CN103439174A - 以二氧化钛为固相对样品中核苷的萃取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于二氧化钛材料对核苷的吸附方法。该方法利用二氧化钛材料对顺式二醇结构的亲和作用,通过固相萃取模式,实现快速、高效吸附生物样品中大量存在的正常核苷类物质的目的。与目前广泛应用的传统酶解法除核苷相比,该方法体现出成本低、速度快、特异性高的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种以二氧化钛为固相对正常核苷(腺苷、胞苷、尿苷、尿苷)的萃取方法,属于样品预处理技术。
背景技术
DNA/RNA的修饰与人体的各项生理过程息息相关,对其的研究一直是相关学科的重点。而在体内,由于正常核苷的丰度较高,容易干扰2’-脱氧核苷及2’-O修饰的核苷的检测。在分析2’-脱氧核苷前,通常采用预酶解RNA、沉淀DNA的步骤以降低最终样品中正常核苷的含量。而这种酶解法包含一系列多步处理过程(如RNase酶酶解、苯酚/氯仿溶液萃取、异丙醇低温沉淀、清洗复溶等),需要近12个小时的处理时间。另外,频繁的样品转移与溶剂交换导致样品回收率降低、重现性变差。而且,实际上,该方法去除核苷的效率并不高。另外,对于分析2’-O修饰的核苷,目前还未出现有效去除水解RNA时共生成的正常核苷的手段。
二氧化钛是一种常见的金属氧化物材料,价格低廉、用途广泛。这类材料对于含有顺式羟基结构的物质具有独特的亲和能力,相关研究一直是光催化领域的热点。相对于2’-脱氧核苷及2’-O修饰的核苷,正常核苷戊糖基团上存在有一对顺势羟基。我们利用该结构与二氧化钛间的特异性作用,以各种形式的二氧化钛材料为吸附介质,达到除去生物样品中高丰度正常核苷的目的。这种以二氧化钛材料特异性吸附核苷的概念和方法为本专利首次提出。
发明内容
本发明所要解决的问题在于克服现有技术的不足,提供一种步骤少、效率高的去除样品中正常核苷的前处理方法。
为解决上述问题,本发明利用二氧化钛材料对样品中正常核苷的特异性萃取,达到在检测2’-脱氧核苷及2’-O修饰的核苷前,除去样品中存在的大量正常核苷的目的。
具体方案为:
将DNA或RNA样品溶于水中,通过二氧化钛柱,然后用水淋洗,所得洗脱液中不含核苷;或者将DNA或RNA样品溶于水中,溶解液和二氧化钛混合,涡旋15分钟以上,然后离心分离,所得清液不含核苷。
上述的二氧化钛,粒径为20微米到40微米。
上述的二氧化钛,可以包覆于其他材料的表面,如TiO2包裹SiO2材料。
各种形式的二氧化钛材料均可以用于相关处理过程,如纳米颗粒、纤维、薄膜、微球、粉末、涂层等等。吸附形式亦有多种选择,如固相萃取,分散固相萃取等。经过测定,样品中正常核苷浓度在较宽的范围内均可以得到有效去除(如500μg/mL),符合各种实际样品中应用的要求。
附图说明
图1为本发明中涉及到的固相萃取流程示意图。
图2为实施例1中涉及到的LC-UV色谱分析图。(I)为4种正常核苷及4种脱氧核苷混合样品直接进样分析结果;(II)为4种正常核苷及4种脱氧核苷混合样品经过TiO2固相萃取后分析结果。
图3为实施例2中涉及到的LC-UV色谱分析图。(I)为腺苷及2’-脱氧腺苷混合样品直接进样分析结果;(II)为利用商品化的TiO2纳米颗粒对样品进行分散固相萃取后的分析结果;(III)为利用液相沉积法制备的TiO2包裹SiO2材料对样品进行分散固相萃取后的分析结果;(IV)为利用实施例1中使用的TiO2粉末对样品进行分散固相萃取后的分析结果。
图4为实施例3中涉及到的正常核苷的LC-MS/MS选择离子流图。(A)腺苷;(B)尿苷;(C)胞苷;(D)鸟苷。(I)为酵母样品直接分析结果;(II)为酵母样品利用传统酶解法处理一次后分析结果;(III)为酵母样品利用传统酶解法处理两次后分析结果;(IV)为利用TiO2固相萃取后分析结果。
图5为实施例3中涉及到的2’-脱氧核苷的LC-MS/MS选择离子流图。(A)2’-脱氧腺苷;(B)胸苷;(C)2’-脱氧胞苷;(D)2’-脱氧鸟苷。(I)为酵母样品直接分析结果;(II)为酵母样品利用传统酶解法处理一次后分析结果;(III)为酵母样品利用传统酶解法处理两次后分析结果;(IV)为利用TiO2固相萃取后分析结果。
图6为实施例4中涉及到的正常核苷及2’-O修饰核苷的LC-MS/MS选择离子流图。(A)为宫颈癌细胞样品直接分析结果;(B)为宫颈癌细胞样品利用TiO2固相萃取后分析结果。
具体实施方式
1. TiO2粉末的制备
0 °C下混合冰醋酸(0.1g)、水(1g)及乙醇(25g)。将钛酸四丁酯(10g)加入其中,混合均匀。将此混合溶液置于40°C下反应10小时。生成的白色凝胶分别用乙醇和水进行清洗,在30°C下充分干燥。所得固体经研磨和筛分得到20~40μm颗粒,用于后续固相萃取及分散固相萃取实验。
2. 商品化TiO2纳米颗粒购于阿拉丁试剂(T104936)。
3. 液相沉积TiO2包裹SiO2材料的制备
首先,二氧化硅微球经稀盐酸和去离子水清洗后在真空环境下烘干。然后,干燥后的硅胶分散于100 mL 0.1 M (NH4)2TiF6、0.3 M H3BO3 溶液中。悬浊液在真空环境下保持1 h 后,于35 °C 下震荡16 h。最后,得到的复合微球经去离子水清洗后置于120 °C 干燥4 h。制备所得复合微球置于马弗炉中,以1 °C/min 的速度升温至300 °C 并保持2 h。
4. 细胞中的DNA/RNA利用相应商品化试剂盒(如DNAiso reagent)进行提取。
5. 传统酶解法除样品中正常核苷(即除DNA中的RNA污染)步骤
6. 150 μL提取的DNA(100μg)中加入2 μL RNase T1(25 unit/μL)及10 μL RNase A(10 mg/mL)后置于37oC下孵育6小时。利用等体积的苯酚/氯仿(1:1, v/v)及氯仿分别萃取两次后,取水层加入15μL醋酸钠溶液(3M, pH 5.2)和150μL冰异丙醇混匀。在-20oC下保存30分钟后,4oC下离心15分钟得到DNA沉淀。用70%乙醇清洗三次后,于室温下自然干燥,利用tris-HCl(pH 8.0)复溶。总耗时约12小时。
7. DNA/RNA水解
提取的DNA/RNA首先于95oC下加热5分钟,然后在冰浴中淬火2分钟。然后加入1/10体积比的缓冲液(30 mM CH3COONa, pH 4.6, 280 mM NaCl, 1 mM ZnSO4)及S1 nuclease(600 units)。将上述溶液(20μL)置于37oC下孵育2小时后,加入2μL缓冲液(50mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, pH 9.0)及venom phosphodiesterase I(0.02 units)和碱性磷酸酶(30 units),继续孵育2小时。所得溶液利用等体积的苯酚/氯仿(1:1, v/v)及氯仿分别萃取后,取水层干燥即可。
8. 萃取过程
TiO2固相萃取:制得的TiO2粉末(75mg)填充于1mL注射器内,两端利用聚丙烯筛板固定(如图1)。样品溶解于80μL纯水中以40μL/min流速进行上样。完成上样后,用320μL纯水进行清洗(200μL/min)。合并上样流出液及清洗流出液即可进行后续LC-UV及LC-MS分析。萃取过程耗时约5分钟。
分散固相萃取:将TiO2粉末、商品化TiO2纳米颗粒或液相沉积TiO2包裹SiO2材料(10mg)加入100μL腺苷及2’-脱氧腺苷混合溶液(1μg/mL)中,涡旋15分钟后,10000转离心5分钟取上层清液进行LC-UV分析。
9. 分析条件
实施例1和2中使用的色谱柱为Hisep C18(150mm x 4.6mm i.d., 5μm, Weltech Co., Ltd.)。流动相为5mM甲酸/甲醇(93/7, v/v)。流速为1mL/min。检测波长为254nm。进样体积为5μL。
实施例3和4中使用的色谱柱为Hisep C18-T column (150 mm x 2.1 mm i.d., 5 μm, Weltech Co., Ltd.)。流速为0.2mL/min。实施例3中使用的梯度为:5min 5%B,20min 5-50%B,5min 50%B,10min 5%B;实施例4中使用的梯度为:15min 5%B,5min 5-15%B,10min 5%B(A为5mM甲酸铵溶液、B为甲醇)。
以下通过实施例对本发明做进一步的介绍。
实施例1:标准样品中核苷的萃取
配制4种核苷(腺苷、尿苷、胞苷、鸟苷)及4种2’-脱氧核苷(2’-脱氧腺苷、2’-脱氧尿苷、2’-脱氧胞苷、2’-脱氧鸟苷)的混合溶液(1μg/mL),进行TiO2固相萃取后分析。结果如图2所示。与直接进样分析(0.2μg/mL)相比,经过TiO2萃取后,4种核苷的信号均完全消失,仅余4种2’-脱氧核苷信号,说明制备的TiO2粉末对于核苷有良好的萃取效果。
实施例2:不同TiO2材料对核苷的萃取
配制腺苷及2’-脱氧腺苷的混合溶液(1μg/mL),分别利用商品化的TiO2纳米颗粒、液相沉积法制备的TiO2包裹SiO2材料和实施例1中的TiO2粉末对样品进行分散固相萃取后分析。结果如图3所示。与直接进样分析相比,经过萃取后,对于所有实验组,腺苷的信号都有不同程度的下降。说明3种不同制备方法得到的TiO2材料对于核苷均有明显的萃取效果。说明了本发明对于各类TiO2材料的普适性。
实施例3:利用TiO2材料吸附酵母细胞提取的DNA酶解物中的正常核苷,以检测其中的2’-脱氧核苷
将不同方法处理后的酵母细胞DNA酶解物溶于水中,进行LC-MS分析。正常核苷的选择离子流图如图4。即使经过两次传统酶解法的处理,仍然有明显的核苷残留(4%到21%);而经过TiO2固相萃取后,所有核苷得以有效除去(均低于2%)。2’-脱氧核苷的选择离子流图如图5。经过两次酶解法处理后,2’-脱氧核苷回收率相对较低(50%到62%);而TiO2固相萃取对2’-脱氧核苷的回收率影响较小(70%到97%)。以上结果说明本发明所涉及TiO2材料吸附核苷方法相比于传统酶解方法具有吸附效果好、特异性高、速度快的优势。
实施例4:利用TiO2材料吸附宫颈癌细胞提取的RNA酶解物中的正常核苷,以检测其中的2’-O甲基化的核苷
将宫颈癌细胞提取的RNA酶解物溶于水中,经过TiO2固相萃取后,进行LC-MS分析。结果如图6所示。当直接进样分析时,谱图中的主要信号为样品中较高浓度的正常核苷;而经过TiO2固相萃取后,所有正常核苷均得以有效除去,谱图中仅余2’-O甲基化核苷信号。此结果说明了本发明所涉及TiO2材料吸附核苷方法适用于在检测2’-O修饰的核苷前,有效去除体系中的正常核苷干扰。
Claims (5)
1.一种以二氧化钛为固相对核苷的萃取方法,其特征在于,
将DNA或RNA样品溶于水中,通过二氧化钛柱,然后用水淋洗,所得洗脱液中不含核苷;或者将DNA或RNA样品溶于水中,溶解液和二氧化钛混合,涡旋15分钟以上,然后离心分离,所得清液不含核苷。
2.根据权利要求1所述的萃取方法,其特征在于,上述的二氧化钛,粒径为20微米到40微米。
3.根据权利要求1所述的萃取方法,其特征在于,所述二氧化钛材为颗粒、纤维、薄膜、微球或粉末。
4.根据权利要求1所述的萃取方法,其特征在于,所述的二氧化钛,包覆于其他材料的表面。
5.根据权利要求4所述的萃取方法,其特征在于,所述的二氧化钛,为TiO2包裹SiO2材料。
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