CN103055830A - 一种基于单链dna核酸适配体修饰氧化石墨烯涂层的固相微萃取头制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于单链DNA修饰氧化石墨烯涂层的新型固相微萃取头的制备方法,按以下步骤进行:(1)对石英纤维进行硅烷化处理;(2)在石英纤维表面涂渍多孔聚合物溶液;(3)重复涂渍多孔聚合物涂层;(4)硅烷化处理;(5)在PBS缓冲液、催化剂EDC溶液、NHS溶液及氧化石墨烯水溶液的混合液中,插入硅烷化多孔聚合物涂层石英纤维;(6)在同一石英纤维上重复步骤(4)及(5)若干次;(7)将氧化石墨烯/多孔聚合物涂层石英纤维取出,插入到PBS缓冲液、EDC溶液、NHS溶液及核酸适配体溶液的混合液。本发明克服了常规涂渍方法固载率低、易脱落、不稳定等缺点,并且显著提高核酸适配体固载量,增强SPME富集效率。
Description
技术领域
本发明属于化学分析测试仪器领域,涉及到基于单链DNA核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法。适用于复杂生物样品中痕量生物碱、抗生素或核苷酸类物质的高选择性、快速分离与富集。
背景技术
样品前处理方法与技术一直是现代化学领域的重要课题和发展方向之一。在一个完整的样品分析过程中包括样品采集、样品前处理、分析测定、数据处理与报告结果,其中样品前处理所需的时间约占整个分析时间的60%,并可能带来30%以上的误差,因而成为分析工作中的瓶颈问题,也是分析过程中最为关键的部分。传统的样品前处理方法有液-液萃取、蒸馏、吸附、沉淀、索氏萃取、高温消解等,这些样品前处理技术虽然具有可靠性好、回收率高等优点,但同时存在着处理时间长,操作繁琐,劳动强度大,消耗大量有机溶剂等较多缺点。研究高效、快速、简便、无二次污染的样品前处理技术,已经成为目前的一个研究热点。
固相微萃取(SPME)是一种简便的样品前处理技术,自1989年Belardi等首次报道以来,受到了分析化学家们的广泛关注。SPME技术是基于用涂有固定相的熔融石英纤维来吸附、富集样品中的待测物质。该方法巧妙地将待测物的萃取、脱附、进样结合在一起,无需或仅需少量有机溶剂,操作简便,费用低,集采样、萃取、浓缩、进样于一体,易与气相或液相色谱仪联用。涂层是SPME技术发展的关键,涂层的性质很大程度上决定了方法的灵敏度和选择性。目前,已有几种商品化的SPME熔融石英纤维涂层,大部分商品化涂层是通过物理作用吸附到萃取头表面,选择性不高,稳定性较差,在有机溶剂里不稳定,且不适合于处理极性或碱性物质,限制了其应用的范围。近年来,一些文献报道了几类新型SPME涂层的研制工作,如聚硅氧烷-富勒烯(Xiao C.H.,Han S.Q.,Wang Z.Xing Y.,J.,and Wu C.Y.2001.J.Chromatogr.A927:121-130)、冠醚(Zeng,Z.R.,W.L.Qiu,and Z.F.Huang.2001.Anal.Chem.73:2429-2436)、杯芳烃(Li,X.J.,Z.R.Zeng,S.Z.Gao,and H.B.Li.2004.J.Chromatogr.A1023:15-25)等,这些涂层的选择性相对于商品化涂层有一定提高,但分析对象范围较窄,主要用于测定挥发或半挥发性有机环境污染物,且选择性仍不够强。类似于酶-底物的相互作用识别原理的分子印迹技术的出现,在分析化学领域获得了广泛应用。该技术能够以较高选择性识别复杂样品中的印迹分子,且化学稳定性好,制备简单,适合作为SPME的涂层材料。但由于分子印迹技术本身的局限,尚存在以下不足之处:分子印迹聚合物(MIP)中刚性识别“空穴”易被破坏或变形;MIP涂层在生物样品分析中受到较大限制;其特异性及亲合力不如生物识别体系如酶-底物、抗体-受体等相互作用;萃取溶剂大多为有机溶剂,易污染环境。为此,适合于复杂生物样品中痕量物质分析,同时选择性更强的SPME涂层是目前涂层研究的趋势,而具有特异性强、亲和力高等优点的生物识别体系无疑是合适的选择。
近几十年,抗体技术发展迅速,基于抗体-抗原相互作用的生物识别体系在分析化学领域也获得了较多应用。但自从1990年核酸适配体出现以来,抗体技术受到前所未有的挑战。核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)经体外筛选得到的一段短的单链寡核苷酸序列(DNA或RNA)。适配体与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性,它通过链内某些互补碱基间的配对和静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠,形成一些稳定的三维空间结构,通过各种相互作用与配体间产生高特异性的结合力。例如,茶碱与咖啡因在结构上只相差一个甲基,难以区分。Jenison等从RNA库中分离得到茶碱适配体,与茶碱的亲和力比咖啡因高10000倍以上(JenisonR.D.,Gill S.C.,PardiA.,andPoliskyB.1994.Science263:1425-1429);Rusconi等也发现,尽管凝血因子Xa和Ⅶa(FⅦ)有一套相同的结构域,但修饰过的RNA适配体对凝血因子Ⅶa比对凝血因子Xa显示高出500多倍的选择性(Rusconi C.,YehA.,Lyerly H.,Lawson J.,and Sullenger B.2000.Thromb.Haemostasis84:841-848)。适配体与抗体一样能与相应配体高效、专一地结合,同时适配体还具有抗体无法比拟的以下优点:目标物范围广,具有高的亲和力,结合特异性强,筛选制备方便,稳定性高,可复性,易引入修饰基团。至今已经筛选出300种以上能够与目标分子结合的适配体,这些目标分子包括酶、生长因子、抗体、转录因子、核苷酸、肽、多肽、抗生素、氨基酸、有机染料以及重金属离子,甚至完整的病毒和病原体以及细胞。
适配体由于亲和力高、特异性强以及相对于抗体/抗原传统生物识别体系的众多优点,在分析化学领域的应用成为人们关注的焦点。适配体在化学修饰后能够固定在各种材料表面,如玻璃、磁性微球、金属、硅胶、量子点等,应用于各类分离技术,包括生化分析、生物传感器、适配子信标、毛细管电泳、亲和色谱、生物质谱、流式细胞分析、荧光偏振分析、靶向治疗等。例如,McGown小组较早报道了将核酸适配体共价键合修饰到开管毛细管的管壁上,用来分离小分子目标物如氨基酸、多环芳香烃、二肽等(Vo T.U.,McGown L.B.2006.Electrophoresis25:749);Medley等人开发出一种利用适配体键合到纳米金颗粒上来检测疾病细胞的比色方法(Medley C.D.,Smith J.E.,Tang Z.2008.Anal Chem80:1067-1072)。
氧化石墨烯(grapheneoxide)是石墨烯的一种重要的派生物,也被称为功能化的石墨烯。它的结构与石墨烯大体相同,石墨烯是一种二维碳原子晶体,具有独特的二维结构,由一层密集的、包裹在蜂巢晶体点阵上的碳原子以sp2杂化连接而成的单原子层组成,具有高的比表面积,突出的导热性能和力学性能,但是他自身可以用的基团很少。而氧化石墨烯则是在二维基面上多了有大量官能团,如羟基、环氧官能团、羧基等,从而可以合成大量共价键合的氧化石墨烯衍生物。氧化石墨烯的独特结构和超大的比表面积、优良的光学、热学和机械性能使之在纳米电子器件、生物传感器、信息存储等领域的潜在重要应用。例如,Shan等将氧化石墨烯与赖氨酸共价结合,赖氨酸修饰后的氧化石墨烯在水中会产生大量的自由氨基,作为新型生物检测器,将过氧化氢酶共价结合到赖氨酸修饰后的氧化石墨烯上可以定性检测生物体中的H2O2(Shan C.S.,Yang H.F.,Han D.X.,Zhang Q.X.,Ivaska A.,and Niu L.2009.Langmuir25:12030-12033)。同时,氧化石墨烯在和适配体键合后进行分离检测方面,也有很大潜力。例如,Sheng等开发了一个简单的方法来检测由赭曲霉和鲜绿青霉引起的赭曲霉毒素A,利用氧化石墨烯与未结合赭曲霉毒素A的适配体键合使之荧光猝灭,而结合赭曲霉毒素A的适配体仍有荧光,该传感器赭曲霉毒素A结构类似物没有响应(Sheng L.F.,Ren J.T.,MiaoY.Q.,Wang J.H.,WangE.K.2011.Biosens.Bioelectron.26:3494-3499)。
相对于氧化石墨烯和核酸适配体在各自相关领域中的广泛研究和应用,将氧化石墨烯和核酸适配体结合在一起应用于固相微萃取技术,以氧化石墨烯为载体提供大的比表面积,以核酸适配体为识别单元提高选择性,国内外均未有相关文献报道。
发明内容
针对上述SPME涂层材料在选择性、稳定性、生物样品兼容性等方面存在的问题,本发明将氧化石墨烯超高比表面积的特点、核酸适配体特异选择性强的特性与SPME技术耗时少、效率高、操作简单等优点结合在一起,制备得到一种基于单链DNA核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相涂层的新型石英纤维固相微萃取头。该新型萃取头可实现复杂生物样品中生物碱、抗生素或核苷酸类物质高效、高选择性分离与富集,清除样品基体干扰,从而降低检出限,提高分析的准确性和精度。
本发明通过以下技术方案实现:一种基于单链DNA修饰氧化石墨烯涂层的新型固相微萃取头的制备方法,按以下步骤进行:
(1)对石英纤维进行丙酮洗、苯洗、碱洗、酸洗、高温活化,然后用具有不饱和双键的硅烷化试剂在纤维表面进行硅烷化处理;
(2)在聚合溶剂中加入功能单体、交联剂及引发剂,充分混合制得多孔聚合物溶液,取一定量所述多孔聚合物溶液于试管中,插入硅烷化石英纤维,通氮气除氧后,密封试管口,水浴中热引发共聚反应;聚合一定时间,取出石英纤维,置于干燥箱中于一定温度下老化一定时间;
(3)在同一根石英纤维上重复步骤(2)若干次,即在石英纤维表面重复涂渍多孔聚合物涂层;
(4)用具有氨基的硅烷化试剂对得到的多孔聚合物涂层石英纤维进行硅烷化处理;
(5)在PBS缓冲液、催化剂EDC溶液、NHS溶液及氧化石墨烯水溶液的混合液中,插入硅烷化多孔聚合物涂层石英纤维,室温反应一定时间,取出纤维,置于干燥箱中于一定温度下老化;
(6)在同一根石英纤维上依次重复步骤(4)及(5)若干次;
(7)将第(6)步中最后得到的氧化石墨烯/多孔聚合物涂层石英纤维取出,插入到PBS缓冲液、EDC溶液、NHS溶液及核酸适配体溶液的混合液中,室温反应一定时间,取出后用PBS缓冲液清洗,氮气吹干,保存。
具体来说,所述步骤(2)中多孔聚合物溶液的制备所采用的聚合溶剂为丙酮溶液,加入的功能单体为甲基丙烯酸,加入的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,加入的引发剂为偶氮二异丁腈。
作为一个具体实施例,所述步骤(2)中多孔聚合物溶液的制备是在锥形瓶中加入335μL甲基丙烯酸功能单体、5mL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交联剂、50mg偶氮二异丁腈引发剂及45mL丙酮溶液,充分摇匀。当然,上述功能单体、交联剂、引发剂及聚合溶液也可以采用其它的体积用量,只要满足反应所需的量即可。
作为其中一个优选方案,步骤5中所采用的氧化石墨烯化学键合条件为:所述EDC溶液浓度为4.5~6mM,NHS溶液浓度为8~12mM,氧化石墨烯水溶液的浓度为0.35~0.6mg/mL的混合液中,PBS缓冲液:EDC溶液:NHS溶液:氧化石墨烯水溶液体积比为2:2:1:2;室温下键合,键合时间为24h。
进一步地具体来说,步骤5中所采用的氧化石墨烯化学键合条件为:所述EDC溶液浓度为5mM,NHS溶液浓度为10mM,氧化石墨烯水溶液的浓度为0.5mgmL的混合液中,PBS缓冲液:EDC溶液:NHS溶液:氧化石墨烯水溶液体积比为2:2:1:2。
作为其中一个优选方案,步骤7所采用的核酸适配体化学键合条件为:所述EDC溶液浓度为4.5~6mM,NHS溶液浓度为8~12mM,核酸适配体溶液浓度为5.5~6.5μg/mL,PBS缓冲液:EDC溶液:NHS溶液:核酸适配体溶液体积比为1:6:4:5,室温下键合,键合时间为24h。
进一步地具体来说,步骤7所采用的核酸适配体化学键合条件为:所述EDC溶液浓度为5mM,NHS溶液浓度为10mM,核酸适配体溶液浓度为6.25μgmL,PBS缓冲液:EDC溶液:NHS溶液:核酸适配体溶液体积比为1:6:4:5。
石英纤维表面重复涂渍多孔聚合物涂层2~4层,以确保涂层稳定。
同样地,步骤6是指对同一根石英纤维上依次对步骤4及5重复4~6次,通过多次化学键合涂渍方法将氧化石墨烯修饰到多孔聚合物涂层表面。
石英纤维表面光洁平整,表面积小,核酸适配体在裸石英纤维表面键合较难实现,存在固载率低、易脱落、不稳定等问题,难以满足SPME富集性能要求。本发明在硅烷化石英纤维表面制备一层多孔聚合物涂层,再通过多次化学键合涂渍方法将氧化石墨烯修饰到多孔聚合物涂层表面,利用氧化石墨烯涂层表面羧基基团与核酸适配体端基上修饰的氨基基团进行化学键合,将核酸适配体固载于氧化石墨烯/多孔聚合物涂层表面,克服了常规涂渍方法固载率低、易脱落、不稳定等缺点,并且显著提高核酸适配体固载量,增强SPME富集效率。
附图说明
图1各图是核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头制备过程示意图。其中,
图1A是石英纤维表面化学处理及硅烷化示意图;
图1B是多孔聚合物涂层纤维制备示意图;
图1C是多孔聚合物涂层表面键合氧化石墨烯示意图;
图1D是氧化石墨烯涂层表面键合核酸适配体示意图。
图2是氧化石墨烯的透射电子显微镜照片(5000倍)。
图3是氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的扫描电子显微镜照片(涂层涂渍次数为5),其中图3A是1000倍放大;图3B是50000倍放大。
图4是腺苷核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头(Apt-PP-fiber)、乱序核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头(SApt-PP-fiber)、氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头(Non-Apt-PP-fiber)萃取1mgL腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、β-胸苷、邻甲基苯甲酸标准溶液萃取量对比图。
图5是腺苷核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头萃取不同浓度腺苷标准溶液萃取量曲线。
具体实施方式
本实施例如以腺苷为例,对本发明进行详细地描述,但并不以此限定本发明的保护范围。
如图1所示,基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头的制备方法如下:
(1)将5.0cm长石英纤维置于丙酮中浸泡0.5h,取出,用乙醇清洗三次;随即放入苯中浸泡0.5h,取出,用乙醇清洗三次,再用蒸馏水清洗三次;置于1.0mol/L NaOH碱洗液中室温浸泡1h,取出,用蒸馏水清洗三次;碱洗后石英纤维随即置于1.0mol/L HCl洗液中浸泡1h,取出,用蒸馏水清洗干净。经碱洗、酸洗后石英纤维置于烘箱内150℃活化1h。从烘箱中取出石英纤维,立即置于10%(v/v)3-甲基丙烯酰基-丙基-三甲氧基硅烷硅丙酮溶液中,硅烷化反应1h,取出后以乙醇冲洗三次,氮气吹干。
(2)在锥形瓶中加入335μL甲基丙烯酸功能单体、5mL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交联剂、50mg偶氮二异丁腈引发剂及45mL丙酮溶液,充分摇匀。取一小试管,加入1.5mL上述聚合溶液,放入一根经硅烷化处理的石英纤维,通氮气以除去试管内空气,立即用胶塞封口,置于恒温水浴锅中60℃加热聚合。1.5h后,聚合溶液固化,打开胶塞,匀速拔出石英纤维,转移入洁净的空试管中,通氮气除氧,用胶塞封口后置于烘箱60℃下加热固化12h。
(3)上一步中得到的多孔聚合物涂层纤维,按照上述第(2)步相同方法在其表面进行第二次、第三次涂渍,制得反复凃渍3次的多孔聚合物涂层石英纤维,将其置于恒温干燥箱中150℃下加热老化处理2h。
(4)采用Hummers氧化法制备氧化石墨烯。在干燥的500mL三口烧瓶中加入100mL98%的浓硫酸,用冰块冷却至0℃,100r/min转速下搅拌,加入2.5g天然鳞片石墨及1.25g NaNO3,再缓慢加入8g KMNO4,冰水浴2h。将烧瓶置于35℃左右的恒温水浴中,100r/min转速下搅拌,待反应液温度升至35℃后继续搅拌30min,随后用分液漏斗连续滴加去离子水130mL,控制反应液温度在100℃以内,反应1h。冷却至室温,向烧瓶中加入50mL5%H2O2,静置12h。用5%HCl调节溶液pH为7.0,在4000r/min转速下离心,弃去上清液,取下层沉淀物置于表面皿中,60℃下真空干燥,得到氧化石墨。称取氧化石墨0.0500g溶解于100mL去离子水中,在600w功率条件下超声3h,静置12h,取上层清液,在4000r/min转速条件下离心10min,取上层清液于,65℃下真空干燥,得到氧化石墨烯。
(5)在100mL烧杯中加入25mg氧化石墨烯及50mL去离子水,600w功率条件下超声2h,得到氧化石墨烯溶液(0.5mg/mL)。
(6)将多孔聚合物涂层石英纤维置于10%(v/v)γ-氨丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中,硅烷化反应3h,取出后以乙醇清洗三次,氮气吹干。
(7)在50mL小烧杯中加入0.85g NaCl、0.22g Na2HPO4和0.11g NaH2PO4,用20mL去离子水溶解后,用0.2mol/L NaOH调节PH到7.5,倒入100mL容量瓶中,加水至刻度,配成10mM的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)。
在25mL小烧杯中加入5mLPBS缓冲液、5mLEDC溶液(10mM)、2.5mLNHS溶液(5mM)、5mL氧化石墨烯水溶液(0.5mg/mL),插入硅烷化后的多孔聚合物涂层石英纤维,室温下键合反应3h。取出纤维,置于恒温干燥箱中60℃下老化处理5min。
(8)重复上述6-7步操作,在同一根多孔聚合物涂层石英纤维表面反复涂渍5次氧化石墨烯涂层,得到氧化石墨烯/多孔聚合物涂层石英纤维。用PBS缓冲液清洗氧化石墨烯/多孔聚合物涂层石英纤维,用小刀将离纤维顶端1cm以上的氧化石墨烯/多孔聚合物涂层刮去,剩下的氧化石墨烯/多孔聚合物涂层长度统一为1.0cm。
(9)在玻璃内插管中依次加入40μL6.25μg/mL腺苷核酸适配体标准溶液(PBS缓冲液溶解)、8μLPBS缓冲液、48μL EDC溶液(10mM)、24μL NHS溶液(5mM),将氧化石墨烯/多孔聚合物涂层石英纤维插入玻璃内插管中,室温下键合反应24h。取出纤维,用PBS缓冲液清洗3次,得到核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头。
本实施例制备核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物SPME涂层萃取头具有以下优点:
(1)采用化学键合方法,通过多孔聚合物及氧化石墨烯涂层多次涂渍方式制备核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物SPME涂层萃取头,如图3所示,涂层均匀、致密,平均厚度为3.8μm,RSD为2.8%(n=10),氧化石墨烯在涂层表面覆盖率为100%,该方法重现性高、稳定性好。
(2)如图4所示,本发明制备的核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头对腺苷分子具有很高的选择性萃取能力,相对于鸟苷、尿苷、胞苷、β-胸苷等结构类似物的选择性因子分别为6.2、10.1、10.5与11.1,萃取量为未键合核酸适配体的氧化石墨烯/多孔聚合物涂层SPME萃取头的14.9倍,可用于复杂生物样品中痕量腺苷分子的高选择性分离与富集。该萃取头腺苷萃取容量约为4.6ng,如图5所示。
Claims (10)
1.一种基于单链DNA修饰氧化石墨烯涂层的新型固相微萃取头的制备方法,按以下步骤进行:
(1)对石英纤维进行丙酮洗、苯洗、碱洗、酸洗、高温活化,然后用具有不饱和双键的硅烷化试剂在纤维表面进行硅烷化处理;
(2)在聚合溶剂中加入功能单体、交联剂及引发剂,充分混合制得多孔聚合物溶液,取一定量所述多孔聚合物溶液于试管中,插入硅烷化石英纤维,通氮气除氧后,密封试管口,水浴中热引发共聚反应;聚合一定时间,取出石英纤维,置于干燥箱中于一定温度下老化一定时间;
(3)在同一根石英纤维上重复步骤(2)若干次,即在石英纤维表面重复涂渍多孔聚合物涂层;
(4)用具有氨基的硅烷化试剂对得到的多孔聚合物涂层石英纤维进行硅烷化处理;
(5)在PBS缓冲液、催化剂EDC溶液、NHS溶液及氧化石墨烯水溶液的混合液中,插入硅烷化多孔聚合物涂层石英纤维,室温反应一定时间,取出纤维,置于干燥箱中于一定温度下老化;
(6)在同一根石英纤维上依次重复步骤(4)及(5)若干次;
(7)将第(6)步中最后得到的氧化石墨烯/多孔聚合物涂层石英纤维取出,插入到PBS缓冲液、EDC溶液、NHS溶液及核酸适配体溶液的混合液中,室温反应一定时间,取出后用PBS缓冲液清洗,氮气吹干,保存。
2.如权利要求1所述的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中多孔聚合物溶液的制备所采用的聚合溶剂为丙酮溶液,加入的功能单体为甲基丙烯酸,加入的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,加入的引发剂为偶氮二异丁腈。
3.如权利要求2所述的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中多孔聚合物溶液的制备是在锥形瓶中加入335μL甲基丙烯酸功能单体、5mL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交联剂、50mg偶氮二异丁腈引发剂及45mL丙酮溶液,充分摇匀。
4.如权利要求1所述的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法,其特征在于步骤5中所采用的氧化石墨烯化学键合条件为:所述EDC溶液浓度为4.5~6mM,NHS溶液浓度为8~12mM,氧化石墨烯水溶液的浓度为0.35~0.6mg/mL的混合液中,PBS缓冲液:EDC溶液:NHS溶液:氧化石墨烯水溶液体积比为2:2:1:2;室温下键合,键合时间为24h。
5.如权利要求4所述的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法,其特征在于步骤5中所采用的氧化石墨烯化学键合条件为:所述EDC溶液浓度为5mM,NHS溶液浓度为10mM,氧化石墨烯水溶液的浓度为0.5mg/mL的混合液中,PBS缓冲液:EDC溶液:NHS溶液:氧化石墨烯水溶液体积比为2:2:1:2。
6.如权利要求1所述的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法,其特征在于步骤7所采用的核酸适配体化学键合条件为:所述EDC溶液浓度为4.5~6mM,NHS溶液浓度为8~12mM,核酸适配体溶液浓度为5.5~6.5μgmL,PBS缓冲液:EDC溶液:NHS溶液:核酸适配体溶液体积比为1:6:4:5,室温下键合,键合时间为24h。
7.如权利要求6所述的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法,其特征在于步骤7所采用的核酸适配体化学键合条件为:所述EDC溶液浓度为5mM,NHS溶液浓度为10mM,核酸适配体溶液浓度为6.25μgmL,PBS缓冲液:EDC溶液:NHS溶液:核酸适配体溶液体积比为1:6:4:5。
8.如权利要求1所述的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法,其特征在于:石英纤维表面重复涂渍多孔聚合物涂层2~4层。
9.如权利要求1所述的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头的制备方法,其特征在于:步骤6是指对同一根石英纤维上依次对步骤4及5重复4~6次。
10.采用权利要求1~9任一方法所制备的基于核酸适配体/氧化石墨烯/多孔聚合物固相微萃取涂层的萃取头。
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