CN104606919A - 一种新型核酸适配体/纳米金修饰固相微萃取石英毛细管的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型核酸适配体/纳米金修饰固相微萃取石英毛细管的制备方法，步骤：石英毛细管内表面碱洗及活化处理，然后硅烷化处理；取所述纳米金胶体溶液流经硅烷化后所得的石英毛细管，反应后取出石英毛细管，冲洗；取二硫代乙二醇溶液流经键合后的纳米金单次修饰的石英毛细管，在纳米金粒子表面修饰巯基；取所述纳米金胶体溶液流经巯基处理后的石英毛细管，悬停后通过巯金键使纳米金粒子再次修饰所述石英毛细管的内表面，室温下键合反应后清洗；取核酸适配体溶液通过所述石英毛细管，反应后，用缓冲液清洗，氮气吹干，低温保存。本发明利用纳米金优良的生物兼容性及高比表面积，显著提高核酸适配体在石英毛细管内表面的键合量。

Description

一种新型核酸适配体/纳米金修饰固相微萃取石英毛细管的制备方法

技术领域

本发明属于化学分析测试仪器领域，涉及到新型固相微萃取形式的核酸适配体/纳米金修饰的石英毛细管的制备方法，该毛细管适用于复杂生物样品中痕量、超痕量腺苷、三磷酸腺苷、茶碱等核苷酸或生物碱类组分快速、高效、高选择性分离富集。

背景技术

样品前处理是样品分析的第一步,也是整个样品分析过程中的关键步骤,直接影响分析的准确度和精密度。传统样品前处理技术如液-液萃取、溶剂提取、索氏提取、柱色谱等，普遍存在耗时、低效、有毒有机溶剂用量大、操作较繁琐等问题,因此，发明简单、快速、高效、绿色、高选择性、自动化的样品前处理技术是分析复杂样品如血浆、尿液、医药、环境样品和食品中痕量或超痕量待测组分的重要方面。

固相微萃取技术是20世纪90年代兴起的一项新颖的样品前处理与富集技术，它最先由加拿大Waterloo大学的Pawliszyn教授的研究小组于1989年首次进行开发研究，属于非溶剂型选择性萃取法。SPME已由美国Supelco公司在1993年实现商品化，其装置类似于一支气相色谱的微量进样器，萃取头是在一根石英纤维上涂上固相微萃取涂层，外套细不锈钢管以保护石英纤维不被折断，纤维头可在钢管内伸缩。将纤维头浸入样品溶液中或顶空气体中一段时间，同时搅拌溶液以加速两相间达到平衡的速度，待平衡后将纤维头取出插入气相色谱汽化室，热解吸涂层上吸附的物质。被萃取物在汽化室内解吸后，靠流动相将其导入色谱柱，完成提取、分离、浓缩的全过程。固相微萃取技术几乎可以用于气体、液体、生物、固体等样品中各类挥发性或半挥发性物质的分析，已在环境、生物、工业、食品、临床医学等领域的各个方面得到广泛的应用。整个固相微萃取装置中，其关键部分是萃取头。固相微萃取发展到现在已有多种形式出现，包括管内固相微萃取、纤维针式固相微萃取、萃取搅拌棒、膜萃取等。固相微萃取的萃取头通常是以石英纤维作为载体，将不同的材料凃渍或固定在其表面，应用广泛可用于气体、液体和固体中的挥发性、半挥发性、难挥发性物质的萃取富集。但纤维针式固相微萃取头易破损，涂层易脱落。萃取搅拌棒是用吸附搅拌棒代替石英纤维，吸附搅拌棒一般是内有铁芯的玻璃棒，表面覆盖涂层。与传统SPME相比，萃取搅拌棒的固定相体积大，精密度高，重现性好，具有更高的富集倍数，更适合于痕量物质的分析。膜萃取是在基底材料(铝铂，平面玻璃等)的表面上均匀地凃渍涂层材料，形成膜状的萃取涂层。固相微萃取膜是一种全新的分离方法，其将固相微萃取技术的吸附性和膜分离的选择性通过定向合成的方法有机地结合在一起，同时具备了两种方法的优点：少溶剂，方便简单，少污染。但萃取搅拌棒和膜萃取都不易与仪器联用。而管内固相微萃取在毛细管内壁凃渍涂层作为萃取头。由于毛细管柱方便易得，使用寿命长，并且内径小涂层薄，与传统的SPME外涂萃取针相比样品扩散快，平衡时间短，故多与气相色谱、高效液相色谱联用，用于环境分析和药品分析。其萃取表面积大且固定相膜薄，所以脱附比较容易，是一种有发展前途的SPME萃取形式。SPME装置中对萃取起决定作用的是所用的吸附涂层材料，目前，已有几种商品化的SPME熔融石英纤维涂层出现，最常用的高分子涂层材料为聚二甲基硅氧烷和聚甲基丙烯酸甲酯。其中不同规格的聚二甲基硅氧烷适用于不同沸点和极性的物质，聚甲基丙烯酸甲酯则适用于强极性的物质。后来又出现了聚乙二醇等涂层材料。但是现在大部分商品化涂层是通过物理作用吸附到萃取头表面，选择性不高，稳定性较差，在有机溶剂里也不稳定，且不适合于处理极性或碱性物质，从而限制了其使用范围。而新型的涂层的选择性相对于商品化涂层有一定提高，但分析对象范围较窄，且选择性仍不够强。为此，国内外众多研究小组开发了各种新型SPME涂层材料，如聚噻吩、聚苯胺、聚醚砜酮、离子液体、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、富勒烯、冠醚、β-环糊精、杯芳烃等，其中被称为第一、第二、第三代主体化合物的冠醚、β-环糊精、杯芳烃涂层材料在选择性方面有一定提高。近年来，具有选择性高、稳定性好、制备简单等特点的分子印迹聚合物(MIP)成为SPME涂层材料的研究热点。但MIP合成过程中不可避免地产生非特异性结合位点，且在生物样品(常以水溶液形式存在)分析中的应用受到较大限制。因此，水溶液样品适用性好、选择性更强的生物识别体系对于复杂生物样品中痕量、超痕量组分分析是较好的选择。

基于抗体-抗原相互作用的生物识别体系为医学及整个生命科学的发展做出了巨大贡献，在分析化学领域也获得了较多应用，如将抗原或抗体结合到层析载体上实现免疫亲和色谱法，可用于抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体、病毒等高特异性、高亲和力分离与纯化。但自1990年Tuerk和Ellington分别从约含10¹⁵种寡核苷酸分子的文库中筛选出RNA型核酸适配体以来，抗体技术受到巨大挑战。核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)经体外筛选得到的一段短的单链寡核苷酸序列，它通过链内某些互补碱基间的配对和静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构，如发夹、假结、凸环、G2四分体等，通过空间构型互补与配体分子高亲和力、高特异性地结合。例如，茶碱在哮喘、支气管炎和肺气肿的治疗中常用作支气管扩张药物，易引起中毒，与血清中的咖啡因(两者结构上只相差一个甲基)难以区分。Jenison等从RNA库中分离得到茶碱适配体，与茶碱的亲和力比咖啡因高10000倍以上(Jenison R.D.,Gill S.C.,Pardi A.,and Polisky B.1994.Science 263:1425-1429.)；Sazani等筛选得到的三磷酸腺苷(ATP)RNA适配体与ATP的亲和力比二磷酸腺苷(ADP)高64倍，比单磷酸腺苷(AMP)高1100倍(Sazani P.L.,Larralde R.,and Szostak J.W.2004.J.Am.Chem.Soc.126:8370-8371.)。核酸适配体除具有与抗体一样能与相应配体高效、专一结合的特点外，还具有以下优点：易化学修饰；体外筛选，化学合成，容易获取，成本低；稳定性好，可复性；目标分子范围广。适配体通过SELEX技术从随机寡核苷酸库筛选得到，加之单链核酸形成三维结构的多样性和适配体与配体之间相互作用力的多样性，理论上自然界中的绝大多数物质都能够筛选到相应的适配体(Burgstaller P.,Girod A.,and Blind M.2002.Drug Discovery Today 7:1221-1228.)，目前已报道的配体范围相当广泛，有小分子(Ferapontova E.E.,Olsen E.M.,and Gothelf K.V.2008.J.Am.Chem.Soc.130:4256-4258.)、糖类(Jeong S.,Eom T.,Kim S.,Lee S.,and YuJ.2001.Biochem.Biophys.Res.Commun.281:237-243.)、氨基酸(Famulok M.1994.J.Am.Chem.Soc.116:1698-1706.)、核苷酸(Zhang S.S.,Xia J.P.,and Li X.M.2008.Anal.Chem.80:8382-8388.)、肽(Davis J.J.,TkacJ.,Laurenson S.,and Ferrigno P.K.2007.Anal.Chem.79:1089-1096.)、蛋白质(Yigit M.V.,Mazumdar D.,andLu Y.2008.Bioconjugate Chem.19:412-417.)、甚至整个细胞(Hamula C.L.A.,Zhang H.Q.,Guan L.L.,Li X.F.,and Le X.C.2008.Anal.Chem.80:7812-7819.)。

核酸适配体在分析化学领域的应用已成为国内外研究者关注的焦点。适配体在化学修饰后作为配基可固定在各种材料表面，如金属、硅胶、玻璃、磁性微球、石墨烯、量子点等，应用于各类分离技术，包括液相色谱、亲和色谱、毛细管电泳、毛细管电色谱、生物传感器及原子力显微镜等。例如，Kim等利用内置核酸适配体的脂质体选择性地除去自来水中的污染物(如双酚A，17β-雌二醇，氧四环素)(Kim Y S,NiaziJ H,Chae Y J,et al.Macromol.Rapid Commun.,2011,32(15):1169-1173)。等将核酸适配体6H7和6H5共价键合的方式固载到磁珠上，实现了大肠杆菌溶解物中组氨酸标记蛋白的分离纯化(,Walter J G,Shoham Y,et al.Biotechnol.Bioeng.,2011,108(10):2371-2379)。Hu等将适配体键合到色谱柱上制备了可以除去饮用水中痕量药物(如可卡因，双氯芬酸)适配体亲和色谱柱(Hu X,Mu L,Zhou Q,et al.Environ.Sci.Technol.,2011,45(11):4890-4895)。He等将核酸适配体键合至DNA诱导水凝胶上制备了可逆适配体-目标物识别和DNA杂交选择性分离ATP和凝血酶(He X,Wei B,Mi Y.Chem.Commun.,2010,46(34):6308-6310)。Yasun等[89]将适配体键合到纳米金棒上对凝血酶进行富集(Yasun E,Gulbakan B,Ocsoy I,et al.Anal.Chem.,2012,84(14):6008-6015)。

发明内容

本发明针对前文所述的SPME涂层种类较少、选择性不高及生物样品兼容性较差等问题，将核酸适配体亲合力高、特异性强、生物样品相容性好等特性与SPME技术耗时少、效率高、操作简单等优点结合在一起，在硅烷化石英毛细管内表面修饰一层纳米金粒子，通过化学键合方法将核酸适配体固定到纳米金表面，研制一种基于核酸适配体/纳米金修饰的石英毛细管新型管内SPME萃取头，用于复杂生物样品中痕量、超痕量生物碱、抗生素或核苷酸类物质的高选择性分离与富集。

本发明通过以下过程实现：

一种新型核酸适配体/纳米金修饰固相微萃取石英毛细管的制备方法，其步骤依次如下：

(1)采用经典柠檬酸钠还原法制备粒径均一、稳定的纳米金胶体溶液；

(2)对空心石英毛细管内表面进行食人鱼碱洗及活化处理，然后用氨基硅烷化试剂进行硅烷化处理；

(3)取一定量所述纳米金胶体溶液于试剂瓶中，通过虹吸法使其流经步骤(2)硅烷化后所得的石英毛细管，使所述石英毛细管内表面涂渍纳米金粒子；

(4)上述键合反应一定时间后，取出所述石英毛细管，去离子水冲洗干净，通氮气除氧，取一定量的双头巯基-乙醇溶液于试剂瓶中，使其流经步骤(3)所得的纳米金单次修饰的石英毛细管，使纳米金粒子表面修饰上巯基；

(5)取一定量纳米金胶体溶液于试剂瓶中，使其流经步骤(4)巯基处理后所得的石英毛细管，通过巯金键使纳米金粒子再次修饰石英毛细管内表面，室温下键合反应一定时间，取出石英毛细管，用蒸馏水清洗，氮气吹干；

(6)取一定量的经活化处理后的腺苷核酸适配体溶液于试剂瓶中，使其流经步骤(5)处理后所得的石英毛细管，室温下键合反应一定时间，用缓冲液清洗并填充适配体缓冲溶液低温保存。

具体来说，经典柠檬酸钠还原法指的是，三颈烧瓶中加入氯金酸溶液，加冷凝管回流，高速搅拌下加热煮沸，快速加入柠檬酸钠水溶液，继续煮沸至溶液变成深红色后，停止加热，继续搅拌，使其冷却至室温，得到纳米金胶体溶液。

具体来说，所述氨基硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。

具体来说，本发明以纳米金作为键合剂，利用纳米金通过化学键合链接石英毛细管内表面的氨基及核酸适配体端基上修饰的巯基。

进一步来说，步骤(3)所采用的键合条件：纳米金粒径15nm，键合时间为24h。核酸适配体键合缓冲液为Tris-HCl缓冲液，核酸适配体溶液浓度为0.205μmol/L，适配体键合时间为72h。

进一步来说，选用三(2-氯乙基)磷酸酯活化处理巯基修饰的核酸适配体，以打断双硫键降低DNA的二聚化；经活化后的核酸适配体通过巯金键固定到纳米金粒子表面，适配体键合条件：核酸适配体键合缓冲液为Tris-HCl缓冲液(20mmol/L tris-HCl,pH＝7.4)，适配体键合时间为72小时。

石英毛细管内表面均匀平滑，表面积小，不利于核酸适配体的键合。本发明对石英毛细管内表面进行化学改性及硅烷化处理后，通过化学键合的方式在石英毛细管内表面均匀覆盖一层纳米金，利用纳米金优良的生物兼容性及高比表面积，显著提高核酸适配体在石英毛细管内表面的键合量。

核酸适配体载体有石英纤维、水凝胶、脂质体、胶团、磁性微球、金属、硅胶、玻璃、量子点等材料，固载方法有多聚物包埋、物理吸附、直接自组装、间接自组装等，但普遍存在固载率较低、固载不牢固、适配体易流失、材料易破损等问题。本发明选用石英毛细管为载体材料，采用纳米金作为链接剂，通过化学键合方式链接3-氨丙基三乙氧基硅烷的氨基基团与核酸适配体末端修饰的巯基基团，将核酸适配体共价键合固载于石英毛细管内表面，制备得到新型核酸适配体/纳米金修饰的石英毛细管SPME萃取头。

附图说明

图1.核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管制备过程中石英毛细管内表面化学处理及硅烷化的示意图。

图2.核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管制备过程中纳米金修饰石英毛细管的制备的示意图。

图3.核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管制备过程中纳米金表面键合核酸适配体的示意图。

图4.纳米金的放大倍数为40K的透射电子显微镜照片。

图5.纳米金的放大倍数为100K的透射电子显微镜照片。

图6.裸石英毛细管的放大倍数为200X的电子显微镜照片。

图7.裸石英毛细管的放大倍数为5.00KX的电子显微镜照片。

图8.纳米金修饰石英毛细管的放大倍数为100X的电子显微镜照片。

图9.纳米金修饰石英毛细管的放大倍数为150KX的电子显微镜照片。

图10.腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管管内SPME(Apt-AuNPs-silica in-tube SPME)、乱序腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管SPME萃取头(SApt-AuNPs-silica in-tube SPME)、纳米金修饰石英毛细管SPME萃取头(AuNPs-silica in-tube SPME)分别萃取1μg/mL腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、β-胸苷、邻甲基苯甲酸标准溶液萃取量对比图。

图11.腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管SPME萃取头萃取不同浓度腺苷标准溶液萃取量曲线。

具体实施方式

本实施以腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管SPME萃取头制备为例，对本发明进行详细描述，但并不以此限定本发明的保护范围。

如图1-3所示，腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管SPME萃取头的制备步骤依次如下：

(1)取内径为0.53mm、长度为1m的空心熔融石英毛细管，采用流动式反应方式用食人鱼碱洗液—30％H₂O₂-H₂SO_4(浓)(1:4，V/V)在60℃条件下清洗1.5h；冷却至室温，依次用去离子水、无水乙醇彻底清洗干净，氮气吹干，置于烘箱内120℃活化2h，除去其表面吸附的水分。石英毛细管活化脱水后从烘箱中取出，立即用硅烷化试剂[10％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液]硅烷化处理，室温下反应4h，无水乙醇冲洗三次，去离子水冲洗三次，氮气吹干；硅烷化处理后的石英毛细管置于120℃老化2h。

(2)取一洁净小试剂瓶，加入2.0mL纳米金胶体溶液，采用流动式反应方式将纳米金胶体溶液与老化处理后的石英毛细管室温下单次化学键合24h，之后用蒸馏水冲洗干净，除去表面物理吸附的纳米金胶体溶液，氮气吹干；立即用双头巯基[5％(v/v)1,2-乙二硫醇乙醇溶液]修饰处理，室温下反应3h；用无水乙醇冲洗干净，去离子水冲洗3次，氮气吹干；为提高石英毛细管内表面纳米金粒子的覆盖率，纳米金胶体溶液与巯基修饰的石英毛细管室温下进行第二次键合24h，再用蒸馏水冲洗干净，除去表面物理吸附的纳米金胶体溶液，氮气吹干。

(3)取410μL 5μmol/L腺苷适配体储备液(Tris-HCl缓冲液溶解，20mmol/L Tris-HCl,pH＝7.4)于一个1.5mL的离心试管中，加入410μL 500μmol/L TCEP溶液(Tris-HCl缓冲液溶解，20mmol/L Tris-HCl,pH＝7.4)，室温摇床摇动1h，打断双硫键降低DNA的二聚化。

(4)在干燥洁净试剂瓶中加入889L 0.205μmol/L腺苷适配体标准溶液(Tris-HCl缓冲液溶解，20mmol/L Tris-HCl，pH＝7.4)，室温下流动式键合反应48h，用Tris-HCl缓冲溶液冲洗3次，得到腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管SPME萃取头。

本实施案例制备的腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管SPME萃取头具有以下优点：

1.采用食人鱼碱对石英毛细管内表面化学处理及氨基硅烷化处理，通过氮金键修饰纳米金粒子，再以纳米金粒子为载体通过巯金键键合双头巯基并进行纳米金二次键合，制备得到的石英毛细管内表面纳米金涂层均匀、致密(如图9所示)；最后通过巯金键键合巯基修饰的腺苷核酸适配体，增强适配体键合强度及密度，延长石英毛细管长度，使适配体键合量相比于纤维式SPME萃取头提高2-3个数量级。实验测试结果表明，纳米金平均键合量为26.4μg(石英毛细管长15cm)，相对标准偏差为3.9％(n＝10)。腺苷核酸适配体平均化学键合率为96.1％，适配体键合量达到2.45μg(石英毛细管长27cm)，相对标准偏差为0.21％(n＝6)，该制备方法重现性高、稳定性好。

2.如图10所示，本发明制备的腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管SPME萃取头对腺苷具有很高的选择性萃取能力。腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管对腺苷的萃取量为40.3ng，而对其结构类似物如鸟苷、尿苷、胞苷、β-胸苷等萃取量仅为2.1～14.3ng，对腺苷萃取量为其他结构类似物的3～20倍。相比之下，乱序腺苷核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管以及未经腺苷修饰的纳米金修饰石英毛细管对腺苷及其他5种结构类似物的萃取选择性较差，萃取量分别为1.8～3.4ng、0.9～2.1ng。这表明腺苷适配体/纳米金修饰石英毛细管对特定目标分子腺苷有很高的选择性分离富集能力，适用于复杂样品中痕量腺苷分子的快速分离与富集。

Claims (6)

1.一种核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管的制备方法，其步骤依次如下：

(1)采用柠檬酸钠还原法制备得纳米金胶体溶液；

(2)对石英毛细管内表面进行食人鱼碱洗及活化处理，然后采用氨基硅烷化试剂进行硅烷化处理；

(3)取所述纳米金胶体溶液，使其流经步骤(2)硅烷化后所得的石英毛细管，悬停后在石英毛细管内表面涂渍纳米金粒子，反应后取出石英毛细管，去离子水冲洗干净，通氮气除氧；

(4)取二硫代乙二醇溶液，使其流经步骤(3)所得的纳米金单次修饰的石英毛细管，在纳米金粒子表面修饰巯基；

(5)取所述纳米金胶体溶液，使其流经步骤(4)巯基处理后所得的石英毛细管，悬停后通过巯金键使纳米金粒子再次修饰所述石英毛细管的内表面，室温下键合反应后，用蒸馏水清洗，氮气吹干；

(6)取核酸适配体溶液通过步骤(5)处理后所得的石英毛细管，室温下键合反应后，用缓冲液清洗，氮气吹干，低温保存。

2.如权利要求1所述的核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管的制备方法，其特征在于：石英毛细管内表面第一次化学键合修饰纳米金粒子后，经过二硫代乙二醇溶液改性再进行第二次纳米金粒子化学键合修饰。

3.如权利要求1所述的核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)的核酸适配体选用三(2-氯乙基)磷酸酯活化处理巯基修饰。

4.如权利要求1所述的核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管的制备方法，其特征在于：所述核酸适配体溶液浓度为0.205μmol/L，适配体键合时间为72h。

5.如权利要求1所述的核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管的制备方法，其特征在于，所述核酸适配体键合条件：核酸适配体键合缓冲液为Tris-HCl缓冲液(20mmol/L tris-HCl,pH＝7.4)，适配体键合时间为72小时。

6.如权利要求1所述的核酸适配体/纳米金修饰石英毛细管的制备方法，其特征在于：石英毛细管内表面化学处理方法：60℃条件下用30％H₂O₂-H₂SO_4(浓)(1:4,V/V)溶液流动式清洗1.5小时。