JP3602071B2

JP3602071B2 - 核酸の精製分離方法

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Publication number: JP3602071B2
Application number: JP2001169566A
Authority: JP
Inventors: 恭子小島; 理小澤
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2001-06-05
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2004-12-15
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料等の核酸を含有する試料から核酸を溶出させて核酸を精製して分離する核酸の精製分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来技術に於ける有効な核酸の精製分離方法は、カオトロピック塩の存在下で核酸をガラスやシリカゲル粒子へ吸着させ核酸を回収する原理に基づいている（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｄ．（１９７９）；「アガロースからのＤＮＡの調製的および分解的精製」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：６１５−６１９）。この方法によれば、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、またはグアニジンチオシアン酸塩等の高濃度のカオトロピック塩を用いると、ＤＮＡがアガロースから単離、精製され、あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡが種々の混合物から単離、精製される（Ｂｏｏｍ，Ｒ．（１９９０）；核酸の迅速で簡易な精製法、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：４９５−５０３）。
【０００３】
核酸は精製の後に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）に使用されることが多い。ＰＣＲ反応によれば、核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、遺伝子診断等に広く応用されている。このＰＣＲ法を日常的に臨床で使用する際に、いくつかの問題点が存在する。その中でも、核酸精製時に除去できなかった阻害物質の影響で、ＰＣＲ反応が阻害される事が知られている。阻害物質としては、ヘモグロビン、核酸の抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。このような背景により、核酸の抽出、精製工程は、重要であることが指摘されている（大島ほか、ＪＪＣＬＡ，２２（２），１４５−１５０（１９９７））。
【０００４】
また、抽出工程は従来、手動で行われてきたが、操作が煩雑で熟練性を要することから、装置による自動化が望まれている。そして、使用する試薬等を含め、自動化に適した抽出法の開発が要求されている。自動化に適した核酸の抽出法として、特開平１１−１２７８５４号に記載の方法および特開平１１−２６６８６４号に記載の装置を用いた方法がある。さらに、自動化装置による抽出に適した試薬としては、特表平８―５０１３２１号に記載のものが知られている。特表平８―５０１３２１号に記載の試薬を用いた方法では、高濃度の塩（イオン強度）および高濃度のアルコールを含む溶液から分離精製すべき核酸を抽出用チップ内の吸着担体に接触させて吸着させ、次いで、より低濃度の塩（イオン強度）を含む溶液によって吸着担体から脱着して目的の核酸を得ることができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
特表平８―５０１３２１号に記載の試薬を用いた核酸の精製分離方法では、核酸の回収の収率が低いという問題があった。また、特開平１１−１２７８５４号に記載の抽出用チップを用いた方法では、高濃度の塩（イオン強度）および高濃度のアルコールを含む溶液から分離精製すべき核酸を抽出用チップ内の吸着担体に接触させて吸着させる工程において、溶液の粘度が高いために、操作に長い時間を要することが問題であった。
本発明の目的は、回収の収率を向上させるとともに、核酸回収までに要する時間を短縮し、操作性に優れ、汚染の影響が少ない核酸の精製分離方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の核酸の精製分離方法では、核酸を含有する試料、高濃度の塩、及び有機溶剤を含む混合液から前記核酸を無機担体に吸着させ、次に、水溶液からなる溶出液によって核酸を無機担体から脱離させて回収する。必要に応じて回収の前に、核酸以外の成分を取り除くための洗浄液を用いて担体を洗浄する。核酸は例えば全血の白血球に由来する。
【０００７】
塩としては、カオトロピック塩を使用し、例えば、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチアン酸塩、ヨウ化カリウムの何れかを濃度１Ｍから８Ｍの範囲で使用する。
有機溶剤（有機化合物）は、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族ケトンの中から選ばれた１種類又は複数種類の化合物であり、炭素数２から１０を有する化合物である。混合液の有機溶剤の濃度は５容量％〜５０容量％とする。
【０００８】
混合液の有機溶剤（有機化合物）として使用可能な脂肪族エーテルの代表的な例としては、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１、４−ジオキサンをあげることができる。
混合液の有機溶剤（有機化合物）として使用可能な脂肪族エステルの代表的な例としては、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチルをあげることができる。
混合液の有機溶剤（有機化合物）として使用可能な脂肪族ケトンの代表的な例としては、ヒドロキシアセトン、アセトン、メチルエチルケトンをあげることができる。
本発明においては、混合液に、０．１容量％〜５０容量％の界面活性剤を含ませ、より好ましくは、界面活性剤として０．１容量％〜５容量％の消泡剤を使用すると良い。
【０００９】
無機担体としては、シリカ、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン等からなる多孔性材料又は非多孔性材料を使用する。
洗浄液は、アルコール等の有機溶剤を高濃度に含むものであり、吸引又は遠心分離操作により無機担体を複数回洗浄して核酸以外の成分を取り除く。
本発明の核酸の精製分離方法によれば、核酸を含む溶液の粘度が減少し、気泡の発生が抑制され、かつ、消泡が促進されるので操作性が向上し、汚染の影響を受けにくく、核酸の回収量が増加する。また、核酸回収までに要する操作時間も短縮できる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸の精製分離は、図１に示された方法に基づいて行う。ここでは、特開平１１―１２７８５４号に記載した４つの工程と同様の項目を挙げた。以下に各工程での詳細について述べる。
【００１１】
図２から図５は、図１に挙げた項目に関する、本発明の核酸抽出試薬を用いた全血からの核酸抽出の手順を説明する図である。以下の説明では、ヒト全血１００μＬからの核酸抽出を例とする。図２に示すように、ヒト全血１の中には、赤血球２、白血球３等の成分が含まれており、核酸は主に白血球３内の核４に存在している。
【００１２】
図３に示すように、先ず、チューブ５に１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（６）を注入する。次に、チューブ５に１００μＬの全血１を加える。この工程が１０１である。次に、１００μＬの反応液を加えて攪拌する。この工程が１０２である。この反応液は１Ｍから８Ｍのカオトロピック塩と５０容量％以下の界面活性剤を含む。チューブ５の溶液を５６℃で１０分間インキュベートすることにより、白血球が破壊され、核４内の核酸が溶液内に出る。この工程が１０３である。その後、添加液（例えば、ＥＧＤＥ（エチレングリコールジエチルエーテル）、ＤＩＧＬＹＭＥ（ジエチレングリコールジメチルエーテル）等の有機溶剤）を１００μＬ加えて攪拌すると、混合液７が得られる。この工程が１０４である。ここまでの操作を分解工程と呼ぶ。
この分解工程以降は、数種類の核酸回収法がある。何れの方法も、吸着工程、洗浄工程、回収工程からなる。代表的な例として、スピンカラム法、吸引吐出法がある。
【００１３】
図４はスピンカラム法（以下、第１の方法という）を示す。添加液を加えた後のチューブ５の混合液７をスピンカラム８の中へ移す。スピンカラム８の底部には非常に細かいシリカ又はガラス繊維からなる濾紙状の吸着担体９が充填されている。添加液を含む混合液７を、吸引により吸着担体９内を通過させて、核酸を吸着担体９に吸着させる（吸着工程）。この工程が１０５である。その後、アルコール等の有機溶剤を２０％から８０％含む５００μＬの洗浄液１１をスピンカラム８に注入する。この工程が１０６である。次に、吸引により吸着担体９を洗浄し、核酸以外の成分を取り除くのが工程１０７である（洗浄工程）。この洗浄工程は２回繰り返すが、吸着した核酸は溶離しない。その後、低塩濃度の溶出液１２を添加して、２分間から５分間静置する。この工程が１０８である。核酸を吸着担体９から溶離させ、最後に、吸引により、チューブ１０に回収するのが工程１０９である（溶出工程）。代表的な溶出液の組成は、５０ｍｍｏｌＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．１ｍｍｏｌＥＤＴＡ・２Ｎａである。第１の方法においては、簡便かつ迅速な処理のために、各工程において遠心分離操作を使用することができる。
【００１４】
図５は吸引吐出法（以下、第２の方法という）を示す。第２の方法では、吸着担体１３としてガラス、石英等の繊維を低密度に充填した円筒型中空のカラム１４を使用する。このカラム１４で添加液を加えた後の混合液７を複数回吸引吐出を繰り返し、吸着担体１３に核酸を吸着させるのが工程１１０である（吸着工程）。続いて、５００μＬのアルコール等の有機溶剤を２０％から８０％含む洗浄液１５を入れた別のチューブ１６を使用して吸引吐出を行ない、核酸以外の成分を取り除く。この洗浄工程は、２回以上行う。その後、予め７０℃に加熱したチューブ１７内の溶出液１８（１００μＬ）をカラム１４内の吸着担体１３に接触する位置まで吸い上げた状態で約２分間静止する。この工程が１１１である。この操作により、核酸が吸着担体１３から溶出液１８に溶離する。溶出液１８を吐出させて、核酸を回収する。この工程が１１２である。代表的な溶出液の組成は、５０ｍｍｏｌＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．１ｍｍｏｌＥＤＴＡ・２Ｎａである。
以下、実施例で使用する材料、薬品、試料について詳細に説明する。
【００１５】
１．核酸吸着材料およびカラム
１．１スピンカラム
例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社のガラス繊維ろ紙を３層、遠心分離クロマトグラフィカラム（スピンカラム）に固定した。図４に示す第１の方法のプロトコルにて使用した。
１．２核酸捕捉用カラム
特開平１１―２６６８６４号に記載の核酸捕捉用チップに使用した直径０．５μｍ〜３０μｍの石英繊維（東ソー・クオーツ株式会社製または東芝セラミックス株式会社製）を充填した。これを図５に示す第２の方法のプロトコルにて使用した。
【００１６】
２．核酸を含有する試料
２．１血液（ヒト）
採血直後の血液、あるいは―２０℃で凍結保存した血液を使用した。
２．２組織
新鮮組織あるいは凍結保存した組織を使用した。
２．３植物
植物を液体窒素下、乳鉢ですりつぶし、直接使用、あるいは凍結保存して用いた。
２．４細胞
単離、または単離／培養された細胞を直接使用、または凍結保存していた細胞を用いた。
【００１７】
３．試薬
３．１反応液
反応液は、以下に示すカオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、その他塩成分から構成される。
３．１．１カオトロピック塩
カオトロピック塩として、以下のいずれかを使用した。
ＫＩ：ヨウ化カリウム
ＧｕＨＣｌ：グアニジン塩酸塩
ＧｕＨＳＣＮ：グアニジンチオシアン酸塩
３．１．２界面活性剤
界面活性剤として、以下のいずれかを使用した。
Tween20：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート
Tween40：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート
Tween60：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート
Tween80：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート
Tween85：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート
TritonX-100：ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル
３．１．３消泡剤
ＣＥ−４５７：日本油脂株式会社製の消泡剤ディスホーム、ポリアルキレングリコール誘導体
３．１．４その他の塩
ＥＤＴＡ・２Ｎａ：エチレンジアミン四酢酸・ニナトリウム塩
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
３．２．添加液
添加液には、以下のいずれかの有機溶剤を使用した。
ＥＧＤＭＥ：エチレングリコールジメチルエーテル
ＥＧＤＥＥ：エチレングリコールジエチルエーテル
ＰＧＤＭＥ：プロピレングリコールジメチルエーテル
ＰＧＤＥＥ：プロピレングリコールジエチルエーテル
ＤＩＧＬＹＭＥ：ジエチレングリコールジメチルエーテル
ＤＧＤＥＥ：ジエチレングリコールジエチルエーテル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＸ：１，４―ジオキサン
ＰＧＭＥＡ：プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート
ＥＬ：乳酸エチル
ＨＡＣ：ヒドロキシアセトン
ＡＣ：アセトン
ＭＥＫ：メチルエチルケトン
３．３洗浄液
洗浄液には、以下のいずれかの組成を用いた。
Ｗ１：２５mmol/l 酢酸カリウム、７０容量％エタノール
Ｗ２：２５mmol/l 酢酸カリウム、５０容量％エタノール
Ｗ３：２５mmol/l Tris/HCl、５０容量％エタノール
Ｗ４：１０mmol/l Tris/HCl(pH8.5)、０．１mmol/l ＥＤＴＡ・２Ｎａ、５０容量％エタノール
３．４溶出液
溶出液には、以下のいずれかの組成を用いた。
Ｅ１：水（１００％）、ｐＨ８．０
Ｅ２：１０mmol/l Tris/HCl(pH8.5)、０．１mmol/l EDTA・２Ｎａ
Ｅ３：５０mmol/l Tris/HCl(pH8.5)、０．１mmol/l EDTA・２Ｎａ
３．５．酵素
以下のいずれかの酵素を用いた。
protease：タンパク分解酵素プロテアーゼ
proteinase K：アルカリ性プロテイナーゼＫ
【００１８】
【実施例】
実施例１全血からの核酸抽出１
図３および図５に示された第２の方法に従ってヒト全血１（１００μＬ）からの核酸抽出を行った。分解工程では、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（６）（１０μＬ）を入れたチューブ５に、全血１（１００μＬ）および反応液（１００μＬ）を添加、攪拌し、混合液を得た。ここで用いた反応液は、濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩、５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んでいる。混合液を７０℃で１０分間インキュベートした。その後、ＥＧＤＭＥ、ＥＧＤＥＥ、ＰＧＤＭＥ、ＰＧＤＥＥ、ＤＩＧＬＹＭＥ、ＤＧＤＥＥ、ＴＨＦ、ＤＸ、ＰＧＭＥＡ、ＥＬ、ＨＡＣ、ＡＣおよびＭＥＫの中から選ばれた添加液（１００μＬ）を加え、攪拌した。
【００１９】
吸着工程では、吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４を用いて、混合液７の吸引および吐出の操作を１０回繰り返し行った。
洗浄工程では、別のチューブ１６に入れた洗浄液（Ｗ１）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
回収工程では、別のチューブ１７に入れた溶出液１８を、吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて、２分間静止した。その後、溶出液１８を吐出し、核酸溶液を回収した。
得られた核酸溶液は、沈殿精製等の工程無しで次のＰＣＲ等の反応や分析に使用することができた。
【００２０】
表１は、各種添加液を用いたときの核酸収量と、抽出した核酸溶液における核酸の純度の指標となるＡ２６０／Ａ２８０を示す。
【表１】

【００２１】
ここで、Ａ２６０は、核酸を含んだ水溶液の波長２６０ｎｍにおける吸光度を表す。Ａ２６０／Ａ２８０の値が１．８であるときに、核酸が純粋であるとされている。また、Ａ２６０／Ａ２８０の値が１．７から１．９の間であるときに、十分な純度であるとされている。表１における一連の実験では同一の酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）、反応液、洗浄液および溶出液を使用した。得られた核酸は、二本鎖核酸を定量するための蛍光色素ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．）を用いて、蛍光測定により、定量を行った。いずれの添加液を用いた場合でも、高純度の核酸が得られたことが判る。
【００２２】
図６は、添加液ＤＩＧＬＹＭＥの添加量を変化させたときの核酸収量の変化を示している。横軸は混合液７中のＤＩＧＬＹＭＥ濃度（容量％）、縦軸は最大収量を１００とした時の相対収量（％）を表す。相対収量が８０％以上のときに、目標の収量が得られる。ＤＩＧＬＹＭＥ濃度が５％から５０％にかけて相対収量８０％以上の収量が得られ、特に、約４３％の時に最大収量が得られることが判る。
【００２３】
図７は、添加液ＥＬの添加量を変化させたときの核酸収量の変化を示している。一連の実験では同一の酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）、反応液、洗浄液および溶出液を使用した。相対収量が８０％以上のときに、目標の収量が得られる。ＥＬ添加量が１０％から５０％にかけて相対収量８０％以上の収量が得られ、特に約３３％の時に最大収量が得られることが判る。
【００２４】
図８は、添加液として、ＤＩＧＬＹＭＥとＥＬを混合して使用したときの核酸収量の変化を示している。ここでは、添加液の添加量は混合液全体の３３％に相当する。図８の横軸は、添加液中のＤＩＧＬＹＭＥ比率（体積比）を表す。相対収量が８０％以上のときに、目標の収量が得られる。任意のＤＩＧＬＹＭＥ比率において目的の収量が得られることが判る。
【００２５】
図９、図１０および図１１は、反応液中の界面活性剤濃度と核酸収量との関係を示す。図９―図１１の一連の実験では酵素としてｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、添加液、洗浄液および溶出液を使用した。相対収量が８０％以上のときに、目標の収量が得られる。界面活性剤含有量が５％から５０％において相対収量８０％以上の核酸収量が得られることが示されている。
【００２６】
図１２は、混合液７中の消泡剤（ＣＥ―４５７）添加量と核酸収量との関係を示す。一連の実験では同一の酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）、添加液、洗浄液および溶出液を使用した。反応液については、消泡剤以外の組成は同一である。消泡剤添加量が０．２％から２．５％において相対収量８０％以上の高い核酸収量が得られることが示されている。したがって、消泡剤の添加は、混合液における起泡の抑制のみならず、核酸収量の向上にも有効であることが示された。
【００２７】
表２は、添加液にＤＩＧＬＹＭＥを採用することにより、吸着工程における操作性が向上することを示すものである（^＊”ＯｒｇａｎｉｃＳｏｌｖｅｎｔｓ，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８６）。
【表２】

【００２８】
特表平８―５０１３２１号に記載のアルコールの代表的な化合物であるエタノールと本発明の方法における添加液ＤＩＧＬＹＭＥの粘性を比較すると、ＤＩＧＬＹＭＥの粘性のほうが低いために、吸着工程において、混合液の粘性が低下し、カラム１４内での通液抵抗が低下するので、吸着工程に要する時間が１０秒短縮されたことが示されている。また、起泡が抑制されるので、汚染も減少し、操作性が向上した。
【００２９】
表３は、各種添加液の引火点を示すものであり、これらの安全性について検討した（「溶剤ポケットブック」、有機合成化学協会編、オーム社）。
【表３】

【００３０】
引火点を比較すると、エタノールの引火点よりもＤＩＧＬＹＭＥ、ＥＬ、ＥＧＤＥＥおよびＤＧＤＥＥの方が高い。したがって、添加液としては、中でも、ＤＩＧＬＹＭＥ、ＥＬ、ＥＧＤＥＥおよびＤＧＤＥＥを用いた方が、爆発や火災等の危険性が低く、安全上好ましいということができる。
【００３１】
実施例２全血からの核酸抽出２
図３および図５に示された第２の方法に従ってヒト全血１（１ｍＬ）からの核酸抽出を行った。分解工程では、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（６）（１００μＬ）を入れたチューブ５に、全血１（１ｍＬ）および反応液（１ｍＬ）を添加、攪拌し、混合液を得た。ここで用いた反応液は、濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩、５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んでいる。混合液を７０℃で１０分間インキュベートした。その後、ＤＩＧＬＹＭＥ、エタノールの中から選ばれた添加液を（１ｍＬ）加え、攪拌した。
【００３２】
吸着工程では、吸着担体１３（１００ｍｇ）（東ソー・クオーツ株式会社製）を充填したカラム１４を用いて、混合液７の吸引および吐出の操作を１０回繰り返し行った。
洗浄工程では、別のチューブ１６に入れた洗浄液（Ｗ１）（３ｍｌ）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
回収工程では、別のチューブ１７に入れた溶出液（１ｍｌ）１８を、吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて、２分間静止した。その後、溶出液１８を吐出し、核酸溶液を回収した。
得られた核酸溶液は、沈殿精製等の工程無しで次のＰＣＲ等の反応や分析に使用することができた。
【００３３】
表４は、添加液にエタノールとＤＩＧＬＹＭＥを用いたときの、核酸収量と、得られた核酸溶液のＡ２６０／Ａ２８０を示したものである。
【００３４】
【表４】

【００３５】
添加液としてエタノールを用いた場合には、核酸収量が０．６μｇであったのに対し、ＤＩＧＬＹＭＥを用いた場合には、１５．０μｇであり、添加液としてＤＩＧＬＹＭＥが優れていることが判明した。
【００３６】
実施例３全血からの核酸抽出３
図３および図４に示された第１の方法に従ってヒト全血１００μＬからの核酸抽出を行った。
分解工程は実施例１と同様に行った。また、使用した酵素、反応液、添加液、洗浄液および溶出液についても実施例１と同じであった。
吸着工程では、スピンカラム８に混合液を注ぎ、卓上遠心機（回転数６０００ｒｐｍ）を用いて、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
洗浄工程では、スピンカラム８に、洗浄液（Ｗ２）１１（５００μｌ）を注ぎ、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
回収工程では、スピンカラム８に溶出液（Ｅ２）１２（１００μｌ）を注ぎ、２分間室温（２５℃）で放置した後、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って核酸を回収し、定量、純度評価を行った。
この方法においても、実施例１と同様の結果が得られた。
【００３７】
実施例４組織からの核酸抽出１（第１の方法）
２５ｍｇの肝臓組織（ラット）と８０μｌのＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）を混合し、機械的にホモジナイズした。ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０μｌ）を添加後、攪拌し、組織が溶解するまで５６℃に加熱した。濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩、５容量％のＴｗｅｅｎ８０を含んだ反応液２００μｌを添加して混合液とした後、攪拌、７０℃で１０分間加熱した。ＤＩＧＬＹＭＥ（２００μｌ）を添加し、混合した。以上が分解工程である。
【００３８】
吸着工程では、スピンカラム８に混合液を注ぎ、卓上遠心機を用いて、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
洗浄工程では、スピンカラム８に洗浄液（Ｗ３）１１（５００μｌ）を注ぎ、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
回収工程では、スピンカラム８に上記Ｅ１、Ｅ２およびＥ３から選ばれた溶出液１２（１００μｌ）を注ぎ、２分間室温（２５℃）で放置した後、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って核酸を回収し、定量、純度評価を行った。
その結果、Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ、ＰＣＲ反応に使用することが可能であった。
【００３９】
実施例５組織からの核酸抽出２（第１の方法）
２０ｍｇのぼうこう組織（ラット）から、実施例４と同様の方法で核酸抽出を行った。その結果、Ａ２６０／Ａ２８０が１．７の高純度の核酸が得られ、ＰＣＲ反応に使用することが可能であった。
【００４０】
実施例６尿からの核酸抽出（第１の方法）
２０ｍｌの尿検体を、５分間遠心処理（回転数１４０００ｒｐｍ）を行った。上清を除去し、尿沈査を分離した。得られた尿沈査に、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０μｌ）と、濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩、５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだ反応液２００μｌを添加後、攪拌、７０℃で１０分間加熱した。ＤＩＧＬＹＭＥ２００μｌを添加し、混合した。以上が分解工程である。
【００４１】
吸着工程では、上記スピンカラム８に混合液を注ぎ、卓上遠心機を用いて、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
洗浄工程では、スピンカラム８に洗浄液（Ｗ４）１１（５００μｌ）を注ぎ、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
回収工程では、スピンカラム８に溶出液（Ｅ３）１２（１００μｌ）を注ぎ、２分間室温（２５℃）で放置した後、１分間遠心処理を行って核酸を回収し、定量、純度評価を行った。
その結果、Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ、ＰＣＲ反応に使用することが可能であった。
【００４２】
実施例７細胞からの核酸抽出（第１の方法）
１０^６個のＨｅＬａ細胞をＰＢＳ（１００μｌ）に分散させ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０μｌ）と、濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩、５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだ反応液２００μｌを添加後、攪拌、７０℃で１０分間加熱した。ＤＩＧＬＹＭＥ２００μｌを添加し、混合した。以上が分解工程である。
【００４３】
吸着工程では、上記スピンカラム８に混合液を注ぎ、卓上遠心機を用いて、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
洗浄工程では、スピンカラム８に洗浄液（Ｗ２）１１（５００μｌ）を注ぎ、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
回収工程では、スピンカラム８に溶出液（Ｅ１）１２（１００μｌ）を注ぎ、２分間室温（２５℃）で放置した後、１分間遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って核酸を回収し、定量、純度評価を行った。
その結果、Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ、ＰＣＲ反応に使用することが可能であった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、回収の収率を向上させるとともに、核酸回収までに要する時間を短縮し、操作性に優れ、汚染の影響が少ない核酸の精製分離方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例に於ける核酸の抽出プロセスを示す。
【図２】本発明の実施例に於ける全血の構成を示す。
【図３】本発明の実施例に於ける全血からの核酸抽出の手順中の分解工程を示す。
【図４】本発明の実施例に於ける全血からの核酸抽出の手順（第１の方法）を示す。
【図５】本発明の実施例に於ける全血からの核酸抽出の手順（第２の方法）を示す。
【図６】本発明の実施例に於ける混合液中のＤＩＧＬＹＭＥ濃度と相対核酸収量の相関を示す。
【図７】本発明の実施例に於ける混合液中のＥＬ濃度と相対核酸収量の相関を示す。
【図８】本発明の実施例に於けるＤＩＧＬＹＭＥおよびＥＬ混合添加液を用いた場合の添加液中のＤＩＧＬＹＭＥ比率と相対核酸収量を示す。
【図９】本発明の実施例に於ける反応液中のＴｗｅｅｎ２０含有量と相対核酸収量の相関を示す。
【図１０】本発明の実施例に於ける反応液中のＴｗｅｅｎ８０含有量と相対核酸収量の相関を示す。
【図１１】本発明の実施例に於ける反応液中のＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有量と相対核酸収量の相関を示す。
【図１２】本発明の実施例に於ける反応液への消泡剤ＣＥ−４５７添加量と相対核酸収量の相関を示す。
【符号の説明】
１…ヒト全血、２…赤血球、３…白血球、４…核、５…チューブ、６…ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、７…混合液、８…スピンカラム、９…吸着担体、１０…チューブ、１１…洗浄液、１２…溶出液、１３…吸着担体、１４…カラム、１５…洗浄液、１６…チューブ、１７…チューブ、１８…溶出液、
１０１…全血添加、１０２…反応液添加および攪拌、１０３…混合溶液のインキュベート、１０４…添加液の添加と攪拌、１０５…吸引による核酸吸着、１０６…洗浄液のカラムへの添加、１０７…洗浄工程、１０８…溶出液添加と静置、１０９…核酸の回収、１１０…吸引吐出による核酸吸着、１１１…溶出液吸上げと静置、１１２…核酸の回収

Claims

プロテアーゼ、カオトロピック塩、及び界面活性剤と試料とを混合した第1の混合液を所定の温度とし、
前記所定の温度とした後に、前記第1の混合液に、化合物を添加して第2の混合液とし、
前記第2の混合液に含まれる核酸を担体に吸着させ、
エタノールを含む溶液を用いて前記担体を洗浄し、
前記担体に吸着した核酸を溶出させて回収し、
前記化合物はエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする核酸抽出方法。
プロテアーゼ、カオトロピック塩、及び界面活性剤と試料とを混合した第 1 の混合液を所定の温度とし、
前記所定の温度とした後に、前記第 1 の混合液に、ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルを添加して第 2 の混合液とし、
前記第 2 の混合液に含まれる核酸を担体に吸着させ、
エタノールを含む溶液を用いて前記担体を洗浄し、
前記担体に吸着した核酸を溶出させて回収する
ことを特徴とする核酸抽出方法。
前記試料は組織であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸抽出方法。
前記試料は尿であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸抽出方法。
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と、
化合物と、
核酸を吸着させるための担体と、
エタノールを含む第2の液体と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液と
を有し、前記化合物はエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする核酸抽出キット。
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第 1 の液体と、
ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルと、
核酸を吸着させるための担体と、
エタノールを含む第 2 の液体と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液と
を有することを特徴とする核酸抽出キット。
前記カオトロピック塩は、ヨウ化カリウム、グアニジン塩酸塩、及びグアニジンチオシアン酸塩の少なくとも１つであることを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の核酸抽出キット。
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、及びポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテルの少なくとも１つであることを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の核酸抽出キット。
前記担体は、シリカ、アルミナ、ゼオライト、及び二酸化チタンの少なくとも１つを材料とすることを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の核酸抽出キット。
プロテアーゼ、カオトロピック塩、及び界面活性剤と血液とを混合した第1の混合液を所定の温度とし、
前記所定の温度とした後に、前記第1の混合液に、化合物を添加して第2の混合液とし、
前記第2の混合液に含まれる核酸を担体に吸着させ、
エタノールを含む溶液を用いて前記担体を洗浄し、
前記担体に吸着した核酸を溶出させて回収し、
前記化合物はエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする、血液からの核酸抽出方法。
プロテアーゼ、カオトロピック塩、及び界面活性剤と血液とを混合した第 1 の混合液を所定の温度とし、
前記所定の温度とした後に、前記第 1 の混合液に、ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルを添加して第 2 の混合液とし、
前記第 2 の混合液に含まれる核酸を担体に吸着させ、
エタノールを含む溶液を用いて前記担体を洗浄し、
前記担体に吸着した核酸を溶出させて回収する
ことを特徴とする、血液からの核酸抽出方法。
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と、
化合物と、
核酸を吸着させるための担体と、
エタノールを含む第2の液体と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液と
を有し、前記化合物はエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする血液からの核酸抽出キット。
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第 1 の液体と、
ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルと、
核酸を吸着させるための担体と、
エタノールを含む第 2 の液体と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液と
を有することを特徴とする血液からの核酸抽出キット。
タンパク質分解酵素と、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含み、試料に供給される反応液と、
前記試料に供給した反応液に添加される添加液と、
核酸を吸着させる吸着担体と、
前記吸着担体を洗浄する洗浄液と、
核酸が吸着した吸着担体から前記核酸を溶出させる、溶出液と
を有し、前記添加液がエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする核酸抽出キット。
タンパク質分解酵素と、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含み、試料に供給される反応液と、
前記試料に供給した反応液に添加される添加液と、
核酸を吸着させる吸着担体と、
前記吸着担体を洗浄する洗浄液と、
核酸が吸着した吸着担体から前記核酸を溶出させる、溶出液と
を有し、前記添加液がジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルであることを特徴とする核酸抽出キット。
プロテイナーゼＫと、
グアジニン塩酸塩とポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートとポリアルキレングリコール誘導体を含む第1の液体と
ジエチレングリコールジメチルエーテルと、
核酸を吸着させるための担体と、
酢酸カリウムとエタノールとを含む第2の液体と、
トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタンとエチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩とを含む第3の液体とを有することを特徴とする核酸抽出キット。
前記第1の液体は試料に供給される反応液であり、前記ジエチレングリコールジメチルエーテルは前記試料に供給した反応液に添加される添加液であり、前記第2の液体は前記担体を洗浄する洗浄液であり、前記第3の液体は前記担体から前記核酸を溶出させる溶出液であることを特徴とする請求項１６に記載の核酸抽出キット。
前記第 1 の混合液は消泡剤を含むことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸抽出方法。
前記第 1 の混合液は消泡剤を含むことを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載の血液からの核酸抽出方法。
前記第 1 の液体は消泡剤を含むことを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の核酸抽出キット。
前記第 1 の液体は消泡剤を含むことを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載の血液からの核酸抽出キット。
前記反応液は消泡剤を含むことを特徴とする請求項１４又は請求項１５に記載の核酸抽出キット。