JP3644426B2 - 核酸の精製分離方法および装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，核酸を有する生体試料から核酸を溶出させて，核酸を精製して分離する核酸の精製分離方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来技術に於ける有効な核酸の精製分離方法は，カオトロピック塩の存在下で核酸をガラスやシリカゲル粒子へ吸着させ核酸を回収する原理に基づいている（従来技術−１：Vogelstein,B. and Gillespie,D.(1979)；「アガロースからのＤＮＡの調製的及び分解的精製」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:615-619，従来技術−２：Boom,R.(1990)；「核酸の迅速で簡易な精製法」，J.Clin.Microbiol.28:495-503）。従来技術−１，２によれば，ヨウ化ナトリウム，過塩素酸ナトリウム，又はグアニジンチオシアン酸塩等の高濃度のカオトロピック塩を用いると，ＤＮＡがアガロースから単離，精製され，あるいは，ＲＮＡ又はＤＮＡが種々の混合物から単離，精製される。
【０００３】
核酸は精製の後に，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Polymerase chain reaction）に使用されることが多い。ＰＣＲでは，核酸は配列に特異的に増幅できるので，遺伝子診断等に広く応用されている。ＰＣＲ法を日常的に臨床で使用する際に，いくつかの問題がある。核酸の精製時に除去できなかった阻害物質の影響で，ＰＣＲが阻害される事が知られている。阻害物質として，ヘモグロビン，核酸の抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。このため，核酸の抽出，精製工程は，重要であることが指摘されている（従来技術−３：大島他，JJCL A,22(2),145-150(1997)）。
【０００４】
従来，抽出工程は手作業でなされてきたが，操作が煩雑で熟練性を要することから，装置による自動化が望まれている。また，自動化に適した抽出法（使用する試薬を含む）の開発が要求されている。
【０００５】
特開平１１−１２７８５４号公報（従来技術−４），特開平１１−２６６８６４号公報（従来技術−５）に，自動化に適した核酸の抽出法，核酸捕捉用チップが記載されている。また，特表平８−５０１３２１号公報（従来技術−６）に，自動化装置による核酸の抽出に適した試薬の記載があり，高濃度の塩（イオン強度が大）及び高濃度のアルコールを含む溶液中に存在する分離精製すべき核酸を，抽出用チップ内の吸着担体に接触させて吸着させ，次いで，より低濃度の塩（イオン強度が小）を含む溶液を用いて，吸着担体から核酸を遊離させて，目的の核酸を得ている。
【０００６】
全血からの核酸の抽出は，以下のようにして行われる。蛋白分解酵素と血球溶解のためのバッファーを全血に加え攪拌後，５６°Ｃ又は７０°Ｃで１０分間インキュベーションする。インキュベーション後，エタノールを添加し，核酸を含む溶液を吸着カラムに通す。エタノールを含むバッファーでカラムを洗浄した後，核酸回収用バッファーにより，カラムに吸着した核酸を回収する（従来技術−７：QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook，及び，QIAamp DNA Blood Midi/Maxi Kit Handbook,QIAGEN）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術−６に記載の試薬を用いた核酸の精製分離方法では，核酸の回収の収率が低いという課題があった。また，従来技術−４に記載の抽出用チップを用いた方法では，核酸回収量のばらつきが大きいという課題があった。
【０００８】
本発明の目的は，核酸回収量のばらつきが小さく，安定して高い核酸回収量が得られる核酸の精製分離方法及び装置を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の核酸の精製分離方法では，（工程１）核酸と高濃度の塩とを含む溶液（以下，核酸遊離溶液という）に有機溶剤を添加し，（工程２）有機又は無機の担体に核酸を吸着させ，（工程３）水溶液からなる回収液を用いて，有機又は無機担体から核酸を脱離させて回収する。必要に応じて，（工程３）の前に，洗浄液を用いて担体を洗浄して核酸以外の成分を取り除く工程を実行する。有機溶剤の添加直前の核酸遊離溶液の温度を有機溶剤の温度にほぼ同じくして，温度Ｔ（°Ｃ）の有機溶剤の添加直前の核酸遊離溶液の温度をＴ±（２〜３）°Ｃとする。なお，以下の説明で，温度Ｔ（°Ｃ）とほぼ同じ温度とは，Ｔ±（２〜３）°Ｃの温度をいう。また，核酸遊離溶液の温度と有機溶剤の温度とを異ならせても良い。核酸は，例えば，全血の白血球に由来する。
【００１０】
核酸収量は，最大核酸収量を１００％とする相対核酸収量により比較される。
【００１１】
本発明では，（工程１）で，−５°Ｃ〜５５°Ｃの範囲の温度に保持された，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルの何れかを添加することにより，８０％以上の相対核酸収量が得られ，また，（工程１）で，０°Ｃ〜５０°Ｃの範囲の温度に保持された，ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルを添加することにより，８０％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１２】
より好ましくは，（工程１）で，０°Ｃ〜５０°Ｃの範囲の温度に保持された，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，乳酸エチルの何れかを添加することにより，９０％以上の相対核酸収量が得られ，また，（工程１）で，０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度に保持された，ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルを添加することにより，９０％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１３】
更に好ましくは，（工程１）で，１０°Ｃ〜３５°Ｃの範囲の温度に保持された，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルの何れかを添加することにより，９５％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１４】
本発明の核酸の精製分離方法では，（工程１）核酸と高濃度の塩とを含み，０°Ｃ〜５０°Ｃの範囲の温度Ｔに保持された溶液に，温度Ｔとほぼ同じ温度に保持された有機溶剤を添加し，（工程２）担体に核酸を吸着させる。有機溶剤として，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，乳酸エチルの何れかを用いることにより，９０％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１５】
本発明の核酸の精製分離方法では，（工程１）核酸と高濃度の塩とを含み，０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度Ｔに保持された溶液に，温度Ｔとほぼ同じ温度に保持された有機溶剤を添加し，（工程２）担体に核酸を吸着させる。有機溶剤として，ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルを使用することにより，９０％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１６】
本発明の核酸の精製分離方法は，以下の特徴を有する。
（Ａ）（１）核酸と高濃度の塩とを含み，１０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度Ｔに保持された溶液に，前記温度Ｔとほぼ同じ温度に保持された有機溶剤を添加する工程と，（２）担体に前記核酸を吸着させる工程とを有することを特徴とする核酸の分離精製方法。
（Ｂ）（Ａ）に記載の核酸の分離精製方法に於いて，前記有機溶剤が，エタノール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルの何れかであることを特徴とする核酸の分離精製方法。（Ａ）及び（Ｂ）の方法では，９５％以上の相対核酸収量が得られる。
（Ｃ）（１）核酸と高濃度の塩とを含み，２０°Ｃ〜３６°Ｃの範囲の温度Ｔに保持された溶液に，前記温度Ｔとほぼ同じ温度に保持された有機溶剤を添加する工程と，（２）前記温度Ｔとほぼ同じ温度で担体に前記核酸を吸着させる工程とを有することを特徴とする。
（Ｄ）（Ｃ）に記載の核酸の分離精製方法に於いて，前記温度Ｔが２２°Ｃ〜３２°Ｃの範囲の温度に設定されることを特徴とする核酸の分離精製方法。
（Ｃ）の方法では，８０％以上の相対核酸収量が得られ，（Ｄ）の方法では，９５％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１７】
本発明の精製分離方法を自動的に実行する核酸の精製分離装置は，以下の特徴を有する。
（１）核酸と高濃度の塩とを含む溶液に有機溶剤を添加した後，担体に前記核酸を吸着させる核酸の分離精製装置に於いて，前記溶液を０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度に保持する手段を有することを特徴とする核酸の分離精製装置。
（２）（１）に記載の核酸の分離精製装置に於いて，前記有機溶剤が０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度に保持されることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（３）（１）に記載の核酸の分離精製装置に於いて，前記溶液の温度と前記有機溶剤の温度がほぼ同じであることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（４）（１）に記載の核酸の分離精製装置に於いて，前記溶液の温度と前記有機溶剤の温度が異なることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（１）から（４）の装置では，９０％以上の相対核酸収量が得られる。
（５）核酸と高濃度の塩とを含む溶液に有機溶剤を添加した後，担体に前記核酸を吸着させる核酸の分離精製装置に於いて，前記有機溶剤及び前記溶液の温度を，２０°Ｃ〜３６°Ｃの範囲の温度Ｔに保持する手段を有し，前記温度Ｔの前記溶液に，前記温度Ｔの前記有機溶剤を添加した後に，前記温度Ｔとほぼ同じ温度で前記担体に前記核酸を吸着させることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（６）（５）に記載の核酸の分離精製装置に於いて，前記温度Ｔが２２°Ｃ〜３２°Ｃの範囲の温度に設定されることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（５）の装置では，８０％以上の相対核酸収量が得られ，（６）の装置では，９５％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１８】
本発明の装置では，Ｔを−２０°Ｃから８０°Ｃの間において任意の温度として，核酸遊離溶液を温度Ｔに保持する手段，及び，温度Ｔとほぼ同じ温度に有機又は無機の担体を保持する手段ととして，共通の加熱冷却温度制御回路を使用する。加熱冷却温度制御回路は，温度センサ，ペルチェ素子，及びペルチェ素子の制御回路を組み合わせて構成され，温度制御対象を一定の温度に保持する。このような構成によれば，温度制御を高速に行なうことができる。また，加熱冷却温度制御回路を，温度センサ，循環水冷装置，及び循環水冷装置の制御回路を組み合わせて構成してもよい。
【００１９】
また，ＰＣＲを行うサーマルサイクラ部が組み込まれた本発明の装置では，核酸の精製分離の後，直ちに，自動的にＰＣＲを実行させることができるので，例えば，遺伝子検査を高速に行なうことが可能となる。
【００２０】
以下，本発明の核酸の精製分離方法，及び装置で好適に使用される試薬，構成要素について説明する。
【００２１】
塩としてカオトロピック塩を１Ｍ〜８Ｍの濃度範囲で使用する。例えば，グアニジン塩酸塩，グアニジンチオシアン酸塩，ヨウ化カリウムの何れかを使用する。
【００２２】
有機溶剤として，２から１０の範囲の炭素数を持つ化合物を使用する。化合物は，脂肪族アルコール，脂肪族エーテル，脂肪族エステル，脂肪族ケトンから選択される。１つの化合物，又は，複数の化合物の混合物が，有機溶剤として使用される。有機溶剤は，その濃度が５容量％〜５０容量％となるように添加すると良い。
【００２３】
脂肪族アルコールの代表的な例として，エタノール（ＥｔＯＨ），１−プロパノール（ＰｒＯＨ），２−プロパノール（ｉ−ＰｒＯＨ）がある。
【００２４】
脂肪族エーテルの代表的な例として，エチレングリコールジメチルエーテル，エチレングリコールジエチルエーテル（ＥＧＤＥ），プロピレングリコールジメチルエーテル（ＰＧＤＭＥ），プロピレングリコールジメチルエーテル，プロピレングリコールジエチルエーテル（ＰＧＤＥＥ），ジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＩＧＬＹＭＥ），ジエチレングリコールジエチルエーテル（ＤＧＤＥＥ），テトラヒドロフラン（ＴＨＦ），１，４−ジオキサン（ＤＸ）がある。
【００２５】
脂肪族エステルの代表的な例として，プロピレングリコールモノメチルアセテート（ＰＧＭＥＡ），乳酸エチル（ＥＬ）がある。
【００２６】
脂肪族ケトンの代表的な例として，ヒドロキシアセトン（ＨＡＣ），アセトン（ＡＣ），メチルエチルケトン（ＭＥＫ）がある。
【００２７】
無機担体として，シリカ，アルミナ，ゼオライト，二酸化チタンからなる多孔性材料又は非多孔性材料を使用する。
【００２８】
洗浄液は，アルコール等の有機溶剤を高濃度に含み，吸引又は遠心分離操作により，有機又は無機の担体を複数回洗浄して，核酸以外の成分を取り除く。
【００２９】
回収液は，低濃度の塩を含む水溶液であり，有機又は無機の担体と接触させることにより，有機又は無機の担体に吸着していた核酸を溶出させる。
【００３０】
本発明では，核酸と高濃度の塩とを含む溶液に，０．１容量％〜５０容量％の界面活性剤を添加する。好ましくは，界面活性剤として，０．１容量％〜５容量％の消泡剤を使用すると良い。
【００３１】
【発明の実施の形態】
図１は，本発明の実施例での核酸の抽出プロセスを説明する図である。図２は，本発明の実施例で用いる全血の構成を説明する図である。図３から図５は，従来技術−４に記載される図１の方法に基づく，本発明の核酸の精製分離方法に於ける，核酸抽出試薬を用いた全血からの核酸抽出の手順を説明する図である。以下の説明では，１００μＬのヒト全血からの核酸抽出を例にとる。
【００３２】
図１に示す核酸の抽出プロセスは，従来技術−４に記載される６つの工程から構成される。核酸抽出の手順は，核酸を含有する材料（試料）から核酸を遊離させる第１工程５０１，第１工程５０１で得られる遊離した核酸を含む核酸遊離溶液に，核酸の固相への結合を促進させる添加液（アルコール系，エステル系，エーテル系等の有機溶剤）を添加して混合する第２工程５０２，第２工程５０２で得られた混合液と核酸結合性固相（核酸を吸着する担体）とを接触させる第３工程５０３，核酸が結合した固相と液体とを分離する第４工程５０４，核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する第５工程，核酸が結合した固相から核酸を遊離させる第６工程から構成される。以上の工程により，核酸を含有する材料（試料）から，精製状態の核酸が得られる。
【００３３】
以下，第１工程と第２工程を合わせて分解工程と呼び，第３工程と第４工程を合わせて吸着工程と呼ぶ。
【００３４】
図２に示すように，ヒト全血１の中には，赤血球２，白血球３等の成分が含まれており，核酸は主に白血球３の核４に存在している。
【００３５】
図３は，本発明の実施例での，全血からの核酸抽出の手順を説明する図である。先ず，チューブ５に１０μＬのProteinase K（６）を注入する。次に，チューブ５に１００μＬの全血１を加える（全血の添加１０１）。次に，１００μＬの反応液（１Ｍ〜８Ｍのカオトロピック塩と５０％以下の界面活性剤を含む）を加えて攪拌する（反応液の添加及び攪拌１０２）。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートする（インキュベート１０３）ことにより，白血球が破壊され，核４内の核酸が溶液内に出る（添加液の添加前の核酸遊離溶液を得る）。その後，この核酸遊離溶液に，核酸の固相への結合を促進させる添加液（アルコール系，エステル系，エーテル系等の有機溶剤）を１００μＬ加えて攪拌する（添加液の添加と攪拌１０４）と，混合液７が得られる。混合液７を得るまでの工程が分解工程である。
【００３６】
この分解工程以降に行なう数種類の核酸回収法がある。何れの方法も，吸着工程，洗浄工程，回収工程からなる。代表的な例として，スピンカラム法，吸引吐出法がある。
【００３７】
図４は，本発明の実施例での，全血からの第１の核酸回収方法（スピンカラム法）の手順を説明する図である。先ず，チューブ５中の混合液７を，スピンカラム８の中へ移す。スピンカラム８の底部には非常に細かいシリカ又はガラス繊維からなる濾紙状の吸着担体９が充填されている。
【００３８】
添加液を含む混合液７を，吸引により吸着担体９内を通過させて，核酸を吸着担体９に吸着させる（吸着工程７：吸引による核酸吸着工程１０５）。その後，アルコール等の有機溶剤を２０％〜８０％含む５００μＬの洗浄液１１を，スピンカラム８に注入する（洗浄液のカラムへの添加１０６）。
【００３９】
次に，吸引により吸着担体９を洗浄し，核酸以外の成分を取り除く（洗浄工程１０７）。この洗浄工程は２回繰り返すが，吸着担体に吸着した核酸は洗浄工程により溶離しない。その後，低塩濃度の溶出液１２を添加して２分間から５分間静置する（溶出液の添加と静置１０８）。核酸を吸着担体から溶離させ，最後に，吸引により，チューブ１０に回収する（溶出工程：核酸の回収１０９）。代表的な溶出液１２の組成は，５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａである。
【００４０】
図５は，本発明の実施例での，全血からの第２の核酸回収方法（吸引吐出法）の手順を説明する図である。吸引吐出法では，吸着担体１３としてガラス，石英等の繊維を低密度に充填した円筒型中空カラム１４を使用する。カラム１４を使用して，チューブ５中の混合液７の吸引吐出を，複数回繰り返し，吸着担体１３に核酸を吸着させる（吸着工程：吸引吐出による核酸吸着１１０）。続いて，５００μＬのアルコール等の有機溶剤を２０％〜８０％含む洗浄液１５を入れた別のチューブ１６を使用して，吸引吐出を行ない，核酸以外の成分を取り除く（洗浄工程）。この洗浄工程は，２回以上行う。その後，予め７０°Ｃに加熱したチューブ１７内の溶出液１６（１００μＬ）を，カラム１４内の吸着担体１３に接触する位置まで吸い上げた状態で約２分間静止する（溶出液の吸上げと静置１１１）。この操作により，核酸が吸着担体１３から溶出液１８に溶離する。溶出液１８を吐出させて，チューブ１７に核酸を回収する（核酸の回収１１２）。代表的な溶出液の組成は，５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａである。
【００４１】
以下，実施例で使用する材料，薬品，試料について詳細に説明する。
１． 核酸吸着材料及びカラム
１．１ スピンカラム：例えば，３層のガラス繊維濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）を，遠心分離クロマトグラフィカラム（スピンカラム）に固定した。スピンカラムは，図３，図４に示すスピンカラム法のプロトコルにて使用した。
１．２ 核酸捕捉用カラム：従来技術−５に記載の核酸捕捉用チップ（カラム）に，直径０．５μｍ〜３０μｍの石英繊維（東ソー・クオーツ株式会社製又は東芝セラミックス株式会社製）を充填した。核酸捕捉用チップは，図３，図５に示す吸引吐出法のプロトコルにて使用した。
２． 核酸を含有する試料
２．１ 血液（ヒト）：採血直後の血液，又は，−２０°Ｃで凍結保存した血液を使用した。
２．２ 組織：新鮮組織又は凍結保存した組織を使用した。
２．３ 植物：植物を液体窒素下で乳鉢ですりつぶし直接使用，又は，凍結保存した後用いた。
２．４ 細胞：単離，又は単離／培養された細胞を直接使用，又は凍結保存していた細胞を用いた。
３． 試薬
３．１ 反応液：反応液は，以下に示すカオトロピック塩，界面活性剤，消泡剤，その他塩成分を含む。
３．１．１ カオトロピック塩：ヨウ化カリウム（ＫＩ），グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ），グアニジンチオシアン酸塩（ＧｕＨＳＣＮ）の何れかを使用した。
３．１．２ 界面活性剤：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０），ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミレート（Ｔｗｅｅｎ４０），ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の何れかを使用した。
３．１．３ 消泡剤：ＣＥ−４５７（日本油脂株式会社製の消泡剤ディスホーム，ポリアルキレングリコール誘導体）
３．１．４ その他の塩：エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ），トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）
３．２ 添加液：ＰＧＤＭＥ，ＰＧＤＥＥ，ＤＩＧＬＹＭＥ，ＤＧＤＥＥ，ＴＨＦ，ＤＸ，ＰＧＭＥＡ，ＥＬ，ＨＡＣ，ＡＣ，ＭＥＫ，ＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨの何れかの有機溶剤を使用した。
３．３ 洗浄液：２５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸カリウム＋７０容量％エタノール（Ｗ１），２５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸カリウム＋５０容量％エタノール（Ｗ２），１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａ＋５０容量％エタノール（Ｗ３）の何れかの組成を用いた。
３．４ 溶出液：水（１００％，ｐＨ８．０）（Ｅ１），１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌのＥＤＴＡ・２Ｎａ（Ｅ２），５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａ（Ｅ３）の何れかの組成を用いた。
３．５． 酵素：タンパク分解酵素プロテアーゼ（protease），アルカリ性プロテイナーゼＫ（proteinase K）の何れかの酵素を用いた。
実施例１：全血からの核酸抽出（その１）
図３及び図５に示された方法に従って，１００μＬのヒト全血１から核酸抽出を行った。分解工程では，１０μＬのproteinase K（６）を入れたチューブ５に，１００μＬの全血１及び１００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｗｅｅｎ４０を含む）を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートして，核酸遊離溶液を得た。核酸遊離溶液に，ＥＬ，ＤＩＧＬＹＭＥ，ＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨから選ばれた添加液（１００μＬ）を加え攪拌して，混合液７を得た。
【００４２】
吸着工程では，石英ウール吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４を用いて，混合液７の吸引及び吐出の操作を，温度２５°Ｃにて１０回繰り返し行った。
【００４３】
洗浄工程では，別のチューブ１６に入れた洗浄液（Ｗ１）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
【００４４】
回収工程では，別のチューブ１７に入れた溶出液１８を，吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて２分間静止した。その後，溶出液１８を吐出し，核酸を含む溶液を回収した。回収した核酸は，良好な純度を有し，沈殿，精製等の工程無しで，次のＰＣＲ等の反応や分析に使用できた。
【００４５】
図６は，本発明の実施例１に於いて，添加液としてＥＬを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。
【００４６】
以下の説明では，温度Ｔと相対核酸収量の関係を求める場合には，温度Ｔ以外の化学反応条件を同一として，温度Ｔを変化させた時の核酸収量を，最大核酸収量を１００％とする相対核酸収量により比較する。
【００４７】
図６，図７，図８，図１１に於いて，横軸の温度は，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液をほぼ同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加する時の温度Ｔを示し，縦軸は，温度Ｔを変化させた時に得られた相対核酸収量を示す。
【００４８】
図６に示すように，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，温度Ｉが１０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【００４９】
ＥＬと同様に使用できるエステル系有機溶剤として，ＰＧＭＥＡがある。
【００５０】
図７は，本発明の実施例１に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。図７に示すように，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜４５°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，温度Ｔが１０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【００５１】
ＤＩＧＬＹＭＥと同様に使用できるエーテル系有機溶剤として，ＥＧＤＭＥ，ＥＧＤＥＥ，ＰＧＤＭＥ，ＰＧＤＥＥ，ＤＧＤＥＥ，ＴＨＦ，ＤＸがある。
【００５２】
図８は，本発明の実施例１に於いて，添加液としてＥｔＯＨを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。図８に示すように，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，温度Ｔが１０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【００５３】
ＥｔＯＨと同様に使用できるアルコール系有機溶剤として，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨがある。添加液としてＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨの何れかを使用して，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を調べた結果，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。
【００５４】
アルコール系有機溶剤を用いた場合には，エーテル系有機溶剤を用いた場合よりも，やや広い温度範囲で高い相対核酸収量が得られた。
実施例２：全血からの核酸抽出（その２）
図３及び図５に示された方法に従って，１ｍＬのヒト全血１から核酸抽出を行った。分解工程では，１００μＬのprotease（６）を入れたチューブ５に，１ｍＬの全血１及び１ｍＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートした後，２０°Ｃまで冷却して核酸遊離溶液を得た。ＥＧＤＭＥ，ＥＧＤＥＥ，ＰＧＤＭＥ，ＰＧＤＥＥ，ＤＩＧＬＹＭＥ，ＤＧＤＥＥ，ＴＨＦ，ＤＸ，ＰＧＭＥＡ，ＥＬ，ＨＡＣ，ＡＣ，ＭＥＫ，ＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨから選ばれた添加液８（１ｍＬ）をチューブ５に加え，攪拌して，混合液７を得た。
【００５５】
吸着工程では，２０°Ｃに於いて，スピンカラム８に混合液７を注ぎ，卓上遠心機を用いて１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００５６】
洗浄工程では，スピンカラム８に５００μＬの洗浄液（Ｗ２）１１を注ぎ，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００５７】
回収工程では，スピンカラム８に１００μＬの溶出液（Ｅ２）１２を注ぎ，２分間室温（２５°Ｃ）で放置した後，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って，核酸を回収し，定量，純度評価を行った。回収した核酸は，ＰＣＲに使用することが可能であった。
【００５８】
図９は，本発明の実施例２に於いて，異なる種類の添加液を加えた時に得られた核酸収量を示す図である。核酸遊離溶液の温度を２０°Ｃとして，核酸遊離溶液に２０°Ｃの添加液を添加した。吸着工程は２０°Ｃで行なった。目標とする核酸収量は１５μｇであるが，何れの種類の添加液を用いた場合にも，目標とする核酸収量以上の値が得られた。
実施例３：全血からの核酸抽出（その３）
１００μＬのヒト全血１からの核酸抽出を行った。
【００５９】
分解工程では，１０μＬのproteinase K（６）を入れたチューブ５に，１００μＬの全血１及び１００μＬの反応液（濃度４Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含む）を分注，攪拌した。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートした。
【００６０】
図１０は，本発明の実施例３で，インキュベートに用いた反応槽の構造を示す図である。全血１及び反応液が入ったサンプルチューブ２５１は，ヒートブロック２５４上で加熱される。温度センサ２５９により計測された温度に基づいて温度制御回路２５５により生成される，加熱冷却基板２５６のための温度制御信号が，制御線２６０を通して加熱冷却基板２５６に付与され，ヒートブロック２５４の温度が，調整される。加熱冷却基板２５６の下部に，加熱，冷却を加速するために，放熱ファン２５７が取り付けられている。放熱ファン２５７の動作は，制御線２６１を通して，温度制御回路２５５により制御されている。ヒートブロック２５４の外側は，温度制御を安定して行なうために，断熱材２５３で覆われている。断熱材２５３はカバー２５２で覆われている。反応槽の全体は支柱２５８によって支えられている。
【００６１】
インキュベート後，サンプルチューブ２５１の溶液の温度を２０°Ｃまで冷却して，核酸遊離溶液を得た。サンプルチューブ２５１に，ＥＬ，ＤＩＧＬＹＭＥ，ＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨから選ばれた添加液（１００μＬ）を加え，振とう攪拌して，混合液７を得た。
【００６２】
吸着工程では，スピンカラム８を用いて混合液７を真空ポンプにより吸引濾過した。
【００６３】
洗浄工程では，スピンカラム８に５００μＬの洗浄液（Ｗ３）１１を注ぎ，真空ポンプにより吸引濾過した。
【００６４】
回収工程では，スピンカラム８に溶出液（Ｅ３）１８を注ぎ２分間静置した。その後，真空ポンプを用いて吸引濾過し，核酸を含む溶液を回収した。回収した核酸は，十分な収量であり，純度も良好であり，ＰＣＲに使用することが可能であった。
【００６５】
図１１は，本発明の実施例３に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。図１１に示すように，温度Ｔが−５°Ｃ〜４５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，温度Ｔが１０°Ｃ〜３５°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【００６６】
また，添加液としてＥＬを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を調べた結果，温度Ｔが−５°Ｃ〜４５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。
【００６７】
更に，添加液としてＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨの何れかを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を調べた結果，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。
【００６８】
アルコール系有機溶剤を用いた場合には，エステル系有機溶剤又はエーテル系有機溶剤を用いた場合よりも，やや広い温度範囲で高い相対核酸収量が得られた。
実施例４：自動化された装置による全血からの核酸抽出（その１）
図１２は，本発明の実施例４での自動化された核酸の精製分離装置２０６の構成を示すブロック図である。図１２に示す装置２０６では，実施例１で説明した方法を自動的に実行する。制御部２０１によって，装置の運転を制御する。装置２０６は，抽出カラムを備え，核酸を分離する分離部２０２，試薬の分注を行なう分注部２０４，検体，反応容器，保存容器，核酸捕捉用チップ，試薬容器等が配置される架設部２０３，反応容器内の液の温度を制御してＰＣＲを行なうサーマルサイクラ部２０５を有している。核酸抽出の操作手順は図３及び図５に従って，自動的に実行される。
【００６９】
図１３は，本発明の実施例４での自動化された核酸の精製分離装置２０６の構成要素の配置を示す平面図である。検体架設部２２３には，血液等の検体が置かれる。反応容器架設部２２４，２２５には，反応容器が置かれている。保存容器架設部２２６，２２７，２２８，２２９には，反応後の溶液を保存する保存容器が置かれている。試薬架設部２１８には，装置２０６で使用する薬品が置かれている。サーマルサイクラ部２２２，２３０では，反応容器内の液の温度を制御してＰＣＲを行なう。エタノール等の洗浄液は，廃液口２１２，２２１から廃液用容器に排出される。チップ架設部２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１９には，チップ又はカラムが置かれている。使用済のチップ又はカラムは，チップ廃棄口２１１，２２０から廃棄用の容器に廃棄される。
【００７０】
検体の血液は検体架設部２２３に設置されている。装置２０６では，分解工程及び吸着工程は同じ温度で実行される。図１２，図１３に示す装置２０６を用いて，１００μＬのヒト全血１からの核酸抽出を行った。核酸抽出に使用する試薬は，実施例１で説明した試薬と同様である。
【００７１】
分解工程は，反応容器架設部２２４で行った。分注部２０４で，１００μＬのproteinase K（６）を分注したチューブ５に，１ｍＬの全血１及び１ｍＬの反応液を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を３０°Ｃで１０分間インキュベートして，核酸遊離溶液を得た。チューブ５に，ＥＬ，ＥｔＯＨ，ＤＩＧＬＹＭＥから選ばれた添加液（１ｍＬ）を加え，攪拌して，混合液７を得た。
【００７２】
吸着工程は，反応容器架設部２２４で行った。分離部２０２には，石英ウール製の吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４が装着されている。駆動ポンプによる混合液７の吸引及び吐出の操作を３０°Ｃで１０回繰り返し行った。
【００７３】
洗浄工程は，分離部２０２を反応容器架設部２２５に移動して行った。別のチューブ１６が反応容器架設部２２５に設置されている。チューブ１６に入れた１ｍＬの洗浄液（Ｗ１）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
【００７４】
回収工程は，分離部２０２を保存容器架設部２２７に移動して行った。保存容器架設部２２７にはヒータが配置されている。保存容器架設部２２７に設置されたチューブ１７には１ｍＬの溶出液１８が分注されており，予め７０°Ｃに加熱された。チューブ１７に入れた溶出液１８を，吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて２分間静止した。その後，溶出液１８を吐出し，核酸を含む溶液を回収した。
【００７５】
次に，保存容器架設部２２８で核酸を含む溶出液１８の分注を行ない，分注さた核酸を含む溶出液に，ｄＮＴＰ，塩化マグネシウム，ＤＮＡポリメラーゼ，及びＰＣＲ用緩衝溶液を調合した後，反応容器をサーマルサイクラ部２３０に移し，ＰＣＲを行うことができた。
【００７６】
図１４は，本発明の実施例４に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した後に，同じ温度Ｔで吸着工程を実行した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。分解工程及び吸着工程は，反応容器架設部２２４で実行され，反応容器架設部２２４の温度は温度Ｔに保持されている。図１４は，温度Ｔ（図１４の横軸）を変化させた時の相対核酸収量（図１４の縦軸）を調べた結果を示す。分解工程及び吸着工程に於ける反応容器架設部の温度が２０°Ｃ〜３５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。
【００７７】
図１５は，本発明の実施例４に於いて得られた核酸を鋳型として，ｐ５３遺伝子のエキソン８部位のＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。レーン−１（３０１），及びレーン−２（３０２）でＰＣＲ産物の泳動を泳動方向３０４で行なった。レーン−３（３０３）でＤＮＡ分子量マーカーの泳動を行なった。図１５から明らかなように，鎖長２００塩基対のＰＣＲ産物が確認できた。
実施例５：自動化された装置による全血からの核酸抽出（その２）
実施例４と同様に，図１２，図１３に示す装置２０６を用いて，１００μＬのヒト全血１からの核酸抽出を行った。核酸抽出に使用する試薬は，実施例１で説明した試薬と同様である。検体の血液は検体架設部２２３に設置されている。
【００７８】
分解工程は，反応容器架設部２２４で行った。分注部２０４で，１００μＬのproteinase K（６）を分注したチューブ５に，１ｍＬの全血１及び１ｍＬの反応液を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を７０℃で１０分間インキュベートした後，２５°Ｃに冷却して核酸遊離溶液を得た。
【００７９】
図１６は，本発明の実施例５で使用する反応容器架設部２２４の構成を示す図である。反応容器架設部２２４では，温度センサにより検知された温度に基づいて，自動的に有機溶剤の供給を行なう。
【００８０】
全血１及び反応液を含む溶液４０３が入ったチューブ５は，ヒートブロック４１４に設置されている。温度制御プログラムが組み込まれた計測制御部４０７は，支持台４２０に組み込まれている。計測制御部４０７は，ヒートブロック４１４に組み込まれた温度センサ４０６により検出された温度に基づいて，ヒートブロック４１４に組み込まれたペルチェ素子４０５を駆動して，ヒートブロック４１４の温度制御を行なう。
【００８１】
チューブ５の溶液４０３の７０°Ｃでのインキュベート終了後，ペルチェ素子４０５によりヒートブロック４１４を冷却する。温度センサ４０６が，ヒートブロック４１４の温度が２５°Ｃになった時点を検知すると，有機溶剤（添加液）４０９の添加を開始を行なう試薬供給命令が，コントロールライン４１５を経由してポンプ４１０に送られ，支柱４２１に組み込まれたポンプ４１０が駆動される。ノズル４０８から吸上げられた有機溶剤４０９は，試薬供給路４１１を経由して，アーム４２２に配置された試薬供給ノズル４０２よりチューブ５に添加される。
【００８２】
図１６に示す構成により，反応容器架設部２２４の温度を２５°Ｃに下げた後，添加液として１ｍＬのＤＩＧＬＹＭＥを自動で加え，混合液７を得た。
【００８３】
吸着工程は，反応容器架設部２２４上で行った。分離部２０２には，石英ウール製の吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４が装着されている。駆動ポンプによる混合液７の吸引及び吐出の操作を２５°Ｃで１０回繰り返し行った。
【００８４】
洗浄工程は，分離部２０２を反応容器架設部２２５に移動して行った。別のチューブ１６が反応容器架設部２２５に設置されている。チューブ１６に入れた１ｍＬの洗浄液（Ｗ２）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
【００８５】
回収工程は，分離部２０２を保存容器架設部２２７に移動して行った。保存容器架設部２２７にはヒータが配置されている。保存容器架設部２２７に設置されたチューブ１７には，１ｍＬの溶出液１８が分注されており，予め７０°Ｃに加熱された。チューブ１７に入れた溶出液１８を，吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて２分間静止した。その後，溶出液１８を吐出，回収し，２５μｇの核酸を得た。
【００８６】
次に，保存容器架設部２２８で核酸を含む溶出液１８の分注を行ない，分注さた核酸を含む溶出液に，ｄＮＴＰ，塩化マグネシウム，ＤＮＡポリメラーゼ，及びＰＣＲ用緩衝溶液を調合した後，反応容器をサーマルサイクラ部２３０に移し，ＰＣＲを行うことができた。
実施例６：組織からの核酸抽出１
チューブ内で，２５ｍｇの肝臓組織（ラット）と８０μＬのＰＢＳ（phosphate buffered saline）を混合し，機械的にホモジナイズした。チューブに，２０μＬのProteinase Kを添加して攪拌した後，チューブの溶液を，組織が溶解するまで５６°Ｃに加熱した。チューブに，２００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｗｅｅｎ８０を含む）を添加して攪拌した後，チューブの溶液を，７０°Ｃで１０分間加熱した。水冷により，チューブの溶液を２５°Ｃに冷却して，核酸遊離溶液を得た。チューブに２００μＬのＤＩＧＬＹＭＥを添加し混合して，混合液７を得た。以上が分解工程である。
【００８７】
吸着工程では，スピンカラム８に混合液７を注ぎ，卓上遠心機を用いて，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００８８】
洗浄工程では，スピンカラム８に５００μＬの洗浄液（Ｗ３）を注ぎ，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００８９】
回収工程では，スピンカラム８に，Ｅ１，Ｅ２及びＥ３から選ばれた溶出液１３（１００μＬ）を注ぎ，２分間室温（２５℃）で放置した後，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って核酸を回収し，定量して純度の評価を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。なお，Ａ２６０は，核酸を含む溶液の波長２６０ｎｍに於ける吸光度を示し，Ａ２８０は，核酸を含む溶液の波長２８０ｎｍに於ける吸光度を示す。
実施例７：組織からの核酸抽出２
２０ｍｇのぼうこう組織（ラット）から，実施例６と同様の方法により，核酸抽出を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．７の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。
実施例８：尿からの核酸抽出
２０ｍＬの尿検体を含むチューブを，５分間の遠心処理（回転数１４０００ｒｐｍ）した。チューブから上清を除去し，尿沈査を分離した。チューブ内に得られた尿沈査に，２０μＬのproteinase Kと，２００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加し，攪拌した。チューブの溶液を７０℃で１０分間加熱した後，放冷により２５℃に冷却して核酸遊離溶液を得た。チューブに，２００μＬのＥｔＯＨを添加し，混合して，混合液７を得た。以上が分解工程である。
【００９０】
吸着工程では，スピンカラム８に混合液７を注ぎ，卓上遠心機を用いて，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００９１】
洗浄工程では，スピンカラム８に，５００μＬの洗浄液（Ｗ４）１２を注ぎ，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００９２】
回収工程では，スピンカラム８に，１００μＬの溶出液（Ｅ３）１３を注ぎ，２分間室温（２５°Ｃ）で放置した後，１分間の遠心処理を行って核酸を回収し，定量し，純度の評価を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。
実施例９：細胞からの核酸抽出
チューブ内で，１０６個のＨｅＬａ細胞を，１００μＬのＰＢＳに分散させた後，チューブに，２０μＬのproteinase Kと，２００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加し，攪拌した。チューブの溶液を７０°Ｃで１０分間加熱した後，水冷により，２５°Ｃに冷却して核酸遊離溶液を得た。チューブに，２００μＬのＤＩＧＬＹＭＥを添加し，混合して，混合液７を得た。以上が分解工程である。
【００９３】
吸着工程では，スピンカラム８に混合液７を注ぎ，卓上遠心機を用いて，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００９４】
洗浄工程では，スピンカラム８に，５００μＬの洗浄液（Ｗ２）１１を注ぎ，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００９５】
回収工程では，スピンカラム８に，１００μＬの溶出液（Ｅ１）１２を注ぎ，２分間室温（２５°Ｃ）で放置した後，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って核酸を回収し，定量して，純度の評価を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。
実施例１０：全血からの核酸抽出（その４）
図３及び図５に示された方法に従って，１００μＬのヒト全血１から核酸抽出を行った。分解工程では，１０μＬのproteinase K（６）を入れたチューブ５に，１００μＬの全血１及び１００μＬの反応液（濃度４Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含む）を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートして，核酸遊離溶液を得た。チューブ５に，ＥＬ，ＥｔＯＨ，ＤＩＧＬＹＭＥの中から選ばれた添加液（１００μＬ）を加え，攪拌して，混合液７を得た。
【００９６】
吸着工程では，石英ウール吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４を用いて，混合液７の吸引及び吐出の操作を，温度２５°Ｃにて１０回繰り返し行った。
【００９７】
洗浄工程では，別のチューブ１６に入れた洗浄液（Ｗ１）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
【００９８】
回収工程では，別のチューブ１７に入れた溶出液１８を，吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて２分間静止した。その後，溶出液１８を吐出し，核酸を含む溶液を回収した。回収した核酸は，良好な純度を有し，沈殿，精製等の工程無しで，次のＰＣＲ等の反応や分析に使用できた。
【００９９】
図１７は，本発明の実施例１０に於いて，添加液としてＥｔＯＨを用いて，２０°Ｃの添加液を温度Ｔ（°Ｃ）の核酸遊離溶液に添加した時の温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。温度Ｔの核酸遊離溶液に，２０°ＣのＥｔＯＨが添加されて混合液７が調製される。図１７，図１８に於いて，横軸は，添加液が添加される核酸遊離溶液の温度Ｔを示し，縦軸は，最大核酸収量を１００％として相対核酸収量を示す。図１７に示すように，核酸遊離溶液の温度Ｔが−５°Ｃ〜６０°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，核酸遊離溶液の温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，核酸遊離溶液の温度Ｔが１０°Ｃ〜４５°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【０１００】
ＥｔＯＨと同様に使用できるアルコール系有機溶剤として，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨがある。
【０１０１】
図１８は，本発明の実施例１０に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，２０°Ｃの添加液を温度Ｔ（°Ｃ）の核酸遊離溶液に添加した時の温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。温度Ｔの核酸遊離溶液に，２０°ＣのＤＩＧＬＹＭＥが添加されて混合液７が調製される。図１８に示すように，核酸遊離溶液の温度Ｔが−５°Ｃ〜５０°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，核酸遊離溶液の温度Ｔが，温度が１０°Ｃ〜４５°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，核酸遊離溶液の温度Ｔが，温度が２０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【０１０２】
本発明では，以上説明した実験結果に基づいて，核酸と高濃度の塩とを含む核酸遊離溶液に添加するエタノール等の有機溶媒の温度，及び，核酸遊離溶液と有機溶媒との混合液の温度が，核酸の回収量に及ぼす影響を検討した結果，これら温度と核酸の回収量との間に密接な関係が存在することを見い出した。核酸の回収量のばらつきを低減させるには，これらの温度の制御が重要であるとの結論に至った。
【０１０３】
【発明の効果】
発明の方法によれば，核酸の回収の収率を向上でき，核酸回収量のばらつきが小さく，安定して高い核酸回収量が得られる核酸の精製分離方法及び装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例での核酸の抽出プロセスを説明する図。
【図２】本発明の実施例で用いる全血の構成を説明する図。
【図３】本発明の実施例での，全血からの核酸抽出の手順を説明する図。
【図４】本発明の実施例での，全血からの第１の核酸回収方法の手順を説明する図。
【図５】本発明の実施例での，全血からの第２の核酸回収方法の手順を説明する図。
【図６】本発明の実施例１に於いて，添加液としてＥＬを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図７】本発明の実施例１に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図８】本発明の実施例１に於いて，添加液としてＥｔＯＨを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図９】本発明の実施例２に於いて，異なる種類の添加液を加えた時に得られた核酸収量を示す図。
【図１０】本発明の実施例３で用いた反応槽の構造を示す図。
【図１１】本発明の実施例３に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図１２】本発明の実施例４での自動化された核酸の精製分離装置の構成を示すブロック図。
【図１３】本発明の実施例４での自動化された核酸の精製分離装置の構成要素の配置を示す平面図。
【図１４】本発明の実施例４に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した後に，同じ温度Ｔで吸着工程を実行した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図１５】本発明の実施例４に於けるアガロース電気泳動の結果を示す図。
【図１６】本発明の実施例５で使用する反応容器架設部２２４の構成を示す図。
【図１７】本発明の実施例１０に於いて，添加液としてＥｔＯＨを用いて，２０°Ｃの添加液を温度Ｔ（°Ｃ）の核酸遊離溶液に添加した時の温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図１８】本発明の実施例１０に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，２０°Ｃの添加液を温度Ｔ（°Ｃ）の核酸遊離溶液に添加した時の温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【符号の説明】
１…ヒト全血，２…赤血球，３…白血球，４…核，５，１０，１６，１７…チューブ，６…Proteinase K，７…混合液，８…スピンカラム，９，１３…吸着担体，１１，１５…洗浄液，１２，１８…溶出液，１４…カラム，１０１…全血の添加，１０２…反応液の添加及び攪拌，１０３…インキュベート，１０４…添加液の添加と攪拌，１０５…吸引による核酸吸着，１０６…洗浄液のカラムへの添加，１０７…洗浄工程，１０８…溶出液の添加と静置，１０９…核酸の回収，１１０…吸引吐出による核酸吸着，１１１…溶出液の吸上げと静置，１１２…核酸の回収，２０１…制御部，２０２…分離部，２０３…架設部，２０４…分注部，２０５…サーマルサイクラ部，２０６…核酸の精製分離装置，２１１，２２０…チップ廃棄口，２１２，２２１…廃液口，２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１９…チップ架設部，２１８…試薬架設部，２２２，２３０…サーマルサイクラ部，２２３…検体架設部，２２４，２２５…反応容器架設部，２２６，２２７，２２８，２２９…保存容器架設部，２５１…サンプルチューブ，２５２…カバー，２５３…断熱材，２５４…ヒートブロック，２５５…温度制御回路，２５６…加熱冷却基板，２５７…放熱ファン，２５８…支柱，２５９…温度センサ，２６０，２６１…制御線，３０１…レーン−１，３０２…レーン−２，３０３…レーン−３，３０４…泳動方向，３０５…鎖長２００塩基対のバンド，４０２…試薬供給ノズル，４０３…全血及び反応液を含む溶液，４０５…ペルチェ素子，４０６…温度センサ，４０７…計測制御部，４０８…ノズル，４０９…有機溶剤，４１０…ポンプ，４１１…試薬供給路，４１４…ヒートブロック，４１５…コントロールライン，４２０…支持台，４２１…支柱，４２２…アーム，５０１…第１工程，５０２…第２工程，５０３…第３工程，５０４…第４工程，５０５…第５工程，５０６…第６工程。
【発明の属する技術分野】
本発明は，核酸を有する生体試料から核酸を溶出させて，核酸を精製して分離する核酸の精製分離方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来技術に於ける有効な核酸の精製分離方法は，カオトロピック塩の存在下で核酸をガラスやシリカゲル粒子へ吸着させ核酸を回収する原理に基づいている（従来技術−１：Vogelstein,B. and Gillespie,D.(1979)；「アガロースからのＤＮＡの調製的及び分解的精製」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:615-619，従来技術−２：Boom,R.(1990)；「核酸の迅速で簡易な精製法」，J.Clin.Microbiol.28:495-503）。従来技術−１，２によれば，ヨウ化ナトリウム，過塩素酸ナトリウム，又はグアニジンチオシアン酸塩等の高濃度のカオトロピック塩を用いると，ＤＮＡがアガロースから単離，精製され，あるいは，ＲＮＡ又はＤＮＡが種々の混合物から単離，精製される。
【０００３】
核酸は精製の後に，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Polymerase chain reaction）に使用されることが多い。ＰＣＲでは，核酸は配列に特異的に増幅できるので，遺伝子診断等に広く応用されている。ＰＣＲ法を日常的に臨床で使用する際に，いくつかの問題がある。核酸の精製時に除去できなかった阻害物質の影響で，ＰＣＲが阻害される事が知られている。阻害物質として，ヘモグロビン，核酸の抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。このため，核酸の抽出，精製工程は，重要であることが指摘されている（従来技術−３：大島他，JJCL A,22(2),145-150(1997)）。
【０００４】
従来，抽出工程は手作業でなされてきたが，操作が煩雑で熟練性を要することから，装置による自動化が望まれている。また，自動化に適した抽出法（使用する試薬を含む）の開発が要求されている。
【０００５】
特開平１１−１２７８５４号公報（従来技術−４），特開平１１−２６６８６４号公報（従来技術−５）に，自動化に適した核酸の抽出法，核酸捕捉用チップが記載されている。また，特表平８−５０１３２１号公報（従来技術−６）に，自動化装置による核酸の抽出に適した試薬の記載があり，高濃度の塩（イオン強度が大）及び高濃度のアルコールを含む溶液中に存在する分離精製すべき核酸を，抽出用チップ内の吸着担体に接触させて吸着させ，次いで，より低濃度の塩（イオン強度が小）を含む溶液を用いて，吸着担体から核酸を遊離させて，目的の核酸を得ている。
【０００６】
全血からの核酸の抽出は，以下のようにして行われる。蛋白分解酵素と血球溶解のためのバッファーを全血に加え攪拌後，５６°Ｃ又は７０°Ｃで１０分間インキュベーションする。インキュベーション後，エタノールを添加し，核酸を含む溶液を吸着カラムに通す。エタノールを含むバッファーでカラムを洗浄した後，核酸回収用バッファーにより，カラムに吸着した核酸を回収する（従来技術−７：QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook，及び，QIAamp DNA Blood Midi/Maxi Kit Handbook,QIAGEN）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術−６に記載の試薬を用いた核酸の精製分離方法では，核酸の回収の収率が低いという課題があった。また，従来技術−４に記載の抽出用チップを用いた方法では，核酸回収量のばらつきが大きいという課題があった。
【０００８】
本発明の目的は，核酸回収量のばらつきが小さく，安定して高い核酸回収量が得られる核酸の精製分離方法及び装置を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の核酸の精製分離方法では，（工程１）核酸と高濃度の塩とを含む溶液（以下，核酸遊離溶液という）に有機溶剤を添加し，（工程２）有機又は無機の担体に核酸を吸着させ，（工程３）水溶液からなる回収液を用いて，有機又は無機担体から核酸を脱離させて回収する。必要に応じて，（工程３）の前に，洗浄液を用いて担体を洗浄して核酸以外の成分を取り除く工程を実行する。有機溶剤の添加直前の核酸遊離溶液の温度を有機溶剤の温度にほぼ同じくして，温度Ｔ（°Ｃ）の有機溶剤の添加直前の核酸遊離溶液の温度をＴ±（２〜３）°Ｃとする。なお，以下の説明で，温度Ｔ（°Ｃ）とほぼ同じ温度とは，Ｔ±（２〜３）°Ｃの温度をいう。また，核酸遊離溶液の温度と有機溶剤の温度とを異ならせても良い。核酸は，例えば，全血の白血球に由来する。
【００１０】
核酸収量は，最大核酸収量を１００％とする相対核酸収量により比較される。
【００１１】
本発明では，（工程１）で，−５°Ｃ〜５５°Ｃの範囲の温度に保持された，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルの何れかを添加することにより，８０％以上の相対核酸収量が得られ，また，（工程１）で，０°Ｃ〜５０°Ｃの範囲の温度に保持された，ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルを添加することにより，８０％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１２】
より好ましくは，（工程１）で，０°Ｃ〜５０°Ｃの範囲の温度に保持された，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，乳酸エチルの何れかを添加することにより，９０％以上の相対核酸収量が得られ，また，（工程１）で，０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度に保持された，ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルを添加することにより，９０％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１３】
更に好ましくは，（工程１）で，１０°Ｃ〜３５°Ｃの範囲の温度に保持された，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルの何れかを添加することにより，９５％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１４】
本発明の核酸の精製分離方法では，（工程１）核酸と高濃度の塩とを含み，０°Ｃ〜５０°Ｃの範囲の温度Ｔに保持された溶液に，温度Ｔとほぼ同じ温度に保持された有機溶剤を添加し，（工程２）担体に核酸を吸着させる。有機溶剤として，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，乳酸エチルの何れかを用いることにより，９０％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１５】
本発明の核酸の精製分離方法では，（工程１）核酸と高濃度の塩とを含み，０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度Ｔに保持された溶液に，温度Ｔとほぼ同じ温度に保持された有機溶剤を添加し，（工程２）担体に核酸を吸着させる。有機溶剤として，ジエチレングリコールジメチルエーテル又は乳酸エチルを使用することにより，９０％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１６】
本発明の核酸の精製分離方法は，以下の特徴を有する。
（Ａ）（１）核酸と高濃度の塩とを含み，１０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度Ｔに保持された溶液に，前記温度Ｔとほぼ同じ温度に保持された有機溶剤を添加する工程と，（２）担体に前記核酸を吸着させる工程とを有することを特徴とする核酸の分離精製方法。
（Ｂ）（Ａ）に記載の核酸の分離精製方法に於いて，前記有機溶剤が，エタノール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルの何れかであることを特徴とする核酸の分離精製方法。（Ａ）及び（Ｂ）の方法では，９５％以上の相対核酸収量が得られる。
（Ｃ）（１）核酸と高濃度の塩とを含み，２０°Ｃ〜３６°Ｃの範囲の温度Ｔに保持された溶液に，前記温度Ｔとほぼ同じ温度に保持された有機溶剤を添加する工程と，（２）前記温度Ｔとほぼ同じ温度で担体に前記核酸を吸着させる工程とを有することを特徴とする。
（Ｄ）（Ｃ）に記載の核酸の分離精製方法に於いて，前記温度Ｔが２２°Ｃ〜３２°Ｃの範囲の温度に設定されることを特徴とする核酸の分離精製方法。
（Ｃ）の方法では，８０％以上の相対核酸収量が得られ，（Ｄ）の方法では，９５％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１７】
本発明の精製分離方法を自動的に実行する核酸の精製分離装置は，以下の特徴を有する。
（１）核酸と高濃度の塩とを含む溶液に有機溶剤を添加した後，担体に前記核酸を吸着させる核酸の分離精製装置に於いて，前記溶液を０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度に保持する手段を有することを特徴とする核酸の分離精製装置。
（２）（１）に記載の核酸の分離精製装置に於いて，前記有機溶剤が０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲の温度に保持されることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（３）（１）に記載の核酸の分離精製装置に於いて，前記溶液の温度と前記有機溶剤の温度がほぼ同じであることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（４）（１）に記載の核酸の分離精製装置に於いて，前記溶液の温度と前記有機溶剤の温度が異なることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（１）から（４）の装置では，９０％以上の相対核酸収量が得られる。
（５）核酸と高濃度の塩とを含む溶液に有機溶剤を添加した後，担体に前記核酸を吸着させる核酸の分離精製装置に於いて，前記有機溶剤及び前記溶液の温度を，２０°Ｃ〜３６°Ｃの範囲の温度Ｔに保持する手段を有し，前記温度Ｔの前記溶液に，前記温度Ｔの前記有機溶剤を添加した後に，前記温度Ｔとほぼ同じ温度で前記担体に前記核酸を吸着させることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（６）（５）に記載の核酸の分離精製装置に於いて，前記温度Ｔが２２°Ｃ〜３２°Ｃの範囲の温度に設定されることを特徴とする核酸の分離精製装置。
（５）の装置では，８０％以上の相対核酸収量が得られ，（６）の装置では，９５％以上の相対核酸収量が得られる。
【００１８】
本発明の装置では，Ｔを−２０°Ｃから８０°Ｃの間において任意の温度として，核酸遊離溶液を温度Ｔに保持する手段，及び，温度Ｔとほぼ同じ温度に有機又は無機の担体を保持する手段ととして，共通の加熱冷却温度制御回路を使用する。加熱冷却温度制御回路は，温度センサ，ペルチェ素子，及びペルチェ素子の制御回路を組み合わせて構成され，温度制御対象を一定の温度に保持する。このような構成によれば，温度制御を高速に行なうことができる。また，加熱冷却温度制御回路を，温度センサ，循環水冷装置，及び循環水冷装置の制御回路を組み合わせて構成してもよい。
【００１９】
また，ＰＣＲを行うサーマルサイクラ部が組み込まれた本発明の装置では，核酸の精製分離の後，直ちに，自動的にＰＣＲを実行させることができるので，例えば，遺伝子検査を高速に行なうことが可能となる。
【００２０】
以下，本発明の核酸の精製分離方法，及び装置で好適に使用される試薬，構成要素について説明する。
【００２１】
塩としてカオトロピック塩を１Ｍ〜８Ｍの濃度範囲で使用する。例えば，グアニジン塩酸塩，グアニジンチオシアン酸塩，ヨウ化カリウムの何れかを使用する。
【００２２】
有機溶剤として，２から１０の範囲の炭素数を持つ化合物を使用する。化合物は，脂肪族アルコール，脂肪族エーテル，脂肪族エステル，脂肪族ケトンから選択される。１つの化合物，又は，複数の化合物の混合物が，有機溶剤として使用される。有機溶剤は，その濃度が５容量％〜５０容量％となるように添加すると良い。
【００２３】
脂肪族アルコールの代表的な例として，エタノール（ＥｔＯＨ），１−プロパノール（ＰｒＯＨ），２−プロパノール（ｉ−ＰｒＯＨ）がある。
【００２４】
脂肪族エーテルの代表的な例として，エチレングリコールジメチルエーテル，エチレングリコールジエチルエーテル（ＥＧＤＥ），プロピレングリコールジメチルエーテル（ＰＧＤＭＥ），プロピレングリコールジメチルエーテル，プロピレングリコールジエチルエーテル（ＰＧＤＥＥ），ジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＩＧＬＹＭＥ），ジエチレングリコールジエチルエーテル（ＤＧＤＥＥ），テトラヒドロフラン（ＴＨＦ），１，４−ジオキサン（ＤＸ）がある。
【００２５】
脂肪族エステルの代表的な例として，プロピレングリコールモノメチルアセテート（ＰＧＭＥＡ），乳酸エチル（ＥＬ）がある。
【００２６】
脂肪族ケトンの代表的な例として，ヒドロキシアセトン（ＨＡＣ），アセトン（ＡＣ），メチルエチルケトン（ＭＥＫ）がある。
【００２７】
無機担体として，シリカ，アルミナ，ゼオライト，二酸化チタンからなる多孔性材料又は非多孔性材料を使用する。
【００２８】
洗浄液は，アルコール等の有機溶剤を高濃度に含み，吸引又は遠心分離操作により，有機又は無機の担体を複数回洗浄して，核酸以外の成分を取り除く。
【００２９】
回収液は，低濃度の塩を含む水溶液であり，有機又は無機の担体と接触させることにより，有機又は無機の担体に吸着していた核酸を溶出させる。
【００３０】
本発明では，核酸と高濃度の塩とを含む溶液に，０．１容量％〜５０容量％の界面活性剤を添加する。好ましくは，界面活性剤として，０．１容量％〜５容量％の消泡剤を使用すると良い。
【００３１】
【発明の実施の形態】
図１は，本発明の実施例での核酸の抽出プロセスを説明する図である。図２は，本発明の実施例で用いる全血の構成を説明する図である。図３から図５は，従来技術−４に記載される図１の方法に基づく，本発明の核酸の精製分離方法に於ける，核酸抽出試薬を用いた全血からの核酸抽出の手順を説明する図である。以下の説明では，１００μＬのヒト全血からの核酸抽出を例にとる。
【００３２】
図１に示す核酸の抽出プロセスは，従来技術−４に記載される６つの工程から構成される。核酸抽出の手順は，核酸を含有する材料（試料）から核酸を遊離させる第１工程５０１，第１工程５０１で得られる遊離した核酸を含む核酸遊離溶液に，核酸の固相への結合を促進させる添加液（アルコール系，エステル系，エーテル系等の有機溶剤）を添加して混合する第２工程５０２，第２工程５０２で得られた混合液と核酸結合性固相（核酸を吸着する担体）とを接触させる第３工程５０３，核酸が結合した固相と液体とを分離する第４工程５０４，核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する第５工程，核酸が結合した固相から核酸を遊離させる第６工程から構成される。以上の工程により，核酸を含有する材料（試料）から，精製状態の核酸が得られる。
【００３３】
以下，第１工程と第２工程を合わせて分解工程と呼び，第３工程と第４工程を合わせて吸着工程と呼ぶ。
【００３４】
図２に示すように，ヒト全血１の中には，赤血球２，白血球３等の成分が含まれており，核酸は主に白血球３の核４に存在している。
【００３５】
図３は，本発明の実施例での，全血からの核酸抽出の手順を説明する図である。先ず，チューブ５に１０μＬのProteinase K（６）を注入する。次に，チューブ５に１００μＬの全血１を加える（全血の添加１０１）。次に，１００μＬの反応液（１Ｍ〜８Ｍのカオトロピック塩と５０％以下の界面活性剤を含む）を加えて攪拌する（反応液の添加及び攪拌１０２）。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートする（インキュベート１０３）ことにより，白血球が破壊され，核４内の核酸が溶液内に出る（添加液の添加前の核酸遊離溶液を得る）。その後，この核酸遊離溶液に，核酸の固相への結合を促進させる添加液（アルコール系，エステル系，エーテル系等の有機溶剤）を１００μＬ加えて攪拌する（添加液の添加と攪拌１０４）と，混合液７が得られる。混合液７を得るまでの工程が分解工程である。
【００３６】
この分解工程以降に行なう数種類の核酸回収法がある。何れの方法も，吸着工程，洗浄工程，回収工程からなる。代表的な例として，スピンカラム法，吸引吐出法がある。
【００３７】
図４は，本発明の実施例での，全血からの第１の核酸回収方法（スピンカラム法）の手順を説明する図である。先ず，チューブ５中の混合液７を，スピンカラム８の中へ移す。スピンカラム８の底部には非常に細かいシリカ又はガラス繊維からなる濾紙状の吸着担体９が充填されている。
【００３８】
添加液を含む混合液７を，吸引により吸着担体９内を通過させて，核酸を吸着担体９に吸着させる（吸着工程７：吸引による核酸吸着工程１０５）。その後，アルコール等の有機溶剤を２０％〜８０％含む５００μＬの洗浄液１１を，スピンカラム８に注入する（洗浄液のカラムへの添加１０６）。
【００３９】
次に，吸引により吸着担体９を洗浄し，核酸以外の成分を取り除く（洗浄工程１０７）。この洗浄工程は２回繰り返すが，吸着担体に吸着した核酸は洗浄工程により溶離しない。その後，低塩濃度の溶出液１２を添加して２分間から５分間静置する（溶出液の添加と静置１０８）。核酸を吸着担体から溶離させ，最後に，吸引により，チューブ１０に回収する（溶出工程：核酸の回収１０９）。代表的な溶出液１２の組成は，５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａである。
【００４０】
図５は，本発明の実施例での，全血からの第２の核酸回収方法（吸引吐出法）の手順を説明する図である。吸引吐出法では，吸着担体１３としてガラス，石英等の繊維を低密度に充填した円筒型中空カラム１４を使用する。カラム１４を使用して，チューブ５中の混合液７の吸引吐出を，複数回繰り返し，吸着担体１３に核酸を吸着させる（吸着工程：吸引吐出による核酸吸着１１０）。続いて，５００μＬのアルコール等の有機溶剤を２０％〜８０％含む洗浄液１５を入れた別のチューブ１６を使用して，吸引吐出を行ない，核酸以外の成分を取り除く（洗浄工程）。この洗浄工程は，２回以上行う。その後，予め７０°Ｃに加熱したチューブ１７内の溶出液１６（１００μＬ）を，カラム１４内の吸着担体１３に接触する位置まで吸い上げた状態で約２分間静止する（溶出液の吸上げと静置１１１）。この操作により，核酸が吸着担体１３から溶出液１８に溶離する。溶出液１８を吐出させて，チューブ１７に核酸を回収する（核酸の回収１１２）。代表的な溶出液の組成は，５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａである。
【００４１】
以下，実施例で使用する材料，薬品，試料について詳細に説明する。
１． 核酸吸着材料及びカラム
１．１ スピンカラム：例えば，３層のガラス繊維濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）を，遠心分離クロマトグラフィカラム（スピンカラム）に固定した。スピンカラムは，図３，図４に示すスピンカラム法のプロトコルにて使用した。
１．２ 核酸捕捉用カラム：従来技術−５に記載の核酸捕捉用チップ（カラム）に，直径０．５μｍ〜３０μｍの石英繊維（東ソー・クオーツ株式会社製又は東芝セラミックス株式会社製）を充填した。核酸捕捉用チップは，図３，図５に示す吸引吐出法のプロトコルにて使用した。
２． 核酸を含有する試料
２．１ 血液（ヒト）：採血直後の血液，又は，−２０°Ｃで凍結保存した血液を使用した。
２．２ 組織：新鮮組織又は凍結保存した組織を使用した。
２．３ 植物：植物を液体窒素下で乳鉢ですりつぶし直接使用，又は，凍結保存した後用いた。
２．４ 細胞：単離，又は単離／培養された細胞を直接使用，又は凍結保存していた細胞を用いた。
３． 試薬
３．１ 反応液：反応液は，以下に示すカオトロピック塩，界面活性剤，消泡剤，その他塩成分を含む。
３．１．１ カオトロピック塩：ヨウ化カリウム（ＫＩ），グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ），グアニジンチオシアン酸塩（ＧｕＨＳＣＮ）の何れかを使用した。
３．１．２ 界面活性剤：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０），ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミレート（Ｔｗｅｅｎ４０），ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の何れかを使用した。
３．１．３ 消泡剤：ＣＥ−４５７（日本油脂株式会社製の消泡剤ディスホーム，ポリアルキレングリコール誘導体）
３．１．４ その他の塩：エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ），トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）
３．２ 添加液：ＰＧＤＭＥ，ＰＧＤＥＥ，ＤＩＧＬＹＭＥ，ＤＧＤＥＥ，ＴＨＦ，ＤＸ，ＰＧＭＥＡ，ＥＬ，ＨＡＣ，ＡＣ，ＭＥＫ，ＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨの何れかの有機溶剤を使用した。
３．３ 洗浄液：２５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸カリウム＋７０容量％エタノール（Ｗ１），２５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸カリウム＋５０容量％エタノール（Ｗ２），１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａ＋５０容量％エタノール（Ｗ３）の何れかの組成を用いた。
３．４ 溶出液：水（１００％，ｐＨ８．０）（Ｅ１），１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌのＥＤＴＡ・２Ｎａ（Ｅ２），５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）＋０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａ（Ｅ３）の何れかの組成を用いた。
３．５． 酵素：タンパク分解酵素プロテアーゼ（protease），アルカリ性プロテイナーゼＫ（proteinase K）の何れかの酵素を用いた。
実施例１：全血からの核酸抽出（その１）
図３及び図５に示された方法に従って，１００μＬのヒト全血１から核酸抽出を行った。分解工程では，１０μＬのproteinase K（６）を入れたチューブ５に，１００μＬの全血１及び１００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｗｅｅｎ４０を含む）を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートして，核酸遊離溶液を得た。核酸遊離溶液に，ＥＬ，ＤＩＧＬＹＭＥ，ＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨから選ばれた添加液（１００μＬ）を加え攪拌して，混合液７を得た。
【００４２】
吸着工程では，石英ウール吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４を用いて，混合液７の吸引及び吐出の操作を，温度２５°Ｃにて１０回繰り返し行った。
【００４３】
洗浄工程では，別のチューブ１６に入れた洗浄液（Ｗ１）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
【００４４】
回収工程では，別のチューブ１７に入れた溶出液１８を，吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて２分間静止した。その後，溶出液１８を吐出し，核酸を含む溶液を回収した。回収した核酸は，良好な純度を有し，沈殿，精製等の工程無しで，次のＰＣＲ等の反応や分析に使用できた。
【００４５】
図６は，本発明の実施例１に於いて，添加液としてＥＬを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。
【００４６】
以下の説明では，温度Ｔと相対核酸収量の関係を求める場合には，温度Ｔ以外の化学反応条件を同一として，温度Ｔを変化させた時の核酸収量を，最大核酸収量を１００％とする相対核酸収量により比較する。
【００４７】
図６，図７，図８，図１１に於いて，横軸の温度は，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液をほぼ同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加する時の温度Ｔを示し，縦軸は，温度Ｔを変化させた時に得られた相対核酸収量を示す。
【００４８】
図６に示すように，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，温度Ｉが１０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【００４９】
ＥＬと同様に使用できるエステル系有機溶剤として，ＰＧＭＥＡがある。
【００５０】
図７は，本発明の実施例１に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。図７に示すように，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜４５°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，温度Ｔが１０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【００５１】
ＤＩＧＬＹＭＥと同様に使用できるエーテル系有機溶剤として，ＥＧＤＭＥ，ＥＧＤＥＥ，ＰＧＤＭＥ，ＰＧＤＥＥ，ＤＧＤＥＥ，ＴＨＦ，ＤＸがある。
【００５２】
図８は，本発明の実施例１に於いて，添加液としてＥｔＯＨを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。図８に示すように，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，温度Ｔが１０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【００５３】
ＥｔＯＨと同様に使用できるアルコール系有機溶剤として，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨがある。添加液としてＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨの何れかを使用して，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を調べた結果，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。
【００５４】
アルコール系有機溶剤を用いた場合には，エーテル系有機溶剤を用いた場合よりも，やや広い温度範囲で高い相対核酸収量が得られた。
実施例２：全血からの核酸抽出（その２）
図３及び図５に示された方法に従って，１ｍＬのヒト全血１から核酸抽出を行った。分解工程では，１００μＬのprotease（６）を入れたチューブ５に，１ｍＬの全血１及び１ｍＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートした後，２０°Ｃまで冷却して核酸遊離溶液を得た。ＥＧＤＭＥ，ＥＧＤＥＥ，ＰＧＤＭＥ，ＰＧＤＥＥ，ＤＩＧＬＹＭＥ，ＤＧＤＥＥ，ＴＨＦ，ＤＸ，ＰＧＭＥＡ，ＥＬ，ＨＡＣ，ＡＣ，ＭＥＫ，ＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨから選ばれた添加液８（１ｍＬ）をチューブ５に加え，攪拌して，混合液７を得た。
【００５５】
吸着工程では，２０°Ｃに於いて，スピンカラム８に混合液７を注ぎ，卓上遠心機を用いて１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００５６】
洗浄工程では，スピンカラム８に５００μＬの洗浄液（Ｗ２）１１を注ぎ，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００５７】
回収工程では，スピンカラム８に１００μＬの溶出液（Ｅ２）１２を注ぎ，２分間室温（２５°Ｃ）で放置した後，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って，核酸を回収し，定量，純度評価を行った。回収した核酸は，ＰＣＲに使用することが可能であった。
【００５８】
図９は，本発明の実施例２に於いて，異なる種類の添加液を加えた時に得られた核酸収量を示す図である。核酸遊離溶液の温度を２０°Ｃとして，核酸遊離溶液に２０°Ｃの添加液を添加した。吸着工程は２０°Ｃで行なった。目標とする核酸収量は１５μｇであるが，何れの種類の添加液を用いた場合にも，目標とする核酸収量以上の値が得られた。
実施例３：全血からの核酸抽出（その３）
１００μＬのヒト全血１からの核酸抽出を行った。
【００５９】
分解工程では，１０μＬのproteinase K（６）を入れたチューブ５に，１００μＬの全血１及び１００μＬの反応液（濃度４Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含む）を分注，攪拌した。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートした。
【００６０】
図１０は，本発明の実施例３で，インキュベートに用いた反応槽の構造を示す図である。全血１及び反応液が入ったサンプルチューブ２５１は，ヒートブロック２５４上で加熱される。温度センサ２５９により計測された温度に基づいて温度制御回路２５５により生成される，加熱冷却基板２５６のための温度制御信号が，制御線２６０を通して加熱冷却基板２５６に付与され，ヒートブロック２５４の温度が，調整される。加熱冷却基板２５６の下部に，加熱，冷却を加速するために，放熱ファン２５７が取り付けられている。放熱ファン２５７の動作は，制御線２６１を通して，温度制御回路２５５により制御されている。ヒートブロック２５４の外側は，温度制御を安定して行なうために，断熱材２５３で覆われている。断熱材２５３はカバー２５２で覆われている。反応槽の全体は支柱２５８によって支えられている。
【００６１】
インキュベート後，サンプルチューブ２５１の溶液の温度を２０°Ｃまで冷却して，核酸遊離溶液を得た。サンプルチューブ２５１に，ＥＬ，ＤＩＧＬＹＭＥ，ＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨから選ばれた添加液（１００μＬ）を加え，振とう攪拌して，混合液７を得た。
【００６２】
吸着工程では，スピンカラム８を用いて混合液７を真空ポンプにより吸引濾過した。
【００６３】
洗浄工程では，スピンカラム８に５００μＬの洗浄液（Ｗ３）１１を注ぎ，真空ポンプにより吸引濾過した。
【００６４】
回収工程では，スピンカラム８に溶出液（Ｅ３）１８を注ぎ２分間静置した。その後，真空ポンプを用いて吸引濾過し，核酸を含む溶液を回収した。回収した核酸は，十分な収量であり，純度も良好であり，ＰＣＲに使用することが可能であった。
【００６５】
図１１は，本発明の実施例３に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。図１１に示すように，温度Ｔが−５°Ｃ〜４５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，温度Ｔが１０°Ｃ〜３５°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【００６６】
また，添加液としてＥＬを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を調べた結果，温度Ｔが−５°Ｃ〜４５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。
【００６７】
更に，添加液としてＥｔＯＨ，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨの何れかを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を調べた結果，温度Ｔが−５°Ｃ〜５５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。
【００６８】
アルコール系有機溶剤を用いた場合には，エステル系有機溶剤又はエーテル系有機溶剤を用いた場合よりも，やや広い温度範囲で高い相対核酸収量が得られた。
実施例４：自動化された装置による全血からの核酸抽出（その１）
図１２は，本発明の実施例４での自動化された核酸の精製分離装置２０６の構成を示すブロック図である。図１２に示す装置２０６では，実施例１で説明した方法を自動的に実行する。制御部２０１によって，装置の運転を制御する。装置２０６は，抽出カラムを備え，核酸を分離する分離部２０２，試薬の分注を行なう分注部２０４，検体，反応容器，保存容器，核酸捕捉用チップ，試薬容器等が配置される架設部２０３，反応容器内の液の温度を制御してＰＣＲを行なうサーマルサイクラ部２０５を有している。核酸抽出の操作手順は図３及び図５に従って，自動的に実行される。
【００６９】
図１３は，本発明の実施例４での自動化された核酸の精製分離装置２０６の構成要素の配置を示す平面図である。検体架設部２２３には，血液等の検体が置かれる。反応容器架設部２２４，２２５には，反応容器が置かれている。保存容器架設部２２６，２２７，２２８，２２９には，反応後の溶液を保存する保存容器が置かれている。試薬架設部２１８には，装置２０６で使用する薬品が置かれている。サーマルサイクラ部２２２，２３０では，反応容器内の液の温度を制御してＰＣＲを行なう。エタノール等の洗浄液は，廃液口２１２，２２１から廃液用容器に排出される。チップ架設部２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１９には，チップ又はカラムが置かれている。使用済のチップ又はカラムは，チップ廃棄口２１１，２２０から廃棄用の容器に廃棄される。
【００７０】
検体の血液は検体架設部２２３に設置されている。装置２０６では，分解工程及び吸着工程は同じ温度で実行される。図１２，図１３に示す装置２０６を用いて，１００μＬのヒト全血１からの核酸抽出を行った。核酸抽出に使用する試薬は，実施例１で説明した試薬と同様である。
【００７１】
分解工程は，反応容器架設部２２４で行った。分注部２０４で，１００μＬのproteinase K（６）を分注したチューブ５に，１ｍＬの全血１及び１ｍＬの反応液を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を３０°Ｃで１０分間インキュベートして，核酸遊離溶液を得た。チューブ５に，ＥＬ，ＥｔＯＨ，ＤＩＧＬＹＭＥから選ばれた添加液（１ｍＬ）を加え，攪拌して，混合液７を得た。
【００７２】
吸着工程は，反応容器架設部２２４で行った。分離部２０２には，石英ウール製の吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４が装着されている。駆動ポンプによる混合液７の吸引及び吐出の操作を３０°Ｃで１０回繰り返し行った。
【００７３】
洗浄工程は，分離部２０２を反応容器架設部２２５に移動して行った。別のチューブ１６が反応容器架設部２２５に設置されている。チューブ１６に入れた１ｍＬの洗浄液（Ｗ１）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
【００７４】
回収工程は，分離部２０２を保存容器架設部２２７に移動して行った。保存容器架設部２２７にはヒータが配置されている。保存容器架設部２２７に設置されたチューブ１７には１ｍＬの溶出液１８が分注されており，予め７０°Ｃに加熱された。チューブ１７に入れた溶出液１８を，吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて２分間静止した。その後，溶出液１８を吐出し，核酸を含む溶液を回収した。
【００７５】
次に，保存容器架設部２２８で核酸を含む溶出液１８の分注を行ない，分注さた核酸を含む溶出液に，ｄＮＴＰ，塩化マグネシウム，ＤＮＡポリメラーゼ，及びＰＣＲ用緩衝溶液を調合した後，反応容器をサーマルサイクラ部２３０に移し，ＰＣＲを行うことができた。
【００７６】
図１４は，本発明の実施例４に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した後に，同じ温度Ｔで吸着工程を実行した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。分解工程及び吸着工程は，反応容器架設部２２４で実行され，反応容器架設部２２４の温度は温度Ｔに保持されている。図１４は，温度Ｔ（図１４の横軸）を変化させた時の相対核酸収量（図１４の縦軸）を調べた結果を示す。分解工程及び吸着工程に於ける反応容器架設部の温度が２０°Ｃ〜３５°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。
【００７７】
図１５は，本発明の実施例４に於いて得られた核酸を鋳型として，ｐ５３遺伝子のエキソン８部位のＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。レーン−１（３０１），及びレーン−２（３０２）でＰＣＲ産物の泳動を泳動方向３０４で行なった。レーン−３（３０３）でＤＮＡ分子量マーカーの泳動を行なった。図１５から明らかなように，鎖長２００塩基対のＰＣＲ産物が確認できた。
実施例５：自動化された装置による全血からの核酸抽出（その２）
実施例４と同様に，図１２，図１３に示す装置２０６を用いて，１００μＬのヒト全血１からの核酸抽出を行った。核酸抽出に使用する試薬は，実施例１で説明した試薬と同様である。検体の血液は検体架設部２２３に設置されている。
【００７８】
分解工程は，反応容器架設部２２４で行った。分注部２０４で，１００μＬのproteinase K（６）を分注したチューブ５に，１ｍＬの全血１及び１ｍＬの反応液を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を７０℃で１０分間インキュベートした後，２５°Ｃに冷却して核酸遊離溶液を得た。
【００７９】
図１６は，本発明の実施例５で使用する反応容器架設部２２４の構成を示す図である。反応容器架設部２２４では，温度センサにより検知された温度に基づいて，自動的に有機溶剤の供給を行なう。
【００８０】
全血１及び反応液を含む溶液４０３が入ったチューブ５は，ヒートブロック４１４に設置されている。温度制御プログラムが組み込まれた計測制御部４０７は，支持台４２０に組み込まれている。計測制御部４０７は，ヒートブロック４１４に組み込まれた温度センサ４０６により検出された温度に基づいて，ヒートブロック４１４に組み込まれたペルチェ素子４０５を駆動して，ヒートブロック４１４の温度制御を行なう。
【００８１】
チューブ５の溶液４０３の７０°Ｃでのインキュベート終了後，ペルチェ素子４０５によりヒートブロック４１４を冷却する。温度センサ４０６が，ヒートブロック４１４の温度が２５°Ｃになった時点を検知すると，有機溶剤（添加液）４０９の添加を開始を行なう試薬供給命令が，コントロールライン４１５を経由してポンプ４１０に送られ，支柱４２１に組み込まれたポンプ４１０が駆動される。ノズル４０８から吸上げられた有機溶剤４０９は，試薬供給路４１１を経由して，アーム４２２に配置された試薬供給ノズル４０２よりチューブ５に添加される。
【００８２】
図１６に示す構成により，反応容器架設部２２４の温度を２５°Ｃに下げた後，添加液として１ｍＬのＤＩＧＬＹＭＥを自動で加え，混合液７を得た。
【００８３】
吸着工程は，反応容器架設部２２４上で行った。分離部２０２には，石英ウール製の吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４が装着されている。駆動ポンプによる混合液７の吸引及び吐出の操作を２５°Ｃで１０回繰り返し行った。
【００８４】
洗浄工程は，分離部２０２を反応容器架設部２２５に移動して行った。別のチューブ１６が反応容器架設部２２５に設置されている。チューブ１６に入れた１ｍＬの洗浄液（Ｗ２）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
【００８５】
回収工程は，分離部２０２を保存容器架設部２２７に移動して行った。保存容器架設部２２７にはヒータが配置されている。保存容器架設部２２７に設置されたチューブ１７には，１ｍＬの溶出液１８が分注されており，予め７０°Ｃに加熱された。チューブ１７に入れた溶出液１８を，吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて２分間静止した。その後，溶出液１８を吐出，回収し，２５μｇの核酸を得た。
【００８６】
次に，保存容器架設部２２８で核酸を含む溶出液１８の分注を行ない，分注さた核酸を含む溶出液に，ｄＮＴＰ，塩化マグネシウム，ＤＮＡポリメラーゼ，及びＰＣＲ用緩衝溶液を調合した後，反応容器をサーマルサイクラ部２３０に移し，ＰＣＲを行うことができた。
実施例６：組織からの核酸抽出１
チューブ内で，２５ｍｇの肝臓組織（ラット）と８０μＬのＰＢＳ（phosphate buffered saline）を混合し，機械的にホモジナイズした。チューブに，２０μＬのProteinase Kを添加して攪拌した後，チューブの溶液を，組織が溶解するまで５６°Ｃに加熱した。チューブに，２００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｗｅｅｎ８０を含む）を添加して攪拌した後，チューブの溶液を，７０°Ｃで１０分間加熱した。水冷により，チューブの溶液を２５°Ｃに冷却して，核酸遊離溶液を得た。チューブに２００μＬのＤＩＧＬＹＭＥを添加し混合して，混合液７を得た。以上が分解工程である。
【００８７】
吸着工程では，スピンカラム８に混合液７を注ぎ，卓上遠心機を用いて，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００８８】
洗浄工程では，スピンカラム８に５００μＬの洗浄液（Ｗ３）を注ぎ，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００８９】
回収工程では，スピンカラム８に，Ｅ１，Ｅ２及びＥ３から選ばれた溶出液１３（１００μＬ）を注ぎ，２分間室温（２５℃）で放置した後，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って核酸を回収し，定量して純度の評価を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。なお，Ａ２６０は，核酸を含む溶液の波長２６０ｎｍに於ける吸光度を示し，Ａ２８０は，核酸を含む溶液の波長２８０ｎｍに於ける吸光度を示す。
実施例７：組織からの核酸抽出２
２０ｍｇのぼうこう組織（ラット）から，実施例６と同様の方法により，核酸抽出を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．７の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。
実施例８：尿からの核酸抽出
２０ｍＬの尿検体を含むチューブを，５分間の遠心処理（回転数１４０００ｒｐｍ）した。チューブから上清を除去し，尿沈査を分離した。チューブ内に得られた尿沈査に，２０μＬのproteinase Kと，２００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加し，攪拌した。チューブの溶液を７０℃で１０分間加熱した後，放冷により２５℃に冷却して核酸遊離溶液を得た。チューブに，２００μＬのＥｔＯＨを添加し，混合して，混合液７を得た。以上が分解工程である。
【００９０】
吸着工程では，スピンカラム８に混合液７を注ぎ，卓上遠心機を用いて，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００９１】
洗浄工程では，スピンカラム８に，５００μＬの洗浄液（Ｗ４）１２を注ぎ，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００９２】
回収工程では，スピンカラム８に，１００μＬの溶出液（Ｅ３）１３を注ぎ，２分間室温（２５°Ｃ）で放置した後，１分間の遠心処理を行って核酸を回収し，定量し，純度の評価を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。
実施例９：細胞からの核酸抽出
チューブ内で，１０６個のＨｅＬａ細胞を，１００μＬのＰＢＳに分散させた後，チューブに，２０μＬのproteinase Kと，２００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加し，攪拌した。チューブの溶液を７０°Ｃで１０分間加熱した後，水冷により，２５°Ｃに冷却して核酸遊離溶液を得た。チューブに，２００μＬのＤＩＧＬＹＭＥを添加し，混合して，混合液７を得た。以上が分解工程である。
【００９３】
吸着工程では，スピンカラム８に混合液７を注ぎ，卓上遠心機を用いて，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００９４】
洗浄工程では，スピンカラム８に，５００μＬの洗浄液（Ｗ２）１１を注ぎ，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行った。
【００９５】
回収工程では，スピンカラム８に，１００μＬの溶出液（Ｅ１）１２を注ぎ，２分間室温（２５°Ｃ）で放置した後，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って核酸を回収し，定量して，純度の評価を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。
実施例１０：全血からの核酸抽出（その４）
図３及び図５に示された方法に従って，１００μＬのヒト全血１から核酸抽出を行った。分解工程では，１０μＬのproteinase K（６）を入れたチューブ５に，１００μＬの全血１及び１００μＬの反応液（濃度４Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含む）を添加，攪拌した。チューブ５の溶液を７０°Ｃで１０分間インキュベートして，核酸遊離溶液を得た。チューブ５に，ＥＬ，ＥｔＯＨ，ＤＩＧＬＹＭＥの中から選ばれた添加液（１００μＬ）を加え，攪拌して，混合液７を得た。
【００９６】
吸着工程では，石英ウール吸着担体１３（東芝セラミックス株式会社製）を充填したカラム１４を用いて，混合液７の吸引及び吐出の操作を，温度２５°Ｃにて１０回繰り返し行った。
【００９７】
洗浄工程では，別のチューブ１６に入れた洗浄液（Ｗ１）１５の吸引吐出の操作を３回繰り返し行った。
【００９８】
回収工程では，別のチューブ１７に入れた溶出液１８を，吸着担体１３の全体が浸漬する位置まで吸上げて２分間静止した。その後，溶出液１８を吐出し，核酸を含む溶液を回収した。回収した核酸は，良好な純度を有し，沈殿，精製等の工程無しで，次のＰＣＲ等の反応や分析に使用できた。
【００９９】
図１７は，本発明の実施例１０に於いて，添加液としてＥｔＯＨを用いて，２０°Ｃの添加液を温度Ｔ（°Ｃ）の核酸遊離溶液に添加した時の温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。温度Ｔの核酸遊離溶液に，２０°ＣのＥｔＯＨが添加されて混合液７が調製される。図１７，図１８に於いて，横軸は，添加液が添加される核酸遊離溶液の温度Ｔを示し，縦軸は，最大核酸収量を１００％として相対核酸収量を示す。図１７に示すように，核酸遊離溶液の温度Ｔが−５°Ｃ〜６０°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，核酸遊離溶液の温度Ｔが０°Ｃ〜５０°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，核酸遊離溶液の温度Ｔが１０°Ｃ〜４５°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【０１００】
ＥｔＯＨと同様に使用できるアルコール系有機溶剤として，ＰｒＯＨ，ｉ−ＰｒＯＨがある。
【０１０１】
図１８は，本発明の実施例１０に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，２０°Ｃの添加液を温度Ｔ（°Ｃ）の核酸遊離溶液に添加した時の温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図である。温度Ｔの核酸遊離溶液に，２０°ＣのＤＩＧＬＹＭＥが添加されて混合液７が調製される。図１８に示すように，核酸遊離溶液の温度Ｔが−５°Ｃ〜５０°Ｃの時，目標とした８０％以上の相対核酸収量が得られた。また，核酸遊離溶液の温度Ｔが，温度が１０°Ｃ〜４５°Ｃの時，９０％以上の好適な相対核酸収量が得られた。更に，核酸遊離溶液の温度Ｔが，温度が２０°Ｃ〜４０°Ｃの時，９５％以上のより好適な相対核酸収量が得られた。
【０１０２】
本発明では，以上説明した実験結果に基づいて，核酸と高濃度の塩とを含む核酸遊離溶液に添加するエタノール等の有機溶媒の温度，及び，核酸遊離溶液と有機溶媒との混合液の温度が，核酸の回収量に及ぼす影響を検討した結果，これら温度と核酸の回収量との間に密接な関係が存在することを見い出した。核酸の回収量のばらつきを低減させるには，これらの温度の制御が重要であるとの結論に至った。
【０１０３】
【発明の効果】
発明の方法によれば，核酸の回収の収率を向上でき，核酸回収量のばらつきが小さく，安定して高い核酸回収量が得られる核酸の精製分離方法及び装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例での核酸の抽出プロセスを説明する図。
【図２】本発明の実施例で用いる全血の構成を説明する図。
【図３】本発明の実施例での，全血からの核酸抽出の手順を説明する図。
【図４】本発明の実施例での，全血からの第１の核酸回収方法の手順を説明する図。
【図５】本発明の実施例での，全血からの第２の核酸回収方法の手順を説明する図。
【図６】本発明の実施例１に於いて，添加液としてＥＬを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図７】本発明の実施例１に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図８】本発明の実施例１に於いて，添加液としてＥｔＯＨを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図９】本発明の実施例２に於いて，異なる種類の添加液を加えた時に得られた核酸収量を示す図。
【図１０】本発明の実施例３で用いた反応槽の構造を示す図。
【図１１】本発明の実施例３に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図１２】本発明の実施例４での自動化された核酸の精製分離装置の構成を示すブロック図。
【図１３】本発明の実施例４での自動化された核酸の精製分離装置の構成要素の配置を示す平面図。
【図１４】本発明の実施例４に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，温度Ｔ（°Ｃ）の添加液を同じ温度Ｔの核酸遊離溶液に添加した後に，同じ温度Ｔで吸着工程を実行した時の，温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図１５】本発明の実施例４に於けるアガロース電気泳動の結果を示す図。
【図１６】本発明の実施例５で使用する反応容器架設部２２４の構成を示す図。
【図１７】本発明の実施例１０に於いて，添加液としてＥｔＯＨを用いて，２０°Ｃの添加液を温度Ｔ（°Ｃ）の核酸遊離溶液に添加した時の温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【図１８】本発明の実施例１０に於いて，添加液としてＤＩＧＬＹＭＥを用いて，２０°Ｃの添加液を温度Ｔ（°Ｃ）の核酸遊離溶液に添加した時の温度Ｔと相対核酸収量の関係を示す図。
【符号の説明】
１…ヒト全血，２…赤血球，３…白血球，４…核，５，１０，１６，１７…チューブ，６…Proteinase K，７…混合液，８…スピンカラム，９，１３…吸着担体，１１，１５…洗浄液，１２，１８…溶出液，１４…カラム，１０１…全血の添加，１０２…反応液の添加及び攪拌，１０３…インキュベート，１０４…添加液の添加と攪拌，１０５…吸引による核酸吸着，１０６…洗浄液のカラムへの添加，１０７…洗浄工程，１０８…溶出液の添加と静置，１０９…核酸の回収，１１０…吸引吐出による核酸吸着，１１１…溶出液の吸上げと静置，１１２…核酸の回収，２０１…制御部，２０２…分離部，２０３…架設部，２０４…分注部，２０５…サーマルサイクラ部，２０６…核酸の精製分離装置，２１１，２２０…チップ廃棄口，２１２，２２１…廃液口，２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１９…チップ架設部，２１８…試薬架設部，２２２，２３０…サーマルサイクラ部，２２３…検体架設部，２２４，２２５…反応容器架設部，２２６，２２７，２２８，２２９…保存容器架設部，２５１…サンプルチューブ，２５２…カバー，２５３…断熱材，２５４…ヒートブロック，２５５…温度制御回路，２５６…加熱冷却基板，２５７…放熱ファン，２５８…支柱，２５９…温度センサ，２６０，２６１…制御線，３０１…レーン−１，３０２…レーン−２，３０３…レーン−３，３０４…泳動方向，３０５…鎖長２００塩基対のバンド，４０２…試薬供給ノズル，４０３…全血及び反応液を含む溶液，４０５…ペルチェ素子，４０６…温度センサ，４０７…計測制御部，４０８…ノズル，４０９…有機溶剤，４１０…ポンプ，４１１…試薬供給路，４１４…ヒートブロック，４１５…コントロールライン，４２０…支持台，４２１…支柱，４２２…アーム，５０１…第１工程，５０２…第２工程，５０３…第３工程，５０４…第４工程，５０５…第５工程，５０６…第６工程。
Claims (24)
- 試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度を−５℃〜５５℃の範囲の温度に下げた後に、前記範囲の温度の脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体に接触させて前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。 - 前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを添加するときに前記溶液の温度と前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかの温度とがほぼ同じであることを特徴とする請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記試料は血液であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記試料は組織であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記試料は細胞であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを添加するときの前記第1の液体の温度が、１０℃〜４０℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記第1の液体は前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを添加する前に放冷されることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記担体としてスピンカラムを用いることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかが、ジエチレングリコールジメチルエーテルであることを特徴とする請求項１乃至請求項８に記載の核酸の分離精製方法。
- プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と
−５℃〜５５℃の範囲の温度の第1の液体に添加するための脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかの有機溶剤と、
核酸を吸着させるための担体と、
前記担体を洗浄するための洗浄液と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液とを有することを特徴とする核酸抽出キット。 - 前記担体はスピンカラムであることを特徴とする請求項１０に記載の核酸抽出キット。
- 試料及びカオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体とを収める容器の温度を制御する温度制御部と、
前記温度制御部によって設定された温度を計測する温度センサと、
前記温度センサで検知された温度に基づいて前記容器に脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを供給する供給部とを有し、
前記温度制御部は、前記容器の温度を前記容器前記試料から核酸を遊離させるときの第1の温度、前記核酸を含む液体に前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを供給するときの第2の温度とするための制御を行うことを特徴とする核酸精製分離装置。 - 試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度を−５℃〜５５℃の範囲の温度に下げた後に、前記範囲の温度の脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体を収めるカラムに吸引及び吐出させて前記担体に前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。 - 前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかが、ジエチレングリコールジメチルエーテルであることを特徴とする請求項１３に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを添加するときの前記第1の液体の温度が、１０℃〜４０℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項１３乃至請求項１４に記載の核酸の分離精製方法。
- プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と
−５℃〜５５℃の範囲の温度の第1の液体に添加するための添加剤と、
核酸を吸着させるための担体と、
前記担体を洗浄するための洗浄液と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液とを有し、
前記添加剤は、ジエチレングリコールジメチルエーテルであることを特徴とする核酸抽出キット。 - 試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度を−５℃〜５５℃の範囲の温度に下げた後にエタノールを添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体に接触させて前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。 - 前記エタノールを添加するときの前記第1の液体の温度が、１０℃〜４０℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項１７に記載の核酸の分離精製方法。
- 前記第1の液体の温度を下げた後の第1の液体の温度を第１の温度としたときに、前記担体に前記核酸を吸着させるときの前記第2の液体の温度が第１の温度であることを特徴とする請求項１、請求項１３及び請求項１７に記載の核酸の分離精製方法。
- プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と
−５℃〜５５℃の範囲の温度の第1の液体に添加するための添加剤と、
核酸を吸着させるための担体と、
前記担体を洗浄するための洗浄液と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液とを有し、
前記添加剤は、エタノールであることを特徴とする核酸抽出キット。 - 前記担体はスピンカラムであることを特徴とする請求項２０に記載の核酸抽出キット。
- 試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体を温度制御手段によって所定の温度に冷却し、
冷却された第１の液体に脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体に接触させて前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。 - 試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体を水冷によって所定の温度に冷却し、
冷却された第１の液体に脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかを添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体に接触させて前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。 - 前記脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族アルコールのいずれかが、ジエチレングリコールジメチルエーテルであることを特徴とする請求項２２乃至請求項２３に記載の核酸の分離精製方法。
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