JPWO2012023569A1 - Rna抽出用溶液 - Google Patents
Rna抽出用溶液 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2012023569A1 JPWO2012023569A1 JP2011538560A JP2011538560A JPWO2012023569A1 JP WO2012023569 A1 JPWO2012023569 A1 JP WO2012023569A1 JP 2011538560 A JP2011538560 A JP 2011538560A JP 2011538560 A JP2011538560 A JP 2011538560A JP WO2012023569 A1 JPWO2012023569 A1 JP WO2012023569A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- rna
- concentration
- total amount
- biological sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 title description 50
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 80
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 55
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 13
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 239000000306 component Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000012503 blood component Substances 0.000 claims description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 203
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 149
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 38
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 38
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 36
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 34
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 33
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 31
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 27
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 22
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- QJPJQTDYNZXKQF-UHFFFAOYSA-N 4-bromoanisole Chemical compound COC1=CC=C(Br)C=C1 QJPJQTDYNZXKQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 12
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 11
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical group SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEAOBYFQWJFORM-UHFFFAOYSA-N 1-bromo-4-(trifluoromethoxy)benzene Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=C1 SEAOBYFQWJFORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZBTMRBYMKUEVEU-UHFFFAOYSA-N 1-bromo-4-methylbenzene Chemical compound CC1=CC=C(Br)C=C1 ZBTMRBYMKUEVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VIPWUFMFHBIKQI-UHFFFAOYSA-N 1-fluoro-4-methoxybenzene Chemical compound COC1=CC=C(F)C=C1 VIPWUFMFHBIKQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KBTMGSMZIKLAHN-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-1,2-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=C(Br)C=C1OC KBTMGSMZIKLAHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFCURAJBHDNUNG-UHFFFAOYSA-N 6-bromo-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine Chemical compound O1CCOC2=CC(Br)=CC=C21 LFCURAJBHDNUNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBPOBCXHALHJFP-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-bromobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCBr XBPOBCXHALHJFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIUZVSQOXJIHBL-UHFFFAOYSA-N 1-bromo-2,4-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=C(Br)C(OC)=C1 NIUZVSQOXJIHBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005096 28S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFESCIUQSIBMSM-UHFFFAOYSA-N I-BCP Chemical compound ClCCCBr MFESCIUQSIBMSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-L L-tartrate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-L 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C01—INORGANIC CHEMISTRY
- C01C—AMMONIA; CYANOGEN; COMPOUNDS THEREOF
- C01C3/00—Cyanogen; Compounds thereof
- C01C3/20—Thiocyanic acid; Salts thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C39/00—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
- C07C39/02—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring monocyclic with no unsaturation outside the aromatic ring
- C07C39/04—Phenol
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
- G01N2001/2866—Grinding or homogeneising
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
[1]RNAと、少なくともDNAを含む生物試料からRNAを抽出するための溶液であって、
(a)溶液の総量に対して50容量%超過のフェノール、
(b)溶液の総量に対して3〜10容量%の多価アルコール、
(c)溶液の総量に対して0.5〜2.0M濃度のグアニジニウム塩、
(d)溶液の総量に対して0.1〜0.5M濃度のチオシアン酸塩、及び
(e)溶液のpHを4〜6に維持するための緩衝剤、
を含む溶液。
[2]フェノール濃度が、溶液の総量に対して55〜65容量%である、[1]に記載の溶液。
[3]水層を分離するための有機溶媒をさらに含む、[1]又は[2]に記載の溶液。
[4]生物試料が培養細胞の培養液である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の溶液。
[5]生物試料が生物の体液成分である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の溶液。
[6]生物試料が生物の血液成分である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の溶液。
(a)溶液の総量に対して50容量%超過のフェノール、
(b)溶液の総量に対して3〜10容量%の多価アルコール、
(c)溶液の総量に対して0.5〜2.0M濃度のグアニジニウム塩、
(d)溶液の総量に対して0.1〜0.5M濃度のチオシアン酸塩、及び
(e)溶液のpHを4〜6に維持するための緩衝剤、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
得られたホモジェネートを、水層を分離するための有機溶媒と混合する工程と、
得られた混合物を遠心分離する工程と、
遠心分離により生成した、RNA含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からRNAを抽出する方法。
(a)溶液の総量に対して50容量%超過のフェノール、
(b)溶液の総量に対して3〜10容量%の多価アルコール、
(c)溶液の総量に対して0.5〜2.0M濃度のグアニジニウム塩、
(d)溶液の総量に対して0.1〜0.5M濃度のチオシアン酸塩、及び
(e)溶液のpHを4〜6に維持するための緩衝剤、
(f)水層を分離するための有機溶媒、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
得られたホモジェネートを遠心分離する工程と、
遠心分離により生成した、RNA含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からRNAを抽出する方法。
(a)溶液の総量に対して50容量%超過のフェノール、
(b)溶液の総量に対して3〜10容量%(3容量%以上10容量%以下)の多価アルコール、
(c)溶液の総量に対して0.5〜2.0M(0.5M以上2.0M以下)濃度のグアニジニウム塩、
(d)溶液の総量に対して0.1〜0.5M(0.1M以上0.5M以下)濃度のチオシアン酸塩、及び
(e)溶液のpHを4〜6に維持するための緩衝剤。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してRNA抽出用の溶液を調製した。
・58容量%フェノール
・5容量%グリセロール
・0.8Mチオシアン酸グアニジニウム(水溶液にて混合)
・0.4Mチオシアン酸アンモニウム(水溶液にて混合)
・0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(水溶液にて混合)、pHが5になるように調整。
RNAと、DNA及びタンパク質を含む生物試料として血清を用いてRNA抽出を行った。上記(1)で調製した溶液900μLと血清300μLをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加えて混和し、室温で12,000xGで10分間遠心した。遠心により、RNAを含有する水層と、DNA及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層400μLを別のチューブに分離した。
(2)で分離したRNAを含む水層に1.5倍容量の100%エタノールを加え、核酸の精製カラムである「miRNeasy mini kit」(株式会社キアゲン製)の「RNeasy Mini Spin Column」に700μL加え、8000xGで15秒遠心してカラムに核酸を吸着させ、カラムを通過した液は廃棄した。エタノール混和RNAサンプルがなくなるまで同作業を繰り返し、水層に含まれていた核酸をすべてカラムに吸着させた。その後「miRNeasy mini kit」のプロトコルに従い、Buffer RWT 700μL、Buffer RPE 500μLで2回カラムを洗浄し、カラムを乾燥させた後、30μLのRNase−free水で溶出し、精製、濃縮したRNAサンプルを得た。
抽出された核酸がRNAであることを確認するために、(2)で分離したサンプルに対してRNase処理を行った。(2)で分離したRNAを含む水層に1.5倍容量の100%エタノールを加え、(3a)と同様に核酸をカラムに吸着させた。Buffer RWT 350μLで洗浄した後、希釈したRNaseを加えてカラムに吸着した核酸をRNase処理し、Buffer RWT 350μL、Buffer RPE 500μLで2回カラムを洗浄して、カラムを乾燥させた後、30μLのRNase−free水で溶出し、精製、濃縮したRNAサンプルを得た。
(3a)、(3b)で得た各RNAサンプル1μLを70℃で2分熱変性したあと、急冷した。アジレント・テクノロジー株式会社製「Agilent RNA6000ピコキット」(型番5067−1513)を用いて、電気泳動を行った。その結果を図1に示した。また、「Bioanalyzer 2100」のSmear Analysis機能により、25−500ntのピークエリアの面積を算出してピークのサイズと検出された核酸量(濃度)を確認した。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、フェノール濃度を50容量%とし、これ以外は実施例1と同じ組成になるように調製して、特許文献2に記載の溶液を調製した。
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(3b)水層からのRNAの精製、濃縮−RNase処理有り−
実施例1と同様に行った。
(3c)水層からのRNAの精製、濃縮−DNase処理有り−
実施例1の(3b)において、RNAを含む水層を(3b)のRNaseに代えてDNaseで処理して精製、濃縮したサンプルを得た。以上のほかは、実施例1と同様に行った。
実施例1と同様に行った。その結果を図2に示した。
酵素処理していないサンプルからは2本の強いピーク(塩基数が200塩基と500塩基付近)と1本の弱いピーク(実施例1と同塩基数)が検出された(レーン1)。RNase処理有りサンプルでは、200塩基と500塩基のピークにはほとんど変化がなかったことから、2本のピークはRNAではないことが明らかとなった(レーン2)。一方、レーン1で見られた、1本の弱いピークは消失したことから、実施例1と同様にこのピークはRNAであったことが確認された。DNase処理したサンプルでは、2本の強いピークが消失し、非常に短く分解された断片が検出された(レーン3)ことから、この2本の強いピークは、混入したDNA断片であったことがわかった。
以上の結果を表3にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
フェノール濃度が60容量%である以外は、特許文献1に記載の抽出用溶液と同様の溶液を調製した。即ち、終濃度が60容量%フェノール、2Mチオシアン酸グアニジニウム、0.1M酢酸ナトリウム、0.2容量%2−メルカプトエタノールとし、pHは4とした。
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
実施例1と同様に行った。その結果を図3に示した。
比較例1と同様の3本のピークが確認された。このことから、DNA断片が混入していることが確認された。
以上の結果を表3にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、フェノール濃度を55容量%とし、これ以外は実施例1と同じ組成になるように溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(3b)水層からのRNAの精製、濃縮−RNase処理有り−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図4に示した。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、フェノール濃度を65容量%とし、これ以外は実施例1と同じ組成になるように溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図4のレーン2に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、フェノール濃度を53容量%とし、これ以外は実施例1と同じ組成になるように溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図4のレーン3に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加える代わりに、240μLのクロロホルムを加え、これ以外は実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を、図4のレーン4に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加える代わりに、100μLの4−ブロモベラトロールを加え、これ以外は実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図5のレーン1に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加える代わりに、100μLの6−ブロモ−1,4−ベンゾジオキサンを加え、これ以外は実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図5のレーン2に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加える代わりに、100μLの1−ブロモ−4−トリフルオロメトキシベンゼンを加え、これ以外は実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図5のレーン3に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加える代わりに、100μLの1−ブロモ−2,4,−ジメトキシベンゼンを加え、これ以外は実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図5のレーン4に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表1にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加える代わりに、100μLの4−フルオロアニソールを加え、これ以外は実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図5のレーン5に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表2にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加える代わりに、100μLの4−ブロモトルエンを加え、これ以外は実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図5のレーン6に示した
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表2にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
ホモジェネートに60μLのp−ブロモアニソールを加える代わりに、100μLの4−ブロモ酪酸エチルを加え、これ以外は実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図5のレーン7に示した。
実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表2にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1で調製した溶液に塩酸を加えて、溶液のpHを4.2に調整した溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図6のレーン1に示した。
溶液のpHが4.2においても実施例1と同様のピークが検出され、RNAのみが純度高く抽出されたことがわかった。
以上の結果を表2にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
比較例1で調製した溶液に塩酸を加えて、溶液のpHを3.6に調整した溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図6のレーン2に示した比較例1と同様の3本のピークが確認された。このことから、フェノール濃度が50容量%の溶液を用いた場合は、pHを3.6としてもDNA断片が混入していることが確認された。
以上の結果を表3にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
実施例1と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1の300μLの血清の代わりに、生物試料としてPBS300μLに懸濁した培養細胞(HEK293細胞)を使用した以外は、実施例1と同様に行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
水層に加えるエタノール量を1.5倍容量ではなく、1.25倍容量にした以外は、実施例1と同様に行った。
(3b)水層からのRNAの精製、濃縮−RNase処理有り−
水層に加えるエタノール量を1.5倍容量ではなく、1.25倍容量にした以外は、実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
使用するキットを「Agilent RNA6000ピコキット」の代わりに、「Agilent RNA6000ナノキット」(型番5067−1511)(アジレント・テクノロジー社製)を用いた以外は実施例1と同様に行った。その結果を図7に示した。
以上の結果を表2にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してRNA抽出用の溶液を調製した。すなわち、実施例1と同じ組成の溶液900μLに対しさらに60μLのp−ブロモアニソールを加えて溶液を調製した。
・58容量%フェノール
・5容量%グリセロール
・0.8Mチオシアン酸グアニジニウム(水溶液にて混合)
・0.4Mチオシアン酸アンモニウム(水溶液にて混合)
・0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(水溶液にて混合)、pHが5になるように調整
・上記の全量100%に対し6.6容量%のp−ブロモアニソール
上記(1)で調製した溶液900μLと血清300μLをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。室温で12,000xGで10分間遠心した。遠心により、RNAを含有する水層と、DNA及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層350μLを別のチューブに分離した。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(3b)水層からのRNAの精製、濃縮−RNase処理有り−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図8のレーン1、3、5に示した。
以上の結果を表2にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してRNA抽出用の溶液を調製した。すなわち、実施例1と同じ組成の溶液900μLに対しさらに90μLのクロロホルムを加えて溶液を調製した。
・58容量%フェノール
・5容量%グリセロール
・0.8Mチオシアン酸グアニジニウム(水溶液にて混合)
・0.4Mチオシアン酸アンモニウム(水溶液にて混合)
・0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(水溶液にて混合)、pHが5になるように調整
・上記の全量100%に対し10容量%クロロホルム
(2)生物試料からのRNA抽出
上記(1)で調製した溶液900μLと血清300μLをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。室温で12,000xGで10分間遠心した。遠心により、RNAを含有する水層と、DNA及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層350μLを別のチューブに分離した。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(3b)水層からのRNAの精製、濃縮−RNase処理有り−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図8のレーン2、4、5に示した。
以上の結果を表2にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
フェノール濃度が55容量%である以外は比較例3と同じ組成の溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(3b)水層からのRNAの精製、濃縮−RNase処理有り−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図9に示した。
以上の結果を表3にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、pH4とし、これ以外は実施例1と同じ組成になるように溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(3b)水層からのRNAの精製、濃縮−RNase処理有り−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図10(レーン1、2、5)に示した。
以上の結果を表2にまとめた。
(1)RNA抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、pH6とし、これ以外は実施例1と同じ組成になるように溶液を調製した。
(2)生物試料からのRNA抽出
実施例1と同様に生物試料として血清を用いて行った。
(3a)水層のRNAの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例1と同様に行った。
(3b)水層からのRNAの精製、濃縮−RNase処理有り−
実施例1と同様に行った。
(4)電気泳動による純度評価
実施例1と同様に行った。その結果を図10(レーン3、4、5)に示した。
以上の結果を表2にまとめた。
Claims (9)
- RNAと、少なくともDNAを含む生物試料からRNAを抽出するための溶液であって、
(a)溶液の総量に対して50容量%超過のフェノール、
(b)溶液の総量に対して3〜10容量%の多価アルコール、
(c)溶液の総量に対して0.5〜2.0M濃度のグアニジニウム塩、
(d)溶液の総量に対して0.1〜0.5M濃度のチオシアン酸塩、及び
(e)溶液のpHを4〜6に維持するための緩衝剤、
を含む溶液。 - フェノール濃度が、溶液の総量に対して55〜65容量%である、請求項1に記載の溶液。
- 水層を分離するための有機溶媒をさらに含む、請求項1又は2に記載の溶液。
- 生物試料が培養細胞の培養液である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の溶液。
- 生物試料が生物の体液成分である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の溶液。
- 生物試料が生物の血液成分である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の溶液。
- RNAと少なくともDNAを含む生物試料を、
(a)溶液の総量に対して50容量%超過のフェノール、
(b)溶液の総量に対して3〜10容量%の多価アルコール、
(c)溶液の総量に対して0.5〜2.0M濃度のグアニジニウム塩、
(d)溶液の総量に対して0.1〜0.5M濃度のチオシアン酸塩、及び
(e)溶液のpHを4〜6に維持するための緩衝剤、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
得られたホモジェネートを、水層を分離するための有機溶媒と混合する工程と、
得られた混合物を遠心分離する工程と、
遠心分離により生成した、RNA含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からRNAを抽出する方法。 - RNAと少なくともDNAを含む生物試料を、
(a)溶液の総量に対して50容量%超過のフェノール、
(b)溶液の総量に対して3〜10容量%の多価アルコール、
(c)溶液の総量に対して0.5〜2.0M濃度のグアニジニウム塩、
(d)溶液の総量に対して0.1〜0.5M濃度のチオシアン酸塩、及び
(e)溶液のpHを4〜6に維持するための緩衝剤、
(f)水層を分離するための有機溶媒、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
得られたホモジェネートを遠心分離する工程と、
遠心分離により生成した、RNA含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からRNAを抽出する方法。 - フェノール濃度が、(a)〜(e)の溶液の総量に対して55〜65容量%である、請求項7又は8に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010183280 | 2010-08-18 | ||
JP2010183280 | 2010-08-18 | ||
PCT/JP2011/068620 WO2012023569A1 (ja) | 2010-08-18 | 2011-08-17 | Rna抽出用溶液 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012023569A1 true JPWO2012023569A1 (ja) | 2013-10-28 |
JP5906740B2 JP5906740B2 (ja) | 2016-04-20 |
Family
ID=45605222
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011538560A Active JP5906740B2 (ja) | 2010-08-18 | 2011-08-17 | Rna抽出用溶液 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20130144049A1 (ja) |
EP (1) | EP2607482B1 (ja) |
JP (1) | JP5906740B2 (ja) |
KR (1) | KR101641113B1 (ja) |
CN (1) | CN103068979B (ja) |
AU (1) | AU2011291680B2 (ja) |
BR (1) | BR112013003528B1 (ja) |
CA (1) | CA2808265C (ja) |
DK (1) | DK2607482T3 (ja) |
ES (1) | ES2622964T3 (ja) |
PL (1) | PL2607482T3 (ja) |
RU (1) | RU2013111745A (ja) |
WO (1) | WO2012023569A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2501238B (en) | 2012-03-16 | 2018-10-24 | Cambridge Entpr Ltd | Methods for obtaining liquid from a solid phase |
JP6704621B2 (ja) * | 2013-08-16 | 2020-06-03 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 核酸の抽出及び保存のための方法及び組成物 |
CN103952399A (zh) * | 2014-04-18 | 2014-07-30 | 天根生化科技(北京)有限公司 | 一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法 |
CN110511927A (zh) | 2014-04-25 | 2019-11-29 | 川斯勒佰尔公司 | 信使rna的纯化方法 |
CA2965500A1 (en) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Abbott Molecular Inc. | Enrichment of small nucleic acids |
KR20190014204A (ko) | 2017-07-28 | 2019-02-12 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 미세관을 이용한 rna 추출 방법 |
CN108587029B (zh) | 2018-03-28 | 2020-09-08 | 中国石油天然气股份有限公司 | 一种相变材料液及其所形成的固相支撑剂 |
CN108676791B (zh) * | 2018-04-25 | 2022-03-25 | 浙江迪恩生物科技股份有限公司 | 一种磁珠法提取dna的试剂盒及提取方法 |
CN110887970B (zh) * | 2019-11-29 | 2023-10-31 | 北京赛科希德科技股份有限公司 | 抽提缓冲液、兔脑抽提液、pt检测试剂及pt检测试剂盒 |
KR102587121B1 (ko) | 2020-09-15 | 2023-10-11 | 주식회사 제노헬릭스 | Rna 분리용 조성물 |
KR102657767B1 (ko) | 2021-12-02 | 2024-04-16 | 한화오션 주식회사 | 액화가스 연료 선박의 시운전용 연료 공급 시스템 |
CN114350650A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-04-15 | 力因精准医疗产品(上海)有限公司 | 无dna残留血液rna提取试剂盒及核酸提取方法 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB190600753A (en) * | 1906-01-11 | 1906-12-06 | William Phillips Thompson | Improved Process and Apparatus for Distilling Coals and other Hydrocarbonaceous Substances. |
JPS5344886B2 (ja) | 1973-11-19 | 1978-12-02 | ||
US4843155A (en) | 1987-11-19 | 1989-06-27 | Piotr Chomczynski | Product and process for isolating RNA |
US5346994A (en) * | 1992-01-28 | 1994-09-13 | Piotr Chomczynski | Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins |
EP0755401B1 (en) * | 1994-04-14 | 2002-09-18 | The Rockefeller University | Apparatus for isolating cellular components |
US5945515A (en) * | 1995-07-31 | 1999-08-31 | Chomczynski; Piotr | Product and process for isolating DNA, RNA and proteins |
JP2001524820A (ja) | 1997-04-10 | 2001-12-04 | ライフ テクノロジーズ,インコーポレイテッド | Rna単離試薬および方法 |
US7794932B2 (en) * | 2004-04-16 | 2010-09-14 | Piotr Chomczynski | Reagents and methods for isolation of purified RNA |
US7749519B2 (en) * | 2005-12-09 | 2010-07-06 | Kim Lee Sim | Unique DNA and polypeptide sequences based on the circumsporozoite protein of Plasmodium vivax |
WO2008157316A1 (en) * | 2007-06-14 | 2008-12-24 | Creighton University | Improved method for rna isolation |
WO2010045292A2 (en) * | 2008-10-15 | 2010-04-22 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Nanoparticle compositions comprising liquid oil cores |
-
2011
- 2011-08-17 AU AU2011291680A patent/AU2011291680B2/en not_active Ceased
- 2011-08-17 CA CA2808265A patent/CA2808265C/en active Active
- 2011-08-17 BR BR112013003528-5A patent/BR112013003528B1/pt active Search and Examination
- 2011-08-17 JP JP2011538560A patent/JP5906740B2/ja active Active
- 2011-08-17 RU RU2013111745/10A patent/RU2013111745A/ru not_active Application Discontinuation
- 2011-08-17 EP EP11818210.4A patent/EP2607482B1/en active Active
- 2011-08-17 ES ES11818210.4T patent/ES2622964T3/es active Active
- 2011-08-17 DK DK11818210.4T patent/DK2607482T3/en active
- 2011-08-17 US US13/816,792 patent/US20130144049A1/en not_active Abandoned
- 2011-08-17 CN CN201180038826.1A patent/CN103068979B/zh active Active
- 2011-08-17 KR KR1020127031131A patent/KR101641113B1/ko active IP Right Grant
- 2011-08-17 PL PL11818210T patent/PL2607482T3/pl unknown
- 2011-08-17 WO PCT/JP2011/068620 patent/WO2012023569A1/ja active Application Filing
-
2017
- 2017-04-28 US US15/581,344 patent/US10647978B2/en active Active
-
2018
- 2018-07-30 US US16/048,695 patent/US11851646B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2808265C (en) | 2016-09-06 |
RU2013111745A (ru) | 2014-09-27 |
CA2808265A1 (en) | 2012-02-18 |
KR20130098163A (ko) | 2013-09-04 |
EP2607482A4 (en) | 2014-01-15 |
CN103068979B (zh) | 2015-03-11 |
KR101641113B1 (ko) | 2016-07-20 |
WO2012023569A1 (ja) | 2012-02-23 |
AU2011291680B2 (en) | 2014-01-09 |
US10647978B2 (en) | 2020-05-12 |
US11851646B2 (en) | 2023-12-26 |
US20130144049A1 (en) | 2013-06-06 |
BR112013003528A2 (pt) | 2016-06-28 |
BR112013003528B1 (pt) | 2019-09-24 |
ES2622964T3 (es) | 2017-07-10 |
AU2011291680A1 (en) | 2013-02-28 |
CN103068979A (zh) | 2013-04-24 |
PL2607482T3 (pl) | 2017-09-29 |
EP2607482A1 (en) | 2013-06-26 |
US20170247681A1 (en) | 2017-08-31 |
EP2607482B1 (en) | 2017-04-05 |
US20180340166A1 (en) | 2018-11-29 |
DK2607482T3 (en) | 2017-07-03 |
JP5906740B2 (ja) | 2016-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5906740B2 (ja) | Rna抽出用溶液 | |
EP3529374B1 (en) | Sequencing and analysis of exosome associated nucleic acids | |
JP5572578B2 (ja) | 精製rnaの単離試薬及び方法 | |
EP3636769B1 (en) | Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof | |
US20090143570A1 (en) | Method for isolation of genomic dna, rna and proteins from a single sample | |
US20100221788A1 (en) | Method for recovering short rna, and kit therefor | |
US7374881B2 (en) | Method for collecting and using nuclear mRNA | |
US20200149036A1 (en) | Methods to distinguish rna and dna in a combined preparation | |
US10323241B2 (en) | Method for recovering short-chain nucleic acids | |
US20210207125A1 (en) | Method of isolating nucleic acids for long sequencing reads | |
EP3631006A2 (en) | Dna stabilization of rna | |
US20210189458A1 (en) | Methods and compositions for the purification of unbiased rna | |
CN114686575A (zh) | 使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法 | |
JP2008086283A (ja) | Rnaの抽出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140620 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150825 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151023 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160223 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160307 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5906740 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |