CN111094586A - 用于分离不对称核酸复合物的方法和组合物 - Google Patents

用于分离不对称核酸复合物的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本公开内容提供了用于分离不对称带引物和/或不对称加标签的核酸复合物的改进的方法，其可用于下游分析型分析，包括序列分析。还提供了包含此类复合物的组合物，以及用于产生此类复合物的试剂盒和系统。

Description

用于分离不对称核酸复合物的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月18日提交的题为“用于分离不对称核酸复合物的方法和组合物(Methods and Compositions for Isolating Asymmetric Nucleic AcidComplexes)”的美国临时专利申请62/534,065的优先权权益，其全部内容通过引用方式纳入本文。
背景技术
理解作为所有生命框架蓝图的遗传密码的能力已在无数领域取得了无数进步。从诊断疾病的能力到鉴定进化联系和/或多样性的能力，再到开发新材料和新组合物时操作遗传框架的能力，这种理解为无数的、已造福人类并将继续造福人类的进步打开了大门。
这些进步不可或缺的是针对遗传密码的读取和/或表征的技术的进步。例如，核酸测序技术的发展已经允许一个碱基接一个碱基地鉴定构成遗传密码的核酸序列，以至阐明整个人类基因组。其它进展包括基于快速阵列的技术，该技术允许合理方便地从患者或其它生物样品中鉴定遗传模式。
随着每一项技术进步，都有机会通过与这些先进领域相关联的相关或辅助性技术的进步来进一步改善现有技术。例如，荧光染料化学的进步通过允许对生物反应及其产物进行简单的光学分析，推动了遗传技术的许多进步。同样，微流体技术的发展为流体和试剂处理方面的进步提供了可重复性，这是以前无法通过更常规的手段实现的。
如下详述，本公开内容提供了用于分离特定核酸复合物的改进方法，其可用于许多下游分析中，包括单分子序列分析。
发明概述
本公开内容提供了用于分离不对称带引物(asymmetrically-primed)和/或不对称加标签(asymmetrically-tagged)的核酸复合物的改进的方法，其可用于下游分析型分析，包括序列分析。还提供了包含此类复合物的组合物，以及用于产生此类复合物的试剂盒和系统。
本公开内容的方面包括一种用于分离不对称带引物的核酸模板的方法，该方法包括：获得样品，所述样品包含对称带引物的核酸模板和不对称带引物的核酸模板的混合物，其中所述核酸模板包含两端带有发夹衔接子的双链插入物区域，其中各对称带引物的核酸模板包含与两个末端发夹衔接子杂交的捕获引物或与两个末端发夹衔接子杂交的合成引物，并且其中各不对称带引物的核酸模板包含在一端与发夹衔接子杂交的捕获引物和在相对端与发夹衔接子杂交的合成引物；使样品与固体支持物接触，所述固体支持物包含对捕获引物上的捕获区域具有特异性的固定的结合部分，由此将捕获引物杂交的核酸模板固定至固体支持物；在促进从合成引物进行核酸合成的条件下，使固体支持物上固定的核酸模板与具有链置换活性的核酸聚合酶接触；和，通过所述核酸聚合酶的链置换活性，收集从固体支持物固定的捕获引物洗脱的核酸模板，由此分离不对称带引物的核酸模板。
在某些实施方式中，不对称带引物的核酸模板用包含引物结合位点的第一发夹衔接子对称加标签，其中捕获引物和合成引物对引物结合位点具有特异性，并且其中捕获引物和合成引物无法同时结合至同一引物结合位点。
在某些实施方式中，样品是通过在核酸杂交条件下使对称加标签的核酸模板与捕获引物和合成引物接触而获得。
在某些实施方式中，捕获引物和合成引物的摩尔比为1:1。
在某些实施方式中，对称带引物的核酸模板用第一发夹衔接子或第二发夹衔接子对称加标签，而不对称带引物的核酸模板用第一发夹衔接子在一端和第二发夹衔接子在相对端不对称加标签，其中第一发夹衔接子包含对合成引物具有特异性的合成引物结合位点，第二发夹衔接子包含对捕获引物具有特异性的捕获引物结合位点。
在某些实施方式中，样品通过将捕获引物和合成引物退火至对称加标签和不对称加标签的核酸模板的混合物来获得。
在某些实施方式中，在从固体支持物洗脱核酸模板后，允许核酸合成继续进行。
在某些实施方式中，捕获引物上的捕获区域是固体支持物上固定的结合部分的结合伴侣。
在某些实施方式中，结合伴侣选自下组：核苷酸序列、抗原、抗体或其结合片段、亲和素、链霉亲和素和生物素。
本公开内容的方面包括一种用于分离具有核酸合成能力的核酸模板的方法，该方法包括：获得样品，该样品包含不对称加标签的核酸模板，各所述模板包含双链插入物区域、位于一端的第一发夹衔接子和位于相对端的第二发夹衔接子，其中所述第一发夹衔接子包含合成引物结合位点和位于所述合成引物结合位点3'的捕获引物结合位点；在核酸杂交条件下使核酸样品与对捕获引物结合位点具有特异性的捕获引物接触；通过捕获引物上的捕获区域将捕获引物杂交的核酸模板固定至固体支持物；在促进从与合成引物结合位点杂交的合成引物进行核酸合成的条件下，使固定于固体支持物的核酸模板与具有链置换活性的核酸聚合酶接触；和，通过核酸聚合酶的链置换活性收集从固体支持物洗脱的核酸模板，由此分离具有核酸合成能力的核酸模板。
在某些实施方式中，在第一接触步骤中使合成引物与样品和捕获引物接触。
在某些实施方式中，在固定步骤之后，在核酸杂交条件下使合成引物与样品接触。
在某些实施方式中，捕获引物通过捕获区域共价结合至固体支持物。
在某些实施方式中，捕获引物通过捕获区域非共价结合至固体支持物。
在某些实施方式中，固体支持物包含针对捕获引物上的捕获区域的结合伴侣。
在某些实施方式中，结合伴侣选自下组：核苷酸序列、抗原、抗体或其结合片段、亲和素、链霉亲和素和生物素。
在某些实施方式中，样品还包含对称加标签的核酸模板，各所述模板在两端包含第一发夹衔接子或在两端包含第二发夹衔接子，其中第二发夹衔接子包含第二捕获引物结合位点，其中，在第一接触步骤之前，该方法还包括：在核酸杂交条件下使核酸样品与对第二捕获引物结合位点具有特异性的第二捕获引物接触；通过第二捕获引物上的捕获区域将第二捕获引物杂交的核酸模板固定至第二固体支持物；和，洗脱并收集与第二固体支持物结合的核酸模板。
在某些实施方式中，第二捕获引物通过第二捕获引物上的捕获区域共价结合至第二固体支持物。
在某些实施方式中，第二捕获引物通过第二捕获引物上的捕获区域非共价结合至第二固体支持物。
在某些实施方式中，第二固体支持物包含针对第二捕获引物上的捕获区域的结合伴侣。
在某些实施方式中，结合伴侣选自下组：核苷酸序列、抗原、抗体或其结合片段、亲和素、链霉亲和素和生物素。
在某些实施方式中，不通过链置换核酸合成实现从第二固体基质的洗脱。
在某些实施方式中，链置换聚合酶是Φ29DNA聚合酶、Φ29DNA聚合酶的同源物、Φ29DNA聚合酶的修饰形式或Φ29DNA聚合酶的同源物的修饰形式。
在某些实施方式中，对分离的核酸模板进行序列分析。
在某些实施方式中，序列分析包括边合成边测序(sequencing-by-synthesis)测序反应。
在某些实施方式中，洗脱后与模板核酸相关联的核酸聚合酶被用于边合成边测序测序反应中。
在某些实施方式中，测序反应是单分子实时测序反应。
在某些实施方式中，序列分析包括基于纳米孔的测序反应。
本公开内容的方面包括一种试剂盒，所述试剂盒包含：含有引物结合位点的第一发夹衔接子；对引物结合位点具有特异性的捕获引物；和，对引物结合位点具有特异性的合成引物；其中，捕获引物和合成引物无法同时结合至同一引物结合位点。
本公开内容的方面包括一种试剂盒，所述试剂盒包含：含有合成引物结合位点和捕获引物结合位点的第一发夹衔接子，其中所述捕获引物结合位点位于所述合成引物结合位点的3'；第二发夹衔接子；对捕获引物结合位点具有特异性的捕获引物；和，对合成引物结合位点具有特异性的合成引物。
在某些实施方式中，所述试剂盒还包含固体基质，其包含对捕获引物上的捕获区域具有特异性的固定的结合伴侣。
在某些实施方式中，捕获引物共价附连至固体基质。
本公开内容的方面包括一种试剂盒，所述试剂盒包含：第一发夹衔接子，其包含合成引物结合位点和第一捕获引物结合位点，其中所述第一捕获引物结合位点位于所述合成引物结合位点的3'；第二发夹衔接子，其包含第二捕获引物结合位点；对第一捕获引物结合位点具有特异性的第一捕获引物；对第二捕获引物结合位点具有特异性的第二捕获引物；和，对合成引物结合位点具有特异性的合成引物。
在某些实施方式中，试剂盒还包括：第一固体基质，其包含对第一捕获引物上的第一捕获区域具有特异性的固定的结合伴侣；和，第二固体基质，其包含对第二捕获引物上的第二捕获区域具有特异性的固定的结合伴侣。
在某些实施方式中，第一捕获引物共价附连至第一固体基质。
在某些实施方式中，第二捕获引物共价附连至第二固体基质。
在某些实施方式中，试剂盒还包含链置换聚合酶。
在某些实施方式中，链置换聚合酶是Φ29DNA聚合酶、Φ29DNA聚合酶的同源物、Φ29DNA聚合酶的修饰形式或Φ29DNA聚合酶的同源物的修饰形式。
在某些实施方式中，试剂盒还包含用于进行核酸合成反应的一种或多种试剂和/或缓冲剂。
在某些实施方式中，试剂盒还包含用于将发夹衔接子附连至线性双链核酸的一种或多种试剂和/或缓冲剂。
在某些实施方式中，试剂盒还包含用于核酸分离、核酸富集和/或核酸大小选择的一种或多种组分。
附图说明
图1显示了用于从包含对称加标签的核酸模板的核酸样品分离不对称带引物的核酸的工作流程的实施方式，其采用与捕获区域可裂解地连接的(cleavably-linked)合成引物。
图2显示了使用链置换核酸合成从包含对称加标签的核酸模板的核酸样品分离不对称带引物的核酸的工作流程的实施方式。
图3显示了使用链置换核酸合成从包含对称加标签和不对称加标签的核酸模板的混合物的核酸样品分离不对称带引物的核酸的工作流程的实施方式。图4显示了使用链置换核酸合成从包含对称加标签和不对称加标签的核酸模板的混合物的核酸样品分离不对称带引物的核酸的工作流程的实施方式。
图5显示了使用链置换核酸合成从包含对称加标签和不对称加标签的核酸模板的混合物的核酸样品分离不对称带引物的核酸的工作流程的实施方式。
图6显示了使用链置换核酸合成从包含对称加标签和不对称加标签的核酸模板的混合物的核酸样品分离不对称带引物的核酸的工作流程的实施方式。
图7显示了使用链置换核酸合成从包含对称加标签和不对称加标签的核酸模板的混合物的核酸样品分离不对称带引物的核酸的工作流程的实施方式。
图8显示了使用链置换核酸合成从包含对称加标签和不对称加标签的核酸模板的混合物的核酸样品分离不对称带引物的核酸的工作流程的实施方式，其中衔接子中一种是发夹衔接子，另一种是Y型衔接子。
图9显示了按如下方式处理的对称加标签核酸模板的琼脂糖凝胶分析(如实施例1中所述)：仅带合成引物且无核酸合成的核酸模板(泳道1)；仅带合成引物且在核酸合成之后的核酸模板(泳道2)；在无核酸合成的情况下，带合成引物和捕获引物的1:1混合物的核酸模板(泳道3)；和，在核酸合成之后，带合成引物和捕获引物的1:1混合物的核酸模板(泳道4)。指示了与延伸和非延伸模板相对应的条带。
图10显示了来自对称加标签的核酸模板的
Figure BDA0002414386240000061
测序结果，其实对称带引物的。
图11显示了来自不对称加标签的核酸模板的
Figure BDA0002414386240000062
测序结果，其实不对称带引物的。
图12显示了使用MagBead加载的来自不对称加标签、带引物和分离的核酸模板的
Figure BDA0002414386240000063
测序结果。
图13显示了使用扩散加载(Diffusion loading)的来自不对称加标签、带引物和分离的核酸模板的
Figure BDA0002414386240000064
测序结果。
具体实施方式
除非另有说明，否则本发明的实施可采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述，其在本领域技术范围内。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接、噬菌体展示以及使用标记物的杂交检测。合适的技术的具体说明可以参考下文实施例。然而，当然也可使用其它等效的常规操作。可以在标准实验室手册中找到此类常规技术和说明，例如《基因组分析：实验室手册系列》(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)(第I至IV卷)，《使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies:A Laboratory Manual)，《细胞：实验室手册》(Cells:ALaboratory Manual)，《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer:A Laboratory Manual)和《分子克隆：实验手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(均来自冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))，Stryer,L.(1995)《生物化学》(Biochemistry)(第4版)费曼出版社(Freeman)，纽约，Gait,"《寡核苷酸合成：实用方法》(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)"1984,IRL出版社，伦敦，Nelson和Cox(2000)，Lehninger,《生物化学原理》(Principles of Biochemistry)(第3版)，WH费曼出版社(W.H.Freeman Pub.)，纽约州纽约，和Berg等.(2002)《生物化学》(Biochemistry)(第5版)，WH费曼出版社，纽约州纽约，上述文献均通过引用其全文的方式纳入本文用于所有目的。
注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“聚合酶”是指一种试剂或这些试剂的混合物，并且提及“方法”包括提及本领域技术人员已知的等效步骤和方法等。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。为了描述和公开出版物中描述的并且可与本文描述的发明结合使用的装置、组合物、制剂和方法的目的，本文提及的所有出版物通过引用方式纳入本文。
应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、到下限单位的十分之一的各中间值，以及所述范围的任何其它标注或中间值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所含限值之一个或两个的范围。
在下文描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明的更透彻的理解。然而，对于本领域的技术人员显而易见的是，可以在没有这些具体细节中的一个或多个的情况下实践本发明。在其它情况下，未赘述本领域技术人员公知的众所周知的特征和操作，以避免使本发明晦涩难懂。
如本文所用，术语“包括”或“包含”意在表示所述组合物和方法包括所提及的要素，但并不排除其它要素。当用以定义组合物和方法时，“基本由……组成”应表示排除对于该组合物和方法具有任何基本意义的其它要素。“由……组成”表示排除多于所要求保护的组合物的其它成分的微量元素和基本方法步骤。通过各这些转换术语定义的实施方式在本发明范围内。因此，意图是所述方法和组合物可以包括另外的步骤和组分(包含)或者可选地包括不重要的步骤和组合物(基本上由......组成)或者仅包括所述方法步骤或组合物(由...组成)。
所有指定数值例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都涵盖(+)或(-)0.1的增量变动的近似值。应理解，尽管并非均为明示，所有指定数值之前都有“约”。术语“约”在诸如“X+0.1”或“X-0.1”这样“X”的微小改变之外还包括精确的“X”值。还应理解，尽管并非均为明示，本文述及的试剂仅仅是示例性的，其等同物是本领域所知的。
本文中的“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”或语法等同形式是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸一般将包含磷酸二酯键，尽管在某些情况下，包括可能具有替代主链的核酸类似物，包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和肽核酸(PNA)主链和联接。其它类似物核酸包括具有正义主链；非离子主链和非核糖主链的那些，包括美国专利号5,235,033(标题为“α-吗啉代核糖核苷衍生物及其聚合物(Alpha-morpholinoribonucleoside derivatives and polymers thereof)”)和美国专利号5,034,506(标题为“具有非手性亚单位间联接的不带电的基于吗啉代的聚合物(Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages)”)中描述的那些。模板核酸还可具有其它修饰，例如包含杂原子、附连标记物(例如染料)，或被官能团取代，其将仍允许碱基配对和酶的识别。
在本公开内容中使用的经设计以在合适严谨杂交条件下与靶核酸中的具有足够互补性的核酸序列特异性退火的寡核苷酸在本文中有时称为“引物”，而与它们退火的序列称为“引物结合位点”。因此，对核酸中的引物结合位点(例如衔接子中的引物结合位点)“具有特异性”的引物是包含在合适严谨杂交条件下优先与该引物结合位点杂交的核酸序列的引物。合适严谨杂交条件由本领域普通技术人员常规确定。与引物结合位点杂交的引物中的核酸序列在本文有时称为“引物区域”或类似短语。引物通常包括不直接参与与引物结合位点杂交的区域，其在本文所述方法中可能具有特定用途。引物可用于不同的功能，包括但不限于核酸合成和/或捕获包含其同源(cognage)引物结合位点的核酸。例如，“捕获引物”(或“捕获寡核苷酸”)可用于分离含有特定捕获引物结合位点(例如存在于衔接子序列中)的核酸，并且通常包含结合对(binding pair)的第一成员(例如核酸序列、生物素、亲和素、抗原、抗体或其结合片段等)或直接附连至固体支持物。作为另一个例子，“合成引物”是可用于通过核酸聚合酶(在核酸合成条件下)引发核酸合成的引物，并且在某些特定应用中，可以被用作边合成边测序(SBS)应用中的测序引物。
如本文所用，“基本上相同”的核酸是与参比核酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的核酸。比较的长度优选是核酸的全长，但一般是至少20个核苷酸，30个核苷酸，40个核苷酸，50个核苷酸，75个核苷酸，100个核苷酸，125个核苷酸或更多。
“不对称核酸”是指与核酸的第二端相比在核酸的第一端具有不同核酸组成的核酸。在某些实施方式中，位于第一端的核酸组成包含在第二端不存在的第一退火寡核苷酸。第二端可具有与第一退火寡核苷酸相比有至少一个差异的第二退火寡核苷酸，例如核酸序列差异或核酸修饰差异，例如甲基化差异，附连结合部分(例如生物素)的差异等。此类不对称核酸一般被称为“不对称带引物的核酸”。不对称带引物的核酸本身可以是对称加标签的，即具有在第一和第二端均有相同序列的衔接子的核酸，或可以是不对称加标签的，即具有附连至第一端的第一衔接子和附连至第二端的第二衔接子，其中第一衔接子和第二衔接子具有至少一个核酸组成差异。第一衔接子和第二衔接子之间的核酸组成差异可以是任何所需差异，包括但不限于，一个或多个核酸序列差异(例如，取代、缺失、插入、倒置、重排(例如，功能结构域的不同顺序)，或其任何组合)，或核酸修饰差异。在某些实施方式中，并且如本文所详述，对称加标签的核酸可以通过使它们与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的混合物接触而不对称带引物，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸均对同一引物结合位点具有特异性(即，它们均具有在合适杂交条件下与衔接子中的引物结合位点充分互补以退火的序列)但具有至少一个差异(例如，不同的核酸序列和/或修饰)。在某些实施方式中，并且如本文所详述，不对称加标签的核酸在一端包含第一引物结合位点且在第二端包含与不同寡核苷酸序列结合的第二引物结合位点。因此，在合适杂交条件下，使这种不对称加标签的核酸与对第一引物结合位点具有特异性的第一寡核苷酸和对第二核酸结合位点具有特异性的第二寡核苷酸接触，将产生不对称带引物的核酸。
“结合对”是指在至少一个结合条件下彼此特异性结合的任何两个部分。结合对的成员包括但不限于：互补单链核酸序列、生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素、抗原/抗体、半抗原/抗体(例如洋地黄毒苷/抗洋地黄毒苷抗体)、配体/受体、洋地黄毒苷等。(注意，可以使用抗体的抗原/半抗原结合片段而不是整个抗体。)
“接头”是指作用为将第一功能元件或部分附连到另一个上的部分。关于将核酸结构域彼此附连或附连至不同的部分，接头可以是其它核苷酸碱基(DNA、RNA、PNA等)、肽、碳链、聚乙二醇间隔子等。功能元件/部分与接头的附连可以是共价的或非共价的。在这方面没有限制的意图。
“链置换核酸聚合酶”、“链置换聚合酶”及其等同形式指具有5'至3'模板依赖性核酸合成活性和5'至3'链置换活性的核酸聚合酶。因此，当此类聚合酶在核酸合成过程中遇到模板的双链区域时，它将取代非模板链，同时在模板链上继续核酸合成。在环形模板上(例如，具有在两端带有发夹衔接子的双链插入物的模板，如附图所示)，这样的聚合酶可以在合适的核酸合成条件下进入滚环复制。尽管可以使用任何合适的链置换核酸聚合酶，但是在某些实施方式中，聚合酶是Φ29(phi29)DNA聚合酶或其修饰形式。在使用修饰的重组029DNA聚合酶的情况下，它可以与野生型或核酸外切酶缺陷型Φ29DNA聚合酶同源，例如，如美国专利号5,001,050(标题为“ΡΗΦ29DNA聚合酶(ΡΗΦ29DNA polymerase)”)、5,198,543(标题为“PHI29 DNA聚合酶(PHI29 DNA polymerase)”)，或5,576,204(标题为“Φ29DNA聚合酶(Φ29DNA polymerase)”)中所述，所述文献通过引用其全文方式纳入本文用于所有目的。或者，修饰的重组DNA聚合酶可与其它029型DNA聚合酶(例如B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，Gl，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722，L17，Φ21等)同源。关于命名，还参见Meijer等.(2001)"Φ29噬菌体家族(Φ29Family of Phages)"Microbiology and Molecular Biology Reviews,65(2):261-287。合适的聚合酶描述于例如美国专利号8,420,366和8,257,954，均题为"在单分子测序中产生修饰的聚合酶以提高准确性(Generation of modified polymerases for improved accuracy in singlemolecule sequencing)"，通过引用其全文的方式纳入本文用于所有目的。也可以使用其它链置换聚合酶，例如，见述于：美国专利号8,936,926(题为"活性表面偶联聚合酶(Activesurface coupled polymerases)")、美国专利申请公开号2010/0260465(题为"优化表面附连蛋白质活性的蛋白质工程改造策略(Protein engineering strategies to optimizeactivity of surface attached proteins)")和美国专利号8,921,086(题为"用于核苷酸类似物引入的聚合酶(Polymerases for nucleotide analogue incorporation)")，其均通过引用其全文的方式纳入本文用于所有目的。在某些实施方式中，根据本公开内容的方面产生的聚合酶/模板复合物直接用于边合成边测序反应，例如，
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测序反应(加州太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences of California,Inc)。
I.概述
如上所述，本公开内容一般涉及用于分离不对称带引物的核酸的改进方法，此类核酸的组合物以及用于进行所述方法的试剂和试剂盒。分离的不对称带引物的核酸可用于许多不同的下游应用中，包括用作进行核酸序列分析的模板。
本文所述的方法可以用于从核酸样品(例如核酸文库)分离不对称带引物的核酸，所述核酸样品包含对称加标签的核酸(在各端具有相同衔接子的核酸)或包含不对称加标签的核酸模板(例如，在一端具有第一衔接子且在另一端具有第二衔接子的核酸，其中第一和第二衔接子具有至少一个核酸序列/修饰差异)。在一些实施方式中，核酸样品包含对称加标签和不对称加标签的核酸的混合物。
一般而言，经历本文所述的分离工作流程的核酸模板包含双链区域(例如，双链核酸插入物)，其在至少一端具有发夹。发夹可使用任何合适的方法来生成。在一些实施方式中，如本领域中已知的，通过将发夹衔接子连接至片段的相容端，例如通过平端或粘端连接，而在双链核酸片段上产生发夹。发夹衔接子的连接产生核酸模板，该模板在至少一端上包含单链区域，其连接双链核酸插入物的两条链(将插入物第一链的3'端与该插入物的杂交互补链的5'端相连)。可以采用在核酸上产生发夹的其它方法。
核酸模板的一端或两端可具有发夹。在某些实施方式中，核酸模板在两端具有发夹衔接子，由此使模板核酸呈环状形式。可用于本公开内容中的环状核酸包括
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模板，其是具有中央双链区域并且在双链区域的各端具有发夹区域的核酸。环状模板如
Figure BDA0002414386240000113
模板的制备和使用见述于例如美国专利号8,003,330(题为“用于克隆测序的DNA的无错扩增(Error-free amplification of DNA for clonalsequencing)”)和美国专利号8,236,499(题为“用于核酸样品制备的方法和组合物(Methods and compositions for nucleic acid sample preparation)”)，所述文献通过引用其全文方式纳入本文用于所有目的。SMRTBELL模板的一个优点是，它可以由双链核酸文库(例如，DNA片段)制成。例如，可以通过已知方法(例如通过剪切或通过使用限制性酶)将基因组DNA的样品片段化成DNA片段的文库。可以将DNA片段的文库与发夹衔接子在片段的各端连接，以生成
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模板文库。发夹衔接子在发夹内提供单链区域。通过对所有片段使用相同的发夹衔接子，发夹衔接子为所有序列的通用加引物提供了位置。
本公开内容提供了用于核酸测序的样品制备方法，其中分离了不对称带引物的含发夹的核酸模板。这种不对称带引物可用于许多下游应用，包括仅从一个方向(而不是从模板的两端)对模板进行测序。这在边合成边测序方法中对环状模板进行测序时尤其有用，其中，测序过程中，多重聚合酶作用于单一模板上会导致过早终止或其它干扰。改进的带引物的模板允许产生更长的测序读数(即，更长的读数长度)，因此将有益于许多测序应用，包括通过允许分析相距较远的条码或通过允许较短环状模板上的一个或多个条码的多重读数来实现改进的条码测序和解卷积。较长的测序读数还将有益于基因组组装和全长转录本测序方法。
将参考附图描述本文公开的方法的多个方面。应理解，附图仅显示公开的方法的特定实施方式，而无意于进行限制。
如上所概述，并在下文进一步详细描述，根据本发明的对称加标签和不对称加标签的核酸均可用作模板以生成和分离不对称带引物的核酸模板。在许多方面，用于分离不对称带引物的核酸模板的方法包括，通过核酸聚合酶的链置换活性，通过与捕获引物杂交来洗脱固定在固体支持物上的模板。该步骤不仅导致所需模板的分离，而且还用作质量控制步骤，确保洗脱的模板能够通过双链插入物区域的至少一条或两条链支持核酸合成。该质量控制步骤可移除损坏的模板，损坏的模板对于下游工艺(例如测序反应，包括单分子测序反应(例如
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测序或纳米孔测序))是不希望的。
II.核酸模板的产生
通用方法通常以具有确定端的双链核酸片段开始，所述端可以是钝端或具有已知突出端序列(5'或3'突出端)的端。这些核酸片段可以具有任何大小或大小范围，并且可包括DNA、RNA、DNA-RNA杂合体(例如，在cDNA制备过程中通过第一链合成产生的分子具有一条mRNA链和一条互补DNA链)、基因组DNA、cDNA、mRNA、tRNA等。在一些实施方式中，片段的核苷酸序列是未知的。
在某些实施方式中，本公开内容的方法和组合物中使用的双链核酸片段包含获自样品的核酸。样品可包含许多东西，包括但不限于：体液(包括但不限于血液，尿液，血清，淋巴液，唾液，肛门和阴道分泌物，汗液和精液)，和几乎任何生物体(例如，哺乳动物，包括人类)的细胞；环境样品(包括但不限于空气，农业，水和土壤样品)；生物战剂样品；研究样品；扩增反应的产物(包括靶标和信号扩增，例如PCR扩增反应)；纯化的样品(例如，纯化的基因组DNA，原始样品(细菌，病毒，基因组DNA等))。如本领域技术人员将理解的，几乎可以对样品进行任何实验操作。
当用于公开的方法中时，基因组DNA可通过三个步骤从任何来源制备：细胞裂解，脱蛋白和DNA回收。这些步骤适合于应用的要求，所需的DNA产量、纯度和分子量，以及来源的量和历史。关于基因组DNA分离的更多细节可见述于：Berger和Kimmel,《分子克隆技术指南，酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology)，第152卷，学术出版社公司(Academic Press,Inc.)，加利福尼亚州圣迭戈(Berger)；Sambrook等,《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第3版)，第1-3卷，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约冷泉港，2008("Sambrook")；《新编分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology),F.M.Ausubel等编,《新编方案》(Current Protocols),格林出版协会公司(Greene Publishing Associates,Inc.)与约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc)合资("Ausubel")；Kaufman等.(2003)《生物和医学分子和细胞方法手册》(Handbook of Molecular and Cellular Methods inBiology and Medicine)，第二版，Ceske(编)CRC出版社(Kaufman)；和《核酸方案手册》(TheNucleic Acid Protocols Handbook)Ralph Rapley(编)(2000)冷泉港(Cold SpringHarbor)，胡马那出版公司(Humana Press Inc)(Rapley)。另外，用于从细胞纯化基因组DNA的许多试剂盒是市售可得的，包括可从普洛麦格公司(Promega)获得的WizardTM基因组DNA纯化试剂盒；可从生物辐射公司获得的Aqua PureTM基因组DNA分离试剂盒；可从英杰公司(Invitrogen)获得的Easy-DNATM试剂盒；和可从凯杰公司(Qiagen)获得的DnEasyTM组织试剂盒。或者或此外，可通过靶向捕获方案获得靶核酸片段，其中靶核酸最初以微阵列上的单链区段或其它捕获技术获得，然后扩增捕获的物质以产生双链样品物质。各种这样的捕获方案已描述于，例如，Hodges E等.Nat.Genet.2007年11月4日,Olson M.,Nature Methods2007年11月；4(l l):891-2,Albert TJ等.Nature Methods 2007年11月；4(l l):903-5,和Okou DT等.Nature Methods 2007年11月；4(11):907-9。
可用于本文所述方法的核酸也可源自cDNA，例如由从例如真核对象或衍生自真核对象的特定组织获得的mRNA制备的cDNA。例如使用高通量测序系统对衍生自cDNA文库的核酸模板进行测序而获得的数据可用于鉴定例如感兴趣基因的新型剪接变体或用于比较差异表达，例如感兴趣基因的剪接同种型的差异表达，例如不同组织类型之间，相同组织类型的不同处理之间或相同组织类型的不同发育阶段之间的差异表达。
通常可以使用例如Sambrook和Ausubel中描述的方案和方法从几乎任何来源分离mRNA。分离的mRNA的产量和质量可取决于例如在RNA提取之前如何贮存组织，在RNA提取期间破坏组织的方式或取决于从中提取RNA的组织的类型。可以相应地优化RNA分离方案。许多mRNA分离试剂盒是市售可得的，例如，mRNA-ONLYTM原核mRNA分离试剂盒和mRNA-ONLYTM真核mRNA分离试剂盒(艾匹森特生物技术公司(Epicentre Biotechnologies))，FastTrack2.0mRNA分离试剂盒(英杰公司(Invitrogen))和Easy-mRNA试剂盒(生物链公司(BioChain))。另外，来自各种来源(例如牛，小鼠和人，以及组织，例如大脑，血液和心脏)的mRNA可商购自例如生物链公司(BioChain)(加利福尼亚州海沃德)，安必恩公司(Ambion)(德克萨斯州奥斯汀)和克隆泰克公司(Clontech)(加利福尼亚州山景市)。
一旦纯化的mRNA被回收，逆转录酶即被用于从mRNA模板产生cDNA。从例如由原核生物和真核生物收获的mRNA产生cDNA的方法和方案详述于《cDNA文库方案》，I.G.Cowell等编，胡马那出版社(Humana Press)，新泽西，1997，Sambrook和Ausubel中。此外，用于制备cDNA的许多试剂盒均市售可得，包括Cells-to-cDNATMII试剂盒(安必恩公司)，RETROscriptTM试剂盒(安必恩公司)，CloneMinerTMcDNA文库构建试剂盒(英杰公司)和Universal
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cDNA合成系统(普洛麦格公司)。许多公司，例如阿金库尔生物科学公司(Agencourt Bioscience)和克隆泰克公司(Clontech)，都提供cDNA合成服务。
在本文描述的本发明的一些实施方式中，核酸片段从基因组DNA或cDNA产生。从基因组DNA、cDNA或DNA多联体(concatemer)产生核酸片段的方法有很多种。这些包括但不限于，机械方法，例如超声处理，机械剪切，雾化，水力剪切等；化学方法，例如采用羟基自由基，Cu(II):巯基组合，重氮盐等处理；酶促方法，例如核酸外切酶消化，限制性核酸内切酶消化等；和电化学裂解。这些方法进一步阐述于Sambrook和Ausubel中。
在其它实施方式中，核酸分子获自样品并被片段化以用于本公开内容的方法。片段可根据本领域已知的和本文描述的任何方法进一步修饰。核酸片段可通过使用本领域已知的任何方法使来源核酸(例如基因组DNA)片段化来产生。在一个实施方式中，在裂解和提取基因组DNA期间的剪切力产生所需范围内的片段。本发明还包括利用限制性核酸内切酶进行片段化的方法。
双链核酸片段可以是后续应用(例如克隆，测序，转化，富集等)所需的任何长度。在某些实施方式中，片段的长度可以是约10-约50,000个及其之间的任何范围的碱基对(bp)，例如，约100-约40,000bp，约300-30,000bp，约500-20,000bp，约800-10,000bp，约1,000-8,000bp等。在某些实施方式中，双链核酸片段的平均大小为至少约100bp，至少约200，至少约300，至少约500，至少约1,000，至少约1,500，至少约2,000，至少约5,000，至少约10,000，至少约20,000等。
在某些实施方式中，片段经处理以产生钝端，该钝端适于连接至具有相容钝端的第一衔接子。可使用任何合适的产生钝端的方法，包括用具有5'和/或3'单链核酸外切酶活性的一种或多种酶(例如，大肠杆菌核酸外切酶III)处理和/或进行填充反应以延长3'凹端(例如，使用T4 DNA聚合酶)。在这方面没有限制的意图。
该方法可能需要首先将双链DNA样品片段化成双链片段，然后将发夹连接到双链片段的各端以产生功能性环状DNA模板群，其具有中央双链区域和各端的发夹区域。各端的发夹区域包括可用于带引物和捕获的单链区域。这种功能性环状构建体的产生和使用已描述于：美国专利号8,236,499(题为“用于核酸样品制备的方法和组合物(Methods andcompositions for nucleic acid sample preparation)”)和美国专利号8,153,375(题为“用于核酸测序的组合物和方法(Compositions and methods for nucleic acidsequencing)”)，所述文献通过引用其全文方式纳入本文用于所有目的。这样的结构不仅提供重复复制单一分子(并因此对该分子进行测序)的能力，而且还通过复制双链部分的有义和反义部分来提供附加冗余。在测序应用中，这种冗余测序在序列准确性方面提供了很大的优势。
两端带有发夹衔接子的DNA物质可以是对称的(两端都具有相同的发夹衔接子)，也可以是不对称的(一端的发夹衔接子与另一端的发夹衔接子不同)。在制备不对称DNA模板时，可将两种不同的发夹衔接子(衔接子1和2)混合并同时连接到双链核酸的库中。该方法可产生包含所需的不对称物质但也包含不希望的对称物质(例如，如图3所示；群体301)的样品。也可能存在其它不需要的物质，例如，没有或只有一个衔接子的物质(图3中未显示)。
可以使用可用于公开的方法中的任何制备所需核酸样品的方法。或者，用户可从第三方获得所需的核酸样品。
III.对称加标签的核酸模板
图1显示了用于分离不对称带引物核酸的工作流程的示例。在该工作流程中，包含对称加标签的核酸模板(101)的样品以任何合适的方式(例如，如本文他处所述)获得。对称加标签的核酸模板具有插入物区域(102)，其侧接包含至少一个引物结合位点(104)的相同末端衔接子区域(103)(衔接子可包括其它区域，例如条码，第二引物结合位点等)。
在步骤1中，样品在核酸杂交条件下与第一引物(105)和第二引物(106)接触，第一引物(105)和第二引物(106)分别包含在杂交条件下与样品中对称加标签的核酸模板的衔接子区域中的引物结合位点(104)杂交的区域(分别为107和108)。尽管区域(107)和(108)的核酸序列一般是相同的，但在一些实施方式中，它们是不同的。在区域(107)和(108)的核酸序列不同的情况中，将它们设计为一次只能有一种结合至给定的引物结合位点(即，它们竞争结合至引物结合位点)。
除了区域(107)之外，第一引物(105)还包括裂解位点(109)和第一捕获区域(110)(位于区域(107)的5')。由于这种取向，当引物(105)的区域(107)与其在模板(101)中的同源引物结合位点(104)结合时，其为核酸合成条件下通过核酸聚合酶进行核酸合成提供了起始位点。在某些实施方式中，引物(105)(有时称为“合成引物”)在与核酸样品接触之前与聚合酶复合，而在其它实施方式中，根据需要在随后的步骤中添加聚合酶(未显示)。当存在聚合酶时，可以阻止合成引物的聚合，直至需要这种活性的时候(参见下文)。可采用任何合适的方法来阻止来自退火的合成引物/聚合酶复合物的核酸合成。例如，缓冲液中可不含一种或多种dNTP和/或二价阳离子辅因子，直至需要核酸合成。另外或或者，可从退火的合成引物/聚合酶复合物去除合成阻遏部分，例如引物上的3'-末端双脱氧核苷酸或非互补核苷酸。在这方面没有限制的意图。
除区域(108)之外，第二引物(106)还包括位于区域(108)的3'的第二捕获区域(111)。由于区域(108)和(111)的这种取向，当与其同源引物结合位点(104)结合时，引物(106)不作为聚合酶进行核酸合成的起始位点。具体地，捕获区域(111)被设计为不以具有合成能力的方式与模板(101)中的引物结合位点(104)或与其相邻区域杂交。顾名思义，捕获区域(110)和(111)设计为允许捕获包含它的复合物，例如，与引物(105)[针对第一捕获区域(110)]或引物(106)[针对第二捕获区域(111)]杂交的核酸模板。通常，可认为捕获区域是结合对的第一成员。此外，选择捕获区域(110)和(111)以使其不结合至相同的捕获部分(或结合伴侣)，因此允许包含引物(105)对比引物(106)的复合物的差异结合。在某些实施方式中，捕获标签是引物的区域，其不与衔接子(或模板核酸中的其它序列)中的引物结合位点(104)杂交，因此在对引物中的引物结合位点具有特异性的区域与引物结合位点杂交时保持单链形式。该区域可以是DNA序列，RNA序列，DNA和RNA的组合，和/或包含不同于A、G、C、T和U的核苷酸碱基(例如肌苷)。在其它实施方式中，捕获标签包含非寡核苷酸捕获标签，包括但不限于，亲和素、链霉亲和素、生物素、洋地黄毒苷、抗原、抗体或其片段等。在一些实施方式中，捕获区域通过接头部分与捕获引物的引物结合位点特异性区域连接。可以使用任何合适的接头，包括但不限于，附加的核苷酸序列(例如，DNA、RNA等)、肽、碳链、聚乙二醇间隔子等。
因为引物(105)和(106)竞争性结合至对称加标签的核酸模板中的引物结合位点(104)，所以，在接触步骤中产生三种不同种类的引物杂交的核酸模板复合物(不包括仅具有一个或没有杂交的引物的模板)。使用引物(105)(复合物113)或引物(106)(复合物114)使两个复合物对称带引物，其具有杂交至两个末端衔接子的相同引物，而所述复合物之一是不对称带引物的(复合物112)，其在一端具有第一引物(105)且在另一端具有第二引物(106)。为了使所需的不对称带引物的种类最大化，将合成引物和捕获引物设计为具有相似的杂交特性，当与核酸样品接触时以约1:1的摩尔比存在，并且相对于样品中引物结合位点的总数处于摩尔过量状态。这些参数的合适范围常规确定于相关领域中。
在步骤2中，在允许第一捕获区域(110)与其同源结合伴侣(116)之间的结合的条件下，将包含三种引物杂交的核酸模板复合物(112、113和114)的样品与具有针对第一捕获区域(116)的固定同源结合伴侣的固体支持物(115)接触。鉴于可用的捕获区域的多样性(如上所述)，结合机理可包括核酸杂交、生物素/链霉亲和素结合、抗体/抗原结合、受体/配体结合等中的一种或多种。在这方面没有限制的意图。固体支持物可以是任何合适形式的任何合适材料，包括具有相应结合化学的表面改性的珠、树脂、纳米颗粒或平面。在三种引物杂交的核酸模板复合物(112、113和114)中，只有与第一引物(105)杂交的两种可通过捕获区域(110)与固定的结合伴侣(复合物112和113)结合。将其上没有杂交第一引物(105)的剩余复合物(114)作为上清液从混合物除去(例如在洗涤步骤中)。
在步骤3中，固定的复合物随后通过与能够裂解引物(105)中裂解位点(109)的试剂接触而从固体支持物(115)洗脱。可使用任何合适的裂解位点/裂解试剂组合。例如，在裂解位点(109)是二硫键的情况下，可使固定的复合物与二硫苏糖醇(DTT)接触。或者，在引物(105)中的裂解位点(109)是唯一的限制酶识别位点的情况下，可使固定的复合物与同源限制性酶接触。在这方面没有限制的意图。洗脱的样品包括对称带引物的核酸复合物(117)和不对称带引物的核酸复合物(118)，所述对称带引物的核酸复合物(117)具有退火至位于两端的引物结合位点(104)的引物区域(107)，所述不对称带引物的核酸复合物具有退火至位于第一端的引物结合位点(104)的引物区域(107)和退火至位于第二(相对)端的引物结合位点(104)的第二引物(106)。
随后，在步骤4中，在允许第二捕获区域(111)与其同源结合伴侣(119)之间结合的条件下，将洗脱的样品与具有针对第二捕获区域(120)的、固定的同源结合伴侣的第二固体支持物(119)接触。将其上没有杂交第二引物(106)的剩余物质(117)作为上清液从混合物除去(例如在洗涤步骤中)。然后可以按需使用所得的分离的不对称带引物的核酸复合物(118)，既可以在其固定于固体支持物上时，也可以在其洗脱之后。
在许多实施方式中，分离的不对称带引物的核酸复合物用作核酸测序反应中的模板，其中用杂交的引物区域(107)作为测序引物(因为它具有合成能力)。例如，固定的模板可以被加载到零模波导(zero-mode waveguide)中并在单分子实时测序分析(来自加州太平洋生物科学公司的
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测序)中进行测序，例如，见述于美国专利号7,315,019，题为“光学限制的阵列及其用途(Arrays of optical confinements and uses thereof)；8,153,375，题为“用于核酸测序的组合物和方法(Compositions and methods for nucleicacid sequencing)”；8,658,364，题为“聚合酶-核酸复合物的分离(Isolation ofpolymerase-nucleic acid complexes)”；和9,175,341，题为“鉴定核酸修饰的方法(Methods for identifying nucleic acid modifications)”；上述文献均通过引用其全文的方式纳入本文。
图2显示了用于分离不对称带引物的核酸的工作流程的另一个实施方式。如在图1中示例的先前实施方式中，包含对称加标签的核酸模板的样品(201)以任何合适的方式获得。对称加标签的核酸模板具有插入物区域(202)，其侧接包含至少一个引物结合位点(204)的相同末端衔接子区域(203)(衔接子可包括其它区域，例如条码，第二引物结合位点等)。
在步骤1中，在核酸杂交条件下，使样品与核酸合成引物(或“合成引物”)(205)和捕获引物(206)接触，两者都对对称加标签的核酸的衔接子区域中的引物结合位点(204)具有特异性。因此，合成引物和捕获引物都包括在杂交条件下与样品中的对称加标签的核酸模板的衔接子区域中的引物结合位点(204)杂交的区域(分别为207和208)。尽管区域(207)和(208)的核酸序列一般是相同的，但在一些实施方式中，它们是不同的。在区域(207)和(208)的核酸序列不同的情况中，将它们设计为一次只能有一种结合至给定的引物结合位点(即，它们竞争结合至引物结合位点)。顾名思义，在与其同源引物结合位点结合时，合成引物能够作为通过核酸聚合酶进行核酸合成的起始位点。在某些实施方式中，在与核酸样品接触之前或期间，合成引物与聚合酶复合，而在其它实施方式中，在发生合成引物杂交后，将聚合酶添加至接触的样品(聚合酶未示于图2中)。该工作流程中，阻止来自合成引物的聚合直至需要该活性时(见下文)。可采用任何合适的方法来阻止来自退火的合成引物/聚合酶复合物的核酸合成。例如，缓冲液中可不含一种或多种dNTP和/或二价阳离子辅因子，直至需要核酸合成。另外或或者，可从退火的合成引物/聚合酶复合物去除合成阻遏部分，例如引物上的3'-末端双脱氧核苷酸或非互补核苷酸。在这方面没有限制的意图。
如图2所示，捕获引物(206)包括捕获区域(209)，其经设计以允许捕获和分离包含它的复合物，例如，通过区域(208)与捕获引物杂交的核酸模板。通常，可认为捕获区域(209)是结合对的第一成员。在某些实施方式中，捕获区域(209)是捕获引物(206)的寡核苷酸区域，其不与引物结合位点(204)或衔接子(203)中与其相邻的区域(或模板核酸中的其它序列)杂交，因此当捕获引物(206)中的区域(208)与引物结合位点(204)杂交时，其保持为单链。该区域可以是DNA序列，RNA序列，DNA和RNA的组合，和/或包含不同于A、G、C、T和U的核苷酸碱基(例如肌苷)。在其它实施方式中，捕获区域包含非寡核苷酸结合部分，包括但不限于，亲和素、链霉亲和素、生物素、洋地黄毒苷、抗原、抗体或其片段等。在一些实施方式中，捕获区域通过接头部分与捕获引物的引物结合位点特异性区域连接。可以使用任何合适的接头，包括但不限于，附加的核苷酸序列(例如，DNA、RNA等)、肽、碳链、聚乙二醇间隔子等。具有或不具有接头的捕获区域可存在于捕获引物上的任何合适的位置，例如5'端、3'和/或捕获引物的内部位点。在一些实施方式中，接头部分和/或捕获区域用作核酸合成阻遏部分，例如，存在于捕获引物中核酸序列的3'端。
与合成引物(205)不同，且如上所述，捕获引物(206)被设计为当结合至其同源引物结合位点时不作为聚合酶核酸合成的起始位点。对于这种合成缺陷引物可使用任何合适的设计方案，包括在捕获引物(例如，捕获区域209)的3'端具有一个或多个非互补核苷酸。作为另一个实例，捕获引物可在3'端包含核酸合成阻遏部分，例如非核苷酸阻遏部分、双脱氧核苷酸、脱碱基核苷酸等。在这方面没有限制的意图。
由于合成引物和捕获引物与对称核酸模板中的引物结合位点竞争性结合，因此在接触步骤中会生成三种不同的引物杂交核酸模板复合物(不包括仅具有一个或没有杂交引物的模板)。其中所述复合物中两种是对称带引物的，带有合成引物(复合物213)或捕获引物(复合物214)，其具有与两个末端衔接子杂交的相同引物，而所述复合物中的一种是不对称带引物的(复合物212)，其一端具有合成引物，另一端具有捕获引物。为了使所需的不对称带引物的核酸模板复合物最大化，合成引物和捕获引物经设计以具有相似的杂交特性，当与核酸样品接触时以约1:1的摩尔比存在，并且相对于样品中引物结合位点总数的以摩尔过量情况存在。这些参数的合适范围常规确定于相关领域中。
在步骤2中，在允许捕获区域与其同源结合伴侣之间的结合的条件下，将包含三种引物杂交的核酸模板复合物(212、213和214)的样品与具有针对捕获区域(216)的固定同源结合伴侣的固体支持物(215)接触。鉴于可用的捕获区域的多样性(如上所述)，结合机理可包括核酸杂交、生物素/链霉亲和素结合、抗体/抗原结合、受体/配体结合等中的一种或多种。在这方面没有限制的意图。固体支持物可以是任何合适形式的任何合适材料，包括具有相应结合化学的表面改性的珠、树脂、纳米颗粒或平面。在三种引物杂交的核酸模板复合物(212、213和214)中，只有两种具有与之杂交的捕获引物的复合物能够通过捕获区域(210)与固定的结合伴侣(212和214)结合。将其上没有杂交捕获引物的剩余复合物(213)作为上清液从混合物除去(例如在洗涤步骤中)。
在步骤3中，使固体支持物与核酸合成试剂混合物接触，所述核酸合成试剂混合物支持通过链置换核酸聚合酶的来自杂交的合成引物的核酸合成。如上所述，可在之前的步骤中将聚合酶与合成引物复合。然而，在其它实施方式中，可在合成引物杂交之后的任何合适的时间，例如在与固体支持物接触之前、期间或之后，加入聚合酶。因为只有不对称带引物的核酸模板复合物(212)包含杂交的合成引物(205)，所以核酸合成(如虚线217所示)只能从结合于固体支持物的该复合物进行(从对称加标签的核酸模板复合物(214)无法起始核酸合成，因为它具有与之杂交的两个捕获引物)。除5'至3'核酸合成活性外，该方法中使用的链置换核酸聚合酶也具有5'至3'链置换活性。因此，一旦聚合酶已经通过核酸模板的插入物区域，它将在模板的相对端的衔接子中遇到杂交的捕获引物，并将其从引物结合位点(218)移开。因此，该过程导致不对称带引物的核酸模板复合物从固体支持物靶向释放至上清液中，而两端均具有杂交的捕获引物的对称带引物的核酸模板保持固定，从而分离了不对称带引物的核酸模板(步骤4，复合物219和220)。
因为链置换核酸聚合酶的活性用于从固体支持物洗脱所需模板，所以无法在杂交捕获引物上游任何位置处支持核酸合成的任何模板都不会被洗脱。例如，在杂交捕获引物上游的插入物区域中被破坏(例如，具有无碱基残基、缺口、间隙等)的不对称带引物的核酸模板将不支持核酸合成，因此不会被洗脱，即使核酸合成由聚合酶在退火的合成引物处起始也是如此。因此，该过程能用作核酸模板的附加质量控制步骤，并且在分离的模板用于后续序列分析(尤其是单分子序列分析，例如，
Figure BDA0002414386240000211
测序和基于纳米孔的测序)时特别有用。在某些实施方式中，从固体支持物洗脱后，允许核酸合成反应在不对称带引物的模板上继续。在某些实施方式中，允许核酸合成反应继续直至其遍历整个模板，包括插入物的两条链和两个衔接子区域，并进入滚环扩增(220)。一旦核酸合成反应持续了期望的时间量，就可以通过任何合适的方法，例如通过化学或物理手段，将其终止。
分离的不对称带引物的核酸模板可按用户所需用于一种或多种分析反应或过程中，包括核酸序列分析(如上所述)。可以对核酸模板本身和/或从模板合成的新生核酸链(例如，用于洗脱不对称带引物的核酸模板的链置换核酸聚合酶合成的核酸链)进行序列分析。在某些实施方式中，可对分离的不对称带引物的核酸模板进行进一步的富集/分离处理，例如处理以分离在模板的插入物区域中包含一个或多个感兴趣区域的核酸模板。
IV.不对称加标签的核酸模板
图3提供了用于分离不对称带引物的核酸模板复合物的另一种工作流程。与图1和2的工作流程不同，图3中分离的不对称带引物核酸模板是不对称加标签而不是对称加标签的。
核酸样品(301)包括核酸模板的混合物，所述核酸模板包含双链核酸插入物(302)和选自第一衔接子(303)和第二衔接子(304)的末端衔接子。衔接子(303)和(304)不同，意味着它们彼此相比具有至少一个核酸差异(例如，不同的引物结合位点)。核酸样品(301)包含至少3种不同的核酸模板结构：对称加标签的核酸模板(305)和(307)，其在相对端包括相同的衔接子(物质(305)中的衔接子(303)和物质(307)中的衔接子(304))，和，不对称加标签的核酸模板(306)，其在一端(303)包括第一衔接子，且在相对端(304)包括第二衔接子。这里要注意的是，样品中也可能存在其它不需要的模板物质，例如没有或只有一个衔接子的模板物质，但为简单起见未显示。衔接子(303)和(304)各自包含与不同同源引物退火的至少一个引物结合位点(分别为(308)和(309))，即它们在至少一个/一组合适严谨核酸杂交条件下杂交至不同引物序列。衔接子(303)和(304)除引物结合位点(308)和(309)外还可包括其它区域，包括但不限于，条码、其它不同的引物结合位点、启动子、限制酶位点等。
在步骤1中，样品(301)在核酸杂交条件下与对引物结合位点308(其因此可被视为合成引物结合位点)具有特异性的核酸合成引物(或“合成引物”)(310)和对引物结合位点309(其因此可被视为捕获引物结合位点)具有特异性的捕获引物(311)接触。因此，合成引物310和捕获引物311各自包括区域(分别为312和313)，所述区域在合适严谨杂交条件下与其在样品中的核酸模板的衔接子区域中的同源引物结合位点(分别为308和309)杂交。类似于图2中的工作流程，顾名思义，合成引物在与其同源引物结合位点(由所在箭头指示)结合时能够作为聚合酶进行核酸合成的起始位点。在某些实施方式中，在与核酸样品接触之前，合成引物与聚合酶复合，而在其它实施方式中，在发生合成引物杂交后，将聚合酶添加至接触的样品(聚合酶未显示)。该工作流程中，阻止来自合成引物的聚合直至需要该活性时(见下文)。而且，类似于图2中的工作流程，捕获引物被设计为当结合至其同源引物结合位点时不作为聚合酶核酸合成的起始位点。对于这种合成缺陷引物可使用任何合适的设计方案，包括在捕获引物的3'端具有一个或多个非互补核苷酸或具有其它非核苷酸合成阻遏部分。例如，捕获引物可在3'端包含核酸合成阻遏部分，例如，双脱氧核苷酸、脱碱基核苷酸等。顾名思义，捕获引物被设计为允许捕获和分离包含它的复合物，例如，通过捕获部分(314)与捕获引物杂交的核酸模板。因为合成引物和捕获引物结合至模板上不同衔接子中的独特引物结合位点，所以在接触步骤(315、316和317)中产生三种不同种类的带引物的核酸模板复合物，对应于样品中存在的三种不同种类的核酸模板(分别为305、306和307)。因为模板(305)和(307)在两端均具有相同的衔接子，所以同一引物会杂交至各端：具有两个杂交的合成引物的带引物的核酸模板复合物(315)和具有两个杂交的捕获引物的带引物的核酸模板复合物(317)。不同的是，因为模板(306)在各端具有不同的衔接子，所以带引物的核酸模板复合物(316)在一端具有杂交的捕获引物且在另一端具有杂交的合成引物。因此，核酸复合物(316)不对称地带引物，而核酸复合物(315)和(317)对称地带引物。
在步骤2中，在允许捕获部分与其同源结合伴侣之间的结合的条件下，将包含三种带引物的核酸模板复合物(315、316和317)的样品与具有针对捕获部分(319)的固定同源结合伴侣的固体支持物(318)接触。鉴于可用的捕获部分的多样性(如上所述)，结合机理可包括核酸杂交、生物素/链霉亲和素结合、抗体/抗原结合、受体/配体结合等中的一种或多种。在这方面没有限制的意图。固体支持物可以是任何合适形式的任何合适材料，包括具有相应结合化学的表面改性的珠、树脂、纳米颗粒或平面。在三种引物杂交的核酸模板复合物(315、316和317)中，只有两种具有与之杂交的捕获引物的复合物能够通过捕获部分(314)与同源结合伴侣(319)结合。将其上没有杂交捕获引物的剩余核酸模板复合物(315)作为上清液从混合物除去(例如在洗涤步骤中)。
在步骤3中，使固体支持物与核酸合成试剂混合物接触，所述核酸合成试剂混合物支持通过链置换核酸聚合酶的始于杂交的合成引物的核酸合成。如上所述，可以在之前的步骤中将聚合酶与合成引物复合。然而，在其它实施方式中，可在合成引物杂交之后的任何合适的时间，例如在与固体支持物接触之前、期间或之后，加入聚合酶。因为只有不对称带引物的核酸模板复合物(316)包含杂交的合成引物(310)，所以核酸合成(如虚线320所示)只能从结合于固体支持物的该复合物进行(从对称加标签的核酸模板复合物(317)无法起始核酸合成，因为它具有与之杂交的两个捕获引物)。除5'至3'核酸合成活性外，该方法中使用的链置换核酸聚合酶也具有5'至3'链置换活性。因此，一旦聚合酶已经作用通过核酸模板的插入物区域，它将在模板的相对端的衔接子中遇到杂交的捕获引物，并将其从引物结合位点移开(321)。因此，该过程导致不对称带引物的核酸模板复合物从固体支持物靶向释放至上清液中，而两端均具有捕获引物的对称带引物的核酸模板保持固定，从而分离了不对称带引物的核酸模板(步骤4，复合物322和323)。
因为链置换聚合酶的活性用于从固体支持物洗脱所需模板，所以无法在杂交捕获引物上游任何位置处支持核酸合成的任何模板都不会被洗脱。例如，在杂交捕获引物上游的插入物区域中被破坏(例如，具有无碱基残基、缺口、间隙等)的不对称带引物的模板将不支持核酸合成，因此不会被洗脱，即使核酸合成由聚合酶在退火的合成引物处启动也是如此。因此，该过程能用作模板的附加质量控制步骤，并且在分离的模板用于后续序列分析(尤其是单分子序列分析，例如，
Figure BDA0002414386240000241
测序和基于纳米孔的测序)时特别有用。在某些实施方式中，从固体支持物洗脱后，允许核酸合成反应在不对称带引物的模板上继续。在某些实施方式中，允许核酸合成反应继续直至其遍历整个模板，包括插入物的两条链和两个衔接子区域，并进入滚环扩增(323)。一旦核酸合成反应持续了期望的时间量，就可以通过任何合适的方法，例如通过化学或物理手段，将其终止。
分离的不对称带引物的核酸模板复合物可按用户所需用于一种或多种分析反应或过程中，包括核酸序列分析。在某些实施方式中，可对分离的不对称带引物的核酸模板复合物进行进一步的富集/分离处理，例如处理以分离在模板的插入物区域中包含一个或多个感兴趣区域的核酸模板。
可以对图3中的工作流程进行修改，但应仍导致不对称带引物的核酸模板复合物的分离。作为一个示例，可在杂交条件下使核酸样品仅与捕获引物接触，其固定在固体支持物上，并在与合成引物(和聚合酶)接触之前洗涤。这种修饰仍将导致三种带引物的核酸模板复合物中的两种固定化(不具有捕获引物结合位点的复合物不会结合支持物上的同源结合伴侣)。来自杂交的合成引物的后续核酸聚合将释放所需的不对称带引物的核酸模板复合物。
图4显示了图3所示工作流程的另一种替代性工作流程。在图4中，在适当的杂交条件下，将包含三种不同的加衔接子标签的核酸模板(两个对称加标签的(402和404)和一个不对称加标签的(403))的核酸样品(401)与合成引物(405)接触，由此合成引物(405)退火至引物结合位点(406)。然后将这些引物杂交的复合物与其上已固定捕获引物(409)的固体支持物(408)直接接触，以共价或非共价方式，由此使含捕获引物结合位点(407)的核酸模板固定至固体支持物(即，通过使捕获引物结合位点(407)和捕获引物(409)退火)。不含捕获引物结合位点(407)的复合物不与固体支持物结合从而被移除(例如通过洗涤)。然后，使结合的核酸模板复合物经历链置换核酸合成反应(虚线410)，由此从捕获引物(411)以及因而从固体支持物洗脱不对称带引物的核酸模板复合物。然后，洗脱的物质(412)和(413)(后者处于滚环复制模式)可按用户所需在任何所需的下游工艺中使用。注意，核酸样品与合成引物(405)和固体支持物/捕获引物(408/409)的接触可以任何合适的顺序或同时发生。在这方面没有限制的意图。
再次注意，在插入物的上链中具有在到达杂交的捕获引物之前阻止核酸合成的区域/核苷酸的不对称带引物的核酸模板复合物将不会被洗脱，例如，无碱基区域，缺口或其它缺陷。此特征使洗脱的复合物在后续序列分析(例如，
Figure BDA0002414386240000251
测序或基于纳米孔的测序)中特别有用，因为从库中移除了无法提供高质量测序数据的某些受损模板(即，留在固体支持物上)。
图5显示了另一个实施方式。核酸样品(501)类似于图3所示的样品，包括核酸模板的混合物，所述核酸模板包含双链核酸插入物(502)和末端衔接子(503)和(504)。如图所示，样品(501)包括三种类型的核酸模板：两种对称加标签的核酸模板(505和507)，其在相对的模板端包含相同的衔接子(模板505中的衔接子503和模板507中的衔接子504)，以及一种不对称加标签的核酸模板(506)，其在相对的模板端包含不同的衔接子(一端为503，另一端为504)。与图3中的衔接子(303)和(304)相似，衔接子(503)和(504)分别包括合成引物结合位点(508)和第一捕获引物结合位点(509)。然而，与图3中的衔接子(303)不同，衔接子(503)还包括第二捕获引物结合位点(510)，其不同于第一捕获引物结合位点(即第二捕获引物结合位点(510)具有与第一捕获引物结合位点(509)充分不同的序列，从而其将在合适严谨核酸杂交条件下与不同的同源捕获引物杂交)。第二捕获引物结合位点(510)位于衔接子(503)中的合成引物结合位点(508)的3'。
在步骤1中，在核酸杂交条件下，使核酸样品(501)与带有对第一捕获引物结合位点(509)具有特异性的固定的第一捕获引物(512)的第一固体支持物(511)接触。第一固体支持物可以是任何合适形式的任何合适材料，包括表面改性的珠、树脂、纳米颗粒或平面。第一捕获引物可以任何合适的方式共价或非共价固定，这允许其与衔接子(504)中的第一捕获引物结合位点(509)杂交。在三种核酸模板(505、506和507)中，只有两种具有衔接子(504)，因此第一捕获引物结合位点(509)退火至第一捕获引物(模板506和507)。仅具有衔接子(503)的核酸模板(505)作为上清液(例如，在洗涤步骤中)从混合物除去。
从固体基质(511)上去除非结合核酸模板后，包括核酸模板(505)(以及任何其它没有衔接子504的核酸)，在步骤2中从第一捕获引物洗脱结合的模板。在工作流程的第二步，不使用链置换合成方法洗脱与第一捕获引物结合的模板。而是，可使用任何其它合适的洗脱方法，例如，通过使退火的第一捕获引物从第一捕获引物结合位点变性(例如，使用化学或物理手段，例如热变性，使用竞争性捕获引物等)，或通过破坏第一捕获引物和固体支持物(511)之间的连接(例如化学裂解，酶消化等)。在这方面没有限制的意图。注意，从固体支持物(511)洗脱的核酸模板可不含杂交的第一捕获引物(如图5所示)或仍可使其结合(未显示)。这不会对工作流程的后续步骤产生不利影响。
然后，在合适严谨核酸杂交条件下，使从第一固体支持物洗脱的模板与固定有对第二捕获引物结合位点(510)具有特异性的第二捕获引物(514)的第二固体支持物(513)接触。与第一固体支持物(506和507)结合并从其分离的两种DNA模板物质中，只有具有衔接子(503)的那一种退火至第二捕获引物(即核酸模板(507))。仅具有衔接子(504)的剩余核酸模板(506)作为上清液(例如，在洗涤步骤中)从混合物去除。因此，仅在第一端具有衔接子(503)和在相对端具有衔接子(504)的不对称加标签的物质与第二固体支持物(513)上的第二捕获引物(514)结合。在图5中，显示了两种不同类型的不对称加标签的核酸模板(506)。第一个(506A)具有具备完全核酸合成能力的插入物(515)，第二个(506B)具有具备不完全核酸合成能力的插入物(516)。在图5中，插入物(516)在下链中具有由星号表示的终止核酸合成的位点。该位点可以是插入物的损坏，或者可以是阻遏核酸合成的修饰的存在；在这方面没有限制的意图。在步骤3中，在合适严谨杂交条件下，使对衔接子(503)中的合成引物结合位点(508)具有特异性的合成引物(517)与固体支持物结合的模板接触，以允许合成引物(517)退火至其同源合成引物结合位点(508)。在步骤4中，使固体支持物结合的和合成杂交的模板与核酸合成试剂混合物接触，所述核酸合成试剂混合物支持由链置换聚合酶从杂交的合成引物进行的核酸合成。此处注意，可以在核酸合成反应之前的任何合适的时间，例如在结合至第一或第二固体支持物之前、期间或之后，使合成引物与模板杂交(注意：在合成引物杂交之后进行的任何模板处理不阻止其作为核酸合成的起始位点的能力)。在某些实施方式中，使聚合酶在其与合成引物结合位点杂交之前与合成引物复合。然而，在其它实施方式中，在合成引物杂交后的任何合适的时间，例如在与第一或第二固体支持物接触之前、期间或之后，加入聚合酶。由于第二捕获引物结合位点(510)和合成引物结合位点(508)的取向(即第二捕获引物结合位点(510)位于合成引物结合位点(508)的3'位置)，核酸合成从杂交的合成引物(517)沿远离杂交的捕获引物(514)并朝向模板插入物区域的方向(由虚线518指示)进行。因此，为了从核酸模板置换与第二捕获引物结合位点杂交的捕获引物(514)，聚合酶必须通过插入物区域的整个第一链，到相对端的衔接子(即衔接子504)附近，并通过插入物区域的整个第二链。因此，如果在聚合酶到达第二捕获引物结合位点(510)之前，核酸合成在任何位置被阻遏或终止，则模板将保持与固体支持物结合(通过退火至第二捕获引物)。如上所述，核酸模板(506A)具有具备完全核酸合成能力的插入物(515)，而核酸模板(506B)具有具备不完全核酸合成能力的插入物(516)。这样，核酸模板(506A)通过核酸聚合酶(519)的活性从捕获引物洗脱，而核酸模板(506B)不归因于阻遏核酸聚合的位点(由星号指示)的存在。因此，洗脱的核酸模板不仅是不对称带引物的，而且还具有完全核酸合成能力，这使其适用于任何所需下游操作或分析，尤其是在用于后续序列分析(例如，
Figure BDA0002414386240000271
测序和基于纳米孔的测序)时。在步骤5中，从固体支持物的上清液中收集洗脱的模板(520)。聚合反应可以按用户所需在洗脱/收集后的任何时间停止或继续进行。
在某些实施方式中，可对分离的不对称带引物的核酸模板进行进一步的富集/分离处理，例如处理以分离在模板的插入物区域中包含一个或多个感兴趣区域的核酸模板。
图6和7显示了图5中描述的工作流程的变化形式。在图6中，显示模板，其通过杂交至捕获引物1(512)固定于第一固体支持物(511)，如图5所示(具有聚合酶阻遏位点的模板(506B)示于图6，但未示于图5的第一固定步骤中)。
与图5不同，使通过捕获引物1固定于基质的核酸模板与合成引物(517)接触，并经历采用链置换聚合酶的核酸合成反应，以洗脱包含衔接子的核酸模板(503)。洗脱后允许聚合反应进行，其允许具有完全核酸合成能力和不对称带引物的核酸模板(506A)进入滚环复制(601)，而具有聚合阻遏位点的不对称带引物的核酸模板(506B)不进入滚环复制(602)。因此，这些后者模板具有包括第二捕获引物结合位点(510)的单链区域(示于方框603中)。因此，在合适严谨核酸杂交条件下，当这种洗脱的不对称带引物的核酸模板的混合物与固定有第二捕获引物(514)的第二固体基质(513)接触时(步骤3)，仅具有不完全合成能力的模板将被固定，即，通过与捕获引物(514)杂交。因此，步骤4中的非结合性模板的收集将导致具有完全合成能力的不对称带引物的核酸模板的分离(601)。
在图7中，再次显示模板，其固定于第一固体支持物(511)上，如图5所示那样(具有聚合酶阻遏位点的模板(506B)示于图7，但未示于图5的第一个固定步骤中)。与图5不同，在图7的步骤1中，固定的核酸模板在合适严谨杂交条件下与合成引物(517)和第二捕获引物(701)接触，该引物包含对捕获引物结合位点(510)具有特异性的捕获引物结构域(702)和作为结合对的第一成员的捕获部分(703)。捕获引物(701)无法像合成引物(517)那样起始核酸合成。可使用使捕获引物(710)不具备合成能力的任何合适方式(例如3'端双脱氧核糖核苷酸、3'非杂交核苷酸/核苷酸序列等)。在步骤2中，使带引物且固定的复合物经历采用链置换聚合酶的核酸合成反应，以洗脱包含衔接子(503)的核酸模板。洗脱后允许进行聚合反应，其允许聚合酶在具有完全核酸合成能力和不对称带引物的核酸模板上置换第二捕获引物(704)，并进行滚环复制(模板705)，同时在具有聚合阻断位点的不对称带引物的核酸模板上进行的聚合反应不置换第二捕获引物(模板706)。在步骤3中，在捕获部分(703)和其同源结合伴侣(708)之间的合适结合条件下，使不对称带引物的核酸模板的洗脱混合物(即705和706)与具有针对第二捕获引物的捕获部分的固定结合伴侣(708)的第二固体基质(707)接触。通过捕获引物(701)的捕获部分(703)与其在固体基质(707)上的同源结合伴侣(708)的结合，仅不具完全合成能力的模板(706)将被固定在固体支持物上。具有完全合成能力的模板(705)不与结合伴侣(708)结合，因为捕获引物已从模板上洗脱下来。因此，步骤4中非结合性模板的收集将导致具有完全合成能力的不对称带引物的核酸模板(705)与不具有完全合成能力的那些(706)分离。
尽管先前的实施方式主要描述在两端具有发夹衔接子的不对称带引物的核酸模板的分离，但在某些实施方式中，在一端具有非发夹衔接子且在另一端具有发夹衔接子的不对称带引物的核酸被分离。这样的工作流程的一个示例在图8中示出。在该图中，通过衔接子(803)中的捕获引物结合位点(802)与捕获引物(804)的杂交，将来自对称加标签和不对称加标签的核酸的混合样品的模板固定在固体支持物(801)上。模板(805)用衔接子(803)对称地加标签，而模板(806)在第一端用发夹衔接子(803)且在第二(相对)端用Y型衔接子(807)不对称加标签。Y型衔接子(807)包括具有退火的合成引物(809)的单链合成引物结合位点(808)(在两端具有衔接子806的对称模板不与捕获引物(804)结合，因此未示出)。在步骤1中，链置换核酸合成(虚线810)在固定的模板上起始。一旦链置换聚合酶到达位于相对端的衔接子(803)中的捕获引物结合位点(802)处退火的捕获引物(804)，链置换聚合酶的活性将使在一端具有衔接子(807)的不对称带引物的核酸模板洗脱(811)。不具有合成引物结合位点(808)的对称模板(805)将通过与捕获引物的杂交而保持固定在基质上。得到的洗脱的不对称带引物的核酸模板(812)可经收集(步骤2)，并用于任何所需的下游操作/分析中，包括单分子测序反应(例如
Figure BDA0002414386240000281
测序或基于纳米孔的测序)。在替代性实施方式中(未显示)，模板可通过非链置换聚合酶方法从基质(801)洗脱，固定在展示有针对Y型衔接子中另一结构域的捕获引物(813)的第二基质上，并通过链置换核酸合成进行洗脱，以产生具有完全合成能力的、不对称带引物的模板(这与图5中的工作流程相似，不同之处在于所得的分离的不对称加标签的核酸模板是线性双链核酸)。
V.试剂盒与系统
本公开内容还提供了本文公开的方法和组合物的应用实施方式。
例如，在某些实施方式中，本公开内容提供了用于制备本文所述的不对称带引物的核酸构建体的试剂盒。在一些实施方式中，根据本发明的方面的试剂盒提供了用于分离根据本发明的不对称带引物的核酸模板的材料，如本文他处所述。这样，试剂盒通常将包括，例如根据上文概述的各种方法，如本文所述从样品分离不对称带引物的核酸模板所需的那些材料。应理解，取决于初始核酸样品中核酸模板的性质和所用方法，试剂盒的内容物可以变化。在某些实施方式中，试剂盒可包括一个或多个固体基质，其包含附连于其上的捕获引物/捕获部分(例如，两组珠子，一组具有与之偶联的第一捕获引物/部分，第二组具有与之偶联的第二捕获/部分)，链置换核酸聚合酶(如本文中详述)，用于使核酸模板与固体基质上的捕获引物/部分结合的试剂，以及用于进行链置换核酸合成反应的试剂。因此，试剂包括但不限于，杂交/结合缓冲剂、核酸合成缓冲剂、核苷酸、核酸合成引物、捕获引物等。
在一些实施方式中，试剂盒还包括用于从核酸样品产生加标签的核酸模板的试剂。例如，试剂盒可包括一种或多种类型的发夹衔接子，以产生对称加标签和/或不对称加标签的核酸模板。在一些实施方式中，此类试剂盒还可包括合适的连接酶和用于将此类衔接子附连至双链核酸端部的方案，以及在连接前处理双链区段端可能需要的任何加工酶，例如，磷酸酶、核酸外切酶等。
由于某些捕获引物/部分的结合和核酸合成步骤可在不同的反应条件下进行，因此可为它们各自分别提供缓冲剂/试剂。或者，可以提供兼容用于工作流程的多个步骤的单组缓冲剂/试剂。
另外，试剂盒可包括用于去除样品中不期望的核酸或缓冲剂成分的试剂，包括核酸外切酶、核酸纯化柱或珠、尺寸选择柱或旋转管、亲和/捕获试剂(例如生物素、亲和素、捕获引物)等。此外，试剂盒可包括用于产生待加标签的初始核酸片段的试剂，包括核酸分离试剂、片段化试剂(例如片段化柱、限制性酶等)。
在另外的实施方式中，本公开内容的试剂盒可提供不仅用于分离不对称带引物的核酸模板，而且可用于这种不对称带引物的核酸在对这种模板进行序列分析中的用途的材料和方法。因此，除上述组分外，此类试剂盒还可包括用于此类测序过程的试剂。例如，试剂盒可包括提供核酸合成复合物的光学限制的基质。在某些方面，这种基质通常会包括一个或多个零模波导(ZMW)阵列。这样的波导阵列还可以包括在此类零模波导的照明体积内增强合成复合物的定位的表面处理，例如，见述于美国专利号8,975,216号(题为“在其上布置有局部分子的制品及其制造方法(Articles having localized molecules disposedthereon and methods of producing same)”)，该文献通过引用其全文方式纳入本文用于所有目的。另外，此类试剂盒可任选地包括用于测序应用的核苷酸组合物，包括例如带标记的核苷酸，其包括荧光或与核苷多磷酸构建体中的磷酸基团在除α磷酸以外磷酸基团处偶联的其它形式的可检测标记基团。试剂盒中可任选地包括多种其它类型的带标记和未标记的核苷酸，其在本领域中通常是已知的。另外，可用于基于纳米孔的测序中的试剂可包括在本公开内容的试剂盒中，包括带有纳米孔的基质，用于制备用于纳米孔序列分析的模板的试剂，例如用于引导核酸穿过/越过纳米孔的衔接子和/或分子马达(例如解旋酶，聚合酶等)、包含纳米孔可检测标记物的核苷酸类似物等。
VI.功效
本公开内容的方法和组合物提供了优于当前核酸模板制备/分离方法的优点。
例如，出于空间上的考虑，与对称带引物的模板相比，预计不对称带引物的核酸模板在
Figure BDA0002414386240000301
测序(或其它纳米级孔结构)中采用的零模波导(ZMW)中具有改善的加载特性。例如，对称带引物的模板结合有两个活性聚合酶，导致较低的加载效率。另外，如果这样的复合物确实加载，则在单一ZMW中具有两个聚合酶会导致较短的读数和/或嘈杂的数据，因为两种聚合酶将在同一ZMW中于同一基质上同时作用。
另外，根据本公开内容的方面分离(即，使用链置换核酸合成以从捕获引物洗脱)的不对称加标签的核酸模板具有改进的质量，因为它们已在一些实施方式中被筛选为具有完全核酸合成能力。换言之，从模板库中去除了具有核酸合成阻遏作用的核酸模板(例如，受损模板)。改进的质量增加了其在许多下游试验(包括但不限于核酸序列分析)中的有用性。
VII.实施例
实施例1
A.从对称加标签的核酸产生不对称带引物的模板
对称加标签的核酸模板如下制备：
用HindIII酶将10μg的PBR322质粒线性化，然后用ExoVII处理以形成4.3kb的钝端dsDNA。将包含引物结合位点的相同发夹-衔接子连接至线性dsDNA，以形成核酸样品，该核酸样品包含在两端具有相同发夹-衔接子的模板，即对称加标签的核酸模板。对称加标签的核酸模板使用AMPure珠(贝克曼库尔特生命科学公司(Beckman Coulter Life Sciences)(Agencourt)；印第安纳州印第安纳波利斯)根据制造商的说明条件纯化，并用Qubit荧光计(赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific)；马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行定量。
对称加标签的核酸模板在合适杂交条件(80℃热变性2分钟，然后在37℃孵育30-60分钟)下与以下任何一种接触：(i)对发夹衔接子中的引物结合位点具有特异性的核酸合成引物，或(ii)同一核酸合成引物和捕获引物的1:1混合物，该捕获引物具有(a)捕获区域和(b)对发夹衔接子中的引物结合位点具有特异性的引物区域。与合成引物不同，捕获引物不具备作为核酸合成的起始位点的能力，因为不与模板杂交的捕获区域位于引物结构域的3'。各样品中总引物的最终浓度为100nM，且模板的浓度为10nM。杂交后，将各样品分成两份。向这两个样品之一添加Φ29聚合酶，且在30℃孵育4小时，然后置于核酸合成条件(30mMMgAc2和50μM脱氧核苷(dNTP))下30分钟。
图9显示了四个样品的琼脂糖凝胶分析。泳道1显示仅用合成引物带引物而无核酸合成的样品中的核酸物质；泳道2显示仅用合成引物带引物且在核酸合成之后的样品中的核酸物质；泳道3显示用合成引物和捕获引物的1:1混合物带引物且无核酸合成的样品中的核酸物质；和，泳道4显示用合成引物和捕获引物的1:1混合物带引物的核酸合成之后的样品中的核酸物质。
图9中凝胶的下方条带是在无核酸合成的情况下的模板的大小(泳道1和3中的唯一条带；表示为未延伸的模板(箭头))。在核酸合成后，几乎所有仅带合成引物的模板(泳道2)都能够进行核酸合成(表示为延伸的模板(括号))。不同的是，显著量的由合成引物和捕获引物的1:1混合物带引物的模板仍未延伸(第4道)。这些模板代表捕获引物已与其两个末端发夹衔接子中的引物结合位点杂交的模板，因此无法支持核酸合成(即没有合成引物是杂交的)。另外，延伸的模板分为两种物质：较大的物质代表杂交有两个合成引物的模板(指示为对称带引物的)，因此可以同时从两端延伸；较小的物质在一端带有合成引物且在另一端带有捕获引物(指示为不对称带引物的)，因此只能仅从模板的一端延伸。(注意，第2道中几乎所有延伸的物质都是较大的物质，即，对称带引物的延伸的模板物质。)
该实验验证了合成引物和捕获引物针对相同引物结合位点的竞争结合特性，并表明可以从对称加标签的核酸模板产生不对称带引物的模板(这些存在于泳道4的延伸的模板中；较小的物质)。
B.对称或不对称带引物的对称加标签的核酸模板的序列分析
对称或不对称带引物的核酸模板如上所述产生，并经历单分子实时
Figure BDA0002414386240000321
测序分析(加州太平洋生物科学公司；加利福尼亚州门洛帕克)。
图10显示了来自对称带引物的核酸模板的
Figure BDA0002414386240000322
测序结果，而图11显示了来自使用捕获引物分离的不对称带引物的核酸模板的
Figure BDA0002414386240000323
测序结果。从这些图清楚可见，与对称带引物的核酸模板相比，分离的不对称带引物的核酸模板在分析的许多关键方面提供了改进。例如，在对称带引物的模板的
Figure BDA0002414386240000324
测序反应中，在模板指导的合成过程中引入新生链中的连续碱基的平均数(“聚合酶读数长度均值”)为5,373个碱基，而对于不对称带引物的模板，该值达到11,089个碱基(大于2倍的提高)。类似地，不对称带引物的模板中(对比对称带引物的模板)，95％读数长度和最大读数长度的值也取得了改善(参见“聚合酶读数长度95％”和“最大聚合酶读数长度”值)。此外，不对称带引物的模板(对比对称带引物的模板)中的读数长度的分布取得了改善(参见图10和11下方的直方图)。例如，相较于不对称带引物的模板，对称带引物的模板在1,000个碱基-8,000个碱基范围内具有更高比例的终止。
实施例2
使用
Figure BDA0002414386240000325
不对称辅助模板制备试剂盒(太平洋生物科学公司；加利福尼亚州门洛帕克)，根据制造商的说明，生成不对称加标签的DNA模板。将10fmol该不对称模板DNA退火至测序引物和具有3'-A(18)尾的捕获寡核苷酸的1:1混合物。根据制造商的说明将退火的样品与DNA聚合酶接触。
将所得模板/DNA复合物在含400mM KCl的1x MOPS缓冲液中用150个多聚(T)磁珠(Magbead结合试剂盒(Magbead Binding Kit)；太平洋生物科学公司；加利福尼亚州门洛帕克)处理30分钟。移出上清液，并使珠结合的复合物在延伸缓冲液(100μM dNTP，30mMMgCl2，120mM KAc和40mM DTT)中孵育90分钟。收集延伸反应的上清液，并用AMPure珠(样品制备试剂盒(Sample Prep Kit)；太平洋生物科学公司；加利福尼亚州门洛帕克)纯化，无需乙醇洗涤。将延伸产物在含50mM KAC和0.2mM SrAc2的30lx MOPS缓冲液中洗脱。用Qubit荧光计(赛默飞世尔科学公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)对所得的复合物进行定量。
纯化的复合物随后通过
Figure BDA0002414386240000331
系统(太平洋生物科学公司；加利福尼亚州门洛帕克)上的
Figure BDA0002414386240000332
测序法，采用以下两种方法进行测序：
1.Magbead加载法：根据Magbead加载标准操作规程(太平洋生物科学公司；加利福尼亚州门洛帕克)，使复合物结合至Magbead并加载至样品板。
2.扩散加载法：复合物用Magbead结合缓冲液(太平洋生物科学公司；加利福尼亚州门洛帕克)稀释至80，然后根据扩散加载标准操作规程(太平洋生物科学公司；加利福尼亚州门洛帕克)将所得溶液加载至样品板。
两种方法都给出了相似的测序结果。具体来说，如图12(MagBead加载)和图13(扩散加载)所示，比对上的测序读数的数量超过300,000，读数长度约为10,000(4小时影像)。这些不对称加标签和带引物的样品中的读数长度的改善与对于不对称带引物的模板优于对称带引物模板(如实施例1中所示)观察到的情况类似(参见上文所述的图10和11)。
尽管出于说明的目的而进行了详细描述，但容易理解的是，可以在本发明的范围内实践本领域技术人员已知或意识到的许多变化形式。就尚未明确地纳入本文的程度而言，本文中提及的所有公开文献和专利文件均通过引用其全文的方式纳入本文用于所有目的。

Claims (41)

1.一种用于分离不对称带引物的核酸模板的方法，该方法包括：
获得样品，所述样品包含对称带引物的核酸模板和不对称带引物的核酸模板的混合物，其中所述核酸模板包含两端带有发夹衔接子的双链插入物区域，其中各对称带引物的核酸模板包含与两个末端发夹衔接子杂交的捕获引物或与两个末端发夹衔接子杂交的合成引物，并且其中各不对称带引物的核酸模板包含在一端与发夹衔接子杂交的捕获引物和在相对端与发夹衔接子杂交的合成引物；
使样品与固体支持物接触，所述固体支持物包含对捕获引物上的捕获区域具有特异性的固定的结合部分，由此将捕获引物杂交的核酸模板固定至固体支持物；
在促进从合成引物进行核酸合成的条件下，使固体支持物上固定的核酸模板与具有链置换活性的核酸聚合酶接触；和
通过所述核酸聚合酶的链置换活性，收集从固体支持物固定的捕获引物洗脱的核酸模板，由此分离不对称带引物的核酸模板。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述不对称带引物的核酸模板用包含引物结合位点的第一发夹衔接子对称加标签，其中捕获引物和合成引物对所述引物结合位点具有特异性，并且其中捕获引物和合成引物无法同时结合至同一引物结合位点。
3.如权利要求2所述的方法，其中，样品通过在核酸杂交条件下使对称加标签的核酸模板与捕获引物和合成引物接触而获得。
4.如权利要求3所述的方法，其中，捕获引物和合成引物的摩尔比为1:1。
5.如权利要求1所述的方法，其中，对称带引物的核酸模板用第一发夹衔接子或第二发夹衔接子对称加标签，而不对称带引物的核酸模板用第一发夹衔接子在一端和第二发夹衔接子在相对端不对称加标签，其中第一发夹衔接子包含对合成引物具有特异性的合成引物结合位点，第二发夹衔接子包含对捕获引物具有特异性的捕获引物结合位点。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述样品通过使捕获引物和合成引物退火至对称加标签和不对称加标签的核酸模板的混合物来获得。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在将核酸模板从固体支持物洗脱后允许核酸合成继续。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，捕获引物上的捕获区域是针对所述固体支持物上固定的结合部分的结合伴侣。
9.如权利要求9所述的方法，其中，结合伴侣选自下组：核苷酸序列、抗原、抗体或其结合片段、亲和素、链霉亲和素和生物素。
10.一种用于分离具有核酸合成能力的核酸模板的方法，该方法包括：
获得样品，该样品包含不对称加标签的核酸模板，各模板包含双链插入物区域、位于一端的第一发夹衔接子和位于相对端的第二发夹衔接子，其中所述第一发夹衔接子包含合成引物结合位点和位于所述合成引物结合位点3'的捕获引物结合位点；
在核酸杂交条件下使核酸样品与对捕获引物结合位点具有特异性的捕获引物接触；
通过捕获引物上的捕获区域将捕获引物杂交的核酸模板固定至固体支持物；
在促进从与合成引物结合位点杂交的合成引物进行核酸合成的条件下，使固定于固体支持物的核酸模板与具有链置换活性的核酸聚合酶接触；和
通过核酸聚合酶的链置换活性收集从固体支持物洗脱的核酸模板，由此分离具有核酸合成能力的核酸模板。
11.如权利要求10所述的方法，其中，在第一接触步骤中使合成引物与样品和捕获引物接触。
12.如权利要求10所述的方法，其中，在固定步骤之后，在核酸杂交条件下使合成引物与样品接触。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中，捕获引物通过所述捕获区域共价结合至所述固体支持物。
14.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中，捕获引物通过所述捕获区域非共价结合至所述固体支持物。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述固体支持物包含针对捕获引物上的捕获区域的结合伴侣。
16.如权利要求15所述的方法，其中，结合伴侣选自下组：核苷酸序列、抗原、抗体或其结合片段、亲和素、链霉亲和素和生物素。
17.如权利要求10所述的方法，其中，所述样品还包含对称加标签的核酸模板，各所述模板在两端包含第一发夹衔接子或在两端包含第二发夹衔接子，其中第二发夹衔接子包含第二捕获引物结合位点，其中，在第一接触步骤之前，该方法还包括：
在核酸杂交条件下使核酸样品与对第二捕获引物结合位点具有特异性的第二捕获引物接触；
通过第二捕获引物上的捕获区域将第二捕获引物杂交的核酸模板固定至第二固体支持物；和
洗脱并收集与第二固体支持物结合的核酸模板。
18.如权利要求17所述的方法，其中，第二捕获引物通过第二捕获引物上的捕获区域共价结合至第二固体支持物。
19.如权利要求19所述的方法，其中，第二捕获引物通过第二捕获引物上的捕获区域非共价结合至第二固体支持物。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述第二固体支持物包含针对第二捕获引物上的捕获区域的结合伴侣。
21.如权利要求20所述的方法，其中，结合伴侣选自下组：核苷酸序列、抗原、抗体或其结合片段、亲和素、链霉亲和素和生物素。
22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中，不通过链置换核酸合成实现从第二固体基质的洗脱。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，链置换聚合酶是Φ29DNA聚合酶、Φ29DNA聚合酶的同源物、Φ29DNA聚合酶的修饰形式或Φ29DNA聚合酶的同源物的修饰形式。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述分离的核酸模板经历序列分析。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述序列分析包括边合成边测序测序反应。
26.如权利要求25所述的方法，其中，洗脱后与模板核酸相关联的核酸聚合酶被用于边合成边测序测序反应中。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述测序反应是单分子实时测序反应。
28.如权利要求24所述的方法，其中，所述序列分析包括基于纳米孔的测序反应。
29.一种试剂盒，其包含：
包含引物结合位点的第一发夹衔接子；
对所述引物结合位点具有特异性的捕获引物；和
对所述引物结合位点具有特异性的合成引物；
其中，捕获引物和合成引物无法同时结合至同一引物结合位点。
30.一种试剂盒，其包含：
第一发夹衔接子，其包含合成引物结合位点和捕获引物结合位点，其中所述捕获引物结合位点位于所述合成引物结合位点的3'；
第二发夹衔接子；
对所述捕获引物结合位点具有特异性的捕获引物；和
对所述合成引物结合位点具有特异性的合成引物。
31.如权利要求29或30所述的试剂盒，其还包含固体基质，所述固体基质包含对所述捕获引物上的捕获区域具有特异性的固定的结合伴侣。
32.如权利要求29或30所述的试剂盒，其中，所述捕获引物共价连附至固体基质。
33.一种试剂盒，其包含：
第一发夹衔接子，其包含合成引物结合位点和第一捕获引物结合位点，其中所述第一捕获引物结合位点位于所述合成引物结合位点的3'；
第二发夹衔接子，其包含第二捕获引物结合位点；
对第一捕获引物结合位点具有特异性的第一捕获引物；
对第二捕获引物结合位点具有特异性的第二捕获引物；和
对所述合成引物结合位点具有特异性的合成引物。
34.如权利要求33所述的试剂盒，其还包含：
第一固体基质，其包含对第一捕获引物上的第一捕获区域具有特异性的固定结合伴侣；和
第二固体基质，其包含对第二捕获引物上的第二捕获区域具有特异性的固定结合伴侣。
35.如权利要求33所述的试剂盒，其中，所述第一捕获引物共价附连至第一固体基质。
36.如权利要求33或35所述的试剂盒，其中，所述第二捕获引物共价附连至第二固体基质。
37.如权利要求29至36中任一项所述的试剂盒，其还包含链置换聚合酶。
38.如权利要求37所述的试剂盒，其中，链置换聚合酶是Φ29DNA聚合酶、Φ29DNA聚合酶的同源物、Φ29DNA聚合酶的修饰形式或Φ29DNA聚合酶的同源物的修饰形式。
39.如权利要求37或38所述的试剂盒，其还包含用于进行核酸合成反应的一种或多种试剂和/或缓冲剂。
40.如权利要求29-39中任一项所述的试剂盒，其还包含用于将发夹衔接子附连至线性双链核酸的一种或多种试剂和/或缓冲剂。
41.如权利要求29-40中任一项所述的试剂盒，其还包含用于核酸分离、核酸富集和/或核酸大小选择的一种或多种组分。
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