CN110887970B - 抽提缓冲液、兔脑抽提液、pt检测试剂及pt检测试剂盒 - Google Patents
抽提缓冲液、兔脑抽提液、pt检测试剂及pt检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110887970B CN110887970B CN201911200730.5A CN201911200730A CN110887970B CN 110887970 B CN110887970 B CN 110887970B CN 201911200730 A CN201911200730 A CN 201911200730A CN 110887970 B CN110887970 B CN 110887970B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rabbit brain
- extraction buffer
- reagent
- buffer solution
- phosphate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 title claims abstract description 65
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 title claims abstract description 63
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title abstract description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims abstract description 5
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 35
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 34
- 239000002607 heparin antagonist Substances 0.000 claims description 24
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 23
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 19
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 10
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical group [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 8
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 claims description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims description 5
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims description 5
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 claims description 4
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 claims description 4
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 claims description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 11
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 abstract description 9
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 8
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 abstract description 8
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 abstract description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 11
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 7
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 7
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241001411320 Eriogonum inflatum Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 206010051077 Post procedural haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 208000037486 Postoperative Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011885 in vitro diagnostic (IVD) kits Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940127216 oral anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- -1 phosphate compound Chemical class 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明涉及医学检测领域，特别涉及抽提缓冲液、兔脑抽提液、PT检测试剂及PT检测试剂盒。本发明提供的抽提缓冲液包括柠檬酸盐或磷酸盐、无水乙酸钠和水。本发明通过外加电解质，增加了磷脂间电荷的斥力，使PT试剂不容易形成沉淀，更加稳定，测试时的重复性更好。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测领域，特别涉及抽提缓冲液、兔脑抽提液、PT检测试剂及PT检测试剂盒。
背景技术
临床上，在手术前，为了了解患者的止血功能有无缺陷，以事前有所准备，防止术中大出血而措手不及，需要检测患者的凝血功能，而凝血酶原时间(PT)是检测凝血功能之一。PT是检测外源性凝血因子缺乏的主要途径，是证实先天性或获得性纤维蛋白原、凝血酶原和凝血因子V、VII、X的缺陷或者抑制物的存在，同时用于检测口服抗凝剂的用量，是监控口服抗凝剂的首选指标。
PT试剂主要成份为组织凝血活酶(即组织因子和磷脂的混合物)，有些研究提到处理新鲜兔脑得到兔脑粉，在生理盐水中，37℃热激活，再离心得到上清液，冻干得到兔脑组织因子冻干制剂，但该专利中并未提到怎样提高兔脑组织因子冻干制剂的悬浮性。其他的学者提到了用兔脑粉为原材料PT测定体外诊断试剂盒的制备，但是并未提到怎么样提高PT试剂的悬浮性，而悬浮性直接影响到试剂的重复性。
兔脑粉来源的PT试剂是通过浸润把兔脑粉含有的组织因子和磷脂这两种促进凝血的物质以溶液的形式存在，也是这两种物质构成了PT试剂的主要原材料。实际生产过程中兔脑粉的浸出物不止组织因子和磷脂两种物质，还含有其他一些蛋白质等非必须成分，这些非必须成分的存在使得兔脑粉浸出液的溶质浓度过高，另一方面使兔脑浸出液里含有大量的磷脂，这些磷脂远远超出了使PT试剂凝固所需要的最佳量。过高的溶质浓度和大量的磷脂存在使得这种PT试剂稳定性差，即容易形成沉淀。
因此，提供一种稳定性好的PT试剂具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种抽提缓冲液、兔脑抽提液、PT检测试剂及PT检测试剂盒。本发明通过外加电解质，增加了磷脂间电荷的斥力，使PT试剂不容易形成沉淀，更加稳定，测试时的重复性更好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了兔脑粉的抽提缓冲液，以质量百分含量计，包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，以质量百分含量计，包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠；所述磷酸盐包括磷酸钠，磷酸钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述pH值采用乙酸调节。
抽提出的兔脑抽提液由于磷脂的关系，属于表面带负电荷的胶体，胶体的稳定是有条件的，一旦稳定条件被破坏，溶胶中的粒子就会聚集，长大，最后从介质中聚沉，影响胶体聚沉的因素包括加热、电解质等。由于兔脑浸出液带的是负电荷，所以只能加入低浓度高价阴离子，使负电荷间相互排斥，保持胶体粒子的稳定性，而不能只用水或者生理盐水，或者价数高的阳离子。所以加入柠檬酸三钠，由于柠檬酸三钠碱性很强，则加入酸性的无水乙酸钠降低pH值，同时用乙酸来调整pH值。可以替代柠檬酸三钠的高价阴离子化合物可以是磷酸化合物，如磷酸钠，磷酸钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾等。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的抽提缓冲液在制备兔脑抽提液中的应用。
本发明还提供了所述的抽提缓冲液在制备PT检测试剂或PT检测试剂盒中的应用。
在上述研究的基础上，本发明还提供了兔脑抽提液，其制备方法为：取如权利要求1至4任一项所述的抽提缓冲液溶解兔脑粉，于33℃～45℃温育0.5h～1.5h；
以g/mL计，所述兔脑粉与所述抽提缓冲液的质量体积比为(3～5):100。
在本发明的一些具体实施方案中，所述温育时，每15min摇匀一次，所述温育后还包括3000RPM离心后收集上清的步骤。
本发明还提供了PT检测试剂，包括所述的兔脑抽提液、冻干保护剂、肝素拮抗剂和钙离子；
所述冻干保护剂包括牛血清白蛋白、蛋白胨、甘氨酸、丙氨酸、蔗糖、海藻糖中的一种或两者以上的混合物；所述牛血清白蛋白、蛋白胨的质量百分含量为0.5％～5％，所述甘氨酸、丙氨酸、蔗糖、海藻糖的质量百分含量为0.1％～10％；
试剂中加入聚凝胺可以拮抗肝素，是PT试剂在测试时不受肝素的影响，可以只对口服华法林进行监控。所述肝素拮抗剂包括聚凝胺、鱼精蛋白中的一种或两种；所述肝素拮抗剂的浓度为0.01mg/ml～0.1mg/ml；
提供所述钙离子的试剂包括氯化钙、乳酸钙或碳酸钙中的一种或两者以上的混合物；所述钙离子的浓度为10mM～25mM。
本发明还提供了PT检测试剂盒，包括所述的抽提缓冲液、所述的兔脑抽提液或所述的PT检测试剂。
本发明提供的抽提缓冲液包括柠檬酸盐或磷酸盐、无水乙酸钠和水。本发明通过外加电解质，增加了磷脂间电荷的斥力，使PT试剂不容易形成沉淀，更加稳定，测试时的重复性更好。
具体实施方式
本发明公开了一种抽提缓冲液、兔脑抽提液、PT检测试剂及PT检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了如下方案：
1.配制抽提缓冲液
柠檬酸三钠和无水乙酸钠的浓度可以是一个范围，0.1％-1％。
2.兔脑抽提液的获得
用配制的抽提缓冲液溶解3％～5％的兔脑粉(商业购买，质量体积比，单位为g/ml)，温育温度可以在一定的范围内，可以在33℃～45℃之间，温度越高，测正常质控的秒值越长，温度越低，测正常质控的秒值越短，温育可以调节，范围可以在30min到1.5h之间，时间越长，测正常质控秒值越长，时间越短，测正常质控秒值越短。
3.冻干保护剂及肝素拮抗剂的加入
向兔脑抽提液中加入冻干保护剂，肝素拮抗剂和钙离子。保护剂可以为牛血清白蛋白，蛋白胨等大分子蛋白类，浓度在0.5％-5％范围内；也可以是甘氨酸，丙氨酸等小分子蛋白，或者是小分子糖类，浓度范围在0.1％-10％范围内。肝素拮抗剂可以是聚凝胺、鱼精蛋白，浓度在0.01mg/ml-0.1mg/ml范围内。必须要加钙离子，可以选择氯化钙、乳酸钙、碳酸钙等，钙离子浓度在10-25mM范围内。
本发明通过外加电解质，增加了磷脂间电荷的斥力，使PT试剂不容易形成沉淀，更加稳定，测试时的重复性更好。
本发明提供的抽提缓冲液、兔脑抽提液、PT检测试剂及PT检测试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)配制抽提缓冲液
0.3％的柠檬酸三钠，0.3％的无水乙酸钠，用乙酸调节pH至6.4。
(2)兔脑抽提液的获得
用配制的抽提缓冲液溶解4.5％的兔脑粉(以g/mL计，兔脑粉与抽提缓冲液的质量体积比为4.5:100)，在39℃下温育1h，每15min摇匀一次，3000RPM离心后收集上清，即为兔脑抽提液。
(3)冻干保护剂及肝素拮抗剂的加入
向兔脑抽提液中加入冻干保护剂，肝素拮抗剂和钙离子。保护剂为0.5％的牛血清白蛋白，1％的甘氨酸，肝素拮抗剂为0.03mg/ml的聚凝胺，钙离子为15mM氯化钙。
(4)冻干，冻干后用纯化水复溶。
实施例2
(1)配制抽提缓冲液
0.1％的柠檬酸三钠，1％的无水乙酸钠，用乙酸调节pH至6.0。
(2)兔脑抽提液的获得
用配制的抽提缓冲液溶解3％的兔脑粉(以g/mL计，兔脑粉与抽提缓冲液的质量体积比为3:100)，在33℃下温育1.5h，每15min摇匀一次，3000RPM离心后收集上清，即为兔脑抽提液。
(3)冻干保护剂及肝素拮抗剂的加入
向兔脑抽提液中加入冻干保护剂，肝素拮抗剂和钙离子。保护剂为5％的蛋白胨，10％的丙氨酸，肝素拮抗剂为0.01mg/ml的鱼精蛋白，钙离子为10mM乳酸钙。
(4)冻干，冻干后用纯化水复溶。
实施例3
(1)配制抽提缓冲液
1％的柠檬酸三钠，0.1％的无水乙酸钠，用乙酸调节pH至7.0。
(2)兔脑抽提液的获得
用配制的抽提缓冲液溶解5％的兔脑粉(以g/mL计，兔脑粉与抽提缓冲液的质量体积比为5:100)，在45℃下温育0.5h，每15min摇匀一次，3000RPM离心后收集上清，即为兔脑抽提液。
(3)冻干保护剂及肝素拮抗剂的加入
向兔脑抽提液中加入冻干保护剂，肝素拮抗剂和钙离子。保护剂为3％的牛血清白蛋白，5％的甘氨酸，肝素拮抗剂为0.1mg/ml的聚凝胺，钙离子为25mM碳酸钙。
(4)冻干，冻干后用纯化水复溶。
实施例4
(1)配制抽提缓冲液
0.4％的柠檬酸三钠，0.6％的无水乙酸钠，用乙酸调节pH至6.4。
(2)兔脑抽提液的获得
用配制的抽提缓冲液溶解4％的兔脑粉(以g/mL计，兔脑粉与抽提缓冲液的质量体积比为4:100)，在37℃下温育1.2h，每15min摇匀一次，3000RPM离心后收集上清，即为兔脑抽提液。
(3)冻干保护剂及肝素拮抗剂的加入
向兔脑抽提液中加入冻干保护剂，肝素拮抗剂和钙离子。保护剂为1％的蛋白胨，0.1％的丙氨酸，肝素拮抗剂为0.05mg/ml的鱼精蛋白，钙离子为20mM氯化钙。
(4)冻干，冻干后用纯化水复溶。
对比例
(1)配制抽提缓冲液
0.9％生理盐水，调节pH至6.4。
(2)兔脑抽提液的获得
用配制的抽提缓冲液溶解3％-5％的兔脑粉(商业购买)，在39℃下温育1h，每15min摇匀一次，3000RPM离心后收集上清，即为兔脑抽提液。
(3)冻干保护剂及肝素拮抗剂的加入
向兔脑抽提液中加入冻干保护剂，肝素拮抗剂和钙离子。保护剂为0.5％的牛血清白蛋白，1％的甘氨酸，肝素拮抗剂为0.03mg/ml的聚凝胺，钙离子为15mM氯化钙。
(4)冻干，冻干后用纯化水复溶。
实施例5稳定性试验
将实施例1～实施例4制得的兔脑抽提液以及对比例制得的兔脑抽提液各选择8瓶，同时用纯化水复溶到冻干前体积。将对照组8瓶试剂混合在一起，混匀后，分装到8瓶试剂瓶中，盖好瓶塞，瓶盖，任意选择7瓶放入37℃保存，剩余一瓶测试正常质控血浆，得到第0天秒值。实验组操作同对照组相同。
待测样品：正常质控血浆。
检测条件：正常质控50μl，在37℃下温育180s，加入温育10min以上的试剂100μl，计量从加入试剂至血浆完全凝固所用的时间。
测试秒值如表1所示：
表1
表2群组统计资料
表3成对样本检定
对实验组和对照组做T检验，实施例1与对照组比较，P＞0.05，无显著性差异；实施例2与对照组比较，P＜0.05，存在显著性差异；实施例3与对照组比较，P＜0.05，存在显著性差异；实施例4与对照组比较，P＜0.05，存在显著性差异，。
实施例6重复性试验(测试正常质控血浆)
将实施例1～实施例4制得的兔脑抽提液以及对比例制得的兔脑抽提液各选择1瓶，同时用纯化水复溶到冻干前体积，混匀备用。在不搅拌的情况下，分别测试两组试剂的重复性。重复测试10次，计算每组的CV值。
待测样品：正常质控血浆。
检测条件：正常质控50μl，在37℃下温育180s，加入温育10min以上的试剂100μl，计量从加入试剂至血浆完全凝固所用的时间。
从结果可以看出，实验组CV更小，重复性更好。
表4
表5群组统计资料
实施例7
将实施例1～实施例4制得的兔脑抽提液在冻干前，在试剂中加入0.03mg/ml的聚凝胺，冻干后复溶备用。将外购的肝素钠用纯水复溶，分别稀释成肝素钠浓度为0.1IU/ml、0.5IU/ml和1IU/ml。分别用纯水和各个浓度的肝素钠溶液复溶正常质控血浆。
然后用本发明、A公司stago兔脑粉为原材料和B公司西门子以人胎盘为原材料的PT试剂同时测用肝素钠溶液为0IU/ml、0.1IU/ml、0.5IU/ml和1IU/ml正常质控血浆，然后计算各个浓度肝素钠溶液与不含肝素钠的血浆的秒值变化。
待测样品：含肝素钠溶液浓度为0IU/ml、0.1IU/ml、0.5IU/ml和1IU/ml正常质控血浆
检测条件：待测样本50μl，在37℃下温育180s，加入温育10min以上的试剂100μl，计量从加入试剂至血浆完全凝固所用的时间。
结果显示，本发明提供的PT试剂随着肝素浓度的增加，秒值变化较小。
表6
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.PT检测试剂，其特征在于，由兔脑抽提液、冻干保护剂、肝素拮抗剂和钙离子组成；
所述兔脑抽提液的制备方法为：取抽提缓冲液溶解兔脑粉，于33℃～45℃温育0.5h～1.5h；
以g/mL计，所述兔脑粉与所述抽提缓冲液的质量体积比为(3～5):100；
以质量百分含量计，所述抽提缓冲液由如下组分组成：
所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠；所述磷酸盐包括磷酸钠，磷酸钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾中的一种或两者以上的混合物；
所述pH值采用乙酸调节；
所述冻干保护剂为牛血清白蛋白、蛋白胨、甘氨酸、丙氨酸、蔗糖、海藻糖中的一种或两者以上的混合物；所述牛血清白蛋白、蛋白胨的质量百分含量为0.5％～5％，所述甘氨酸、丙氨酸、蔗糖、海藻糖的质量百分含量为0.1％～10％；
所述肝素拮抗剂为聚凝胺、鱼精蛋白中的一种或两种；所述肝素拮抗剂的浓度为0.01mg/ml～0.1mg/ml；
提供所述钙离子的试剂为氯化钙、乳酸钙或碳酸钙中的一种或两者以上的混合物；所述钙离子的浓度为10mM～25mM。
2.如权利要求1所述的PT检测试剂，其特征在于，以质量百分含量计，所述抽提缓冲液由如下组分组成：
3.如权利要求2所述的PT检测试剂，其特征在于，所述温育时，每15min摇匀一次，所述温育后还包括3000RPM离心后收集上清的步骤。
4.PT检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求如权利要求1至3任一项所述的PT检测试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911200730.5A CN110887970B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 抽提缓冲液、兔脑抽提液、pt检测试剂及pt检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911200730.5A CN110887970B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 抽提缓冲液、兔脑抽提液、pt检测试剂及pt检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110887970A CN110887970A (zh) | 2020-03-17 |
| CN110887970B true CN110887970B (zh) | 2023-10-31 |
Family
ID=69749522
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911200730.5A Active CN110887970B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 抽提缓冲液、兔脑抽提液、pt检测试剂及pt检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110887970B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111638374B (zh) * | 2020-06-08 | 2022-10-18 | 深圳市国赛生物技术有限公司 | 一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒 |
| CN111856043A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-10-30 | 保定天岳生物工程有限公司 | 一种凝血酶原时间检测试剂盒 |
| US20230243856A1 (en) * | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Instrumentation Laboratory Company | Identifying direct oral factor xa inhibitors |
| CN116165039B (zh) * | 2023-02-11 | 2023-09-22 | 保定天岳生物工程有限公司 | 一种代替传统兔脑粉的兔脑组织制备方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB807782A (en) * | 1954-05-27 | 1959-01-21 | Ortho Pharma Corp | Thromboplastin and thromboplastic compositions and method of preparation thereof |
| JPH0560764A (ja) * | 1991-08-30 | 1993-03-12 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 血液凝固測定方法 |
| US6100072A (en) * | 1997-04-23 | 2000-08-08 | Instrumentation Laboratory S.P.A. | Recombinant rabbit tissue factor based prothrombin time reagent |
| JP2003517610A (ja) * | 1999-12-15 | 2003-05-27 | ペンタファルム・リミテッド | 血液学的アッセイ及び試薬 |
| CN103068979A (zh) * | 2010-08-18 | 2013-04-24 | 东丽株式会社 | Rna提取用溶液 |
| CN106591267A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-04-26 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种凝血活酶及其提取方法以及pt试剂 |
| CN107356768A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-17 | 宁波艾科生物科技有限公司 | 一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂 |
| CN108226540A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-06-29 | 武汉市长立生物技术有限责任公司 | 一种鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂、aptt试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010530979A (ja) * | 2007-06-20 | 2010-09-16 | エムイーシー ダイナミクス コーポレイション | 血液凝固を測定するための方法および装置 |
-
2019
- 2019-11-29 CN CN201911200730.5A patent/CN110887970B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB807782A (en) * | 1954-05-27 | 1959-01-21 | Ortho Pharma Corp | Thromboplastin and thromboplastic compositions and method of preparation thereof |
| JPH0560764A (ja) * | 1991-08-30 | 1993-03-12 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 血液凝固測定方法 |
| US6100072A (en) * | 1997-04-23 | 2000-08-08 | Instrumentation Laboratory S.P.A. | Recombinant rabbit tissue factor based prothrombin time reagent |
| JP2003517610A (ja) * | 1999-12-15 | 2003-05-27 | ペンタファルム・リミテッド | 血液学的アッセイ及び試薬 |
| CN103068979A (zh) * | 2010-08-18 | 2013-04-24 | 东丽株式会社 | Rna提取用溶液 |
| CN106591267A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-04-26 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种凝血活酶及其提取方法以及pt试剂 |
| CN107356768A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-17 | 宁波艾科生物科技有限公司 | 一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂 |
| CN108226540A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-06-29 | 武汉市长立生物技术有限责任公司 | 一种鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂、aptt试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110887970A (zh) | 2020-03-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110887970B (zh) | 抽提缓冲液、兔脑抽提液、pt检测试剂及pt检测试剂盒 | |
| US5391380A (en) | Thromboplastin extract, reagent, and preparation thereof | |
| JP3246749B2 (ja) | 組換えウサギ組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬 | |
| EP0482088B1 (en) | Improved stable coagulation controls | |
| EP1092157B1 (en) | Coagulation controls for pt and aptt assays | |
| CN107748267B (zh) | 一种测定活化部分凝血活酶时间（aptt）的试剂盒 | |
| EP2722675B1 (en) | Method of measuring blood coagulation time to detect lupus anticoagulants | |
| JP2011133396A (ja) | 活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬、活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法、及び血液凝固抑制物質の有無の判定方法 | |
| EP0396733B1 (en) | Improved extraction methods for preparing thromboplastin reagents | |
| US20110177541A1 (en) | Method for adjusting the coagulation time in calibrator or control plasmas | |
| CN106591267B (zh) | 一种凝血活酶及其提取方法以及pt试剂 | |
| CN114544983A (zh) | 一种凝血与血小板功能分析仪用正常值质控品的制备方法 | |
| CN102692516A (zh) | 狼疮抗凝物筛选测定试剂盒（凝固法） | |
| US5504193A (en) | Extraction methods for preparing thromboplastin reagents | |
| CA2156469C (en) | Additive for diagnostic tests for determination of the coagulability of blood, method of reducing the influencing of diagnostic tests by heparin and the use of metal salts for these purposes | |
| US20060194191A1 (en) | Processing method for the long-term stabilization of biological red blood cell volume | |
| CN106350499B (zh) | 凝血酶溶液的稳定剂 | |
| CN115517243B (zh) | 一种血浆保存液、凝血质控品及其应用 | |
| CN112557665B (zh) | 一种狼疮抗凝物的确认试剂及其制备方法 | |
| CN107561296A (zh) | 一种测定凝血酶时间（tt）的试剂盒 | |
| JP3121456B2 (ja) | プロトロンビン時間テストへの使用に適した培養細胞からのトロンボプラスチン試薬の製法 | |
| EP0217768A2 (en) | Method and compositions for heparin assays | |
| CN110470849A (zh) | 一种用于凝血检测的异常值质控品及其制备方法 | |
| US20020151646A1 (en) | Thromboplastin reagent and method for manufacturing the same | |
| CN112433057B (zh) | 一种狼疮抗凝物的筛选试剂及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |