PT658164E

PT658164E - Processo para a purificacao cromatografica e separacao de misturas de acidos nucleicos

Info

Publication number: PT658164E
Application number: PT94922869T
Authority: PT
Inventors: Joachim Schorr; Colpan Dr Metin; Ralf Hermann; Feuser-Frank Petra
Original assignee: Qiagen Gmbh
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-24
Publication date: 2001-09-28
Also published as: EP0658164A1; DK0658164T3; DE4321904B4; JPH08501321A; US6383393B1; WO1995001359A1; DE59409712D1; ES2155477T3; CA2142910A1; EP0658164B1; DE4321904A1; CA2142910C; ATE200293T1

Description

65% Uoi(

Lc, ^ li DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO CROMATOGRÁFICA E SEPARAÇÃO DE MISTURAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS" O objecto da presente invenção é um processo para a purificação cromatográfica e a separação de misturas de ácidos nucleicos de acordo com o conceito genérico da reivindicação 1, a utilização do processo para a purificação de fragmentos de ácidos nucleicos que foram submetidos a reacções de modificação, um dispositivo para a realização do processo, uma solução aquosa que é utilizável no processo de acordo com a presente invenção, assim como a utilização desta solução. A adsorsão de ácidos nucleicos em partículas de vidro ou de gel de sílica em presença de sais caotrópicos é conhecida (Vogelstein, B. e Gillespie, D. (1979) Preparative and analytical purification of DNA from agarose., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 615 - 619). De acordo com este método, isola-se e purifica-se DNA a partir de geles de agarose, assim como preparações de RNA e de DNA a partir de diferentes extractos com utilização de elevadas concentrações de sais caotrópicos em iodeto de sódio, perclorato de sódio ou tiocianato de guanidina (Boom, R. et al. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin. Microbiol. 28, 495 - 503 e Yamado, 0. et al. (1990) . A new method for extracting DNA or RNA for polymerase chain reaction. J. Viro. Methods 27, 203 - 210). No entanto, na realidade, os processos físicos exactos que originam uma adsorsão dos ácidos nucleicos 1 p L·, ^^ em presença de reagentes caotrópicos em suportes minerais não são esclarecidos pormenorizadamente, muito embora se parta da hipótese de que a razão para a adsorsão se possa procurar na perturbação das estruturas sobrepostas do meio aquoso. Nestas condições, o ácido nucleico que se encontra em solução é adsorvido na superfície das partículas de vidro ou de gel de sílica ou desnaturado. A adsorsão é quase quantitativa em presença de elevadas concentrações de sais caotrópicos. A eluição dos ácidos nucleicos adsorvidos realiza-se em presença de tampões com pequena força iónica (concentração de sais). Por meio dos processos que constam do estado da técnica, são possibilitados ácidos nucleicos e fragmentos com um tamanho de 100 pares de bases (bp) até 50 000 pares de bases (bp) . Até agora, no entanto, não era possível separar quantitativamente fragmentos curtos de ácido nucleico de hélice única ou dupla (100 bp e menores) de oligonucleótidos de espiral única (primários) muito curtos (20 a 40 nucleótidos).

Estas misturas de ácidos nucleicos obtêm-se tipicamente como produtos da amplificação, por exemplo, de acordo com a reacção das cadeias de polimerase (PCR). Os produtos obtidos a partir desta reacção são frequentemente em seguida analisados por biologia molecular, em que se realizam as técnicas usuais como sequenciamento do DNA, hibridização do DNA, de clonagem, restrição e transformação. Com eles podem-se obter parâmetros analíticos como informações sobre mutações genéticas para a consulta genética ou a detecção de agentes patogénicos no diagnóstico médico (HIV). Para poder utilizar o potencial destes processos de diagnóstico, é frequentemente muito importante conseguir uma separação quantitativa ou a purificação destes pequenos fragmentos de DNA (100 pares de bases). 2 r

Os métodos de purificação que presentemente estão à disposição baseiam-se na ultrafiltração, na cromatografia em fase liquida de alta pressão (HPLC) ou na extracção de fragmentos de ácidos nucleicos a partir de geles de agarose em presença de sais caotrópicos por precipitação sobre partículas de vidro ou de gel de sílica. Estes métodos são no entanto apropriados apenas com pequena eficiência para a separação de misturas de ácidos nucleicos que, por exemplo, consistem num fragmento de DNA de hélice dupla curto (100 bp) e num pequeno oligonucleótido de hélice simples (por exemplo, 39 meros). O problema técnico da presente invenção consiste em proporcionar um processo com o qual seja possível evitar os inconvenientes acima referidos do estado da técnica. Resolve-se o problema por um processo de purificação cromatográfica e separação de misturas de ácidos nucleicos em que a mistura de ácidos nucleicos • a partir de uma solução aquosa de adsorsão com elevada concentração de sais (força iónica) e com 1 a 50 % em volume de álcool alifático de um comprimento da cadeia de C1-C5 e/ou de polietilenoglicol (PEG) e/ou de polímeros hidrófobos, inorgânicos e/ou orgânicos e/ou de ácido orgânico como ácido tricloroacético (TCA), • é adsorvida num suporte mineral poroso ou não poroso de óxidos metálicos e/ou de misturas de óxidos metálicos, gel de sílica, materiais que consistem principalmente em vidro, óxido de alumínio, zeólitos, dióxido de titânio, dióxido de zircónio - sem operações prévias de purificação, 3 p U ^^ • é eventualmente lavada com uma solução de lavagem e, em seguida, • se elui com uma solução de pequena concentração de sais (força iónica) e se reúnem os ácidos nucleicos ou as fracções de ácidos nucleicos assim obtidos.

Numa forma de realização preferida, regulam-se as forças iónicas das soluções do sal com 1 a 10 M de cloreto de litio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, acetato de sódio, reagentes como por exemplo ureia e/ou misturas de reagentes.

Noutras formas de realização preferidas, o tamanho das partículas do material de suporte mineral monta a 0,1 μιη até 1 000 μιη e/ou os materiais de suporte minerais porosos utilizados possuem um tamanho dos poros de 2 a 1 000 nm e/ou os materiais de suporte porosos ou não porosos, especialmente zeólitos, encontram-se na forma de materiais a granel soltos ou os materiais de suporte porosos ou não porosos, especialmente zeólitos, são formados como camadas filtrantes sob a forma de camadas de filtração de vidro, quartzo ou material cerâmico e/ou de uma membrana, na qual é colocado gel de sílica e/ou existem sob a forma de partículas ou de fibras de suportes minerais e tecidos de quartzo ou de lã de vidro.

Nos processos acima mencionados, os ácidos nucleicos a separar e a purificar preferivelmente derivam de origens biológicas como culturas de células, tecidos de todos os tipos, líquidos corporais como sangue, plasma, soro, urina, fezes, microrganismos como bactérias especialmente micobactéricas da tuberculose, vírus como vírus de Citomegalia, HIV, Hepatite B, Hepatite C, vírus de Hepatite-δ, em que os ácidos nucleicos são 4 t Γ produtos obtidos por reacção de cadeias de polimerase (PCR), DNA de plasmídio, DNA genómico, RNA, ácidos nucleicos de microrganismos como DNA de plasmídios, DNA ou RNA cromosómicos e/ou ácidos nucleicos de análises de sequência.

Especialmente são também incluidos processos em que os ácidos nucleicos, depois do fraccionamento, são menos do que 10% mais curtos que 10 kb ou nos quais os ácidos nucleicos são oligonicleótidos e/ou nos quais, depois da lise de uma amostra que contém ácidos nucleico como' fonte dos ácidos nucleicos a purificar e a isolar, se realiza a obtenção de condições de adsorsão em gel de sílica numa única fase operatória, em que as condições de adsorsão são ajustadas por lise das amostras no sistema de tampão que é utilizado para a adsorsão. 0 processo permite em uma forma de realização especial, também a purificação e a separação de fragmentos de ácidos nucleicos depois das reacções de modificação. O processo de acordo com a presente invenção aproveita a propriedade em si conhecida dos ácidos nucleicos de, em presença de sais caotrópicos, soluções salinas de elevada força iónica (elevada concentração), reagèntes como por exemplo ureia, ou de misturas destas substâncias precipitarem sobre suportes minerais e serem eluídos por actuação de soluções de pequena força iónica (concentração de sal). Assim, a WO-93/11221 (PCT/EP 92/02775)da Requerente reivindica adsorver em primeiro lugar uma mistura de ácido nucleico de um meio de pequena força iónica num material de permuta de aniões, em seguida dessadsorver o ácido nucleico com um tampão de maior força iónica, e depois, no tampão com esta maior força iónica, adsorver os ácidos nucleicos sobre um material de suporte 5 L-Cj ^ mineral em presença de álcoois inferiores e/ou polietilenoglicol e/ou ácidos orgânicos, como ácido tricloroacético (TCA) . Os ácidos nucleicos são seguidamente eluidos de preferência com água ou uma solução tampão de menor força iónica.

Verificou-se agora que, para a separação de ácidos nucleicos a purificação anterior em materiais de permuta de aniões pode não se realizar. Surpreendentemente pode-se também, por adsorsão de ácidos nucleicos na presença de sais caotrópicos de maior concentração e da desadsorção dos ácidos nucleicos com soluções de pequena força iónica conseguir um fraccionamento excelente de uma mistura de ácidos nucleicos.

Por meio do processo de acordo com a presente invenção, é portanto possível, numa única fase de processamento, obter fracções de ácidos nucleicos que interessam por adsorsão dos ácidos nucleicos a separar e eluição de maneira eficiente, sem fases prévias de purificação.

Se as amostras que contêm ácidos nucleicos deverem servir como fontes dos ácidos nucleicos a purificar e isolar, estas fontes são desintegradas de maneira em si conhecida, por exemplo por tratamento com detergentes ou por influências mecânicas como ultra-sons ou fragmentação. Neste caso, a solução utilizada para a recolha dos ácidos nucleicos pode já conter sais caotrópicos em elevada concentração. Depois da eliminação de componentes das células de grandes dimensões eventualmente existentes por centrifugação ou filtração (WO 93/11218 e WO 93/11211), então a solução é posta em contacto com um material de suporte mineral para adsorver os ácidos 6 Γ u nucleicos sobre ο suporte mineral a partir da solução com elevada força iónica de sal caotrópico.

Uma modificação do processo de acordo com a presente invenção consiste em se realizar a desintegração dos ácidos nucleicos directamente no sistema de tampão que é utilizado para a adsorsão. Então pode conseguir-se uma distribuição de ácidos nucleicos especialmente favorável.

Usualmente, obtêm-se ácidos nucleicos de células eucarióticas e/ou procarióticas (entre as quais também protozoários e fungos) e/ou de virus. Neste caso, as células e/ou virus são desintegrados por exemplo em condições fortemente desnaturantes e eventualmente redutoras (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, S., 1982, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor).

Uma forma de realização especial da invenção é apropriada especialmente para a preparação de DNA de plasmideos ou de DNA de cosmídeos a partir de E. Coli. Depois da lise das células de E. coli com lixívia de soda cáustica/SDS neutraliza-se com acetato de potássio (KAc) 0,2 - 0,9 M.

Usualmente depois da lise neutraliza-se o produto da desintegração das células com SDS com acetato de potássio 3 M. Para separar por centrifugação os fragmentos da ruptura das células, ao lisato das células é então adicionado hidrocloreto de guanidina 5 M ou uma outra solução de elevada concentração de sal caotrópico. Nas minipreparações de E. coli isto realiza-se com cerca de 2 - 3 ml da amostra a adsorver em gel de 7

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L-Ci sílica, o que no entanto é inconveniente porque em seguida se tem de centrifugar durante várias horas. 0 processo de acordo com a presente invenção, depois da lise com lixívia de hidróxido de sódio/SDS, utiliza por exemplo soluções de sais com preferivelmente KAc 0,2 M / GuHCl 5,5 M, KAc 0,2 M / GITC 5,5 M,

NaAc 0,2 M / NaC104 6 M,

NaAc 0,2 M / GuHCl 6 M assim como NH4Ac 0,2 M / NaC104 6 M.

Desta forma, consegue-se uma neutralização do produto da lise das células e uma regulação simultânea das amostras para as condições de elevada concentração de sais em gel de sílica, por meio do que se efectua uma facilitação essencial do trabalho na prática diária. Além disso, foi surpreendentemente verificado que a adsorsão de ácidos nucleicos em gel de sílica também se verifica em presença de detergentes aniónicos ou catiónicos ou neutros, como por exemplo SDS, NP40, Tween 20, Triton X-100, CTAB em combinação com sais caotrópicos ou na realidade ainda se aumenta o rendimento DNA pela presença destes detergentes. É ainda alargada a desintegração das células com detergentes como reagentes desnaturantes e a utilização de determinados enzimas para a desintegração das estruturas das proteínas e enzimas que separam ácidos nucleicos. Assim, por exemplo, utiliza-se dodecilsulfato de sódio (SDS) e EDTA como agentes desnaturantes e Proteinase K para a desintegração de proteínas. O resultado deste processo de desintegração é, na 8

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L·, ^ maior parte das vezes, uma estrutura muito viscosa do género de gelatina a partir da qual se isolam os ácidos nucleicos por meio de extracção com fenol. Os ácidos nucleicos, neste caso, são obtidos conservando grandes comprimentos e são separados da fase aquosa por diálise e precipitação. Este processo de desintegração é tão agressivo em relação às estruturas de ácido não nucleico que se podem submeter ao processo também amostras de tecidos.

No entanto, este método é pouco apropriado para grandes quantidades de amostras e preparações de retina por causa de se tratar de uma técnica de mão de obra intensiva com mudanças múltiplas dos vasos reaccionais. Este processo é na realidade automatizável, muito embora um aparelho actualmente usual no comércio permita tratar aproximadamente oito amostras ao mesmo tempo em quatro horas (Applied Biosystems A 371). 0 processo é por consequência caro e não é apropriado para a efectivação de grandes séries de amostras. Além disso, é inconveniente o facto de as reacções da sequência, como amplificações enzimáticas, sejam prejudicadas em consequência dos grandes comprimentos dos ácidos nucleicos isolados. Além disso, as soluções que se formam são muito viscosas e dificilmente manipuláveis. Especialmente DNA de muito grandes comprimentos da cadeia é antes de tudo incómodo porque os ácidos nucleicos obtidos com o processo de acordo com o estado da técnica têm de ser especialmente cortados para poderem ser processados posteriormente. A desintegração de células eucarióticas e/ou procarióticas e/ou de virus em meio alcalino em presença de detergentes é realmente tecnicamente simples, mas origina no entanto também 9 r ácidos nucleicos com grandes comprimentos da cadeia que são inconvenientes como se referiu acima. À preparação bruta dos ácidos nucleicos adicionam-se sequências de reacções. Estas reacções sequenciais necessitam uma determinada qualidade dos ácidos nucleicos. Assim, estes devem ser o mais possível intactos, o rendimento da preparação deve ser alto e reprodutível; além disso, os ácidos nucleicos devem estar presentes em elevada pureza, isentos de proteínas e metabólitos das células. A via de preparação deve ser simples e económica e proporcionar a possibilidade de automação. A preparação dos ácidos nucleicos deve ser possível sem o perigo de contaminação cruzada com outras amostras, especialmente se encontrarem utilização reacções de amplificação enzimáticas como a Reacção de Cadeia de Polimerase (PCR) (Saiki, r., Gelfand, D.H. Stoffel, S., Scharf, s.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. e Ehrlich, H.A. (1988), Science 239, 487 -491) e a Reacção de Cadeia de Ligase (LCR) (EP-A-8 83 11 741.8). Para estas reacções em sequência é desejável que se obtenham os ácidos nucleicos com comprimentos da cadeia não demasiadamente grandes, que as células sejam desintegradas o mais possível de maneira quantitativa e em geral que se evitem os inconvenientes acima mencionados dos processos de desintegração conhecidos no estado da técnica. É portanto desejável que um processo possibilite o isolamento e a concentração de ácidos nucleicos obtidos a partir de células eucarióticas e/ou procarióticas intactas e/ou vírus ou provenientes de líquidos corporais. Especialmente, o ácido nucleico assim obtido deve caracterizar-se por comprimentos da cadeia não demasiadamente grandes, isolável em 10 p U, ^^ pequeno número de operações e poder ser directamente submetido às reacções sequenciais necessárias. A modificação acima indicada do processo de acordo com a invenção que possibilita isso consiste no facto de as fontes dos ácidos nucleicos serem lisadas como células eucarióticas e/ou procarióticas e/ou virus. A desintegração de fontes que contêm ácidos nucleicos, como células eucarióticas e/ou procarióticas e/ou vírus, pode nesse caso de preferência realizar-se por processamento físico ou químico. Nesse caso, a lise pode conseguir-se ou mecanicamente como com ultra-sons ou por choque osmótico ou quimicamente por meio de detergentes e/ou agentes caotrópicos e/ou dissolventes orgânicos (por exemplo, fenol, clorofórmio, éter) ou desintegração alcalina.

Esta maneira de proceder origina a preparação de ácidos nucleicos com elevada pureza e permite realizar uma análise qualitativa e quantitativamente reprodutível, especialmente em combinação com processos enzimáticos para a amplificação de ácidos nucleicos. Verificou-se que os métodos de desintegração com detergentes e/ou agente caotrópicos, soluções concentradas de sais, reagentes como ureia, misturas destas substâncias e/ou dissolventes orgânicos ou métodos de desintegração físicos como aquecimento de uma amostra facilita as utilizações sequenciais. Com a utilização do processo de acordo com a presente invenção, por exemplo, obtêm-se DNA celulares mais curtos (< 50 kb) designadamente ácidos nucleicos totais de células e/ou vírus e/ou líquidos corporais. O método de purificação (isto é as condições da ligação e eluição dos ácidos nucleicos) origina uma fragmentação dos ácidos nucleicos. 11 A combinação de agentes caotrópicos de elevada força iónica e de polímeros orgânicos ou inorgânicos hidrófobos e/ou álcoois e/ou ácido tricloroacético (TCA) no tampão de adsorsão garante que os ácidos nucleicos, ao contrário dos processos de purificação usuais depois da lise, sejam fixados quantitativamente e de maneira muito específica na superfície do material de suporte mineral como fibras de quartzo e assim sejam protegidos contra o ataque posterior das nucleases, enquanto componentes contaminantes do lisado não são ligados. Neste estado fixado dos ácidos nucleicos podem-se separar facilmente por lavagem os restantes componentes contaminantes seguindo-se a eluição do ácido nucleico purificado num pequeno volume. Obtêm-se assim comprimentos da cadeia reprodutíveis de, em média, 20 a 40 kb. Menos que 10% são mais curtos do que 10 kb sob as condições de desintegração, como se descreve nos exemplos 7 a 9. Isso significa uma óptima distribuição dos comprimentos para uma subsequente amplificação enzimática do ácido nucleico. A combinação especial de sais, especialmente de agentes caotrópicos e de álcoois possibilita primeiramente isolar ácidos nucleicos de um largo espectro de comprimentos da cadeia (10 - 100 000 pares de bases) simultaneamente e purificá-los. A solução aquosa de adsorsão de elevada concentração de sal contém 1 a 50 % em volume de álcool alifático com um comprimento da cadeia de 1 a 5 átomos de C ou polietilenoglicol.

Como suportes minerais interessam materiais porosos ou não porosos à base de óxidos metálicos e de óxidos metálicos mistos como gel de sílica, materiais que consistem principalmente em

Lc, ^ r vidro, óxido de alumínio, zeólitos, dióxido de titânio, dióxido de zircónio. Os zeólitos especialmente deram bons resultados como material de suporte mineral.

Eventualmente o material de suporte mineral com os ácidos nucleicos nele adsorvidos pode ser lavado com uma solução que, por causa de um teor de álcool relativamente alto, evita uma desadsorção dos ácidos nucleicos.

Em seguida, os ácidos nucleicos adsorvidos são eluídos com um tampão de pequena concentração de sal (força iónica) e os ácidos nucleicos ou as fracções dos ácidos nucleicos assim obtidos são reunidas.

Como sais caotrópicos interessam perclorato de sódio, hidrocloreto de guanidina (GuHCl), isotiocianato de guanidina (GTC), iodeto de potássio em concentrações de 1 a 8 M. São igualmente utilizáveis soluções de sais concentradas > 1 M de NaCl, KC1, LiCl, etc., reagentes como por exemplo ureia (> 1 M) e combinações destes componentes. Os álcoois inferiores existentes na solução dos sais caotrópicos são metanol, etanol, isopropanol, butanol e pentanol em quantidades de 1 até 50%, contanto que nestas gamas sejam miscíveis com água. Os etileno -glicois de preferência utilizáveis possuem pesos moleculares compreendidos entre 1 000 e 100 000, especialmente entre 6 000 e 8 000. 0 polietilenoglicol pode ser adicionado ao tampão de maior força iónica em quantidade de 1 a 30%. O tamanho das partículas dos materiais de suporte minerais monta de preferência a 0,1 pm até 1 000 μια. Se se utilizarem suportes minerais porosos como por exemplo gel de sílica poroso, vidro poroso, óxido de alumínio poroso, zeólitos, os 13 | ^—ç· poros possuem de preferência um tamanho de 2 a 1 000 nm. 0 material de suporte pode por exemplo existir na forma de massa solta a granel e ser colocado em contacto com as soluções que contêm os ácidos nucleicos a separar e a purificar.

No entanto os materiais de suporte porosos e não porosos são preferivelmente formados como camadas de filtração e colocados num corpo oco com abertura de entrada e de saída. As camadas de filtração consistem ou em fibras orientadas (urdidas) ou não orientadas de vidro, quartzo, produtos cerâmicos ou outros materiais como minerais ou em uma membrana em que é colocado o gel de sílica. O processo de acordo com a presente invenção é de maneira excelentemente apropriado para separar misturas de ácidos nucleicos, em especial também ácidos nucleicos de cadeia curta que se diferenciam nos comprimentos da cadeia apenas de maneira insignificante. Assim, podem-se por exemplo separar fragmentos de DNA de um tamanho de por exemplo 100 bp de oligonucleótidos de hélice única mais pequenos por exemplo de um 39 mero. Neste caso, o rendimento de DNA sobe então de 60 para 70% em comparação com outros métodos de purificação convencionais como ultrafiltração, HPLC ou utilização apenas de sais caotrópicos.

Por utilização do processo de acordo com a presente invenção, no qual a desintegração das fontes que contêm ácidos nucleicos se realiza em tampão de recolha (adsorsão) é possível uma preparação de ácidos nucleicos com um determinado espectro de comprimentos do ácido nucleico. 0 processo de acordo com a presente invenção permite processar misturas de ácidos nucleicos de qualquer origem. 14 p L·, ^^

Assim, podem-se obter ácidos nucleicos de fontes biológicas como tecidos de todos os tipos, líquidos corporais como sangue, fezes, depois do correspondente processamento das amostras que em cada caso compreende uma recolha da amostra numa solução de elevada concentração salina, de preferência, de elevada concentração de iões caotrópicos. De acordo com a invenção também se podem separar e purificar ácidos nucleicos que são obtidos por meio de reacções químicas como aqueles que foram obtidos por reacção de cadeias de polimerase (PCR) ou DNA de plasmídeos, DNA e RNA genómicos e/ou ácidos nucleicos que derivam de microrganismos. 0 processo de acordo com a invenção é igualmente apropriado para a utilização nas assim chamadas minipreparações de DNA de plasmídeo de Escherichia Coli para a clonagem ou sequencialmente subsequentes; o processo de acordo com a presente invenção é igualmente apropriado para o isolamento de DNA e/ou de RNA de sangue completo, plasma, soro, tecidos, cultura de células, bactérias, especialmente Mycobakterium tuberkulosis, vírus como Cytomegalie-Virus (ácido nucleico DNA) a partir de vírus de RNA como HIV, Hepatite B, Hepatite C, Hepatite-δ. Oligonucleótidos são também ácidos nucleicos no sentido utilizado na presente invenção. Os ácidos nucleicos podem, além disso, derivar de reacções de sequenciamento ou de outras reacções comparáveis. A preparação de DNA ou de RNA a partir de sangue completo é especialmente apropriada para a subsequente tipificação de HLA. 0 processo de acordo com a presente invenção é especialmente apropriado para o isolamento de ácidos nucleicos a partir de Mycobakterium tuberkulosis. Neste caso devem-se manter métodos de desintegração drásticos em que as técnicas convencionais de isolamento originam apenas resultados insuficientes. 15 |—· L-Cj

Um dispositivo a utilizar preferivelmente no processo de acordo com a presente invenção é especialmente um corpo oco cilíndrico com uma abertura de entrada e uma abertura de saída. Na proximidade da abertura de saída, no sentido do escoamento da solução através do corpo oco, está colocado o material de suporte mineral no qual os ácidos nucleicos devem ser adsorvidos. Um dispositivo que, numa forma de realização preferida fixa o material de suporte consiste em duas placas fritadas de polietileno colocadas uma por cima da outra e que formam um espaço intermédio, encontrando-se o material de suporte colocado no espaço intermédio entre as duas placas de polietileno fritadas no lúmen do corpo oco. 0 dispositivo para a fixação do material de suporte pode também ser uma membrana auto-suportada em que o material de suporte é embebido. A fixação do material de suporte ou dos dispositivos que fixam o material de suporte, pode efectuar-se por forças de atrito ou de pressão, como as que por exemplo se obtêm por aperto destes dispositivos no corpo oco e/ou por fixação dos dispositivos com uma anilha de aperto. 0 tamanho dos poros do dispositivo, de preferência placas fritadas de polietileno ou prolipropileno, deve nesse caso ser suficientemente grande para deixar passar os componentes do lisado sem entupimentos. Preferivelmente, os dispositivos têm um tamanho dos poros de 5 a 200 μιη. Este dispositivo permite em primeiro lugar um isolamento simples, rápido e reprodutível de ácidos nucleicos também a partir de lisados muito viscosos que contêm uma grande quantidade de proteína (por exemplo, lisados sanguíneos que possuem um teor muito elevado em hemoglobina).

Numa forma de realização especialmente preferida, o material do suporte mineral é uma membrana do tipo de rede de 16

fibras de gel de sílica, vidro ou quartzo, com um tamanho dos poros < 5 μπι, na qual são adsorvidos os ácidos nucleicos que se libertam.

Uma forma de realização igualmente preferida consiste num dispositivo, no qual o material de suporte mineral é um polímero inorgânico com a forma de partículas como gel de sílica ou gel de quartzo com um tamanho das partículas de 1 a 50 μπι. 0 corpo oco pode por exemplo ser um pequeno tubo usual no comércio. Entre os dois dispositivos apertadamente prensados, por exemplo placas friitadas de polietileno com um tamanho dos poros de 50 a 200 μπι, encontra-se uma ou mais camadas de uma membrana com 0,1 a 1 μια de tamanho dos poros, que consiste em fibras de sílica, vidro ou quartzo ou gel de sílica. A membrana possui uma espessura de cerca de 0,2 a 1,0 mm, especialmente 0,6 mm. A capacidade do material da membrana é aproximadamente igual a 20 a 100 μg de DNA. Por colocação de correspondentes membranas umas por cima das outras pode-se evidentemente aumentar a capacidade para DNA. No caso de pequenos esforços mecânicos é também possível pensar em realizar uma soldadura periférica ou colagem da membrana, por meio do que pode deixar de existir a acção de estabilização dos dispositivos, de modo que a membrana fecha o corpo oco sem os dispositivos. Nestas circunstâncias, a membrana pode ser fixada por assentamento de uma anilha de pressão no corpo oco. É igualmente possível encher pequenas colunas com o gel de sílica descrito, que é colocado entre 2 placas fritadas de 17

V L-Cj ^ polietileno com um tamanho dos poros de 35 pm. De preferência, escolhe-se o dispositivo superior com os poros maiores (10 -250 pm, especialmente 50 pm) . As colunas são de preferência dotadas com cerca de 70 mg de gel de sílica que correspondem a 3 mm de altura de enchimento.

Prefere-se também a utilização do processo descrito em um conjunto de filas de reentrâncias cada uma com 8 possibilidades de tratamento de preparações paralelas com o formato de placa de microtitulação (96 possibilidades de preparações quase simultâneas) e/ou em combinação com uma fase de filtração e/ou uma operação de dessalinização. (Vide pedidos de patente P 41 27 276.5, P 41 39 664.2 da presente Requerente).

Numa forma de realização preferida do dispositivo, aperta-se uma placa filtrada de polietileno com a espessura de 0,5 a 1,5 mm e com uma porosidade igual a cerca de 10 pm numa coluna de cromatografia-centrífugação com a forma de um corpo oco essencialmente cilíndrico. Sobre esta placa fritada é colocada uma camada com aproximadamente o dobro da espessura de gel de sílica com uma granulometria das partículas compreendida entre aproximadamente 10 e 15 pm e com uma porosidade de 40 a 120 Â e fechada com uma segunda placa fritada que pode ser do mesmo tipo que a primeira placa fritada. De preferência, a camada de gel de sílica pode ser comprimida por pressão entre as duas placas fritadas mediante pressão.

Uma outra forma de realização da coluna de cromatografia possui como material de suporte fibras de vidro cortadas com um comprimento de 10 e 300 pm entre duas placas fritadas polietileno que possuem uma porosidade de cerca de 50 pm. Como 18

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L-Cj ^ material de suporte interessam também papéis de fibras de vidro, papéis de fibras de quartzo, tecido de fibra de vidro e outros papéis minerais e tecidos.

Uma outra forma de realização preferida do dispositivo possui uma membrana, em que são inseridas partículas de gel de sílica na proximidade da abertura de saída. Neste caso, a membrana de preferência auto-suportante pode ser fixada com uma anilha de compressão. Como membrana de gel de sílica interessa de maneira especialmente vantajosa uma membrana de gel de sílica Empore da Firma 3M. Igualmente, especialmente com uma anilha de compressão, pode fixar-se uma membrana de gel de sílica que consiste em gel de sílica e PVC poroso no lúmen do corpo oco cilíndrico.

Numa forma de realização preferida do processo de acordo com a presente invenção, o dispositivo descrito por exemplo numa sua forma de realização é cheio com a solução da mistura de ácidos nucleicos a separar. A solução é feita passar através do suporte mineral por aplicação de uma sucção ou centrifugação ou medidas que actuam da mesma maneira, assim como as suas combinações. Neste caso, os ácidos nucleicos são adsorvidos no material de suporte, contanto que a solução possua uma elevada força iónica (concentração de sais). A invenção é mais pormenorizadamente esclarecida com o auxílio dos seguintes exemplos. 19

V Γ

Exemplo 1

Isolamento de DNA de plasmidio de "high copy"

Separa-se por centrifugação o plasmidio pUC 18 que contém células de E. coli obtido a partir de uma cultura de 3 ml HB 101 e ressuspendeu-se em 0,25 ml de tampão PI (10 mM de Tris-HC1, pH 8, 100 μg/ml de RNAseA) e faz-se a sua lise por adição de 0,25 ml de tampão P2 (0,2 M de NaOH, 2% de SDS). Neutraliza-se a amostra por adição de 0,35 ml de tampão N3 (hidrocloreto de guanidina 4,2 M, acetato de potássio 0,9 M, pH 4,8) e simultaneamente regula-se para uma concentração final de 1,75 M de GuHCl. Esta concentração garante uma ligação sem necessidade de outras operações subsequentes. A amostra lisada é separada por centrifugação durante 10 minutos a 13 000 rpm numa minicentrifuga Eppendorf para separar os fragmentos das células e o SDS que precipita. O sobrenadante que contém o DNA do plasmidio é imediatamente pipetado para uma coluna de cromatografia-centrífugação. A coluna de cromatografia- -centrífugação é centrifugada num tubo de centrifugação de 2 ml e lavada por centrifugação mais uma vez com 0,5 ml de tampão PB (hidrocloreto de guanidina 5 M, 30 % de isopropanol), para eliminar impurificações e proteínas. A coluna de cromatografia--centrifugação é lavada 1 x por centrifugação de 80% de etanol/água e em seguida é centrifugado durante 30 a 60 segundos para eliminar completamente o excesso de etanol. Para a eluição centrifugam-se 0,05 - 0,2 ml de tampão de eluição (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) através da coluna de cromatografia-centrífugação num pequeno tubo de centrifugação de 1,5 ml. O DNA do plasmidio fica agora sob a forma concentrada na solução com uma concentração de sal muito pequena. O rendimento monta a 20 Γ

Lcj ^ 15 μς a 20 μg de DNA de plasmídio com uma proporção de A260/A280 igual a 1,75.

Exemplo 2

Isolamento de DNA de plasmidio de "high copy" a partir de culturas de 5 ml

Prepara-se um lisado de células de 5 ml de cultura de plasmídio pUC 18/XL 1 Blue de acordo com o Exemplo 1 e centrifuga-se através de uma coluna de cromatografia de centrifugação, que contém um enchimento a granel de gel de sílica, centrifuga-se e lava-se. 0 DNA do plasmídio é eluído com 0,1 ml de tampão TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM de EDTA) aquecido a 80°C. 0 rendimento monta a 15 - 20 μg de DNA de plasmídio com uma proporção A260/A280 igual a 1,7.

Exemplo 3

Isolamento de DNA de plasmídio de "low copy"

Prepara-se um lisado de células de 5 ml de cultura de plasmídio pBR322/XL 1 Blue de acordo com o Exemplo 1 e centrifuga-se através de uma coluna de cromatografia- centrifugação com uma membrana de fibra de vidro ou de quartzo e lava-se. O DNA do plasmídio é diluído com 0,1 ml de tampão TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM de EDTA) aquecido a 80DC. O rendimento monta a 5 - 10 μg de DNA de plasmídio com uma proporção A260/A280 igual a 1,7. 21

u

Exemplo 4

ΡίϊΓίΓχυα^αυ Utí prouuCOS Q6 SUpiillCãÇáO

Mistura-se uma amostra de 100 μΐ do produto da reacção de amplificação de PCR com 500 μΐ de tampão PB (5 M GuHCl, 30% de isopropanol), em que não é necessária uma separação prévia do óleo de parafina que recobre a mistura reaccional. Esta mistura é pipetada para uma coluna de cromatografia-centrifugação, que contém uma membrana de gel de sílica e centrifuga-se num tubo de centrifugação de 1,5 ml. A coluna de cromatografia-centrifugação é em seguida lavada por tratamento com 80% EtOH/água quase isenta de sais. Para a eluição centrifugam-se 50 μΐ de tampão de eluição (10 mM de Tris, pH 8,5) através da coluna de cromatografia-centrifugação num outro tubo de centrifugação. 0 produto de PCR assim purificado está isento de primários, dNTP, polimerase e sais e pode por exemplo ser utilizado directamente para uma reacção de sequenciamento num sequenciador ABI com a utilização do protocolo de "Sequenciamento de Cyle".

Exemplo 5

Purificação de DMA depois de reacções de restrição

Trata-se 1 μg de DNA com uma endonuclease de restrição. Mistura-se este DNA do produto da reacção de restrição de acordo com o Exemplo 4 com 500 μΐ de tampão PB e procede-se de novo como no Exemplo 4. O DNA obtido depois da ebulição está livre de endonucleases de restrição e sais, a proporção 260/280 é igual a 1,8. 22

Exemplo 6

Fuxiriuavão de uNA depois da marcação raciioactiva enzimática

Marca-se 1 μς de DNA radioactivamente com o auxilio de marcação do oligomarcação, em presença de gama-P32-ATP. Trata-se a mistura reaccional como se descreveu no Exemplo 4. Desta forma o DNA marcado é purificado de dNTP não inserido, gama-P32-ATP, sais e polimerase de Klenow e pode ser utilizado directamente para a reacção de hibridização.

Exemplo 7

Preparação de ãcido nucleico a partir de sangue

Preparação de ácido nucleico total a partir de sangue: num tubo de 1,5 ml de PPN misturam-se 200 μΐ de sangue tratado com citrato, heparina ou EDTA com 200 μΐ de uma solução de sal caotrópico 4 - 8 M (hidrocloridrato de guanidina (GuHCl), isotiocianato de guanidina (GTC), iodeto de potássio), eventualmente um dissolvente orgânico (fenol, clorofórmio, éter) e um detergente a 5 - 100 % (NP40; Tween 20, Triton X- 100, SDS, CTAB) . Em seguida, adicionam-se 200 - 1000 pg de uma protease e incuba-se durante 10 minutos a 70°C e durante um longo intervalo de tempo a temperaturas baixas (por exemplo, 30 minutos à temperatura ambiente). Nesta fase operatória realiza -se simultaneamente a lise eficiente de todas as células eucarióticas e/ou procarióticas e/ou virus (simultânea inactivação de agentes patogénicos infecciosos) e desnaturação e desintegração enzimática de proteínas (simultânea eliminação das proteínas ligadas aos ácidos nucleicos). Por adição de 210 u —ç- Γ μΐ de um álcool a 95 - 100% (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, PEG, álcoois secundários e terciários de cadeia curta ou comprida) são produzidas condições de ligação fortemente especificas para os ácidos nucleicos e o lisado assim ajustado é aplicado ao dispositivo. Por centrifugação ou por pressão, o lisado é imediatamente feito passar através da membrana ou da matriz de gel, sendo os ácidos nucleicos ligados reversivelmente às fibras da membrana ou às partículas de gel. Com 0,7 ml de NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM de pH 7,5, 30 - 80% de um álcool puro (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, PEG, álcoois secundários e terciários de cadeia curta ou comprida) as impurezas como proteínas, heme, heparina, iões ferro, metabólitos, etc. são lavados. O DNA é eluído ou com um tampão de baixa concentração salina (Tris-HCl 10 mM de pH 9,0) ou com água destilada (desionizada) . A vantagem deste processo de eluição consiste no facto de o DNA assim obtido poder ser utilizado directamente, sem outras fases de precipitação ou de aplicação de novo tampão, nas reacções da sequência, especialmente da PCR. A preparação de ácidos nucleicos a partir de outros líquidos corporais como por exemplo esperma, saliva, urina, fezes, suor, escarros, muco do nariz, soro, plasma, lágrimas, etc. é também possível.

Este método simples para isolar ácidos nucleicos possui um elevado potencial de automatização especialmente em ligação com os objectos dos pedidos das DE-A 41 27 276.5, WO 93/11218, WO 93/11211 e DE-A 41 39 664.2. 24 r

Exemplo 8

Preparação de ácido nucleico global de quantidades minimas ou de vestígios de sangue. 1 - 50 μΐ de sangue tratado com citrato, heparina ou EDTA ou sangue congelado e novamente liquefeito ou sangue renaturado a partir de vestígios secos em material têxtil são deitados num tubo de PPM de 1,5 ml e misturados com 1 - 50 μΐ de uma solução de um sal caotrópico 4 - 8 M (hidrocloreto de guanidina, isotiocianato de guanidina, iodeto de potássio) e eventualmente um dissolvente orgânico (fenol, clorofórmio, éter) e um detergente a 1 - 100% (NP40; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) . Em seguida, adicionam-se 1 - 200 μg de uma protease e incuba-se durante 1 minuto a 70°C ou durante um tempo maior no caso de temperaturas mais baixas (por exemplo, 10 minutos à temperatura ambiente).

Nesta fase operacional, realiza-se simultaneamente a lise eficiente de todas as células eucarióticas e/ou procaióticas e/ou vírus (inactivação simultânea de agentes patogénicos infecciosos) e a desnaturação e a desagregação enzimática de proteínas (simultaneamente eliminação das proteínas ligadas aos ácidos nucleicos). Por adição de 1/2 volume de um álcool a 95 -100% (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, álcoois secundários e terciários de cadeia curta ou comprida) ou de polímeros orgânicos (PEG) produzem-se condições de ligação altamente específicas para ácidos nucleicos e o lisado assim obtido é aplicado ao dispositivo. Por centrifugação ou pressão o lisado é imediatamente obrigado a passar através da membrana ou da matriz de gel, em que os ácidos nucleicos são ligados reversivelmente às fibras da membrana ou às partículas de gel. 25 L-Zj

Lavam-se as impurificações tais como proteínas, heme, heparina, iões ferro, metabólitos, etc. com 0,7 ml de NaCl 100 mM, Tris-mji iú mM cie pH 7,0, 3U - 80% de um álcool puro (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, PEG, álcoois secundários e terciários de cadeia curta ou de cadeia comprida) ou de uma mistura de álcoois. O DNA é eluído ou com um tampão contendo uma pequena quantidade de sal (Tris-HCl 10 mM de pH 9,0) ou água destilada (desionizada). A vantagem deste processo de eluição consiste no facto de o DNA assim obtido poder ser utilizado directamente sem quaisquer fases operacionais de precipitação ou de formação de novo tampão nas reacções da sequência, especialmente da PCR.

Este processo é também apropriado para a preparação de ácido nucleicos a partir de pequenas quantidades de outros líquidos corporais (esperma, saliva, urina, fezes, suor, escarros, muco do nariz, soro, plasma, lágrimas, etc.) ou de vestígios secos dos mesmos.

Este método simples para o isolamento de ácidos nucleicos possui um elevado potencial de automatização, especialmente em ligação com os objectos dos pedidos das patentes DE-A 41 27 276.5 , WO 93/11218, WO 93/11211 e DE-A 41 39 664.2.

Exemplo 9

Preparação de ácido nucleico global a partir de tecido 100 μg a 10 mg de um tecido são colocados num tubo de PPN com uma solução de um sal caotrópico 4 - 8 M (hidrocloreto de guanidina, isotiocianato de guanidina, iodeto de potássio), 26 Γ u

eventualmente um dissolvente orgânico (fenol, clorofórmio, éter) e um detergente a 5 - 100% (NP40; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) e homogeneiza-se com um homogenizador comercialmente obtenível ou por trituração com azoto líquido. Em seguida, adicionam-se 100 - 1000 pg de uma protease e incuba-se durante um intervalo de tempo de 10 - 20 minutos a baixas temperaturas 70°C (por exemplo, 30 - 60 minutos à temperatura ambiente). Nesta fase operacional, realiza-se simultaneamente a lise eficiente dé todas as células eucarióticas e/ou procarióticas e/ou outros vírus (simultaneamente, inactivação de agentes patogénicos infecciosos) e a desnaturação ou a degradação enzimática de proteínas (simultânea eliminação das proteínas ligadas aos ácidos nucleicos). Por adição de 1/2 volume de um álcool a 95 - 100% (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, PEG, álcoois secundários e terciários, de cadeia curta ou comprida) são produzidas condições de ligação especialmente específicas para ácidos nucleicos e aplica-se o lisado assim ajustado ao dispositivo. Por centrifugação ou pressão o lisado é rapidamente feito passar através da membrana ou da matriz de gel, em que os ácidos nucleicos se ligam reversivelmente às fibras da membrana ou às partículas de gel. Com 0,7 ml de NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM de pH 7,5, 30 - 80% de um álcool puro (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, PEG, álcoois secundários e terciários de cadeia curta ou de cadeia comprida) ou de uma mistura de álcool são lavadas as impurificações tais como proteínas, M, heparina, iões ferro, metabólitos, etc. 0 DNA é eluído com um tampão de pequena concentração de sais (Tris-HCl 10 mM de pH 9,0) ou água destilada (desionizada) . A vantagem deste processo de eluição consiste no facto de o DNA assim obtido poder ser utilizado directamente sem posteriores operações de precipitação ou de reformulação de tampão nas reacções da sequência, especialmente das PCR. 27 Γ L-Cj

Este método simples para o isolamento de ácidos nucleicos funciona reprodutivelmente em todos os tecidos, entre outros também dc tumores e apiesenLa um elevado potencial de automatização, especialmente em ligação com os objectos dos pedidos das patentes DE-A-41 27 276.5, WO 93/11218, WO 93/11211 e DE-A-41 39 664.2 dos presentes Requerentes.

Exemplo 10

Purificação de fragmentos de DMA a partir de geles de agarose

Separa-se um fragmento de DNA em um gel de agarose (TAE ou TBE 0,5 - 2%). 0 fragmento de DNA a isolar é cortado do gel e misturado num vaso de Eppendorf de 1,5 ml com 300 μΐ de tampão QX1 (NaPO^ 7 M, NaAc 10 mM, pH 5,3) . Depois de incubação durante 10 minutos a 50°,C a agarose tinha-se dissolvido. Adiciona-se esta solução a uma coluna de centrifugação-cromatografia de acordo com Exemplo 1 e centrifuga-se. A coluna de centrifugação-cromatografia é agora lavada por meio de centrifugação de 80% de etanol/água através da coluna até ficar isenta de sais e, em seguida, centrifuga-se durante 1 minuto para eliminar completamente o excesso de etanol. Para a eluição adiciona-se 0,05 ml de tampão de eluição (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5) à coluna de cromatografia e centrifuga-se. 28

de geles de poliacrilamida

Exemplo 11

Purificação de fragmentos de DNA (PAA) 0 fragmento de DNA a isolar é cortado do gel de PAA e colocado num vaso de Eppendorf de 2 ml, desfeito e misturado com 500 μΐ de tampão de eluição PAA (NH^Ac 500 mM, MgAc2 100 mH, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS) . Incuba-se a mistura a 50°C durante 30 minutos e, em seguida, mistura-se com 300 μΐ de tampão QX1 e centrifuga-se através de uma coluna de centrifugação-cromatografia. Lava-se a coluna de centrifugação-cromatografia com 80% de etanol/água até ficar isenta de sais e, em seguida, centrifuga-se durante 1 minuto para eliminar completamente o excesso de etanol. Para a eluição, adiciona-se 0,1 ml de tampão de eluição (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5) à coluna de cromatografia e centrifuga-se.

Exemplo 12

Purificação de fragmentos de PCR de grandes dimensões (> 3 000 bp)

Misturam-se 100 μΐ do produto da reacção de amplificação de PCR com 500 μΐ de tampão QXB (5 M GuHCl) , não sendo necessária uma separação prévia do óleo de parafina que recobre a mistura reaccional. Para a posterior purificação procede-se como no Exemplo 4. 29

Exemplo 13

Purificação de produtos de PCR de hélice única

Mistura-se uma amostra de amplificação de 100 μΐ de uma PCR assimétrica com 500 μΐ de tampão PB (5 M de GuHC, 30% de isopropanol). Para subsequente purificação, procede-se como no Exemplo 4. Para a eluição adiciona-se 0,05 ml de tampão de eluição (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5) à coluna de cromatografia e centrifuga-se. O eluato contém cerca de 90% do produto de PCR que pode ser utilizado directamente para a segunda amplificação ou para o sequenciamento.

Exemplo 14

Preparação de ácido nucleico global a partir de tecido ou de células

Amostras com até 50 mg de um tecido ou até 106 células são homogeneizadas em 400 μΐ de uma solução caotrópica tamponizada (GTC 4 M, citrato de sódio 25 mM de pH 7,5, 2% de 2- -mercaptoetanol) - eventualmente misturados com iam detergente a 5 - 100% (NP40, Tween 20, Triton-X-100, SDS, CTAB, Sarcosilo) . Nesta fase operacional, realiza-se simultaneamente a lise eficiente de todas as células eucarióticas e/ou procarióticas e/ou vírus (inactivação simultânea de agentes patogénicos infecciosos) e a desnaturação das proteínas (especialmente ribonucleases; eliminação simultânea das proteínas ligadas aos ácidos nucleicos) . Por adição de 260 μΐ de um álcool a 100% (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol) obtêm-se condições 30 de ligação altamente especifica para ácidos nucleicos. 0 lisado assim obtido é aplicado no dispositivo.

Em seguida, lavam-se impurezas como proteínas, heme, heparina, metabólitos e polissacáridos com 700 μΐ de um tampão de lavagem que consiste em GTC 1 M, Tris/HCl 25 mM, pH 7,5, 40% de um álcool (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol) assim como 700 μΐ de um tampão de lavagem que consiste em Tris/Hcl 10 mM, pH 7,5, 80% de um álcool (metanol, etanol, n-propanol, isopropanol). Os ácidos nucleicos são eluídos ou com um tampão de pequena concentração de sal (Tris 10 mM, pH 7,5) ou água destilada (desionizada).

Lisboa, 28 de Junho de 2001

0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

t

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a purificação cromatográfica e a separação de misturas de ácidos nucleicos, em que a mistura de ácidos nucleicos • obtida a partir de uma solução de adsorsão aquosa com elevada concentração de sais (força iónica) e com 1 a 50 % em volume de álcool alifático de um complemento da cadeia de Ci-C5 e/ou polietilenoglicol (PEG) e/ou polímeros hidrófobos, inorgânicos e/ou orgânicos e/ou ácidos orgânicos como ácido tricloroacético (TCA), • é adsorvida num suporte mineral poroso ou não poroso de óxidos metálicos e/ou de misturas de óxidos metálicos, gel de sílica, materiais que consistem principalmente em vidro, óxido de alumínio, zóolitos, dióxido de titânio, dióxido de zircónio - sem operações prévias de purificação, • é eventualmente lavada com uma solução de lavagem e, em seguida, • é eluída com uma solução de pequena concentração de sais (força iónica) e se reúnem os ácidos nucleicos ou as fracções de ácidos nucleicos assim obtidos.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que como sais na solução de adsorsão se utilizam sais caotrópicos como 1 de guanidina, de sódio em perclorato de sódio, hidrocloreto isotiocianato de guanidina, iodeto concentrações de 1 a tí M.
3. Processo de acordo com as reivindicações 1 e/ou 2, em que as forças iónicas das soluções de sais são reguladas com cloreto de lítio 1 a 10 M, cloreto de sódio, cloreto de potássio, acetato de sódio, reagentes como por exemplo ureia e/ou suas misturas.
4. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 3, em que o tamanho das partículas do material de suporte mineral está compreendido entre 0,1 μια até 1 000 μια.
5. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 4, em que os materiais de suporte minerais porosos possuem um diâmetro dos poros de 2 até 1 000 nm.
6. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 5, em que os materiais de suporte porosos ou não porosos, especialmente zeólitos, estão presentes sob a forma de massas a granel soltas.
7. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 5, em que os materiais de suporte porosos ou não porosos, especialmente zeólitos, são formados como camadas 2 de filtração sob a forma de camadas de filtração de vidro, quartzo ou material cerâmico e/ou de uma membrana na qual está colocado gel de sílica e/ou que existem como partículas ou fibras de suportes minerais e tecidos de quartzo ou de lã de vidro.
8. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 7, em que os ácidos nucleicos a separar e a purificar são obtidos de fontes biológicas como culturas de células, tecidos de todos os tipos, líquidos corporais como sangue, plasma, soro, urina, fezes, microrganismos como bactérias, em especial Mycobakterium tuberkulosis, como Cytomegalie-vírus cytomegalie, HIV, hepatite B, hepatite C, vírus de hepatite-δ, os produtos obtidos de ácidos nucleicos por reacção de cadeia de polimerase (PCR), DNA de plasmídeos, DNA genómico, RNA, ácidos nucleicos de microrganismos como DNA de plasmídeos, DNA cromossomal ou RNA e/ou ácidos nucleicos de análises de sequências.
9. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 8, em que os ácido nucleicos depois do fraccionamento são 10% mais curtos do que 10 kb.
10. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 9, em que os ácidos nucleicos são oligonucleótidos.
11. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 10, em que, depois da lise de uma amostra que contém 3

ácidos nucleicos como fonte do ácido nucleico a purificar e isolar, a obtenção das condições de adsorsão em gel de sílica se realiza numa única fase, em que as condições de adsorsão são reguladas por lise das amostras no sistema tampão que se utiliza para a adsorsão.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, em que para a preparação de plasmídios depois da lise alcalina das amostras a regulação das condições de adsorsão em gel de sílica se realiza numa única operação.
13. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 12, em que para a preparação do plasmídio se realiza a adsorsão do plasmídio em presença de detergentes.
14. Utilização do processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 13 para a purificação e separação de fragmentos de ácido nucleico depois das reacções de modificação.
15. Utilização de um dispositivo de um corpo oco com abertura de entrada e de saída, em que o lúmen do corpo oco está colocado no dispositivo que fixa o material de suporte para a adsorsão dos ácidos nucleicos a separar, caracterizado por • o dispositivo ser constituído por duas placas fritadas de polietileno com espaço intermédio 4 colocadas uma por cima da outra, em que o material de suporte é colocado entre as placas fritadas de polietileno ou • o dispositivo é uma membrana autossuportada, em que o material de suporte está embebido • para a realização do processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 13.
16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a fixação do dispositivo no lúmen do corpo oco se realiza por forças de atrito e/ou de tracção e/ou por fixação com uma anilha de tracção. Lisboa, 28 de Junho de 2001. O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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