイブリダイゼーションが、代表的に、平行ハイブリダイゼーションよりも安定であるので、競合オリゴの配列は、好ましくは、その競合オリゴが、二本鎖標的核酸の所望の鎖と逆平行配向でハイブリダイズするように選択される。
【００８２】
競合オリゴは、しばしば核酸塩基の連続ストレッチを含むが、これは、必要ではない。核酸塩基のストレッチは、標的核酸との配列特異的な塩基対形成相互作用に関与しない１つ以上のスペーサー部分によって、中断され得る。競合オリゴがスペーサー部分を含む本発明の実施形態が、図３に例示され、そして以下により詳細に考察される。スペーサー部分は、所望の適用に依存して、長くても短くてもよく、疎水性であっても親水性であってもよく、可撓性であっても半剛性であっても剛性であってもよい。一方の分子と別の分子との間隔をあけるため、または分子と固体表面との間隔をあけるために有用な種々のスペーサー部分が、当該分野で記載されている；これらのスペーサー分子の全てが、競合オリゴの領域を互いに間隔をあけるために使用され得る。
【００８３】
例えば、好ましいＰＮＡ競合オリゴについて、スペーサーは、ペプチド（例えば、ポリアミン（可撓性）またはポリプロリン（剛性））を含み得る。ペプチドスペーサーを作製するために、スペーサーを有する個々のアミノ酸は、従来のペプチド合成化学を使用してＰＮＡの合成の間に付加され得る。あるいは、ペプチドスペーサーは、図９に例示されるように、競合オリゴを含むＰＮＡセグメントと縮合され得る。図９を参照して、スペーサーペプチド６０のＮ末端は、例えば、従来の技術に従って、Ｆｍｏｃで保護されて、Ｎ末端が保護されたスペーサー６２を生じる。Ｎ末端が保護されたスペーサー６２は、標準的なカップリング化学を使用して第１のＰＮＡセグメント６４と縮合され、Ｎ末端が保護された中間体６６を生じる。Ｎ末端が保護された中間体６６は、脱保護されて、中間体６８を生じ、これは次いで、再び標準的なカップリング化学を使用してＮ末端が保護された第２のＰＮＡセグメント７０と縮合されて、Ｎ末端が保護された競合オリゴ７２を生じる。７２の脱保護は、ペプチドスペーサーを含む競合オリゴ７４を生じる。スペーサー６０上の任意の反応性側鎖もまた、周知の保護基および化学を使用して保護され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，１９９１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【００８４】
非ペプチドスペーサーを有する競合オリゴがまた、図９に例示されるように合成され得る。例えば、アミノ基およびカルボキシル基の両方を有する任意の分子（例えば、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、アミノアルキル酸（例えば、４−アミノ酪酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノカプロン酸など））が、化合物６０の代わりに使用され得、最終的にスペーサー部分を含む競合オリゴを生じる。競合オリゴの１つの領域と別の領域との間隔をあけるために使用され得るさらなる例示的なスペーサー、ならびにこのようなスペーサーを含む競合オリゴを合成する方法は、当業者に明らかである。ＰＮＡ競合オリゴについて、好ましいスペーサーは、Ｅｇｈｏｌｍら，１９９５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２１７−２２２（参考として本明細書中に援用される）に記載されるＯ−スペーサーである。
【００８５】
スペーサー部分を含む競合オリゴを使用する本発明の実施形態は、図３に例示される。図３において、競合オリゴ１７が介入スペーサー８によって分離されている２つの核酸塩基配列６’および７’を含む以外、図３は図２と同様である。図２の競合オリゴ１４と同様に、核酸塩基６’は、標的１３の第１のテイル配列６に相補的であり、そして核酸塩基７’は、標的１３の第２のテイル配列７に相補的である。標的１３の分離および競合オリゴ１７とのハイブリダイゼーションは、環状へテロ二重鎖２５、三重複合体２６および分離された第２鎖１２を生じる。図２について前に考察したように、高次の複合体が形成され得るが、例示はされていない。以下により詳細に記載するように、分離した第２鎖１２および／または複合体２５および２６は、互いに別々にされ得、そして標的鎖１３が単離される。
【００８６】
競合オリゴは、任意の数の核酸塩基長であり得るが、代表的に、標的の鎖を単離するために使用される温度およびイオン強度における迅速かつ効率的なハイブリダイゼーションを可能にし、同時に、二次構造の発生を最小限にするのに十分な、核酸塩基数を含む。さらに、競合オリゴの長さは、競合オリゴが所望の程度の特異性を与えるのに十分な長さであるべきである。当然、全体的に非標準的合成核酸塩基を含む競合オリゴのみが、他の非標準的合成核酸塩基に相補的であるので、このような競合オリゴの特異性は、長さに依存するように設計され得る。所望の程度の特異性を示す競合オリゴ長を選択することは、当業者に明らかである。
【００８７】
競合オリゴの長さはまた、一部、標的核酸の長さに依存する。好ましくは、競合オリゴの長さは、所望のアッセイ条件下での標的核酸の鎖の再会合または再アニーリングに対して有利に競合し得るように、選択されるべきである。代表的に、これは、単離される標的鎖長の約１／３倍〜１倍（核酸塩基単位）のオーダーである競合オリゴを選択することによって、達成され得る。従って、５０〜６０ｂｐ長の範囲の標的核酸に対して、約１５〜２０核酸塩基長〜約５０〜６０核酸塩基長のサイズ範囲の競合オリゴが、良好な結果を生じるはずである。
【００８８】
二本鎖標的の分離した鎖の単離を容易にするために、競合オリゴは、単離および／または捕捉を容易にする部分（「捕捉部分」）に結合されるか、またはそのような部分を含むように改変され得る。１つの実施形態において、捕捉部分は、固体支持体であり得る。本発明の方法における固体支持体に固定される競合オリゴの使用は、図６に例示される。
【００８９】
図６を参照して、二本鎖標的核酸１３は、固定された競合オリゴ１０に連結される。固定された競合オリゴ１０は、競合オリゴ４および固体支持体９を含む。図６に例示されるように、競合オリゴは、共有結合性の付着によって固体支持体９上に固定される。固定化の他の様式は、以下に議論される。連結は、二本鎖標的１３のそれぞれ第１鎖１１および第２鎖１２への解離、第１鎖１１と固定された競合オリゴ１０の一部である競合オリゴ４との間のハイブリダイゼーションを促進または有利にする条件下で実行され、それによって、ヘテロ二重鎖２２および解離された鎖１２を形成する。次いで、ヘテロ二重鎖２２が、固体支持体９によって（例えば、デカント、ろ過、遠心分離など）、分離した鎖１２および任意の二本鎖標的１３から単離されるかまたは捕捉される。固体支持体９が磁石である場合（例えば、磁気ビーズ）、ヘテロ二重鎖２２は、磁石の補助によって好都合に単離され得る。ヘテロ二重鎖２２の除去は、第２鎖１２を生じ、これは、さらなる精製を伴なわずに使用され得る。第１鎖１１が所望の標的鎖である場合、固体支持体９の補助によって固定された競合オリゴ１０を好都合に除去することによって、ヘテロ二重鎖２２が分離され、第１鎖１１が単離される。
【００９０】
あるいは、分離された第２鎖１２は、捕捉プローブ５０を用いた捕捉によって、混合物から（またはへテロ二重鎖２２の除去後のサンプルから）単離または捕捉され得る。固定された競合オリゴ１０と同様に、捕捉プローブ５０は、好ましくは、固体支持体上に固定された競合オリゴを含む。しかし、捕捉プローブ５０の核酸塩基は、第２鎖１２の一部に相補的である。固定される競合オリゴ１０および捕捉プローブ５０の固体支持体が異なる性質（例えば、サイズ、形状、磁力の差異など）に基づいて互いに分離できない場合、ヘテロ二重鎖２２およびヘテロ二重鎖５２の捕捉は、いずれかの順序で連続して実行されなければならない。第２鎖１２に相補的な捕捉プローブ５０の使用は、標的１３の両方の鎖が、複合体混合物から容易かつ効率的に単離されることを可能にする。
【００９１】
図６には競合オリゴとして例示されるが、当業者は、捕捉プローブ５０がＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含み得ることを認識する。さらに、捕捉部分は、固体支持体である必要はなく、捕捉プローブは、当該分野で公知の任意の捕捉部分（例えば、ビオチンを含む）であり得る。これら他の型の捕捉プローブのための捕捉条件を操作することは、当業者に明らかである。
【００９２】
図６を参照して、競合オリゴ４は、種々の異なる機構（吸収、イオン誘引、疎水性相互作用および共有結合的な付着を含む）によって、固体支持体９上に固定され得るか、または固体支持体９と会合され得る。あるいは、競合オリゴ４は、特定の結合化合物の対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）の使用を介して、固体支持体９上に固定され得る。
【００９３】
支持体９は、種々の規則的形状または不規則的形状（例えば、球状、楕円状、円盤状、立方体状、角錐状など）をとり得、そして固定化の所望の様式に適し、かつ適合性である（すなわち、本発明に従って、競合オリゴを固定するためかまたは二本鎖核酸の１つの鎖を単離するため使用される条件下で、溶解もしないし、さもなくば分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｅ）も分解（ｄｅｇｒａｄｅ）もしない）任意の材料（または材料の混合物）を含み得る。固体支持体に適した材料としては、ゲル（例えば、アガロース、ゼラチン、セファロースなど）、ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシメチルセルロースなど）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンなど）、ナイロン、ガラス、シリカなどが挙げられるが、これらに限定されない。材料の実際の選択は、なかでも固定化の所望の様式という因子に依存し、そしてこれは、当業者に明らかである。
【００９４】
吸着または吸収を介した固定化に関して、固定される競合オリゴ１０は、固体支持体９を競合オリゴ４と、競合オリゴ４がこの支持体上に吸着または吸収されるのに十分な期間接触させることによって、簡便に好都合に調製され得る。任意の洗浄工程の後、この支持体は、次いで乾燥させられる。核酸をニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルター上に固定させるためのドット−ブロットまたは他の核酸ブロッティング技術において記載される種々の方法が、好都合に適応されて、競合オリゴ４を固体支持体９上に固定させ得る。
【００９５】
イオン誘引による固定化について、支持体９は、本来荷電していない場合、競合オリゴ４（これは、最初に反対に荷電されるように改変される）を接触させる前に、まず荷電した基で活性化されるかまたは誘導体化される。
【００９６】
特定の結合化合物の対（例えば、ビオチン−ストレプトアビジンおよび抗体−ハプテン）によって媒介される固定化について、支持体９は、まずこの特定の結合対のうちの１つのメンバー（例えば、ストレプトアビジン）で誘導体化および／またはコーティングされ、次いで、この誘導体化された支持体は、この特定の結合対のうちの他方のメンバー（例えば、ビオチン）に連結された競合オリゴ４と接触させられる。種々の材料を結合分子（例えば、アビジン）で誘導体化またはコーティングするための方法、ならびに無数の型の化合物を結合分子（例えば、ビオチン）に連結させるための方法は、当該分野で周知である。ほとんどの競合オリゴについて、ビオチンが、市販の化学合成試薬を用いて、末端核酸塩基および／もしくは内部核酸塩基のいずれかに、またはそのカルボキシル末端およびアミノ末端のうちの一方もしくは両方に、分子に好都合に組込まれ得、このことは後方の節により詳細に記載される。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態において、競合オリゴ４は、必要に応じて１つ以上の連結部分によって、支持体９に共有結合的に付着され得る。支持体が、本来、競合オリゴと共有結合を形成し得る反応性官能基を含まない限り、この支持体は、そのような反応基で最初に活性化または誘導体化されなければならない。化合物の共有結合的な付着（例えば、競合オリゴの支持体への共有結合的な付着）をもたらすのに有用である代表的な反応基としては、ヒドロキシル基、スルホニル基、アミノ基、シアン基、イソシアン基、チオシアン基、イソチオシアン基、エポキシ基およびカルボキシル基が挙げられるが、当業者に明らかである他の反応基もまた、使用され得る。
【００９８】
多数の型の固体支持体材料を、この支持体に共有結合的に付着する化合物（例えば、ＰＮＡのような競合オリゴを含む）に適切な反応基で活性化するための種々の技術は、当該分野で公知であり、例えば、化学活性化、コロナ放電活性化、フレーム処理活性化、ガスプラズマ活性化およびプラズマ増強化学蒸着が挙げられる。これらの技術のうちのいずれかが、固体支持体を反応基で活性化するために使用され得る。支持体を活性化または誘導体化するために使用され得る多くの技術の概説については、ＷＩＬＥＹ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，第２版，Ｂｒｏｄｙ ＆ Ｍａｒｓｈ，編，「Ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」８６７−８７４頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９７，ならびにこれらの中に引用される参考文献を参照のこと。ガラスビーズ上にアミノ基を作製するのに適した化学方法は、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｓｍｉｔｈ，「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ Ｔｒｉｅｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ」，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｍ Ｊ Ｇａｉｔ，編，１９８５，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（特に、４５〜４９頁）（およびこの中に引用される参考文献）に記載され；ガラスビーズ上にヒドロキシル基を作製するのに適した化学方法は、Ｍａｓｋｏｓら，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９−１６８４）（およびこの中に引用される参考文献）に記載され；ポリスチレン、ポリアミドおよびグラフトポリスチレンのような支持体材料上に官能基を作製するのに適した化学方法は、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９７，ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ ＴＯ ＴＨＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，第２章，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（およびこの中に引用される参考文献）に記載される。さらなる方法が、周知であり、当業者に明らかである。
【００９９】
競合オリゴ４は、合成および／または単離後に活性化支持体上に共有結合的に固定され得るか、あるいは、支持体上にインサイチュで直接合成され得る。例えば、精製ＰＮＡは、好都合にそのカルボキシ末端によって、アミノ活性化された支持体上に共有結合的に固定され得る。あるいは、ＰＮＡは、従来の固相ペプチド化学および試薬を用いて、アミノ活性化された支持体上にインサイチュで直接合成され得る（ＷＯ ９８／０３５４２、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１９，２６２号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号およびこれらに引用される参考文献を参照のこと）。
【０１００】
異なる核酸塩基配列を有する複数の固定された競合オリゴが、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（米国特許第４，６３１，２１１号もまた参照のこと）の「ティータグ（ｔｅａ ｔａｇ）」アプローチ、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４０：４９７−５０６によって記載される自動化方法、またはＦｕｒｋａら，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎら，１９９３，Ｓｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：４１３−４１８；Ｌａｍら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４およびＨｏｕｇｈｔｅｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６もまた参照のこと）によって記載される分割合成方法を使用して、平行して好都合に合成され得る。
【０１０１】
当業者は、インサイチュ化学合成を使用する場合、競合オリゴと支持体との間に形成される共有結合が、合成および／または脱保護の間の競合オリゴの損失を回避するように、使用される合成条件および脱保護条件に対して実質的に安定であるべきであることを認識する。適切な連結は、周知であり、当業者に明らかである。
【０１０２】
活性化もしくは誘導体化された支持体上に直接合成されるか、または合成または単離の後に活性化または誘導体化された支持体上に合成されるか否かに関わらず、競合オリゴは、必要に応じて、１つ以上のリンカーによって支持体から間隔を空けられ得る。当業者に認識されるように、このようなリンカーは、少なくとも二官能性であり、すなわち、このようなリンカーは、活性化された固体支持体との連結を形成し得る一方の官能基または部分、および固定される他方のリンカー分子もしくは化合物との連結を形成し得る別の官能基または部分を有する。このリンカーは、所望の適用に依存して、長くても短くてもよく、可撓性であっても剛性であってもよく、疎水性であっても親水性であってもよい。
【０１０３】
特定の状況において、このようなリンカーは、一方の官能基を他方の官能基に「変換」するために使用され得る。例えば、アミノ活性化された固体支持体は、例えば、３−カルボキシ−プロピオン酸との反応によって、カルボキシル活性化支持体に変換され得る。このようにして、特定化された反応性官能基で容易に活性化も誘導体化もされ得ない固体支持体材料は、適切に活性化された支持体に好都合に変換され得る。このような反応基を「変換する」のに適した化学および試薬は、周知であり、当業者に明らかである。
【０１０４】
リンカーもまた、必要な場合使用されて、活性化支持体上の反応基の数を増加または「増幅」し得る。この実施形態において、リンカーは、代表的に３つ以上の官能基を有する。これらの官能基のうち１つによって活性化支持体に付着させた後、残りの２つ以上の基が、化合物の付着に利用可能である。この様式において活性化支持体上の官能基の数を増幅することは、活性化支持体が相対的に少ない反応基しか含まない場合、特に好都合である。
【０１０５】
反応基の数を増幅するための試薬は、周知であり、当業者に明らかである。増幅試薬の特に好都合な型は、商標名ＤＥＮＡＣＯＬＴＭ（Ｎａｇａｓｓｉ Ｋａｓｅｉ Ｋｏｇｙｏ Ｋ．Ｋ．）の多官能基エポキシド固体である。これらのエポキシドは、４、５、なおさらに多くのエポキシ基を含み、そしてエポキシドと反応する反応基で活性化される支持体（例えば、ヒドロキシル、アミノおよびスルホニルで活性化される支持体を含む）を増幅するために使用され得る。生じるエポキシ活性化支持体は、ヒドロキシル活性化支持体、アミノ活性化支持体、カルボキシ活性化支持体、または周知の方法による他の活性化支持体に、好都合に変換され得る。あるいは、競合オリゴは、エポキシド基に直接共有結合的にカップリングされ得る。
【０１０６】
生物学的分子または他の分子（ポリヌクレオチドおよび競合オリゴを含む）を固体支持体から間隔を空けるのに適したリンカーは、当該分野で周知であり、限定しない例を挙げると、前述のスペーサー分子、ポリペプチド（例えば、ポリプロリンまたはポリアラニン）、飽和二官能価炭化水素または不飽和二官能価炭化水素（例えば、６−アミノカプロン酸）およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）などが挙げられる。
【０１０７】
別の実施形態において、捕捉部分は、１対の特異的結合分子の一方の部分である（例えば、ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジンまたは抗体およびハプテン）。ビオチンは、当該分野で公知の任意の技術を用いて、競合オリゴに結合され得る。例えば、ビオチンは、競合オリゴに対して、その末端の一方もしくは両端、骨格上の別の位置、またはその核酸塩基の１つ以上に対して結合され得る。ビオチンを競合オリゴに対して結合する方法は、当該分野で周知であり、市販の試薬（例えば、ビオチン−ＮＨＳエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手可能））を用いて達成され得る。この場合、ビオチン−ＮＨＳエステルは、競合オリゴ（例えば、ＰＮＡ）のアミノ末端に対して、標準的な連結技術を用いて共有結合され得る。あるいは、ビオチンは、例えば、ジメトキシトリチルビオチンフェニルピラゾラニンエステルを合成試薬として用いることで、合成される間にＰＮＡに結合され得る（例えば、Ｐｅｒｒｙ Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、前出）。他の結合化合物（例えば、ハプテン）を有する競合オリゴを合成する方法は、当業者にとって明白である。
【０１０８】
ビオチン捕捉部分を用いる本発明の実施形態は、図７に例示される。図７に示されるように、二重鎖標的核酸３は、標的３が第１鎖および第２鎖（１および２）にそれぞれ解離する条件下で、ビオチン標識競合オリゴ２０と接触し、第１鎖１は、ビオチン標識競合オリゴ２０とハイブリダイズして、ビオチン標識へテロ二重鎖３２を生じ、第２鎖２を解離する。図７において、ビオチン１４は、競合オリゴ４の末端に共有結合する。ビオチン標識へテロ二重鎖３２は、固定化ストレプトアビジン（例えば、ストレプトアビジン被覆ビーズ３４）と、ビオチンとストレプトアビジン間の結合を導く条件下で接触され、複合体３６を生じる。これは、単離され得て、第１鎖１がここから分離されそして単離される（例えば、Ｂｏｆｆａら、前出）。あるいは、複合体３６が、単離され得て、さらなる精製を行わずに第２鎖２が用いられる。
【０１０９】
さらに別の実施形態において、図８に示されるように、捕捉部分は、捕捉配列４１である。捕捉配列４１は、競合オリゴ４に結合され、プローブ４０を生じる。この捕捉配列は、捕捉プローブ４４に対して相補的であり、競合オリゴ４に対し相補的でなく、標的核酸３のいずれの鎖に対しも相補的でない。図８に例示するように、二重鎖標的核酸３は、標的３が第１鎖および第２鎖（１および２）にそれぞれ解離する条件下で、プローブ４０と接触し、そしてプローブ４０の競合オリゴ部分４は、第１鎖１とハイブリダイズして、複合体４２を生じ、第２鎖２を解離する。次いで、複合体４２は、捕捉プローブ４４がプローブ４０の捕捉配列４１にハイブリダイズする条件下で、捕捉プローブ４４と接触し、三分子複合体４８を生じる。捕捉プローブ４４は、三分子複合体４８の単離を可能にするエレメント４６を含む。エレメント４６は、三分子複合体の捕捉および／または単離を容易にする、当該分野で公知の任意の部分であり得、これらとしては、例えば、前述の捕捉部分、好都合には固体支持体またはビオチンである。
【０１１０】
当業者は、捕捉プローブ４４と捕捉配列４１の間の好ましいハイブリダイゼーションを支持する条件下で、複合体４２の解離ならびに第１鎖および第２鎖（１および２）の再アニールまたは再会合に好ましくない条件下において、捕捉プローブ４４が複合体４２と接触されるべきであることを理解する。これは、好都合には、捕捉配列４１および捕捉配列４４のうち１つが競合オリゴであり、他方が荷電または非荷電の骨格を有するオリゴヌクレオチドであることを保証することにより達成され得る。捕捉配列４１が荷電した骨格（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド）であるキメラプローブ４０を作製する方法も同じである。好ましくは、捕捉配列４１は、非荷電骨格を有し、捕捉プローブ４４は、荷電または非荷電の骨格のいずれかを有する。最も好ましくは、プローブ４０は、ＰＮＡであり、捕捉プローブ４４としては、ＰＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１１１】
（５．２．３ 接触）
本発明の方法の成功は、ハイブリダイゼーションを実施する能力もしくはハイブリダイゼーション条件を操作する能力、反応速度論を利用する能力および／またはＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の間でのヘテロ二重鎖の一方の鎖が競合オリゴ（例えば、ＰＮＡ）であるヘテロ二重鎖と比較した場合の熱安定性の違いにかかってる。前に議論したように、ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖の熱力学的安定性は、ある範囲のイオン強度にわたる対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の熱力学的安定性よりも、広範囲のイオン強度にわたって、有意に高いことが発見されている（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８を参照のこと）。さらに、低イオン強度条件下では、例えば、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖形成の反応速度は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖形成の反応速度よりも顕著に速い。より迅速なＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖形成の反応速度は、長さに依存しない。従って、長さの結果として、生じたＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、生じたヘテロ二重鎖よりも熱安定性である場合においてさえも、ヘテロ二重鎖の形成は、二重鎖の形成より迅速に生じる。反応速度におけるこの違いは、再アニールを生じた標的二重鎖が、速度論的に支持されるヘテロ二重鎖より、熱力学的に安定であるような状況でさえ、競合オリゴが解離した標的鎖に再アニールまたは再会合するような競合を反応速度論的に排除する（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）ことを可能にする。従って、本発明の方法に基づいて、接触時間、温度およびイオン強度の組み合わせを、標的鎖の解離およびヘテロ二重鎖の形成を支持するように選択する。これらの条件が達成される場合、このアッセイ溶液は、標的鎖：競合オリゴへテロ二重鎖を優先的に含み、そして標的鎖を解離し、標的鎖のいずれかの容易かつ効率的な単離を可能にする。
【０１１２】
当業者は、時間、温度およびイオン強度の選択が種々の因子（とりわけ、標的鎖：競合オリゴへテロ二重鎖のＣ＋Ｇ構成、標的核酸および競合オリゴのそれぞれの濃度（すなわちモル比）ならびに溶液のｐＨが挙げられる）に依存することを理解する。さらに、複数の二重鎖標的核酸から、標的鎖に完全に相補的でない競合オリゴを用いて鎖を単離する場合、所望される特異性の程度は、時間、温度およびイオン強度の選択に影響する。
【０１１３】
ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖ならびにＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の相対的な安定性は、Ｔｍに例証されるように、塩濃度に非常に依存する。一般に、ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖は、約５０ｍＭ ＮａＣｌ未満のイオン強度において、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも有意に安定である。典型的に、イオン強度が弱いほど、観察される安定性はより大きく異なる。ヘテロ二重鎖形成はまた、反応速度的に支持される。例えば、相対的に長いＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖（例えば、１００ｂｐ以上）が典型的に、任意のほとんどの塩濃度で、短いＤＮＡ／ＰＮＡヘテロ二重鎖（例えば、１０〜２０ｂｐ）より安定である場合でも、前者のＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、低イオン強度条件で非常にゆっくりと形成する。対照的に、後者のＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖は，非常にすばやく形成する。従って、一旦標的核酸鎖が解離すると、低イオン強度の条件下で、競合オリゴと相補的標的鎖との間でのへテロ二重鎖の形成は、標的鎖の再アニールまたは再会合を反応速度論的に競合から排除する。従って、選択される温度およびイオン強度に関わりなく、生じたヘテロ二重鎖は、再アニールまたは再会合した標的二重鎖より、熱力学的に不安定（Ｔｍにより測定されるように）である場合（例えば、ヘテロ二重鎖が二重鎖より有意に短い（例えば、１／８〜１／２）場合（ｂｐで測定されるように））、この接触時間は、平衡に達してからのハイブリダイゼーションを防止するため十分に短くあるべきである。ヘテロ二重鎖の熱力学的安定性（Ｔｍにより測定されるように）が、再アニールした標的二重鎖の熱力学的安定性におよそ等しいかまたはそれより大きい場合、この接触時間は、ハイブリダイゼーションが平衡に達するのを可能にするのに十分長くあり得る。しかし、この場合においてさえ、平衡状態を避けることが、ヘテロ二重鎖形成のより速い反応速度を最大に利用するので、平衡に達するのを避けるのに十分短い接触時間を用いることが可能であり、このことにより所望の標的鎖の高効率の回収を可能にする。一般に、生じたヘテロ二重鎖および再アニールした標的二重鎖の長さ、数時間から１０時間（好ましくはおよそ１〜２時間程度）といった接触時間に関わりなく、平衡状態は避けられるべきであり、従って、標的鎖の効率的な回収が可能になる。
【０１１４】
上記に議論したように、所定の温度に対し、低イオン強度条件下において、ヘテロ二重鎖の安定性は、対応する二重鎖の安定性より顕著に高い。従って、接触する工程は好ましくは、低いかまたは極度に低いイオン強度条件下で、実施される。一価のカチオンを有する塩（例えば、ＮａＣｌおよびＫＣｌ）については、１０ｍＭ以下程度のカチオン強度が好ましい。二価のカチオンを有する塩（例えば、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２など）については、１ｍＭ以下程度のカチオン強度が好ましい。三価の塩については、１００μＭ以下程度のカチオン強度が好ましい。
【０１１５】
接触する工程の間、当該分野で公知の塩および他の試薬もまた、ヘテロ二重鎖形成を速度論的に促進するため、および／または特定の二重鎖の熱融解温度の配列依存性を減らすため（例えば、スペルミン、ＴＭＡＣ、ＤＴＡＢ、ＣＴＡＢ、ＴＭＡＢ）に使用され得る。このような試薬を用いる場合、緩衝液の総カチオン強度は、好ましくは５０ｍＭを超えないべきであり、そしてより好ましくは、１０ｍＭを超えないべきである。
【０１１６】
この緩衝液は、核酸ハイブリダイゼーションの分野で一般に用いられる他の試薬（例えば、ｐＨ緩衝化剤、ホルムアルデヒドなどの変性剤などおよび他の試薬）を含み得る。適切な緩衝化剤、ｐＨ範囲および変性剤は、例えば、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８９）に記載される。典型的に、接触させる工程は、ｐＨ６〜８の範囲にあるｐＨで実施され、変性剤は使用されない。
【０１１７】
当業者に理解されるように、接触を実施する工程での温度は、部分的に、緩衝液のイオン強度に依存する。ヘテロ二重鎖および二重鎖形成の異なる反応速度により、このような温度の選択は、成功のために必要とされないが、理想的には、選択される温度は、ヘテロ二重鎖が再アニールした標的二重鎖より熱力学的に安定である温度である。好ましくは、イオン強度は、室温または約２０℃と約４０℃の間で接触を可能にするよう選択される。しかし、意図する結果を生じるようするために、他の温度が使用され得る。
【０１１８】
温度は、接触させる工程の間一定に保たれ得るか、典型的にはサーモサイクラー（ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ）（例えば、ＰＣＲ反応において通常用いられる型のサーモサイクラー）を用いて、循環し得る。好都合な循環温度は、標的核酸のＴｍより上で（選択されたイオン強度において）、標的鎖：競合オリゴへテロ二重鎖のＴｍより下の第１の温度およびヘテロ二重鎖のＴｍより上である第２の温度を含む。温度が循環される速度は、急またはゆっくりであり得、典型的にはＰＣＲに用いられる速度に類似する。使用され得る代替的な循環温度および循環速度は、当業者に明白である。
【０１１９】
特定の標的核酸および競合オリゴに対する二重鎖標的のうち一方の鎖の単離を可能にするための時間、イオン強度および温度の適切な組み合わせを選択する能力は、当業者の能力の範囲内である。例えば、標的核酸および所望の競合オリゴを含むモデル化ヘテロ二重鎖の熱融解温度（Ｔｍ）は、種々の異なるイオン強度、およびこれらから選択される温度とイオン強度の組み合わせにおいて得られ得る。温度とイオン強度の組み合わせは、標的核酸とモデル化ヘテロ二重鎖との間の安定性における違いを最大にするよう（すなわちモデル化ヘテロ二重鎖と標的核酸のそれぞれのＴｍ間の違いが最大になる温度とイオン強度）選択され得る。あるいは、特定の温度（例えば、室温）が必要な場合、適切なイオン強度が選択され得る。一旦特定の温度とイオン強度が選択されると、最適な接触時間が経験的に決定され得る。
【０１２０】
モデル化ヘテロ二重鎖を操作して、理想的には、所望の鎖分離アッセイおよび／または標的核酸を示し得る。例えば、単離すべき鎖がＤＮＡである場合、モデル化ヘテロ二重鎖は、ＤＮＡオリゴ：競合オリゴへテロ二重鎖であり得る。このオリゴは、特定の系に依存して、競合オリゴと同じ長さであるか、より長いか、またはより短くあり得る。モデル化ヘテロ二重鎖の配列構成を操作して、特定の鎖分離アッセイに対して必要である相補性の程度を示し得る。
【０１２１】
本発明の方法は、二重鎖標的核酸が相補的オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログとハイブリダイズして、Ｄ−ループまたは標的ならびにオリゴの第１鎖および第２鎖を含む他の構造を形成することにおける方法と異なる。アッセイのパラメータ（例えば、競合オリゴおよびイオン強度、温度およびアッセイの接触時間）を操作する長所により、標的の他の鎖がない競合オリゴと標的鎖との間のヘテロ二重鎖が形成される。しかし、当業者は、標的鎖の全ての分子の競合的解離が有用な結果を達成するのに必要ではないことを理解する。全ての必要なことは、サンプル中に存在する標的分子の画分が、完全に分離し、生物分子標的鎖：競合オリゴへテロ二重鎖が形成されることである。一旦形成されると、ヘテロ二重鎖および／または解離した標的鎖は、標的鎖の再アニーリング前に捕捉される。従って、本明細書で用いられる場合、表現「標的の解離」および他の等価な表現は、有用な結果を提供する標的の解離の程度を示すことを意図する。
【０１２２】
二重鎖核酸を侵害する競合オリゴ（例えば、ＰＮＡ）の能力の一部に起因して、競合オリゴの濃度は、解離の効率を規定する手段として用いられ得る。任意の特定の操作理論に束縛されることを意図しないが、侵害する競合オリゴは、標的核酸を不安定化し、その解離を支援する。侵害の反応は、複数の分子のプロセスであるので、これは濃度依存的である。しかし、使用される標的核酸および競合オリゴの実際の濃度は、成功に重要でなく、標的核酸および／または競合オリゴのいずれかについて、ｐＭのような低い濃度かまたはより低い濃度からｍＭまたはより高い濃度の範囲が使用され得る。競合オリゴ：標的核酸分子の比が、より重要である。競合物：標的Ｄ−ループの形成は、二分子プロセスなので、競合オリゴ：標的核酸の１より大きいモル比を用いて、標的解離およびヘテロ二重鎖形成の達成される効率を操作することを支援し得る。典型的には、１：１〜５０：１の範囲の競合オリゴ：標的分子濃度の比が使用され、好ましくは、１：１〜１０：１の範囲の比が使用される。
【０１２３】
標的鎖は、種々の異なる実施形態において、本発明に従う二重鎖標的核酸から単離され得る。図４に示されるように、二重鎖標的核酸３は、標的３を第１鎖および第２鎖（１および２）に最初に解離することなく、競合オリゴ４と接触され得る。１つの実施形態において、使用される接触条件は、二重鎖標的３が安定である（すなわち、解離する傾向にない）ことである。例えば、標的３は、生理学的ｐＨ、温度およびイオン強度の条件下で競合オリゴ４と接触され得る。次いで、この実施形態の１つのバージョンにおいて、この条件は、例えば、低イオン強度に対する透析により、前述のように、二重鎖標的核酸３の第１鎖および第２鎖（１および２）への解離および競合オリゴ４の第１鎖１へのハイブリダイゼーションを同時に支援する条件に変えられる。これらの変更された条件は、図４にΔ１として例示される。このような条件を選択する方法が記載される（前出）。
【０１２４】
この実施形態の別のバージョンにおいて、条件は、標的核酸の解離を促進または支持するが、競合オリゴ４の第１鎖１へのハイブリダイゼーションを支持しない条件にまず変えられる（図４においてΔ２ａとして例示される）。例示的条件Δ２ａは、例えば、ヘテロ二重鎖５のＴｍより上の温度を含む。次いで、競合オリゴ４の第１鎖１へのハイブリダイゼーションは、前述のように、標的の解離および第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５の形成を支持するようなさらなる条件の変更によって達成される（図４において、Δ２ｂとして例示される）。
【０１２５】
図５に示すように、別の実施形態において、二重鎖標的核酸はまず、第１鎖および第２鎖（１および２）に、それぞれ競合オリゴ４に接触する前に、解離するかまたは変性する。この実施形態の１つのバージョンにおいて、変性条件は、第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５の形成を同時に促進する条件である（Δ３で例示される）。この実施形態において、この条件は、競合オリゴ４との接触後のさらなる調整を必要としない。この実施形態の別のバージョンにおいて、変性条件は、第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖の形成を促進しない（Δ４で例示される）。例えば、標的核酸３は、煮沸により変性した後、急速に冷却（例えば、氷浴または他の従来の方法による）され得る。この実施形態において、次いで変性条件は、接触工程後に変更されて、第１鎖：競合オリゴ５へテロ二重鎖の形成を促進する（Δ５として例示）。これらの代替的実施形態に従う方法を実施するのに有用な条件は、上に記載される。図５に例示される実施形態を用いる条件は、当業者の能力の範囲内である。図１に示されるように、様式に関わらず、二重鎖標的３の解離および第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５の形成に続いて、標的のうち一方の鎖が単離され得る。ハイブリダイズしていない解離した第２鎖２または第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５のいずれかが回収され得る。このへテロ二重鎖５が回収される場合、これは解離され得て、これらから第１鎖１が単離される。
【０１２６】
第２鎖２およびへテロ二重鎖５は、実質的に任意の標準的技術を用いて、互いから単離され得る。例えば、解離した第２鎖２およびへテロ二重鎖５は、ゲル電気泳動と用いて互いから単離され得る（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０−１４６７５を参照のこと）。非変性条件下で、第２鎖２およびへテロ二重鎖５は、それぞれ別々の群として移動し、標準的技術を用いて（例えば、エチジウムブロマイドを用いて）検出され得る。代替的にへテロ二重鎖５は、ゲルマトリックス中を、解離した鎖２よりゆっくりと移動する。いずれかの分子群は、他のものから、それぞれのバンドの切り取りおよび当該分野で周知の技術を用いたゲルから溶出により単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。
【０１２７】
好ましくは、競合オリゴは、前述のように、捕捉部分（例えば、固体支持体、結合分子（例えば、ビオチン）または捕捉配列）に結合されるか、またはこれらを含むよう改変される（例えば、図６〜８を参照のこと）。この場合、第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５の捕捉は、捕捉部分を利用して達成される。この捕捉条件は、捕捉部分の性質に依存し、当業者にとって明白である。第１鎖は、前述のように、ヘテロ二重鎖から解離および単離され得るか、あるいは、解離された第２鎖が回収され得、さらなる精製をせずに使用され得る。
【０１２８】
（５．２．４ ハイブリダイゼーションの検出）
捕捉および最適な洗浄の後、第１鎖と競合オリゴとの間のハイブリダイゼーションの存在または不在は、必要に応じて決定され得る。検出様式は、第１鎖がレポーター分子を有するか否かに依存し、もし有するならレポーター分子の型に依存する。例えば、第１鎖が放射性同位元素標識を有する場合、捕捉される複合体は、放射活性により検出され得；第１鎖が発色蛍光団標識を有する場合、捕捉される複合体は、蛍光によって分析され得；第１鎖がビオチン標識を保有する場合、捕捉される複合体は、標識された（例えば、蛍光で標識された）アビジンまたはストレプトアビジンを結合する能力についてアッセイされ得る。当業者は、実質的に任意のレポーター基および検出の仕組みが本発明の使用について容易に適用され得ることを理解する。多くの場合、レポーター基の量が決定され得、それによって、サンプルから単離された第１鎖の量を決定し得る。
【０１２９】
（５．２．５ 使用）
本発明の方法は、二重鎖標的核酸の一方の鎖の単離が必要な場合、実質的に任意の適用において使用され得る。これらの能力により、簡便で効率的な回収が提供され、本明細書に記載される方法は、有利に使用されて、第１鎖を二重鎖標的核酸から精製し、この二重鎖標的核酸は、続けての使用のために高い収量の関連する配列または関連しない配列のプールに由来する、ＰＣＲ増幅産物である。
【０１３０】
本発明の方法はまた、二重鎖標的核酸の第１鎖の、生物学的サンプルまたは高分子混入物を含む他のサンプルからの捕捉および／または回収を可能にする。一旦捕捉されると、第１鎖は、ＰＣＲ、配列決定または他の適用に直接使用され得る。あるいは、第２鎖が精製され得て、続いての適用に使用され得る。
【０１３１】
従って、当業者に理解されるように、本発明の方法により単離された標的核酸は、一本鎖核酸を必要とする任意の適用（例えば、一塩基多型、Ｓａｎｇｅｒ型または他の核酸の配列決定法など）において有利に使用され得る。
【０１３２】
本発明の種々の実施形態が記載してきた。この記載は、本発明の例示を企図し、限定ではない。実際、当業者にとって、改変が、本発明の精神または添付される上記の特許請求の範囲の範囲を逸脱せずに、記載される本発明の種々の実施形態に対してなされ得ることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一般的の方法を例示を提供する。
【図２】図２は、競合オリゴが、２つの連続した核酸塩基を含み、その一つが第一の標的テイル配列に相補的であり、そして他方が、第二の標的テイル配列に相補的であり、これらは、お互いにスペーサーを介して結合されている本発明の実施形態を例示する。
【図３】図３は、競合オリゴがリンカーおよび２つの核酸塩基配列を含み、その一つが第一の標的テイル配列に相補的であり、そして他方が第二の標的テイル配列に相補的である本発明の実施形態を例示する。
【図４】図４は、本発明の接触工程が、解離工程と同時、またはその前に実施される、本発明の実施形態を例示する。
【図５】図５は、本発明の接触工程が、解離工程に続く、本発明の実施形態を例示する。
【図６】図６は、競合オリゴが固相支持体捕捉部分を含む本発明の実施形態を例示する。
【図７】図７は、競合オリゴがビオチン捕捉部分を含む本発明の実施形態を例示する。
【図８】図８は、競合オリゴが捕捉配列捕捉部位を含む本発明の実施形態を例示する。
【図９】図９は、スペーサー部位を含む競合オリゴを合成するための例示的なスキームを例示する。
（１．発明の分野）
本発明は、二本鎖核酸の一方の鎖を単離するための組成物および方法に関する。
【０００２】
（２．背景）
分子生物学の分野の多くの技術が、標的核酸を、この標的核酸を分析、捕捉、単離および／または検出するために、支持体結合しているかまたは溶液相の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる工程を含む。このような技術は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定（例えば、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７；Ａｎｓｏｒｇｅら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５９３−４６０２；Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２３９９−２４１２；Ｓｍｉｔｈら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：６７４−６７９；Ｐｒｏｂｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：３３６−３４１を参照のこと）（ここで、標識されたプライマーまたは未標識のプライマーが、標的の一方の鎖にアニールし、そして２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチドターミネーターの存在下で酵素的に伸長される（Ｃａｒｒｉｌｈｏ、２０００、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：５５−６５およびＫｈｅｔｅｒｐａｌ＆Ｍａｔｈｉｅｓ、１９９９、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：３１Ａ−３７Ａもまた参照のこと））から、アレイベースの遺伝子発現、遺伝子型決定、遺伝子マッピングおよび核酸配列決定アッセイ（例えば、米国特許第５，２０２，２３１号、同第５，６９５，９４０号および同第５，５２５，４６４号、ＷＯ９５／０９２４８、Ｋｈｒａｐｋｏら、１９９１、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ １：３７５−３８８；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、１９９２、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：１００８−１０１７；Ｐｅａｓｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５０２２−５０２６を参照のこと；当該分野において一般に使用される種々のアレイベースのアッセイの総説については、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ＆Ｆｕｒｔａｄｏ、１９９９、Ａｎａｌｙｓｔ １２４：１１３３−１１３６；Ｒｏｃｋｅｔｔ＆Ｄｉｘ、２０００、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ３０：１５５−１７７；Ｇｒａｎｊｅａｕｄら、１９９９、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２１：７８１−７９０；Ｌｉｐｓｃｕｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１（補遺１）：２０−２４；ＤｅＲｉｓｉ＆Ｉｙｅｒ、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１：７６−７９；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ、１９９８、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．２０：１１１−１２３；Ｃａｓｅ−Ｇｒｅｅｎら、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４０４−４１０；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−１７４；ｄｅ Ｓａｉｚｉｅｕら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４５−４８；およびＭａｒｓｈａｌｌ＆Ｈｏｄｇｓｏｎ、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２７−３１を参照のこと）の範囲にわたる。
【０００３】
標的核酸が一本鎖である場合、オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションは、比較的容易に生じる。しかし、標的核酸が二重鎖である場合、２つの標的鎖の再結合は、特に、これらのアッセイにおいて一般に使用される高塩のストリンジェントの条件下で、標的とオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーションと強力に競合し、そして通常は完全に競合する。
【０００４】
あいにく、標的核酸は、一本鎖形態ではほとんど入手可能でない。実際、ほとんどの標的核酸は二本鎖である。例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムフラグメントおよびｃＤＮＡは、二本鎖である。さらに、目的の特定の核酸の分析可能な量を生成するために、最も一般的に使用される増幅技術の１つである、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第二版、１９８９、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）は、二本鎖のアンプリコン（ずなわち、標的核酸）を生成する。
【０００５】
一本鎖標的核酸を生成するための現在の方法としては、二重鎖標的の一方の鎖のエンドヌクレアーゼ消化（例えば、Ｈａｎｎｏｎら、１９９３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：４２１−４２７を参照のこと）、非対称的ＰＣＲ増幅（例えば、ＳｔｕｒｚｌおよびＲｏｔｈ、１９９０、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１６４−１６９を参照のこと）、Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する二本鎖ＰＣＲアンプリコンのインビトロ転写による、一本鎖ＲＮＡ標的の生成（例えば、ＹａｎｇおよびＭｅｌｅｒａ、１９９２、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：９２２−９２７を参照のこと）およびＭ１３を用いるクローニング（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）が挙げられる。これらの方法の各々は、その一般的な適用可能性を制限する、そして／またはアッセイの時間および経費を有意に増大させるかのいずれかである有意な欠点を有する。
【０００６】
従って、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイーゼションを含むアッセイ（例えば、Ｓａｎｇｅｒ型配列決定反応、ならびにアレイベースのマッピング、遺伝子型決定、発現および配列決定適用）のために、二本鎖標的核酸の一方の鎖を生成および単離する単純な方法についての必要性が、当該分野に存在したままである。
【０００７】
（３．発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、二本鎖標的核酸の一方の鎖を捕捉または単離するための方法を提供する。この方法は、一部、イオン強度の異なる条件下での核酸二重鎖の形成の熱力学的安定性および／または動力学が、二重鎖の鎖を含むヌクレオシド内結合の性質に依存するという観察に基づく。例えば、天然の二本鎖ＤＮＡの存在ならびにＤＮＡおよびＲＮＡが生理学的な条件下でホモ二重鎖およびハイブリッド二重鎖を形成する能力によって示されるように、類似した電荷のヌクレオチド内結合を有する一本鎖核酸（例えば、負に荷電した糖リン酸ジエステル結合を有するＤＮＡおよびＲＮＡ）間に形成される二重鎖は、生理学的なイオン強度（約１００ｍＭ ＮａＣｌ）、温度（約３７℃）およびｐＨ（約ｐＨ７．２）の条件下で比較的安定である。しかし、低イオン強度（約１０ｍＭ以下のＮａＣｌ）の条件下で、このようなＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡの二重鎖は、解離する傾向がある（例えば、Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８を参照のこと）。任意の特定の理論によって束縛されることを意図しないが、低イオン強度の条件で観察される解離は、負に荷電した糖リン酸ジエステル核酸塩基内結合によって引き起こされる、鎖内の静電的反発力に起因すると考えられる。
【０００８】
対照的に、二重鎖の一方の鎖が、従来のＤＮＡまたはＲＮＡであり、かつ他方の鎖が、正味の非荷電骨格または正味の正に荷電した骨格を有する核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ）であるヘテロ二重鎖は、低イオン強度の条件（例えば、同上を参照のこと）で、非常に安定である。実際、約０ｍＭと１０ｍＭとの間のＮａＣｌ濃度で、そして５００ｍＭの高さの濃度でさえ、このようなヘテロ二重鎖は、その対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡの二重鎖（同上）よりも有意に安定である。
【０００９】
さらに、これらのヘテロ二重鎖の形成は、低イオン強度の同じ条件下で、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡの二重鎖の形成よりも動力学的に有利である。動力学におけるこれらの観察された差異は、ヘテロ二重鎖の長さとは無関係である。例えば、比較的長いＤＮＡ／ＤＮＡ標的二重鎖（例えば、１００ｂｐ以上）は、代表的に、実質的にいかなるイオン強度でも、短いＰＮＡ／ＤＮＡへテロ二重鎖（例えば、２０ｂｐ以下）よりも熱力学的に安定であるが、このＤＮＡ／ＤＮＡ標的二重鎖が解離し、かつ低イオン強度（例えば、１０ｍＭ ＮａＣｌ未満）の条件下で、短い相補的ＰＮＡと同等に接触している場合、このＰＮＡ／ＤＮＡへテロ二重鎖の形成は、ＤＮＡ標的鎖の再アニーリングまたは再結合よりも、動力学的に有利である。この系は平衡にまでもたらされるだけなので、ＰＮＡは、相補的ＤＮＡ標的鎖によって置換される。
【００１０】
本発明の方法は、容易かつ効果的に二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離するために、これらの観察された動力学的および熱力学的安定性の差異を利用する。一般に、本方法は、二本鎖標的核酸を、二本鎖標的の一方の鎖にハイブリダイズし得る一本鎖の競合オリゴヌクレオチド（「競合オリゴ」）と接触させる工程を包含する。この競合オリゴは、負に荷電した核酸塩基内結合（例えば、ネイティブな糖リン酸ジエステル）、正に荷電した核酸塩基内結合（例えば、糖グリコシルまたは正のアミド）および／または非荷電の核酸塩基内結合（例えば、中性アミドまたはモルホリノホスホラミデート）の組み合わせを含む核酸アナログであり、その結果、この競合オリゴは、所望の使用ｐＨおよび使用温度（代表的には、ｐＨ６〜９および２０〜４０℃）で、正味の正の電荷または正味の中性の電荷を有する。好ましくは、この競合オリゴは、非荷電の核酸塩基内結合から完全に構成され、必要に応じて３〜４個の正の内結合を含む。競合オリゴの核酸塩基配列は、二本鎖標的の一方の鎖の一部に対して少なくとも部分的に相補的であり、その結果、この競合オリゴは、その相補的標的鎖にハイブリダイズし得る。
【００１１】
標的核酸は、標的鎖が互いに解離し、かつ競合オリゴがその相補的標的鎖にハイブリダイズして、標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖および解離した標的鎖を形成する傾向がある条件下で、この競合オリゴと接触させられる。次いで、二本鎖標的の所望の鎖は、標準的な単離技術および／または捕捉技術を使用して、解離した標的鎖またはヘテロ二重鎖のいずれかを単離することによって、簡便に回収され得る。
【００１２】
この系がヘテロ二重鎖および／または解離した鎖を単離する前に平衡に達することが可能であるか否かは、代表的には、二本鎖標的および標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の、そのアッセイ条件下での熱力学的安定性に依存し、続いて、この熱力学的安定性は、それぞれの標的二重鎖およびへテロ二重鎖の相対的な核酸塩基長に依存する。一般に、（熱融解温度すなわちＴｍによって示されるような）標的二重鎖の熱力学的安定性が、ヘテロ二重鎖の熱力学的安定性よりも有意に高い場合、この系は、平衡に達することが不可能であるはずである。この熱力学的安定性が逆である場合、またはこれらがほぼ等しい場合、この系は、平衡に達することが可能であり得る。例えば、この競合オリゴが標的核酸の長さと（核酸塩基単位で）ほぼ等しい長さのものである場合、このヘテロ二重鎖は、代表的には、再結合または再アニールした標的よりも熱力学的に安定であるので、この系は、所望の標的鎖を単離する前に平衡に達することが可能であり得る。しかし、再結合または再アニールした標的が、ヘテロ二重鎖よりも熱力学的に安定である例において（例えば、競合オリゴが標的よりも有意に短い場合）、標的核酸の所望の鎖は、この系が平衡に達する前に単離されるべきである。
【００１３】
二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離する方法は、種々の代替の様式で実行され得る。１つの実施形態において、この二本鎖標的は、二本鎖標的が安定である（すなわち、標的の鎖が容易に解離しない）条件下で競合オリゴと接触させられる。接触後、次いで、この混合物の条件は、標的鎖の解離および競合オリゴとその相補的標的鎖との間のハイブリダイゼーションを促進するように変更される。
【００１４】
この条件は、一工程で変更され得るか、あるいは２つ以上の工程で変更され得る。一工程が使用される場合、新しい条件は、標的鎖の解離および標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の形成に同時に有利であるべきである。二工程のプロセスが使用される場合、これらの条件は、最初に標的鎖の解離を促進するように変更され、その後、標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の形成を促進するように再び変更される。
【００１５】
これらの条件はまた、循環され得る。例えば、接触後、サンプルの温度は、２以上の異なる温度の間を循環され得る。１つの簡便な実施形態において、接触後、サンプルの温度は、二本鎖標的の熱融解温度（Ｔｍ）を上回り、かつヘテロ二重鎖のＴｍを下回る温度まで上昇され得る。次いで、サンプルの温度は、この温度とヘテロ二重鎖のＴｍを上回る第二の温度との間で循環され得る。ヘテロ二重鎖形成のより速い動力学を利用する循環時間を選択することによって、温度循環を使用して、二本鎖標的の解離およびヘテロ二重鎖の効率的な形成を駆動し得る。
【００１６】
別の実施形態において、二本鎖標的核酸の鎖は、競合オリゴとの接触の前に解離される。二重鎖標的を解離するために使用される条件（「変性条件」）は、標的解離および標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖形成に同時に有利であり得、それによって、条件のさらなる変更についての必要性を排除する。あるいは、標的鎖：競合オリゴ二重鎖形成を好みも促進もしない変性条件が使用され得、そしてこの条件は、ヘテロ二重鎖形成を促進するために、接触後に変更される。温度循環は、以前に記載されたように、効率的なヘテロ二重鎖形成を駆動するために使用され得る。
【００１７】
二本鎖標的を解離し、そして標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖を形成するために使用される方法に関わらず、解離した標的鎖およびへテロ二重鎖は、互いに分離され得、そして所望の標的鎖は、引き続く使用のために回収される。
【００１８】
解離した標的鎖および標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖は、実質的に任意の技術を使用して互いに分離され得る。例えば、解離した鎖およびヘテロ二重鎖は、ゲル電気泳動によって分離され得、それぞれのバンドの一方または両方がゲルから切り出され、そして核酸が切り出されたバンドから溶出される。あるいは、解離した標的鎖およびヘテロ二重鎖は、捕捉によって互いに分離され得る。捕捉によって分離される場合、所望の標的鎖または所望でない標的鎖のいずれかが、捕捉され得る。所望の標的鎖が捕捉される場合、これは、引き続く使用のために解離および回収され得る。所望でない標的鎖を捕捉することは、所望の標的鎖を残し、この所望の標的鎖は、引き続く使用のために、さらなる精製を伴うかまたは伴わないかのいずれかで回収され得る。
【００１９】
１つの実施形態において、解離した標的鎖は、捕捉部分（例えば、ビオチン、固体支持体または捕捉配列）を含む相補的オリゴヌクレオチド捕捉プローブにハイブリダイズし得、そしてハイブリダイズした複合体は捕捉部分によって単離される。好ましくは、この相補的捕捉プローブはまた、正味の正の電荷または正味の中性の電荷を有する核酸塩基内結合を含み、その結果、解離した標的鎖は、標的鎖の再結合も再アニーリングも促進しない条件下で捕捉され得る。捕捉後、この複合体は解離され得、そしてこの標的鎖はこの複合体から単離され得る。
【００２０】
あるいは、この標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖は、捕捉によって単離される。一つの簡便な実施形態において、競合オリゴヘテロ二重鎖は、捕捉部分（例えば、ビオチン、捕捉配列または固相支持体）を含み、そして、このヘテロ二重鎖は、捕捉部分によって解離した標的鎖から単離される。例えば、競合オリゴが、ビオチン捕捉部分を含む場合、このヘテロ二重鎖は、このサンプルを固定化したストレプトアビジンに接触させることによって、例えば、このサンプルをストレプトアビジンで被覆したビーズで充填したカラムを通過させることによって、または、このサンプルをストレプトアビジンで被覆した磁性ビーズ（磁石によって取り出され得る）と接触させることによって、解離された標的鎖から単離され得る。この競合オリゴは、捕捉配列を含む場合、このヘテロ二重鎖は、解離された標的鎖から相補性捕捉プローブ（これはまた、ビオチンのような捕捉部分または固相支持体を含む）を介して単離され得る。この捕捉プローブは、ＲＮＡオリゴマーもしくはＤＮＡオリゴマーなどであり得るか、また、競合オリゴのように、この捕捉プローブは、このアッセイのｐＨおよび温度において正味で正に荷電しているか、または正味で電荷的に中性である骨格を含み得る。この競合オリゴは、固相支持体捕捉部分を含む場合、このヘテロ二重鎖は、例えば、濾過、デカントなどによって、解離された標的鎖から単離され得る。この固相支持体が磁性である場合、このヘテロ二重鎖は、磁石によって簡便に単離され得る。
【００２１】
別の実施形態において、このヘテロ二重鎖は、このヘテロ二重鎖と三重鎖を形成することが可能な捕捉プローブを使用する捕捉によって単離される。好ましくは、この三重鎖捕捉プローブは、修飾され、上述したようなビオチンまたは固相支持体のような捕捉部分を含む。１つの簡便な実施形態において、この三重鎖捕捉プローブは、ＰＮＡである（例えば、米国特許第５，９８６，０５３号；同第５，６４１，６２５号；および同第５，５３９，０８２号（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００２２】
別の局面において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。一般に、このキットは、目的の標的核酸の一つの鎖の少なくとも一部分に相補性である競合オリゴおよび二重鎖標的の解離のため、ならびに標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の形成を与えるために有用な緩衝液を含む。このキットはまた、解離された標的鎖もしくはヘテロ二重鎖のいずれか、またはその両方を単離するための捕捉プローブまたは他の手段を含み得る。この競合オリゴは、上述したような標的鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖の捕捉を容易にするための捕捉部分を使用して必要に応じて修飾され得る。あるいは、このキットは、この競合オリゴを修飾するために有用な試薬、捕捉プローブまたはその両方を捕捉部分と共にさらに含み得る。
【００２３】
本発明の方法およびキットに従って単離された標的鎖は、当該分野で周知の技術を使用してさらに操作され得る。例えば、この単離された鎖は、続くＰＣＲ増幅におけるテンプレートとして、ハイブリダイゼーションによる液相および／またはアレイに基づく配列決定、マッピング、遺伝子発現、遺伝子型決定アッセイのための標的として、またはサンガー型の配列決定反応におけるテンプレートとして使用され得る。
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、二本鎖標的核酸塩基のうちの一方の鎖の単離のための、迅速、効率的、かつ特異的な方法を提供する。このアッセイのｐＨおよび温度においてこの核酸塩基が正味で正に荷電するかまたは正味で電荷的に中性である骨格に結合する競合オリゴヌクレオチドを使用することによって、本発明は、従来のＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、およびＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に比較して核酸ヘテロ二重鎖の観察された有益な速度論的および／または熱動力学的な特性を利用して、これまでに利用可能であった方法に比べ有意な利点を提供する二本鎖標的核酸のうちの一方の鎖を単離するための方法を提供する。
【００２４】
以下でより詳細に議論されるように、正に荷電した核酸塩基内結合および／または非荷電の核酸塩基内結合を有する一本鎖核酸塩基ポリマーは、当該分野で公知である。荷電していない核酸塩基ポリマーの１つの型は、当該分野において通常、「ポリアミド核酸」または「ＰＮＡ」と呼称され、これは、中性のポリアミド骨格に連結された一連の核酸塩基を含む。一方の鎖が非荷電核酸塩基ポリマー（例えば、ＰＮＡ）であるヘテロ二重鎖核酸の形成速度論および熱力学的安定性は、両方の鎖が負の糖リン酸ジエステル核酸塩基内結合を有する（すなわち、負に荷電している）対応する二重鎖（例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖）から完全に別個のものである。大変重要なことに、ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡのヘテロ二重鎖は、広範な緩衝液条件にわたって、これらに対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも有意に熱安定性である（Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８）。さらに，ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖の形成は、同じ範囲の緩衝条件において速度論的に好ましい。低イオン強度（例えば、１０ｍＭ以下のＮａＣｌ）の条件下で、形成の好ましい速度論は、（Ｔｍで測定されるような）熱力学的な安定性に依存しない。例えば、いくつかの例において、この標的核酸二重鎖は、実質的に全てのイオン強度で特定のヘテロ二重鎖より熱安定性である（例えば、長い１００ｂｐの標的二重鎖 対 短い２０ｂｐのヘテロ二重鎖）。この例においてでさえ、低イオン強度の条件下で、ヘテロ二重鎖の形成は、より熱安定性の二重鎖の形成よりも速度論的に好ましい。従って、１００ｂｐの解離された標的が、低イオン強度条件下で２０核酸塩基の相補性ＰＮＡと接触される場合、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖形成は、標的鎖の再アニーリングまたは再会合よりも速度論的に好ましい。
【００２５】
操作の特定の理論のいずれかによって拘束されることが意図しないが、ＰＮＡ骨格は非荷電であるので上で議論されたＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖の観察される好ましい速度論的および／または熱力学的な特性は、このヘテロ二重鎖の２つの鎖の間におけるホスホジエステルの静電的な反発がないことに部分的に起因すると考えられる。この理論は、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖および対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖が、１Ｍ ＮａＣｌを超えるイオン強度においてほぼ等しい熱安定性を有していることを示す実験によって支持される（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３，前出）。
【００２６】
ヘテロ二重鎖とこの対応する二重鎖との間の観察された速度論的および／または熱安定性的な差異は、極度に低いイオン強度から低いイオン強度の条件において、最も明白である。例えば、１０ｍＭ ＮａＣｌにおいて、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖ドデカマーの熱融解温度（Ｔｍ）は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＴｍよりも３０℃を超えて高いことが見出された。しかし、これらの差異は、中程度のイオン強度においてでさえ、観察される。例えば、１００ｍＭ ＮａＣｌにおいても、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖ドデカマーは、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも有意に高い（おおよそ２０℃高い）のＴｍを有する（Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３，前出）。
【００２７】
ＰＮＡはまた、核酸塩基の相補性配列を含む二本鎖ＤＮＡを侵害する能力を有する（例えば、Ｎｉｅｌｓｏｎら，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１９７−２００；Ｐｅｆｆｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０６４８−１０６５２；Ｃｈｅｒｎｙら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１６６７−１６７０を参照のこと）。このＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対を介して相補鎖にハイブリダイズするが、他方の鎖は置換される。二本鎖ＤＮＡは、ＰＮＡの相補性部分よりも実質的に長い場合、この置換された鎖は、Ｄ−ループを形成し得る（同書参照のこと）。従って、二本鎖標的が安定である生理学的条件においてでさえ、ＰＮＡは、これらの相補鎖にハイブリダイズする傾向がある。
【００２８】
以下により詳細に議論されるように、本出願人らは、相補的な二本鎖核酸に侵入するＰＮＡの傾向ならびにＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖とＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖およびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖との間に観察された速度論的および／または熱安定的な差異を調べて、標的核酸の二本鎖のうちの一本鎖を効率的、迅速、かつ容易に単離し得ることを発見した。
【００２９】
一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡと安定な二重鎖を形成するか、またはＤＮＡと安定な三重鎖を形成するＰＮＡの能力は、一本鎖核酸または二本鎖核酸の精製についての数多くの用途において調べられた。例えば、ポリヒスチジンテイルに連結されたＰＮＡを使用して、一本鎖メッセンジャーＲＮＡをニッケルカラム上で精製し得た（Ｏｒｕｍら，１９９５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４７２−４８０を参照のこと）。この方法において、インビトロで転写された一本鎖のｍＲＮＡを、２Ｍの尿素、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（登録商標）を含有する緩衝液中でＲＮＡ−ポリヒスチジン結合体に接触させ、そしてこのｍＲＮＡ−ＰＮＡ−ポリヒスチジン複合体を、サンプルをニッケルカラムを通過させることによって捕捉した。
【００３０】
二本鎖ヒトゲノムＤＮＡを、ビオチン標識ＰＮＡを使用して生物学的なサンプルから精製した（Ｓｅｅｇｅｒら，１９９７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：５１２−５１７；Ｂｏｆｆａら．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１９０１−１９０５を参照のこと）。例えば、転写的に活性である二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントは、Ｄ−ループを形成するための核酸塩基配列（ＣＴＧ）７を含むＰＮＡの侵入およびハイブリダイゼーションによって単離された（Ｂｏｆｆａら，前出を参照のこと）。別の実施形態において、二本鎖ゲノムＤＮＡは、Ｔ７配列を含むビオチン標識ＰＮＡとハイブリダイゼーションすることによってヒト血液から単離された（Ｓｅｅｇｅｒら，前出）。この標識されたＰＮＡは、二本鎖のゲノムＤＮＡ中のＡ７配列と高い親和性の三重鎖を形成した。両方の例において、ＰＮＡ上のビオチン標識を使用して、ストレプトアビジン被覆した磁性ビーズ上でＤ−ループまたは三重鎖ハイブリッドを捕捉した。
【００３１】
ＰＮＡ核酸ハイブリダイゼーションを使用する一塩基変異を検出するための技術もまた、記載される（Ｉｇｌｏｉ，１９９９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７９８−８０８； Ｉｇｌｏｉ，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８５６２−８５６７を参照のこと）。例えば、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的なＰＮＡを、重合に先だってネイティブのポリアクリルアミドゲル溶液に添加した。相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドがゲル上で泳動された場合、これは、ゲルマトリクスに固定された（非荷電であるために、移動しない）ＰＮＡ分子にハイブリダイズした。このＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドの移動は、ハイブリダイズしない、非相補的なコントロールＤＮＡオリゴヌクレオチドの移動に比べて遅かった。他の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合もまた、このゲル上で泳動した。これらのオリゴヌクレオチドの各々は、ＰＮＡと単一塩基のミスマッチを含んだ。このゲルの泳動温度を調節することによって、このＰＮＡが、完全な相補性オリゴヌクレオチドのみにハイブリダイズし、従ってこの完全な相補性オリゴヌクレオチドの移動を遅くすることを引き起し得る。ミスマッチしたオリゴヌクレオチドの移動は遅れず、従って、単一塩基対のミスマッチの検出を可能にする。
【００３２】
ＰＮＡをさらに使用して、ＰＣＲ反応における核酸の増幅を阻害した（例えば、米国特許第５，９７２，６１０号を参照のこと）。この方法において、サンプル中の増幅が所望されない核酸に相補的なＰＮＡは、その核酸にハイブリダイズされ、それによって効率的にその増幅をブロックする。
【００３３】
ついには、標識されたＰＮＡは、標準的なサザンハイブリダイゼーションブロットの代りに使用され、標的核酸を検出した（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０−１４６７５を参照のこと）。この方法において、標識されたＰＮＡを、変性された標的ＤＮＡに添加した。この混合物を、サイズ分離のために電気泳動システムに直接的にロードした。このＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、電気泳動の間、結合したままであった。電気泳動およびメンブレンへのブロッティング後に、この標識されたハイブリッドは、標識されたオリゴヌクレオチドをメンブレンに結合した標的ＤＮＡにハイブリダイズすることなしに、標準的な化学発光技術を使用して検出される。
【００３４】
しかし、本発明とは違って、上記の技術は、ＰＮＡ／ＤＮＡ（またはＰＮＡ／ＲＮＡ）ヘテロ二重鎖とＤＮＡ／ＤＮＡ（またはＤＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＲＮＡ）二重鎖との間の速度論および／または熱安定性の差異を活用し、二本鎖の標的核酸のうちの一方の鎖を単離することはない。
（５．１ 略語および取り決め）
特定の核酸塩基配列を含む標的核酸および競合オリゴを称するために本明細書中の全体および図面にわたる略語は、従来の１文字略記である。大文字は、標的核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（例えば、ＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列）を表し、そして小文字は、競合オリゴ配列（例えば、ＰＮＡ配列）を表す。従って、標的核酸中に含まれる場合、天然に存在するコード核酸塩基は、以下のように略記される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）。競合オリゴ配列に含まれる場合、この天然に存在するコード核酸塩基は、以下のように略記される：アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）。
【００３５】
また別段特定されない限り、一連の１文字略記として表現される標的核酸配列は、５’→３’の方向で表現される。５’末端および３’末端を有する競合オリゴ配列はまた、５’→３’の方向で表現される。アミノ末端およびカルボキシ末端を有する競合オリゴ配列（例えば、ＰＮＡ）は、カルボキシからアミノへの方向で表現される。
【００３６】
（５．２ 本発明）
二本鎖標的核酸のうちの一方の鎖を単離するための本発明に従う一般的な方法は、図１に例示される。図１を参照して、目的の二本鎖標的核酸３は、競合オリゴヌクレオチド（競合オリゴ）４と接触される。この二本鎖標的３は、第一鎖１および第二鎖２含み、そして競合オリゴ４は、第一鎖１の少なくとも一部分に相補性である。図１において、相補領域は、標的核酸の内部の配列として示されるが、後でしめされるように、この相補性領域は、一方または両方の末端の領域に存在し得る。この標的３と競合オリゴ４は、第一鎖１および第二鎖２への二本鎖標的３の解離を、第一鎖１および第二鎖２への二本鎖標的３の解離および競合オリゴ４と第一鎖１との間のハイブリダイゼーションを好む条件下で接触され、それによって、解離された第二鎖２および第一鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖５を生じる。標的３および競合オリゴ４が接触される条件は、標的鎖３の解離とヘテロ二重鎖５の形成を同時に好み得るか、またはこの条件は、第一鎖および第二鎖の解離ならびにヘテロ二重鎖５の形成を達成するための工程において修飾され得、これは、より詳細に以下で議論される。標的３は、第一鎖１および第二鎖２への二本鎖標的３の解離の前、それと同時、またはその後に、競合オリゴ４とそれぞれ接触され得る。
【００３７】
図１および本明細書中全体において、「第一鎖」および「第二鎖」という表現を使用して、二本鎖標的核酸の特定の鎖をいう。これらの表現は、完全に任意であり、そして個々の標的鎖を同定し、そして／または議論するための簡便な手段として単に使用されることが理解される。構造的、機能的、情報的または他の特徴の特性が、これらの表現によって与えられることを意図しない。例えば、二本鎖標的核酸は、遺伝子または遺伝子の部分であり、この「第一鎖」は、コード鎖または非コード鎖のいずれかであり得る。従って、「第一鎖」および「第二鎖」という表現は、二本鎖標的の二つの鎖を互いに区別することを単に容易にし、そして本発明を記載する際の補助として単独で使用され、これは、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００３８】
さらに、本明細書は、種々の異なる型の核酸二重鎖に対して言及する。本明細書中で使用される場合、「ヘテロ二重鎖」という表現は、その表現が本明細書中で定義されるように、少なくとも１つの鎖が競合オリゴである二本鎖核酸をいう。例えば、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とＰＮＡ鎖との間に形成された二重鎖（それぞれＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡ）は、本明細書中で「ヘテロ二重鎖」と称される。ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡを含む全ての他の二本鎖核酸は、「二重鎖」と呼称される。両方の鎖が、ＤＮＡであるか、または両方の鎖がＲＮＡである二重鎖は、「ホモ二重鎖」と称される。一方の鎖がＤＮＡでありかつ他方の鎖がＲＮＡである二重鎖は、「ハイブリッド二重鎖」と呼称される。以下でより詳細に議論されるように、本発明に従う二重鎖標的核酸は、「二重鎖」である。
【００３９】
（５．２．１ 二本鎖標的核酸）
この名称に含意されるように、この二本鎖標的核酸は、最小でも、鎖の間の塩基対形成相互作用を介して互いに結合する二つの鎖を含む。従って、本発明の二本鎖標的核酸は、例えば、ｔＲＮＡのような、鎖内の塩基対相互作用による二本鎖である領域を有する一本鎖核酸から区別されるべきである。この二本鎖標的は、３以上の鎖を含むか、または三本鎖である領域を含み得るが、好ましくは含まない。
【００４０】
二本鎖標的核酸は、平滑末端を有し得（例えば、鎖の各々が同じ数の核酸塩基の数を含む場合）、また、これは、一方の末端または両方の末端で一本鎖である領域を含み得る（例えば、より長い核酸から接着末端を残すエンドヌクレアーゼで切出される場合）。好ましくは、一本鎖のオーバーハングのいずれかが、全長の二本鎖標的と比較して相対的に短く、そして代表的には、１〜８ヌクレオチドの範囲である。
【００４１】
二本鎖標的核酸の各鎖は、完全にデオキシリボヌクレオチドからなり得、完全にリボヌクレオチドからなり得、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの混合物からなり得る。従って、この二本鎖標的は、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡホモ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＲＮＡ／ＲＮＡホモ二重鎖であり得る。さらに、各鎖は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含み得る。天然でのこれらの利用可能性およびＰＣＲ増幅産物の遍在性に起因して、この二本鎖標的核酸は、代表的には、二本鎖のＤＮＡ（ＤＮＡ／ＤＮＡホモ二重鎖）（例えば、単離された遺伝子または遺伝子フラグメントあるいはＰＣＲ増幅産物（「ＰＣＲアンプリコン」））である。
【００４２】
二本鎖標的の鎖は、天然に存在するコード核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ）または修飾もしくは合成された核酸塩基、あるいは、両方の組み合わせであり得る。標的核酸が構成され得る一般的に修飾されたかまたは合成された核酸塩基としては、以下が挙げられる：３−メチルウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ソロウラシル（ｔｈｏｒｏ ｕｒａｃｉｌ）、５−ヨードウラシル、６−ジメチルアミノプリン、６−メチルアミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノ−８−ブロモプリン、イノシン、５−メチルシトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシン。標的核酸が構成され得る、修飾されたかまたは合成された核酸塩基のさらなる非限定的な例は、Ｆａｓｍａｎ，ＣＲＣ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８５，３８５−３９２頁；Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ’ｓ Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（これらの全ては、このような核酸塩基の構造、特性、および調製を記載する刊行物に対する参照を提供する）に見出され得る。
【００４３】
当業者に認識されるように、上記の修飾されたかまたは合成された核酸塩基のうちの多くは、天然に存在するコード核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣならびにＵを用いて、ワトソン−クリック塩基対相互作用を形成し得る。しかし、以下でより詳細に説明されるように、本発明の特定の実施形態において、他の核酸塩基（例えば、天然に存在するコード核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧならびにＵおよび通常の修飾核酸塩基）とワトソン−クリック塩基対を形成し得ないが、互いに非標準（すなわち、非ワトソン−クリック）塩基対を形成し得る二本鎖標的合成核酸塩基を中に含むことが所望され得る。これらの特性を有する核酸塩基は、本明細書中で「非標準合成」核酸塩基と呼称される。このような非標準合成核酸塩基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イソグアニン（ｉｓｏ−Ｇ）、イソシトシン（ｉｓｏ−Ｃ）、キサンチン（Ｘ）、カッパ（ｋａｐｐａ）（Ｋ）、核酸塩基Ｈ、核酸塩基Ｊ、核酸塩基Ｍおよび核酸塩基Ｎ（米国特許第６，００１，９８３号を参照のこと）。これらの非標準合成核酸塩基は、互いに塩基対をつくり、以下の非標準塩基対を形成する：イソ−Ｃ・イソ−Ｇ、Ｋ・Ｘ、Ｈ・ＪおよびＭ・Ｎ。これらの非標準塩基対の各々は、三つの水素結合を有する。さらなる非標準合成核酸塩基およびこれらの合成のための方法、およびこれらを核酸に取り込むための方法は、米国特許第５，４３２，２７２号、同第５，９６５，３６４号および同第６，００１，９８３号（これらの開示は、本明細書中で参考として援用され得る）に見出される。
【００４４】
標的核酸の鎖の骨格は、代表的には、「ネイティブ」の糖リン酸ジエステル内結合から全体が構成されるが、これらは、１以上の修飾された分子内結合（例えば、１以上の糖ホスホロチオエート、糖ホスホロジチオエート、糖ホスホロアミデート、または他の修飾分子内結合）を含み得る。標的核酸を含み得る修飾核酸塩基内結合ならびにこれらの合成方法のさらなる例は、例えば、Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ９０（４）：５４４−５８４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１（３）：１６５−１８６に見出され得る。
【００４５】
本発明の方法が、ヘテロ二重鎖形成の速度論的利益および／または熱力学的利益を利用するとき、このアッセイのｐＨおよび温度において、二本鎖標的核酸のいずれの鎖もが、正味に正に荷電しするかまたは正味で電荷的に中性である核酸塩基内結合（すなわち、骨格）の組み合わせを含むべきでないことを理解する。一方または両方の鎖が、正味で正電荷を保持しているか、または正味に電荷的に中性である骨格を保持している標的は、本発明の方法に従って効率よく解離され、そして競合オリゴにハイブリダイズされるためには高すぎる熱的安定性を有する傾向がある。従って、二本鎖標的の鎖の各々は、１以上の正に荷電したか、または非荷電である核酸塩基内結合を含み得、これらの分子内結合を含む鎖は、このアッセイのｐＨおよび温度で正味で負の電荷を有するはずである。好ましくは、この二本鎖標的核酸の各鎖はネイティブ糖リン酸ジエステル骨格を有する。
【００４６】
二本鎖標的核酸は、人工的に構築され得るかまたは天然から単離され得る。人工的に構築された二本鎖標的核酸の非制限的な例としては、異なる供給源由来の核酸を１つの核酸（例えば、人工的に構築されたプラスミド）へスプライシングすることによって作製されるキメラ核酸、ＲＮＡ鋳型からインビトロで逆転写されたｃＤＮＡ配列、ＰＣＲまたは他の増幅技術を使用して作製されたアンプリコン、および化学的に合成された核酸が挙げられる。天然に存在する二本鎖標的核酸の非制限的な例としては、天然に存在するプラスミドまたはその一部、ゲノムＤＮＡまたはその一部、および細胞以下の細胞小器官に由来するＤＮＡが挙げられ、これらの全てが、先に単離または精製することなく、本発明の方法において使用され得るか、または、好ましくは、当該分野で公知の方法を使用して本発明を用いる使用のために単離されそして調製される。
【００４７】
二本鎖標的核酸は、実質上、数十から数百、数千、またはそれを超える長さの任意の数の塩基対であり得る。例えば、二本鎖標的核酸は、完全な遺伝子、いくつかの遺伝子、または染色体全体でさえあり得る。しかし、本発明を実行することは、サンプル中に存在する標的分子の少なくとも一部の鎖の完全な解離を必要とするので、当業者は、二本鎖標的核酸が、好ましくは、効率的な鎖の解離を可能にする十分な長さであり得ることを理解する。解離の程度および解離が達成され得る条件は、部分的に、核酸塩基組成（例えば、Ｃ＋Ｇ含有）に依存するが、本発明における使用のための標的核酸は、代表的に、約３０と２０００の間の塩基対長、好ましくは、約４０と５００の間の塩基対長、およびより好ましくは、約６０と約２００の間の塩基対長である。標的核酸分子が、例えば、遺伝子全体よりも長い場合、これは、超音波処理、剪断、およびエンドヌクレアーゼ消化のような従来の技術を使用して好ましいサイズに簡便にフラグメント化され得る。特定のフラグメントは、単離され得、そして本明細書中に記載される方法において標的として使用され得るか、またはフラグメント化産物全体は、精製することなく使用され得る。
【００４８】
標的核酸分子は、ハイブリダイゼーション後のさらなる精製または当業者に明らかであるような他の目的のために、例えば、標的と競合オリゴとの間のハイブリダイゼーションを検出するために使用され得るレポーター基またはレポーター部分を含むように改変され得る。有用なレポーター基としては、放射性同位体、非放射性同位体、光を発光する部分（例えば、発蛍光団）および化学発光する部分、光を吸収する部分（例えば、発色団）、第２のレポーター基に結合し得るリガンド（例えば、ビオチン）、比色反応を生成し得る酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ジゴキシゲニン）などが挙げられる。
【００４９】
あるいは、標的核酸は、競合オリゴとの接触を伴う解離した標的核酸の鎖の捕捉および／または単離を容易にする部分を含むように改変され得る。種々のこのような部分は、捕捉プローブを使用する本発明の実施形態と組み合わせて、上記議論され、そして例えば、ビオチンのような結合分子、固体支持体、および捕捉配列を含む。これらの部分のいずれかは、標的核酸に含まれ得る。好ましくは、標的の唯一の鎖は、このような部分を含み得るか、または各鎖は、異なる部分を含み得、その結果、異なる部分は、お互いから解離鎖を容易に分離または単離するように使用され得る。
【００５０】
このようなレポーター部分および／または捕捉部分を核酸に取り込むための方法および試薬は、このようなレポーター基を検出するための方法と同様に、当該分野で周知である。使用される実際のレポーター部分および／または捕捉部分は、もちろん、所望の用途、標的核酸の質、および当業者に明らかな他の要因に依存する。
【００５１】
二本鎖核酸の核酸塩基配列は、排他的にネイティブな配列であり得るか（すなわち、標的が得られる生物から排他的に由来する）、排他的に操作された配列であり得るか、またはネイティブ配列および操作された配列の混合物であり得る。排他的にネイティブな配列を有する標的の例としては、天然に存在する生物から単離された標的核酸などが挙げられ得る。ネイティブな配列および操作された配列の両方を含む標的配列の例としては、制限酵素部位、認識配列（例えば、ジップコード（ｚｉｐ−ｃｏｄｅ）、ユニバーサルプライミング部位など）を含むように操作されたＰＣＲアンプリコンが挙げられる。標的の操作された部位は、内部配列であってもよいし、一方の末端もしくは両方の末端に存在してもよい。
【００５２】
本発明の１つの実施形態において、二本鎖標的核酸は、１つ以上の操作されたテイル配列を含む。本明細書中で使用される場合、「テイル配列」は、二本鎖標的核酸の１つの鎖の末端に位置する公知の核酸塩基配列のストレッチである。標的の鎖のいずれかまたは両方は、同じまたは異なるテイル配列を含み得、そしてこれらは、いずれかの末端または両方の末端に含まれ得る。代表的に、このテイル配列は、競合オリゴに対して完全に相補的であり、そしてこの標的核酸の内部配列に対して非相補的である。このテイル配列は、二本鎖標的核酸の解離鎖の捕捉を容易にするために使用され得るか、または図２および３に示される競合オリゴのハイブリダイゼーションのために使用され得る。
【００５３】
好ましい実施形態において、テイル配列は、上記のように、非標準合成核酸塩基から構成される。図２を参照すると（これは、非標準合成核酸塩基から構成される２つのテイル配列（６および７）を含む標的核酸を用いる本発明の方法を例示する）、非標準テイル配列が使用される場合、競合オリゴはまた、非標準合成核酸塩基を含む。これらの非標準合成核酸塩基は、ワトソン−クリック塩基対を形成しないので、競合オリゴ１４は、第１の鎖１１のテイル配列のみにハイブリダイズし得る。従って、非標準合成テイル配列を利用することは、当業者に明らかな他の利点と同様に、減少した交差反応性の利点を提供する。
【００５４】
テイル配列は、当該分野で公知の任意の技術を使用して標的配列に付加され得るか、または標的核酸内に操作され得る。例えば、テイル配列は、当該分野で周知であるようなＰＣＲ増幅（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）において適切なＰＣＲプライマーを使用することによって付加され得る。この方法に従って、目的の核酸の一方の末端に相補的な配列をその３’末端に有するＰＣＲプライマーが選択される。このプライマーの５’末端は、テイル配列を含む。目的の核酸の他方の末端に相補的な配列をその３’末端に有する第２のプライマーが選択される。これらの２つのプライマーは、目的の核酸を増幅するために使用される。得られた単位増幅配列は、その末端にテイル配列を有する標的核酸を含む。
【００５５】
テイル配列はまた、標準的なクローニング技術を使用して付加され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。例えば、テイル配列を含む合成二本鎖ポリヌクレオチドは、接着末端を含むように操作され得るか、または制限酵素で切断され得、接着末端を残す。目的の核酸は、相補的な接着末端を残す制限酵素で切断され得る。次いで、制限消化されたポリヌクレオチドおよび目的の核酸は、テイル配列を含む標的核酸を作製するように共に連結され得る。あるいは、二本鎖ポリヌクレオチドおよび目的の核酸分子が、各々平滑末端を有する場合、これらは、制限酵素を用いる消化なしで、共に連結され得る。平滑末端はまた、これらが適切な位置に適切な制限部位を含む場合、平滑末端を作製する制限酵素を使用して、二本鎖の目的の核酸および／またはポリヌクレオチドに基づいて作製され得る。
【００５６】
非標準合成核酸塩基から構成されるテイル配列はまた、標準的なクローニング技術を使用して簡便に得られ得る。この方法に従って、一本鎖突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）または接着末端を有する合成二本鎖ポリヌクレオチドは、相補的な突出または接着末端を有する目的の二本鎖核酸に連結される。ポリヌクレオチドの二重鎖領域は、非標準合成テイル配列を含み、そしてこの突出は、天然のコード化ヌクレオチドを含む。突出するオリゴヌクレオチドを目的の二本鎖核酸にアニーリングすることは、非標準合成テイル配列を含む標準核酸を生じる従来の手段に従って連結され得る複合体を生じる。あるいは、非標準合成核酸塩基を含むテイル配列は、公知の技術に従って、適切な非標準合成ヌクレオシド三リン酸を用いる酵素的ギャップ充填反応を使用して調製され得る。
【００５７】
テイル配列を標的核酸に導入する他の方法は、当業者に明らかである。
【００５８】
テイル配列は、任意の数のヌクレオチド長であり、そして任意の核酸塩基組成を含み得るが、代表的に、関連条件下で効率的なハイブリダイゼーションを可能にする長さおよび組成である。好ましくは、テイル配列は、５と５０の間のヌクレオチド、およびより好ましくは、７と２０の間のヌクレオチドを含み得、そして以前に記載されるように、非標準合成核酸塩基から構成される。天然に存在するコード化ヌクレオチドおよび／または改変核酸塩基から構成される場合、Ｃ＋Ｇ含量は、重要ではなく、そしてかなり広い範囲にわたって変化し得る。
【００５９】
テイル配列は、多数の所望の特徴（例えば、より強力なハイブリダイゼーションのための高いＧ−Ｃ含量、より識別力のあるハイブリダイゼーションのための高い配列複雑性、操作を容易にするための多数の制限酵素認識部位など）を同時に有するように設計され得る。特定の用途のための適切な特徴を有するテイル配列は、当業者に明らかである。テイル配列の使用は、有利である。なぜなら、これは、当該分野で周知であるハイブリダイゼーション技術の使用を介して、これを含む核酸の鎖の同定、精製、および／または単離を可能にするからである。複数の異なるテイル配列の使用は、二本鎖標的核酸の鎖の複雑な操作を可能にする。好ましい非標準合成核酸塩基から構成されるテイル配列は、天然に存在するコード化核酸塩基とのそれらの直交性が、次のハイブリダイゼーション工程の間、ハイブリダイゼーション交差反応性を減少させるので、特に有利である。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、二本鎖標的核酸は、ユニバーサルテイル配列を含む。本明細書中で使用される場合、「ユニバーサルテイル配列」は、多数の異なる用途について、これを有用にする特徴を含む、テイル配列である。一般的に、ユニバーサルテイル配列は、十分に長くかつ複雑であり、その結果、これは、天然に存在する可能性が低く（すなわち、１８〜５０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドのオーダーで）、従って、生物から単離された核酸に相補的であると予想されない。これらが標準的なワトソン−クリック塩基対を形成できないことに起因して、非標準合成ユニバーサルテイル配列を含むユニバーサルテイル配列は、生物から単離された核酸と容易にハイブリダイズしない。従って、このような非標準合成核酸塩基から構成されるテイル配列は、代表的に、特異性を損なうことなく、ワトソン−クリック塩基対を形成し得る核酸塩基から構成されるテイル配列よりも短い。従って、６〜８核酸塩基ほどの短いこれらの非天然合成核酸塩基から構成される高度に特異的なユニバーサルテイル配列が、容易に設計され得る。
【００６１】
標的核酸中にユニバーサルテイル配列を含むことは、標的の所望の鎖の操作および単離を容易にする。同じユニバーサルテイル配列が、複数の二本鎖標的核酸の各々に付加される場合、各標的の所望の鎖は、同じ「ユニバーサル」相補的競合オリゴを使用して単離され得る。従って、標的核酸中にユニバーサルテイル配列を含むことは、個々の適用について特有の競合オリゴを合成する必要性を除去する。ユニバーサルテイル配列に相補的な単一のユニバーサル競合オリゴは、任意の標的核酸の１つの鎖を単離するために使用され得る。ユニバーサルテイル配列を含む標的は、以前に記載されるように、当業者に明らかなように、または標準的なクローニング技術を介して、「ユニバーサル」プライマーを使用して、ＰＣＲ反応中で容易に作製され得る。
【００６２】
例えば、ユニバーサルテイル配列を含む二本鎖標的を作製するために、その３’末端に標的核酸に相補的なヌクレオチド配列およびその５’末端にユニバーサルテイル配列を有する、「ユニバーサル」ＰＣＲプライマーが合成され得る。目的の鋳型核酸および別の適切なプライマーのＰＣＲ増幅は、ユニバーサルテイル配列を含む標的核酸分子を生成する。
【００６３】
好ましい実施形態において、二本鎖標的核酸分子は、各々の末端にテイル配列を含む。このような標的核酸は、一般に、以下の構造（Ｉ）：
５’−ＴＡＩＬ１ −ＳＥＱＵＥＮＣＥ −ＴＡＩＬ２ −３’
３’−ＴＡＩＬ１’−ＳＥＱＵＥＮＣＥ’−ＴＡＩＬ２’−５’
を有し、ここで、「ＴＡＩＬ１」は、第１の必要に応じてユニバーサルなテイル配列を示す；「ＴＡＩＬ２」は、第２の必要に応じてユニバーサルなテイル配列を示す；「ＳＥＱＵＥＮＣＥ」は、目的の核酸（すなわち、標的生物由来の核酸）に対応するかまたは目的の核酸から得られるかもしくは由来するヌクレオチド配列を示す；「ＴＡＩＬ１’」は、ＴＡＩＬ１に相補的な配列を示す；「ＴＡＩＬ２’」は、ＴＡＩＬ２に相補的な配列を示す；およびＳＥＱＵＥＮＣＥ’は、ＳＥＱＵＥＮＣＥに相補的な配列を示す。構造（Ｉ）において、種々のＴＡＩＬとＳＥＱＵＥＮＣＥとの間のダッシュは、共有結合を示す。ＴＡＩＬ１およびＴＡＩＬ２の配列は、同じであっても良いし異なっていてもよい。好ましくは、ＴＡＩＬ１およびＴＡＩＬ２は、異なるユニバーサルテイル配列である。
【００６４】
二本鎖標的核酸が構造（Ｉ）に従う構造である本発明の例示的な実施形態は、図２に示される。図２を参照すると、標的核酸１３は、それぞれ、第１鎖の１１および第２鎖の１２を含む。第１鎖１１は、第１の５’テイル配列６および第２の異なる３’テイル配列７を含む。示されるように、テイル配列は、非標準合成核酸塩基から構成されるが、他の核酸塩基（例えば、天然に存在するコード化核酸塩基）が使用され得る。標的１３は、競合オリゴ１４と接触され得、これは、第１のテイル配列６に相補的な第１の核酸塩基配列６’および第２のテイル配列７に相補的な第２の核酸塩基配列７’を含む。標的１３および競合オリゴ１４は、標的１３が解離しそして第１鎖１１が競合オリゴ１４とハイブリダイズする条件下で接触され、解離した第２鎖１２、環状ヘテロ二重鎖１５および三重複合体１６を形成する。１つ以上の第１鎖１１が三重複合体１６の一本鎖部分とハイブリダイズするより高次の複合体がまた、形成し得るが、示さない。種々の異なる分子１５、１６および１２のいずれかまたは全てが、以下により詳細に説明されるように、お互いから単離され得、そして二本鎖標的１３の鎖がそこから単離され得る。例えば、解離した鎖１２は、１２の一部に相補的な捕捉プローブを用いて容易に単離され得る。
【００６５】
（５．２．２ 競合オリゴ）
競合オリゴは、アッセイのｐＨおよび温度において正味の正電荷を有するかまたは正味で電荷的に中性である骨格に共有結合した一連の核酸塩基を含む。標的核酸と組み合わせて、以前に記載されるように、競合オリゴを含む核酸塩基は、天然に存在するコード化核酸塩基、改変核酸塩基、合成核酸塩基もしくは非標準合成核酸塩基、またはこれらの核酸塩基のいずれかの組み合わせであり得る。競合オリゴの核酸塩基についての唯一の必要条件は、これらが標的核酸の領域を含む核酸塩基と共に塩基対を形成し得ることである。例えば、競合オリゴが、天然に存在するコード化核酸塩基から構成される標的核酸の領域とハイブリダイズするように設計される場合、競合オリゴは、ワトソン−クリック型塩基対を形成し得る核酸塩基の相補的な配列を含むべきである。競合オリゴが、例えば、好ましい非標準合成核酸塩基から構成されるユニバーサルテイル配列とハイブリダイズするように設計される場合、競合オリゴヌクレオチドは、非標準合成核酸塩基の相補的な配列を含むべきである。必要とされる相補性の程度は、後の節においてより完全に議論される。
【００６６】
核酸塩基を結合する骨格は、４つの基準を満たす、当該分野で公知の任意のポリマーであり得る。第１に、競合オリゴ中でインキュベートされる場合、骨格は、アッセイのｐＨおよび温度（代表的にｐＨ６〜ｐＨ８および約２０℃〜約４０℃）において正味の正電荷または正味で電荷的に中性を有するべきである。第２に、骨格は、核酸塩基の共有結合に敏感であるべきである。第３に、共有結合した核酸塩基の形状（すなわち、これらの間の距離およびお互いに対するこれらの配向）は、これらが相補的な核酸鎖の核酸塩基と塩基対形成することを可能にするべきである。好ましくは、共有結合した核酸塩基の形状は、天然の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）における核酸塩基の構造に近い。第４に、この骨格は、競合オリゴと相補的な核酸鎖との間のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に可撓性であるべきである。
【００６７】
単独または組み合わせて使用される場合、上記基準を満たす骨格を有する競合オリゴを生じる種々の核酸塩基内結合が当該分野で公知である。例えば、正電荷の糖−グアニジル内結合を有する核酸塩基ポリマーが、米国特許第６，０１３，７８５号および第５，６９６，２５３号（Ｄａｇａｎｉ，１９９５，Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ４−５：１１５３；Ｄｅｍｐｅｙら、１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：６１４０−６１４１もまた参照のこと）において記載される。糖が２’−デオキシリボースであるアナログは、「ＤＮＧ」と称され、ここで、糖がリボースであるアナログは、「ＲＮＧ」と称される。アルキルアミン側鎖を有する正電荷のポリアミド骨格を有する核酸塩基ポリマーの例は、米国特許第５，７８６，４６１号；米国特許第５，７６６，８５５号；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，５３９，０８２号およびＷＯ９８／０３５４２（Ｈａａｉｍａら、１９９６、Ａｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ．ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ ３５：１９３９−１９４２；Ｌｅｓｎｉｋら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ．１６：１７７５−１７７９；Ｄ’Ｃｏｓｔａら、１９９９、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：１５１３−１５１６，Ｎｉｅｌｓｏｎ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５もまた参照のこと）において記載されテイル。
【００６８】
非電荷のポリアミド骨格を有する核酸塩基ポリマーはまた、当該分野で記載されテイル。例えば、非電荷のポリアミド骨格を有する核酸塩基ポリマーは、ＷＯ９２／２０７０２および米国特許第５，５３９，０８２号において記載されテイル。非電荷のモルホリノ−ホスホラミデート骨格を有する核酸塩基ポリマーは、米国特許第５，６９８，６８５号；米国特許第５，４７０，９７４号；米国特許第５，３７８，８４１号および米国特許第５，１８５，１４４号（Ｗａｇｅｓら、１９９７、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１１１６−１１２１もまた参照のこと）において記載されテイル。
【００６９】
競合オリゴを含み得るさらなる核酸塩基内結合としては、ペプチドベースの核酸模倣内結合（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号を参照のこと）、カルバメート分子内結合（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ＆Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，１９８７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２を参照のこと）、アミド分子内結合（例えば、Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，１９９４，Ｓｙｎｌｅｔｔ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ，１９９４：１３７を参照のこと）、メチルヒドロキシアミン分子内結合（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６を参照のこと）、３’−チオホルムアセタル分子内結合（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照のこと）およびスルファメート分子内結合（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照のこと）ならびに前出の標的核酸と組み合わせて考察された種々の改変された分子内結合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
種々の分子内結合に関する上に列挙された参考文献の全ては、本明細書中に参考として援用される。以前に考察されるように、競合オリゴの骨格は、使用の意図されるｐＨおよび温度において正味の正電荷または正味で電荷的に中性を有するべきである。当業者は、競合オリゴ骨格の正味の電荷が正である限り、正味の正電荷を有する競合オリゴが、負に荷電した核酸塩基内結合（例えば、ネイティブな糖ホスホジエステイル分子内結合）を含み得ることを理解する。このことは、大部分の正電荷の分子内結合を含むことによって達成され得る。
【００７１】
正味の正電荷の競合オリゴを使用する場合、骨格の電荷の大きさが大きすぎないことを保証するために注意すべきである。電荷が大きすぎる場合、競合オリゴの標的核酸との相互作用は、本質的にイオン性であり、そして競合オリゴは、その配列特異性を失う傾向がる（すなわち、この競合オリゴは、イオン交換樹脂として作用する傾向がある）。ほとんどの長さの競合オリゴについて、配列特異性は、骨格の正電荷が約５〜６を超えないことを保証することによって容易に保持され得る。好ましくは、骨格の正電荷は、約１〜３を超えるべきではない。
【００７２】
競合オリゴ骨格が、それが正味の正電荷を有するように、正電荷の分子内結合を含む場合、他の核酸塩基内結合は、好ましくは、中性分子内結合（例えば、中性ポリアミド分子内結合もしくは中性モルホリノホルラミデート分子内結合またはその組み合わせ）である。このような中性分子内結合の使用は、競合オリゴが糖ホスホジエステイル分子内結合のような負電荷の核酸塩基内結合を含むヘテロ二重鎖を用いて経験され得る局所的な鎖間での電荷−電荷反発力を回避または減少する。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、競合オリゴは、中性核酸塩基内結合（例えば、以前に記載されるような中性アミド分子内結合およびモルホリノ−ホスホラミデート分子内結合）を含み、そして必要に応じて、約１から約３〜４の正電荷の分子内結合を含む。中性分子内結合は、全て同じであっても良いし、またはこれらは異なっていても良い。例えば、競合オリゴは、いくつかのモルホリノホスホラミド分子内結合およびいくつかの中性アミド分子内結合を含み得る。各クラス内で、種々のモルホリノ−ホスホラミデート分子内結合および中性アミド分子内結合はまた、同じであっても良いし異なっていても良い。必要に応じて正電荷の分子内結合もまた、同じであっても良いし異なっていても良い。
【００７４】
本発明の特に好ましい実施形態において、競合オリゴは、中性ポリアミド核酸（「ＰＮＡ」）である。本明細書中で使用される場合、「ＰＮＡ」は、非荷電のポリアミド骨格を介して共に結合された核酸塩基のポリマーをいう。ＰＮＡ骨格は、核酸塩基が結合し得そして上に議論された基準を満たす、任意の骨格の非環式のアキラルなかつ中性のポリアミドであり得る。本発明において有用なＰＮＡは、例えば、米国特許第５，５３９，０８２号およびＷＯ９２／２０７０２において記載され、これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。ポリアミド骨格を形成するアミノ酸は、同一であっても良いし、異なっていても良い。特に好ましいＰＮＡは、核酸塩基がＮ−（２−アミノエチル）−グリシン骨格に結合したＰＮＡ（すなわち、ペプチド様アミド結合ユニット（例えば、米国特許第５，７１９，２６２号；Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９２，ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００を参照のこと））である。このような特に好ましいＮ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡの部分的な構造は、以下の式（ＩＩ）：
【００７５】
【化１】
ｎは、以下により完全に議論されるように、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡの長さを定義する整数であり；
各Ｂは、独立して、核酸塩基であり；そして
Ｒは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、各Ｒ’は、独立して、水素または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、好ましくは、水素である。
【００７６】
当業者に理解されるように、本明細書中に記載される競合オリゴ（例えば、好ましいＰＮＡ、核酸塩基（天然であるか、改変されているか、合成であるかに関わらない））は、その核酸塩基が標的核酸の所望の鎖と塩基対形成するのを可能にする配向で、骨格に付着される。天然核酸塩基および改変核酸塩基について、これは、天然では同じ位置（すなわち、アデニン、グアニンおよびイノシンについてＮ９位、そしてチミン、シトシン、ウラシル、ジヒドロウリジン（Ｄ）、プソイドウリジン（Ψ）についてはＮ１位など）に見出されている。非標準的合成核酸塩基もまた、代表的に、ピリミジン非標準的合成塩基についてＮ１を、そしてプリン非標準的合成塩基についてはＮ９位を介して、骨格に付着される（例えば、米国特許第６，００１，９８３号、同第５，９６５，３６４号を参照のこと）。他の核酸塩基についての付着点は、当業者に明らかである。
【００７７】
競合オリゴは、当該分野で周知の多数の従来方法のうちのいずれかを用いて合成され得る。使用される方法は、一部、選択される特定の核酸塩基内結合（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）に依存する。特定の連結を含むオリゴを合成するための方法は、連結の各特定の型に関連して列挙している種々の特許および刊行物（上記）に提供される。例えば、正に荷電した糖グアニジル内結合を含む競合オリゴを合成するための適切な方法は、米国特許第６，０１３，７８５号および米国特許第５，６９６，２５３号に記載される。正に荷電したアミド内結合を含む競合オリゴを合成するための適切な方法は、米国特許第５，７８６，４６１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７１９，２６２号およびＷＯ ９８／０３５４２に記載される。天然のモルホリノ内結合を含む競合オリゴを合成するための適切な方法は、米国特許第５，１８５，４４４号および同第５，１４２，０４７号に記載される。天然のアミド内結合を含む競合オリゴ（例えば、特に好ましいＮ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡ）を合成するための適切な方法は、米国特許第５，５３９，０８２号およびＷＯ ９２／２０７０２に記載される。上記に列挙した特許および刊行物の全ては、参考として本明細書中に援用される。異なる分子内結合（ｉｎｔｅｒｌｉｎｋａｇｅ）の組み合わせを含む競合オリゴが、上記に列挙した方法の慣用的な改変および／または周知の方法によって合成され得る。
【００７８】
競合オリゴは、所望のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で二本鎖標的核酸の第１鎖の領域または一部にハイブリダイズし得なければならない。従って、競合オリゴは、特定の適用の必要条件に依存して、標的の第１鎖の領域または一部に対して少なくとも部分的に相補的でなければならない。相補性領域は、図１に例示されるような標的間配列であり得るか、または例えば、図２に例示されるように１つ以上の末端標的配列であり得る。「相補性」によって、競合オリゴの核酸塩基が標的鎖の核酸塩基と塩基対を形成することを意味する。天然に存在するコード核酸塩基および多くの改変塩基または合成塩基について、塩基対形成相互作用は、通常のワトソン−クリック法則に従う。しかし、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号および同第５，９６５，３６４号に記載される非標準的合成核酸塩基（例えば、塩基イソ−Ｃ、イソ−Ｇ、Ｋ、Ｘ、Ｈ、Ｊ、ＭおよびＮ）は、非標準的（すなわち、ワトソン−クリックではない）塩基対を形成する。これらの非標準的塩基は、代表的に、以下のように互いに塩基対になる：イソ−Ｃ・イソ−Ｇ、Ｋ・Ｘ、Ｈ・Ｊ、およびＭ・Ｎ（各塩基対は、代表的に３つの水素結合を有する）。さらなる非標準的合成塩基についての塩基対形成スキームは、米国特許第５，４３２，２７２号、図４に例示される。これらの塩基対形成相互作用（標準的なワトソン−クリックであるか非標準的ワトソン−クリックであるかに関わらず）は、本明細書中に使用される「相補性」という用語の範囲内に入ることが意図される。
【００７９】
相補性の程度は、アッセイの性質に依存する。例えば、多型二本鎖標的核酸のメンバーのうちの各メンバーから一方の鎖を単離することが望ましい場合、競合オリゴは、設計によって、非相補的領域（代表的に、多型を含む領域周辺に作製される）を有し得る。従って、相補性の程度は、その方法の成功に重要ではなく、必要とされることは、その所望の結果を達成するのに十分な程度の相補性である。多くの適用に関して（例えば、多数の異なる標的核酸間から別個の標的核酸の一方の鎖を単離することが望ましい場合）、競合オリゴの配列は、好ましくは、二本鎖標的の所望の鎖の領域または一部に完全に相補的である。この実施形態において、競合オリゴは、好ましくは、特徴的である標的の領域または一部に完全に相補的であり、それによって、多数の標的核酸から標的核酸の相補鎖の特異的な単離を可能にする。従って、相補性の程度は、所望の適用に依存し、そして当業者に明らかである。
【００８０】
標的核酸が１つ以上のテイル（ｔａｉｌ）配列を含む実施形態（例えば、図２および図３に例示される実施形態）において、競合オリゴの配列は、好ましくは、標的のテイル配列に完全に相補的である。標的核酸が２つの末端テイル配列を含む実施形態において、競合オリゴは、図２および図３に例示されるように、好ましくは、一方が第１のテイル配列に完全に相補的であり、そしてもう一方が第２のテイル配列に完全に相補的である、２つの配列を含む。
【００８１】
当業者は、多くの競合オリゴ、とりわけ、特に好ましいＮ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡが、平行配向または逆平行配向のいずれかで相補的ＤＮＡまたは相補的ＲＮＡとハイブリダイズし得ることを、認識する（例えば、Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８を参照のこと）。ＰＮＡのカルボキシル末端がＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端に向かって指向される場合、およびＰＮＡのアミノ末端がＤＮＡまたはＲＮＡの３’末端に向かって指向される場合、配向は逆平行であるといわれる。平行配向において、ＰＮＡのカルボキシル末端およびアミノ末端は、ＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端および３’末端に関して逆方向である。従って、当業者は、競合オリゴの核酸塩基配列が、標的核酸との平行ハイブリダイゼーションまたは逆平行ハイブリダイゼーションのいずれが所望されるかに依存することを認識する。逆平行配向でのハイブリダイゼーションが、代表的に、平行ハイブリダイゼーションよりも安定であるので、競合オリゴの配列は、好ましくは、その競合オリゴが、二本鎖標的核酸の所望の鎖と逆平行配向でハイブリダイズするように選択される。
【００８２】
競合オリゴは、しばしば核酸塩基の連続ストレッチを含むが、これは、必要ではない。核酸塩基のストレッチは、標的核酸との配列特異的な塩基対形成相互作用に関与しない１つ以上のスペーサー部分によって、中断され得る。競合オリゴがスペーサー部分を含む本発明の実施形態が、図３に例示され、そして以下により詳細に考察される。スペーサー部分は、所望の適用に依存して、長くても短くてもよく、疎水性であっても親水性であってもよく、可撓性であっても半剛性であっても剛性であってもよい。一方の分子と別の分子との間隔をあけるため、または分子と固体表面との間隔をあけるために有用な種々のスペーサー部分が、当該分野で記載されている；これらのスペーサー分子の全てが、競合オリゴの領域を互いに間隔をあけるために使用され得る。
【００８３】
例えば、好ましいＰＮＡ競合オリゴについて、スペーサーは、ペプチド（例えば、ポリアミン（可撓性）またはポリプロリン（剛性））を含み得る。ペプチドスペーサーを作製するために、スペーサーを有する個々のアミノ酸は、従来のペプチド合成化学を使用してＰＮＡの合成の間に付加され得る。あるいは、ペプチドスペーサーは、図９に例示されるように、競合オリゴを含むＰＮＡセグメントと縮合され得る。図９を参照して、スペーサーペプチド６０のＮ末端は、例えば、従来の技術に従って、Ｆｍｏｃで保護されて、Ｎ末端が保護されたスペーサー６２を生じる。Ｎ末端が保護されたスペーサー６２は、標準的なカップリング化学を使用して第１のＰＮＡセグメント６４と縮合され、Ｎ末端が保護された中間体６６を生じる。Ｎ末端が保護された中間体６６は、脱保護されて、中間体６８を生じ、これは次いで、再び標準的なカップリング化学を使用してＮ末端が保護された第２のＰＮＡセグメント７０と縮合されて、Ｎ末端が保護された競合オリゴ７２を生じる。７２の脱保護は、ペプチドスペーサーを含む競合オリゴ７４を生じる。スペーサー６０上の任意の反応性側鎖もまた、周知の保護基および化学を使用して保護され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，１９９１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【００８４】
非ペプチドスペーサーを有する競合オリゴがまた、図９に例示されるように合成され得る。例えば、アミノ基およびカルボキシル基の両方を有する任意の分子（例えば、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、アミノアルキル酸（例えば、４−アミノ酪酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノカプロン酸など））が、化合物６０の代わりに使用され得、最終的にスペーサー部分を含む競合オリゴを生じる。競合オリゴの１つの領域と別の領域との間隔をあけるために使用され得るさらなる例示的なスペーサー、ならびにこのようなスペーサーを含む競合オリゴを合成する方法は、当業者に明らかである。ＰＮＡ競合オリゴについて、好ましいスペーサーは、Ｅｇｈｏｌｍら，１９９５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２１７−２２２（参考として本明細書中に援用される）に記載されるＯ−スペーサーである。
【００８５】
スペーサー部分を含む競合オリゴを使用する本発明の実施形態は、図３に例示される。図３において、競合オリゴ１７が介入スペーサー８によって分離されている２つの核酸塩基配列６’および７’を含む以外、図３は図２と同様である。図２の競合オリゴ１４と同様に、核酸塩基６’は、標的１３の第１のテイル配列６に相補的であり、そして核酸塩基７’は、標的１３の第２のテイル配列７に相補的である。標的１３の分離および競合オリゴ１７とのハイブリダイゼーションは、環状へテロ二重鎖２５、三重複合体２６および分離された第２鎖１２を生じる。図２について前に考察したように、高次の複合体が形成され得るが、例示はされていない。以下により詳細に記載するように、分離した第２鎖１２および／または複合体２５および２６は、互いに別々にされ得、そして標的鎖１３が単離される。
【００８６】
競合オリゴは、任意の数の核酸塩基長であり得るが、代表的に、標的の鎖を単離するために使用される温度およびイオン強度における迅速かつ効率的なハイブリダイゼーションを可能にし、同時に、二次構造の発生を最小限にするのに十分な、核酸塩基数を含む。さらに、競合オリゴの長さは、競合オリゴが所望の程度の特異性を与えるのに十分な長さであるべきである。当然、全体的に非標準的合成核酸塩基を含む競合オリゴのみが、他の非標準的合成核酸塩基に相補的であるので、このような競合オリゴの特異性は、長さに依存するように設計され得る。所望の程度の特異性を示す競合オリゴ長を選択することは、当業者に明らかである。
【００８７】
競合オリゴの長さはまた、一部、標的核酸の長さに依存する。好ましくは、競合オリゴの長さは、所望のアッセイ条件下での標的核酸の鎖の再会合または再アニーリングに対して有利に競合し得るように、選択されるべきである。代表的に、これは、単離される標的鎖長の約１／３倍〜１倍（核酸塩基単位）のオーダーである競合オリゴを選択することによって、達成され得る。従って、５０〜６０ｂｐ長の範囲の標的核酸に対して、約１５〜２０核酸塩基長〜約５０〜６０核酸塩基長のサイズ範囲の競合オリゴが、良好な結果を生じるはずである。
【００８８】
二本鎖標的の分離した鎖の単離を容易にするために、競合オリゴは、単離および／または捕捉を容易にする部分（「捕捉部分」）に結合されるか、またはそのような部分を含むように改変され得る。１つの実施形態において、捕捉部分は、固体支持体であり得る。本発明の方法における固体支持体に固定される競合オリゴの使用は、図６に例示される。
【００８９】
図６を参照して、二本鎖標的核酸１３は、固定された競合オリゴ１０に連結される。固定された競合オリゴ１０は、競合オリゴ４および固体支持体９を含む。図６に例示されるように、競合オリゴは、共有結合性の付着によって固体支持体９上に固定される。固定化の他の様式は、以下に議論される。連結は、二本鎖標的１３のそれぞれ第１鎖１１および第２鎖１２への解離、第１鎖１１と固定された競合オリゴ１０の一部である競合オリゴ４との間のハイブリダイゼーションを促進または有利にする条件下で実行され、それによって、ヘテロ二重鎖２２および解離された鎖１２を形成する。次いで、ヘテロ二重鎖２２が、固体支持体９によって（例えば、デカント、ろ過、遠心分離など）、分離した鎖１２および任意の二本鎖標的１３から単離されるかまたは捕捉される。固体支持体９が磁石である場合（例えば、磁気ビーズ）、ヘテロ二重鎖２２は、磁石の補助によって好都合に単離され得る。ヘテロ二重鎖２２の除去は、第２鎖１２を生じ、これは、さらなる精製を伴なわずに使用され得る。第１鎖１１が所望の標的鎖である場合、固体支持体９の補助によって固定された競合オリゴ１０を好都合に除去することによって、ヘテロ二重鎖２２が分離され、第１鎖１１が単離される。
【００９０】
あるいは、分離された第２鎖１２は、捕捉プローブ５０を用いた捕捉によって、混合物から（またはへテロ二重鎖２２の除去後のサンプルから）単離または捕捉され得る。固定された競合オリゴ１０と同様に、捕捉プローブ５０は、好ましくは、固体支持体上に固定された競合オリゴを含む。しかし、捕捉プローブ５０の核酸塩基は、第２鎖１２の一部に相補的である。固定される競合オリゴ１０および捕捉プローブ５０の固体支持体が異なる性質（例えば、サイズ、形状、磁力の差異など）に基づいて互いに分離できない場合、ヘテロ二重鎖２２およびヘテロ二重鎖５２の捕捉は、いずれかの順序で連続して実行されなければならない。第２鎖１２に相補的な捕捉プローブ５０の使用は、標的１３の両方の鎖が、複合体混合物から容易かつ効率的に単離されることを可能にする。
【００９１】
図６には競合オリゴとして例示されるが、当業者は、捕捉プローブ５０がＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含み得ることを認識する。さらに、捕捉部分は、固体支持体である必要はなく、捕捉プローブは、当該分野で公知の任意の捕捉部分（例えば、ビオチンを含む）であり得る。これら他の型の捕捉プローブのための捕捉条件を操作することは、当業者に明らかである。
【００９２】
図６を参照して、競合オリゴ４は、種々の異なる機構（吸収、イオン誘引、疎水性相互作用および共有結合的な付着を含む）によって、固体支持体９上に固定され得るか、または固体支持体９と会合され得る。あるいは、競合オリゴ４は、特定の結合化合物の対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）の使用を介して、固体支持体９上に固定され得る。
【００９３】
支持体９は、種々の規則的形状または不規則的形状（例えば、球状、楕円状、円盤状、立方体状、角錐状など）をとり得、そして固定化の所望の様式に適し、かつ適合性である（すなわち、本発明に従って、競合オリゴを固定するためかまたは二本鎖核酸の１つの鎖を単離するため使用される条件下で、溶解もしないし、さもなくば分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｅ）も分解（ｄｅｇｒａｄｅ）もしない）任意の材料（または材料の混合物）を含み得る。固体支持体に適した材料としては、ゲル（例えば、アガロース、ゼラチン、セファロースなど）、ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシメチルセルロースなど）、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンなど）、ナイロン、ガラス、シリカなどが挙げられるが、これらに限定されない。材料の実際の選択は、なかでも固定化の所望の様式という因子に依存し、そしてこれは、当業者に明らかである。
【００９４】
吸着または吸収を介した固定化に関して、固定される競合オリゴ１０は、固体支持体９を競合オリゴ４と、競合オリゴ４がこの支持体上に吸着または吸収されるのに十分な期間接触させることによって、簡便に好都合に調製され得る。任意の洗浄工程の後、この支持体は、次いで乾燥させられる。核酸をニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルター上に固定させるためのドット−ブロットまたは他の核酸ブロッティング技術において記載される種々の方法が、好都合に適応されて、競合オリゴ４を固体支持体９上に固定させ得る。
【００９５】
イオン誘引による固定化について、支持体９は、本来荷電していない場合、競合オリゴ４（これは、最初に反対に荷電されるように改変される）を接触させる前に、まず荷電した基で活性化されるかまたは誘導体化される。
【００９６】
特定の結合化合物の対（例えば、ビオチン−ストレプトアビジンおよび抗体−ハプテン）によって媒介される固定化について、支持体９は、まずこの特定の結合対のうちの１つのメンバー（例えば、ストレプトアビジン）で誘導体化および／またはコーティングされ、次いで、この誘導体化された支持体は、この特定の結合対のうちの他方のメンバー（例えば、ビオチン）に連結された競合オリゴ４と接触させられる。種々の材料を結合分子（例えば、アビジン）で誘導体化またはコーティングするための方法、ならびに無数の型の化合物を結合分子（例えば、ビオチン）に連結させるための方法は、当該分野で周知である。ほとんどの競合オリゴについて、ビオチンが、市販の化学合成試薬を用いて、末端核酸塩基および／もしくは内部核酸塩基のいずれかに、またはそのカルボキシル末端およびアミノ末端のうちの一方もしくは両方に、分子に好都合に組込まれ得、このことは後方の節により詳細に記載される。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態において、競合オリゴ４は、必要に応じて１つ以上の連結部分によって、支持体９に共有結合的に付着され得る。支持体が、本来、競合オリゴと共有結合を形成し得る反応性官能基を含まない限り、この支持体は、そのような反応基で最初に活性化または誘導体化されなければならない。化合物の共有結合的な付着（例えば、競合オリゴの支持体への共有結合的な付着）をもたらすのに有用である代表的な反応基としては、ヒドロキシル基、スルホニル基、アミノ基、シアン基、イソシアン基、チオシアン基、イソチオシアン基、エポキシ基およびカルボキシル基が挙げられるが、当業者に明らかである他の反応基もまた、使用され得る。
【００９８】
多数の型の固体支持体材料を、この支持体に共有結合的に付着する化合物（例えば、ＰＮＡのような競合オリゴを含む）に適切な反応基で活性化するための種々の技術は、当該分野で公知であり、例えば、化学活性化、コロナ放電活性化、フレーム処理活性化、ガスプラズマ活性化およびプラズマ増強化学蒸着が挙げられる。これらの技術のうちのいずれかが、固体支持体を反応基で活性化するために使用され得る。支持体を活性化または誘導体化するために使用され得る多くの技術の概説については、ＷＩＬＥＹ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＡＣＫＡＧＩＮＧ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，第２版，Ｂｒｏｄｙ ＆ Ｍａｒｓｈ，編，「Ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」８６７−８７４頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９７，ならびにこれらの中に引用される参考文献を参照のこと。ガラスビーズ上にアミノ基を作製するのに適した化学方法は、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｓｍｉｔｈ，「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ Ｔｒｉｅｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ」，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｍ Ｊ Ｇａｉｔ，編，１９８５，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（特に、４５〜４９頁）（およびこの中に引用される参考文献）に記載され；ガラスビーズ上にヒドロキシル基を作製するのに適した化学方法は、Ｍａｓｋｏｓら，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９−１６８４）（およびこの中に引用される参考文献）に記載され；ポリスチレン、ポリアミドおよびグラフトポリスチレンのような支持体材料上に官能基を作製するのに適した化学方法は、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９７，ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ ＴＯ ＴＨＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，第２章，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（およびこの中に引用される参考文献）に記載される。さらなる方法が、周知であり、当業者に明らかである。
【００９９】
競合オリゴ４は、合成および／または単離後に活性化支持体上に共有結合的に固定され得るか、あるいは、支持体上にインサイチュで直接合成され得る。例えば、精製ＰＮＡは、好都合にそのカルボキシ末端によって、アミノ活性化された支持体上に共有結合的に固定され得る。あるいは、ＰＮＡは、従来の固相ペプチド化学および試薬を用いて、アミノ活性化された支持体上にインサイチュで直接合成され得る（ＷＯ ９８／０３５４２、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１９，２６２号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号およびこれらに引用される参考文献を参照のこと）。
【０１００】
異なる核酸塩基配列を有する複数の固定された競合オリゴが、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（米国特許第４，６３１，２１１号もまた参照のこと）の「ティータグ（ｔｅａ ｔａｇ）」アプローチ、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４０：４９７−５０６によって記載される自動化方法、またはＦｕｒｋａら，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎら，１９９３，Ｓｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：４１３−４１８；Ｌａｍら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４およびＨｏｕｇｈｔｅｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６もまた参照のこと）によって記載される分割合成方法を使用して、平行して好都合に合成され得る。
【０１０１】
当業者は、インサイチュ化学合成を使用する場合、競合オリゴと支持体との間に形成される共有結合が、合成および／または脱保護の間の競合オリゴの損失を回避するように、使用される合成条件および脱保護条件に対して実質的に安定であるべきであることを認識する。適切な連結は、周知であり、当業者に明らかである。
【０１０２】
活性化もしくは誘導体化された支持体上に直接合成されるか、または合成または単離の後に活性化または誘導体化された支持体上に合成されるか否かに関わらず、競合オリゴは、必要に応じて、１つ以上のリンカーによって支持体から間隔を空けられ得る。当業者に認識されるように、このようなリンカーは、少なくとも二官能性であり、すなわち、このようなリンカーは、活性化された固体支持体との連結を形成し得る一方の官能基または部分、および固定される他方のリンカー分子もしくは化合物との連結を形成し得る別の官能基または部分を有する。このリンカーは、所望の適用に依存して、長くても短くてもよく、可撓性であっても剛性であってもよく、疎水性であっても親水性であってもよい。
【０１０３】
特定の状況において、このようなリンカーは、一方の官能基を他方の官能基に「変換」するために使用され得る。例えば、アミノ活性化された固体支持体は、例えば、３−カルボキシ−プロピオン酸との反応によって、カルボキシル活性化支持体に変換され得る。このようにして、特定化された反応性官能基で容易に活性化も誘導体化もされ得ない固体支持体材料は、適切に活性化された支持体に好都合に変換され得る。このような反応基を「変換する」のに適した化学および試薬は、周知であり、当業者に明らかである。
【０１０４】
リンカーもまた、必要な場合使用されて、活性化支持体上の反応基の数を増加または「増幅」し得る。この実施形態において、リンカーは、代表的に３つ以上の官能基を有する。これらの官能基のうち１つによって活性化支持体に付着させた後、残りの２つ以上の基が、化合物の付着に利用可能である。この様式において活性化支持体上の官能基の数を増幅することは、活性化支持体が相対的に少ない反応基しか含まない場合、特に好都合である。
【０１０５】
反応基の数を増幅するための試薬は、周知であり、当業者に明らかである。増幅試薬の特に好都合な型は、商標名ＤＥＮＡＣＯＬＴＭ（Ｎａｇａｓｓｉ Ｋａｓｅｉ Ｋｏｇｙｏ Ｋ．Ｋ．）の多官能基エポキシド固体である。これらのエポキシドは、４、５、なおさらに多くのエポキシ基を含み、そしてエポキシドと反応する反応基で活性化される支持体（例えば、ヒドロキシル、アミノおよびスルホニルで活性化される支持体を含む）を増幅するために使用され得る。生じるエポキシ活性化支持体は、ヒドロキシル活性化支持体、アミノ活性化支持体、カルボキシ活性化支持体、または周知の方法による他の活性化支持体に、好都合に変換され得る。あるいは、競合オリゴは、エポキシド基に直接共有結合的にカップリングされ得る。
【０１０６】
生物学的分子または他の分子（ポリヌクレオチドおよび競合オリゴを含む）を固体支持体から間隔を空けるのに適したリンカーは、当該分野で周知であり、限定しない例を挙げると、前述のスペーサー分子、ポリペプチド（例えば、ポリプロリンまたはポリアラニン）、飽和二官能価炭化水素または不飽和二官能価炭化水素（例えば、６−アミノカプロン酸）およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）などが挙げられる。
【０１０７】
別の実施形態において、捕捉部分は、１対の特異的結合分子の一方の部分である（例えば、ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジンまたは抗体およびハプテン）。ビオチンは、当該分野で公知の任意の技術を用いて、競合オリゴに結合され得る。例えば、ビオチンは、競合オリゴに対して、その末端の一方もしくは両端、骨格上の別の位置、またはその核酸塩基の１つ以上に対して結合され得る。ビオチンを競合オリゴに対して結合する方法は、当該分野で周知であり、市販の試薬（例えば、ビオチン−ＮＨＳエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手可能））を用いて達成され得る。この場合、ビオチン−ＮＨＳエステルは、競合オリゴ（例えば、ＰＮＡ）のアミノ末端に対して、標準的な連結技術を用いて共有結合され得る。あるいは、ビオチンは、例えば、ジメトキシトリチルビオチンフェニルピラゾラニンエステルを合成試薬として用いることで、合成される間にＰＮＡに結合され得る（例えば、Ｐｅｒｒｙ Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、前出）。他の結合化合物（例えば、ハプテン）を有する競合オリゴを合成する方法は、当業者にとって明白である。
【０１０８】
ビオチン捕捉部分を用いる本発明の実施形態は、図７に例示される。図７に示されるように、二重鎖標的核酸３は、標的３が第１鎖および第２鎖（１および２）にそれぞれ解離する条件下で、ビオチン標識競合オリゴ２０と接触し、第１鎖１は、ビオチン標識競合オリゴ２０とハイブリダイズして、ビオチン標識へテロ二重鎖３２を生じ、第２鎖２を解離する。図７において、ビオチン１４は、競合オリゴ４の末端に共有結合する。ビオチン標識へテロ二重鎖３２は、固定化ストレプトアビジン（例えば、ストレプトアビジン被覆ビーズ３４）と、ビオチンとストレプトアビジン間の結合を導く条件下で接触され、複合体３６を生じる。これは、単離され得て、第１鎖１がここから分離されそして単離される（例えば、Ｂｏｆｆａら、前出）。あるいは、複合体３６が、単離され得て、さらなる精製を行わずに第２鎖２が用いられる。
【０１０９】
さらに別の実施形態において、図８に示されるように、捕捉部分は、捕捉配列４１である。捕捉配列４１は、競合オリゴ４に結合され、プローブ４０を生じる。この捕捉配列は、捕捉プローブ４４に対して相補的であり、競合オリゴ４に対し相補的でなく、標的核酸３のいずれの鎖に対しも相補的でない。図８に例示するように、二重鎖標的核酸３は、標的３が第１鎖および第２鎖（１および２）にそれぞれ解離する条件下で、プローブ４０と接触し、そしてプローブ４０の競合オリゴ部分４は、第１鎖１とハイブリダイズして、複合体４２を生じ、第２鎖２を解離する。次いで、複合体４２は、捕捉プローブ４４がプローブ４０の捕捉配列４１にハイブリダイズする条件下で、捕捉プローブ４４と接触し、三分子複合体４８を生じる。捕捉プローブ４４は、三分子複合体４８の単離を可能にするエレメント４６を含む。エレメント４６は、三分子複合体の捕捉および／または単離を容易にする、当該分野で公知の任意の部分であり得、これらとしては、例えば、前述の捕捉部分、好都合には固体支持体またはビオチンである。
【０１１０】
当業者は、捕捉プローブ４４と捕捉配列４１の間の好ましいハイブリダイゼーションを支持する条件下で、複合体４２の解離ならびに第１鎖および第２鎖（１および２）の再アニールまたは再会合に好ましくない条件下において、捕捉プローブ４４が複合体４２と接触されるべきであることを理解する。これは、好都合には、捕捉配列４１および捕捉配列４４のうち１つが競合オリゴであり、他方が荷電または非荷電の骨格を有するオリゴヌクレオチドであることを保証することにより達成され得る。捕捉配列４１が荷電した骨格（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド）であるキメラプローブ４０を作製する方法も同じである。好ましくは、捕捉配列４１は、非荷電骨格を有し、捕捉プローブ４４は、荷電または非荷電の骨格のいずれかを有する。最も好ましくは、プローブ４０は、ＰＮＡであり、捕捉プローブ４４としては、ＰＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１１１】
（５．２．３ 接触）
本発明の方法の成功は、ハイブリダイゼーションを実施する能力もしくはハイブリダイゼーション条件を操作する能力、反応速度論を利用する能力および／またはＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の間でのヘテロ二重鎖の一方の鎖が競合オリゴ（例えば、ＰＮＡ）であるヘテロ二重鎖と比較した場合の熱安定性の違いにかかってる。前に議論したように、ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖の熱力学的安定性は、ある範囲のイオン強度にわたる対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の熱力学的安定性よりも、広範囲のイオン強度にわたって、有意に高いことが発見されている（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８を参照のこと）。さらに、低イオン強度条件下では、例えば、ＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖形成の反応速度は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖形成の反応速度よりも顕著に速い。より迅速なＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖形成の反応速度は、長さに依存しない。従って、長さの結果として、生じたＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、生じたヘテロ二重鎖よりも熱安定性である場合においてさえも、ヘテロ二重鎖の形成は、二重鎖の形成より迅速に生じる。反応速度におけるこの違いは、再アニールを生じた標的二重鎖が、速度論的に支持されるヘテロ二重鎖より、熱力学的に安定であるような状況でさえ、競合オリゴが解離した標的鎖に再アニールまたは再会合するような競合を反応速度論的に排除する（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）ことを可能にする。従って、本発明の方法に基づいて、接触時間、温度およびイオン強度の組み合わせを、標的鎖の解離およびヘテロ二重鎖の形成を支持するように選択する。これらの条件が達成される場合、このアッセイ溶液は、標的鎖：競合オリゴへテロ二重鎖を優先的に含み、そして標的鎖を解離し、標的鎖のいずれかの容易かつ効率的な単離を可能にする。
【０１１２】
当業者は、時間、温度およびイオン強度の選択が種々の因子（とりわけ、標的鎖：競合オリゴへテロ二重鎖のＣ＋Ｇ構成、標的核酸および競合オリゴのそれぞれの濃度（すなわちモル比）ならびに溶液のｐＨが挙げられる）に依存することを理解する。さらに、複数の二重鎖標的核酸から、標的鎖に完全に相補的でない競合オリゴを用いて鎖を単離する場合、所望される特異性の程度は、時間、温度およびイオン強度の選択に影響する。
【０１１３】
ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖ならびにＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の相対的な安定性は、Ｔｍに例証されるように、塩濃度に非常に依存する。一般に、ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖は、約５０ｍＭ ＮａＣｌ未満のイオン強度において、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも有意に安定である。典型的に、イオン強度が弱いほど、観察される安定性はより大きく異なる。ヘテロ二重鎖形成はまた、反応速度的に支持される。例えば、相対的に長いＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖（例えば、１００ｂｐ以上）が典型的に、任意のほとんどの塩濃度で、短いＤＮＡ／ＰＮＡヘテロ二重鎖（例えば、１０〜２０ｂｐ）より安定である場合でも、前者のＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、低イオン強度条件で非常にゆっくりと形成する。対照的に、後者のＰＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖は，非常にすばやく形成する。従って、一旦標的核酸鎖が解離すると、低イオン強度の条件下で、競合オリゴと相補的標的鎖との間でのへテロ二重鎖の形成は、標的鎖の再アニールまたは再会合を反応速度論的に競合から排除する。従って、選択される温度およびイオン強度に関わりなく、生じたヘテロ二重鎖は、再アニールまたは再会合した標的二重鎖より、熱力学的に不安定（Ｔｍにより測定されるように）である場合（例えば、ヘテロ二重鎖が二重鎖より有意に短い（例えば、１／８〜１／２）場合（ｂｐで測定されるように））、この接触時間は、平衡に達してからのハイブリダイゼーションを防止するため十分に短くあるべきである。ヘテロ二重鎖の熱力学的安定性（Ｔｍにより測定されるように）が、再アニールした標的二重鎖の熱力学的安定性におよそ等しいかまたはそれより大きい場合、この接触時間は、ハイブリダイゼーションが平衡に達するのを可能にするのに十分長くあり得る。しかし、この場合においてさえ、平衡状態を避けることが、ヘテロ二重鎖形成のより速い反応速度を最大に利用するので、平衡に達するのを避けるのに十分短い接触時間を用いることが可能であり、このことにより所望の標的鎖の高効率の回収を可能にする。一般に、生じたヘテロ二重鎖および再アニールした標的二重鎖の長さ、数時間から１０時間（好ましくはおよそ１〜２時間程度）といった接触時間に関わりなく、平衡状態は避けられるべきであり、従って、標的鎖の効率的な回収が可能になる。
【０１１４】
上記に議論したように、所定の温度に対し、低イオン強度条件下において、ヘテロ二重鎖の安定性は、対応する二重鎖の安定性より顕著に高い。従って、接触する工程は好ましくは、低いかまたは極度に低いイオン強度条件下で、実施される。一価のカチオンを有する塩（例えば、ＮａＣｌおよびＫＣｌ）については、１０ｍＭ以下程度のカチオン強度が好ましい。二価のカチオンを有する塩（例えば、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２など）については、１ｍＭ以下程度のカチオン強度が好ましい。三価の塩については、１００μＭ以下程度のカチオン強度が好ましい。
【０１１５】
接触する工程の間、当該分野で公知の塩および他の試薬もまた、ヘテロ二重鎖形成を速度論的に促進するため、および／または特定の二重鎖の熱融解温度の配列依存性を減らすため（例えば、スペルミン、ＴＭＡＣ、ＤＴＡＢ、ＣＴＡＢ、ＴＭＡＢ）に使用され得る。このような試薬を用いる場合、緩衝液の総カチオン強度は、好ましくは５０ｍＭを超えないべきであり、そしてより好ましくは、１０ｍＭを超えないべきである。
【０１１６】
この緩衝液は、核酸ハイブリダイゼーションの分野で一般に用いられる他の試薬（例えば、ｐＨ緩衝化剤、ホルムアルデヒドなどの変性剤などおよび他の試薬）を含み得る。適切な緩衝化剤、ｐＨ範囲および変性剤は、例えば、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８９）に記載される。典型的に、接触させる工程は、ｐＨ６〜８の範囲にあるｐＨで実施され、変性剤は使用されない。
【０１１７】
当業者に理解されるように、接触を実施する工程での温度は、部分的に、緩衝液のイオン強度に依存する。ヘテロ二重鎖および二重鎖形成の異なる反応速度により、このような温度の選択は、成功のために必要とされないが、理想的には、選択される温度は、ヘテロ二重鎖が再アニールした標的二重鎖より熱力学的に安定である温度である。好ましくは、イオン強度は、室温または約２０℃と約４０℃の間で接触を可能にするよう選択される。しかし、意図する結果を生じるようするために、他の温度が使用され得る。
【０１１８】
温度は、接触させる工程の間一定に保たれ得るか、典型的にはサーモサイクラー（ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ）（例えば、ＰＣＲ反応において通常用いられる型のサーモサイクラー）を用いて、循環し得る。好都合な循環温度は、標的核酸のＴｍより上で（選択されたイオン強度において）、標的鎖：競合オリゴへテロ二重鎖のＴｍより下の第１の温度およびヘテロ二重鎖のＴｍより上である第２の温度を含む。温度が循環される速度は、急またはゆっくりであり得、典型的にはＰＣＲに用いられる速度に類似する。使用され得る代替的な循環温度および循環速度は、当業者に明白である。
【０１１９】
特定の標的核酸および競合オリゴに対する二重鎖標的のうち一方の鎖の単離を可能にするための時間、イオン強度および温度の適切な組み合わせを選択する能力は、当業者の能力の範囲内である。例えば、標的核酸および所望の競合オリゴを含むモデル化ヘテロ二重鎖の熱融解温度（Ｔｍ）は、種々の異なるイオン強度、およびこれらから選択される温度とイオン強度の組み合わせにおいて得られ得る。温度とイオン強度の組み合わせは、標的核酸とモデル化ヘテロ二重鎖との間の安定性における違いを最大にするよう（すなわちモデル化ヘテロ二重鎖と標的核酸のそれぞれのＴｍ間の違いが最大になる温度とイオン強度）選択され得る。あるいは、特定の温度（例えば、室温）が必要な場合、適切なイオン強度が選択され得る。一旦特定の温度とイオン強度が選択されると、最適な接触時間が経験的に決定され得る。
【０１２０】
モデル化ヘテロ二重鎖を操作して、理想的には、所望の鎖分離アッセイおよび／または標的核酸を示し得る。例えば、単離すべき鎖がＤＮＡである場合、モデル化ヘテロ二重鎖は、ＤＮＡオリゴ：競合オリゴへテロ二重鎖であり得る。このオリゴは、特定の系に依存して、競合オリゴと同じ長さであるか、より長いか、またはより短くあり得る。モデル化ヘテロ二重鎖の配列構成を操作して、特定の鎖分離アッセイに対して必要である相補性の程度を示し得る。
【０１２１】
本発明の方法は、二重鎖標的核酸が相補的オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログとハイブリダイズして、Ｄ−ループまたは標的ならびにオリゴの第１鎖および第２鎖を含む他の構造を形成することにおける方法と異なる。アッセイのパラメータ（例えば、競合オリゴおよびイオン強度、温度およびアッセイの接触時間）を操作する長所により、標的の他の鎖がない競合オリゴと標的鎖との間のヘテロ二重鎖が形成される。しかし、当業者は、標的鎖の全ての分子の競合的解離が有用な結果を達成するのに必要ではないことを理解する。全ての必要なことは、サンプル中に存在する標的分子の画分が、完全に分離し、生物分子標的鎖：競合オリゴへテロ二重鎖が形成されることである。一旦形成されると、ヘテロ二重鎖および／または解離した標的鎖は、標的鎖の再アニーリング前に捕捉される。従って、本明細書で用いられる場合、表現「標的の解離」および他の等価な表現は、有用な結果を提供する標的の解離の程度を示すことを意図する。
【０１２２】
二重鎖核酸を侵害する競合オリゴ（例えば、ＰＮＡ）の能力の一部に起因して、競合オリゴの濃度は、解離の効率を規定する手段として用いられ得る。任意の特定の操作理論に束縛されることを意図しないが、侵害する競合オリゴは、標的核酸を不安定化し、その解離を支援する。侵害の反応は、複数の分子のプロセスであるので、これは濃度依存的である。しかし、使用される標的核酸および競合オリゴの実際の濃度は、成功に重要でなく、標的核酸および／または競合オリゴのいずれかについて、ｐＭのような低い濃度かまたはより低い濃度からｍＭまたはより高い濃度の範囲が使用され得る。競合オリゴ：標的核酸分子の比が、より重要である。競合物：標的Ｄ−ループの形成は、二分子プロセスなので、競合オリゴ：標的核酸の１より大きいモル比を用いて、標的解離およびヘテロ二重鎖形成の達成される効率を操作することを支援し得る。典型的には、１：１〜５０：１の範囲の競合オリゴ：標的分子濃度の比が使用され、好ましくは、１：１〜１０：１の範囲の比が使用される。
【０１２３】
標的鎖は、種々の異なる実施形態において、本発明に従う二重鎖標的核酸から単離され得る。図４に示されるように、二重鎖標的核酸３は、標的３を第１鎖および第２鎖（１および２）に最初に解離することなく、競合オリゴ４と接触され得る。１つの実施形態において、使用される接触条件は、二重鎖標的３が安定である（すなわち、解離する傾向にない）ことである。例えば、標的３は、生理学的ｐＨ、温度およびイオン強度の条件下で競合オリゴ４と接触され得る。次いで、この実施形態の１つのバージョンにおいて、この条件は、例えば、低イオン強度に対する透析により、前述のように、二重鎖標的核酸３の第１鎖および第２鎖（１および２）への解離および競合オリゴ４の第１鎖１へのハイブリダイゼーションを同時に支援する条件に変えられる。これらの変更された条件は、図４にΔ１として例示される。このような条件を選択する方法が記載される（前出）。
【０１２４】
この実施形態の別のバージョンにおいて、条件は、標的核酸の解離を促進または支持するが、競合オリゴ４の第１鎖１へのハイブリダイゼーションを支持しない条件にまず変えられる（図４においてΔ２ａとして例示される）。例示的条件Δ２ａは、例えば、ヘテロ二重鎖５のＴｍより上の温度を含む。次いで、競合オリゴ４の第１鎖１へのハイブリダイゼーションは、前述のように、標的の解離および第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５の形成を支持するようなさらなる条件の変更によって達成される（図４において、Δ２ｂとして例示される）。
【０１２５】
図５に示すように、別の実施形態において、二重鎖標的核酸はまず、第１鎖および第２鎖（１および２）に、それぞれ競合オリゴ４に接触する前に、解離するかまたは変性する。この実施形態の１つのバージョンにおいて、変性条件は、第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５の形成を同時に促進する条件である（Δ３で例示される）。この実施形態において、この条件は、競合オリゴ４との接触後のさらなる調整を必要としない。この実施形態の別のバージョンにおいて、変性条件は、第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖の形成を促進しない（Δ４で例示される）。例えば、標的核酸３は、煮沸により変性した後、急速に冷却（例えば、氷浴または他の従来の方法による）され得る。この実施形態において、次いで変性条件は、接触工程後に変更されて、第１鎖：競合オリゴ５へテロ二重鎖の形成を促進する（Δ５として例示）。これらの代替的実施形態に従う方法を実施するのに有用な条件は、上に記載される。図５に例示される実施形態を用いる条件は、当業者の能力の範囲内である。図１に示されるように、様式に関わらず、二重鎖標的３の解離および第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５の形成に続いて、標的のうち一方の鎖が単離され得る。ハイブリダイズしていない解離した第２鎖２または第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５のいずれかが回収され得る。このへテロ二重鎖５が回収される場合、これは解離され得て、これらから第１鎖１が単離される。
【０１２６】
第２鎖２およびへテロ二重鎖５は、実質的に任意の標準的技術を用いて、互いから単離され得る。例えば、解離した第２鎖２およびへテロ二重鎖５は、ゲル電気泳動と用いて互いから単離され得る（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０−１４６７５を参照のこと）。非変性条件下で、第２鎖２およびへテロ二重鎖５は、それぞれ別々の群として移動し、標準的技術を用いて（例えば、エチジウムブロマイドを用いて）検出され得る。代替的にへテロ二重鎖５は、ゲルマトリックス中を、解離した鎖２よりゆっくりと移動する。いずれかの分子群は、他のものから、それぞれのバンドの切り取りおよび当該分野で周知の技術を用いたゲルから溶出により単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。
【０１２７】
好ましくは、競合オリゴは、前述のように、捕捉部分（例えば、固体支持体、結合分子（例えば、ビオチン）または捕捉配列）に結合されるか、またはこれらを含むよう改変される（例えば、図６〜８を参照のこと）。この場合、第１鎖：競合オリゴへテロ二重鎖５の捕捉は、捕捉部分を利用して達成される。この捕捉条件は、捕捉部分の性質に依存し、当業者にとって明白である。第１鎖は、前述のように、ヘテロ二重鎖から解離および単離され得るか、あるいは、解離された第２鎖が回収され得、さらなる精製をせずに使用され得る。
【０１２８】
（５．２．４ ハイブリダイゼーションの検出）
捕捉および最適な洗浄の後、第１鎖と競合オリゴとの間のハイブリダイゼーションの存在または不在は、必要に応じて決定され得る。検出様式は、第１鎖がレポーター分子を有するか否かに依存し、もし有するならレポーター分子の型に依存する。例えば、第１鎖が放射性同位元素標識を有する場合、捕捉される複合体は、放射活性により検出され得；第１鎖が発色蛍光団標識を有する場合、捕捉される複合体は、蛍光によって分析され得；第１鎖がビオチン標識を保有する場合、捕捉される複合体は、標識された（例えば、蛍光で標識された）アビジンまたはストレプトアビジンを結合する能力についてアッセイされ得る。当業者は、実質的に任意のレポーター基および検出の仕組みが本発明の使用について容易に適用され得ることを理解する。多くの場合、レポーター基の量が決定され得、それによって、サンプルから単離された第１鎖の量を決定し得る。
【０１２９】
（５．２．５ 使用）
本発明の方法は、二重鎖標的核酸の一方の鎖の単離が必要な場合、実質的に任意の適用において使用され得る。これらの能力により、簡便で効率的な回収が提供され、本明細書に記載される方法は、有利に使用されて、第１鎖を二重鎖標的核酸から精製し、この二重鎖標的核酸は、続けての使用のために高い収量の関連する配列または関連しない配列のプールに由来する、ＰＣＲ増幅産物である。
【０１３０】
本発明の方法はまた、二重鎖標的核酸の第１鎖の、生物学的サンプルまたは高分子混入物を含む他のサンプルからの捕捉および／または回収を可能にする。一旦捕捉されると、第１鎖は、ＰＣＲ、配列決定または他の適用に直接使用され得る。あるいは、第２鎖が精製され得て、続いての適用に使用され得る。
【０１３１】
従って、当業者に理解されるように、本発明の方法により単離された標的核酸は、一本鎖核酸を必要とする任意の適用（例えば、一塩基多型、Ｓａｎｇｅｒ型または他の核酸の配列決定法など）において有利に使用され得る。
【０１３２】
本発明の種々の実施形態が記載してきた。この記載は、本発明の例示を企図し、限定ではない。実際、当業者にとって、改変が、本発明の精神または添付される上記の特許請求の範囲の範囲を逸脱せずに、記載される本発明の種々の実施形態に対してなされ得ることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一般的の方法を例示を提供する。
【図２】図２は、競合オリゴが、２つの連続した核酸塩基を含み、その一つが第一の標的テイル配列に相補的であり、そして他方が、第二の標的テイル配列に相補的であり、これらは、お互いにスペーサーを介して結合されている本発明の実施形態を例示する。
【図３】図３は、競合オリゴがリンカーおよび２つの核酸塩基配列を含み、その一つが第一の標的テイル配列に相補的であり、そして他方が第二の標的テイル配列に相補的である本発明の実施形態を例示する。
【図４】図４は、本発明の接触工程が、解離工程と同時、またはその前に実施される、本発明の実施形態を例示する。
【図５】図５は、本発明の接触工程が、解離工程に続く、本発明の実施形態を例示する。
【図６】図６は、競合オリゴが固相支持体捕捉部分を含む本発明の実施形態を例示する。
【図７】図７は、競合オリゴがビオチン捕捉部分を含む本発明の実施形態を例示する。
【図８】図８は、競合オリゴが捕捉配列捕捉部位を含む本発明の実施形態を例示する。
【図９】図９は、スペーサー部位を含む競合オリゴを合成するための例示的なスキームを例示する。
Claims (26)
- 二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）第一鎖および第二鎖を含む二本鎖標的核酸を、該第一鎖が該第二鎖から解離し、そして競合オリゴとハイブリダイズして第一鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖を形成する条件下で、該第一鎖にハイブリダイズし得る該競合オリゴと接触させる工程；ならびに
（ｉｉ）該ヘテロ二重鎖または該解離した第二鎖を単離する工程、
を包含する、方法。 - 二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）該二本鎖標的核酸を、第一鎖および第二鎖に解離させる工程；
（ｉｉ）該解離した標的核酸を、第一鎖：競合オリゴヘテロ二重鎖形成に有利であり、かつ該第一鎖と該第二鎖との再アニーリングに不利である条件下で、該第一鎖にハイブリダイズし得る競合オリゴに接触させる工程；ならびに
（ｉｉｉ）該ヘテロ二重鎖または該解離した第二鎖を単離する工程、
を包含する、方法。 - 工程（ｉｉ）において前記へテロ二重鎖が単離される、請求項１または２に記載の方法。
- 前記ヘテロ二重鎖を解離させる工程および前記第一鎖を単離する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
- 工程（ｉｉ）において、前記第二鎖が単離される、請求項１または２に記載の方法。
- 前記二本鎖標的核酸が、二本鎖ＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
- 前記二重鎖標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド二重鎖である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記競合オリゴが、７と４０との間の核酸塩基から構成される、請求項１または２に記載の方法。
- 請求項１または２に記載の方法であって、前記二本鎖標的核酸が、以下の式：
ＴＡＩＬ１−−−ＳＥＱＵＥＮＣＥ−−−ＴＡＩＬ２
ＴＡＩＬ１’−−ＳＥＱＵＥＮＣＥ’−−ＴＡＩＬ２’
を有し、ここで、
ＴＡＩＬ１は、第一のテイル核酸塩基配列を示し；
ＳＥＱＵＥＮＣＥは、標的核酸塩基配列を示し；
ＴＡＩＬ２は、第二のテイル核酸塩基配列を示し；
ＴＡＩＬ１’は、ＴＡＩＬ１に相補的な核酸塩基配列を示し；そして
ＳＥＱＵＥＮＣＥ’は、ＳＥＱＵＥＮＣＥに相補的な核酸塩基配列を示し；
ＴＡＩＬ２’は、ＴＡＩＬ２に相補的な核酸塩基配列を示す、方法。 - 前記競合オリゴの一部がＴＡＩＬ１にハイブリダイズし得、かつ該競合オリゴの別の部分がＴＡＩＬ２にハイブリダイズし得る、請求項９に記載の方法。
- 前記競合オリゴの一部がＴＡＩＬ１’にハイブリダイズし得、かつ該競合オリゴの別の部分がＴＡＩＬ２’にハイブリダイズし得る、請求項９に記載の方法。
- ＴＡＩＬ１およびＴＡＩＬ２が、標準的でない合成核酸塩基を含む、請求項９に記載の方法。
- ＴＡＩＬ１およびＴＡＩＬ２が、互いに相補的でない、請求項９に記載の方法。
- 前記競合オリゴが、捕捉部分を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記捕捉部分が、互いに特異的に結合する分子対の一方のメンバーである、請求項１４に記載の方法。
- 前記捕捉部分がビオチンである、請求項１５に記載の方法。
- 前記部分が固体支持体である、請求項１４に記載の方法。
- 前記固体支持体が磁性である、請求項１７に記載の方法。
- 前記捕捉部分が捕捉配列である、請求項１４に記載の方法。
- 前記捕捉部分が荷電基である、請求項１６に記載の方法。
- 前記競合オリゴが、前記二本鎖標的核酸の前記第一鎖または前記第二鎖のみにハイブリダイズし得る、請求項１または２に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、０〜１０ｍＭの範囲のカチオン強度、６〜８の範囲のｐＨ、および２０〜４０℃の範囲の温度で実行される、請求項１または２に記載の方法。
- 前記競合オリゴがＰＮＡであり、必要に応じて１〜４個の正に荷電した核酸塩基内結合を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記競合オリゴが、標準的でない合成核酸塩基を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 二本鎖標的核酸の一方の鎖を単離する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該二本鎖標的核酸を、第一鎖および第二鎖に解離させる工程；
（ｉｉ）該解離した標的核酸を、動力学的に競合オリゴ：第一鎖ハイブリッド形成に有利であり、かつ動力学的に該第一鎖と該第二鎖との再アニーリングに不利である条件下で、該第一鎖のみにハイブリダイズし得る競合オリゴと接触させる工程であって、該競合オリゴは、競合オリゴ：第一鎖ハイブリッドの捕捉を促進する部分と結合体化されている、工程；ならびに
（ｉｉｉ）該競合オリゴ：第一鎖ハイブリッドを捕捉する工程、
を包含する、方法。 - 前記競合オリゴがＰＮＡである、請求項２５に記載の方法。
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