CN103990423A - 一种单链dna核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法 - Google Patents
一种单链dna核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种单链DNA核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球的制备方法，按以下步骤进行：(1)采用化学共沉淀法得到Fe3O4磁性纳米粒子；(2)采用溶胶凝胶法得SiO2/Fe3O4磁性微球；(3)得-NH2基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球；(4)将-NH2基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球分散于水中，得-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球；(5)将-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球分散于Tris-HCl缓冲溶液中，得核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析测试仪器领域，具体涉及一种单链DNA核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球的制备方法。
背景技术
现代分析化学所涉及的样品以气、液、固相多相形式存在，组成复杂，而且在测定时往往相互干扰，同时分析物较低的浓度、较差的稳定性也给分析检测带来了一系列的困难。尤其是环境和生物样品，都要进行样品前处理才能进一步测定。在一个完整的样品分析过程中，样品前处理所需时间最长，约占整个分析时间的2/3。因此，样品前处理新技术与新方法的探索已成为现代分析化学领域的重要课题和发展方向之一。高效、快速、绿色的样品前处理技术不仅省时省力，而且可以减少多次操作带来的实验误差，同时也可避免使用大量有机溶剂而减少对环境的污染。
核-壳结构磁性复合材料是近年来发展起来的一种新型材料，其独特的结构和磁性能，使其在信息存储、生物、医学以及环保等领域都具有广泛的应用前景。磁性复合材料中的磁性物质大多为氧化物磁性材料或金属磁性材料，相比其它磁性纳米材料，Fe3O4纳米材料不仅制备价格低廉，工艺简单，饱和磁化强度高，而且对人体不产生毒副作用，无免疫原性，可随人体代谢排出体外，基于以上特点Fe3O4纳米材料在生物、临床诊断方面体现出其它材料无可比拟的优势。磁性纳米微粒壳层材料大致包括表面活性剂、无机材料、高分子材料和生物大分子材料四大类。其中无机材料包覆的微粒的粒径小，分布更均匀。常用的无机材料有SiO2、金以及碳。SiO2具有良好的化学惰性、生物相容性以及胶体稳定性等特点，因此常常被用来包覆各种磁性纳米粒子。制备好的核-壳结构磁性粒子也可通过各种表面物理修饰和表面化学修饰来扩展其应用前景。
核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)经体外筛选得到的一段短的单链寡核苷酸序列（DNA或RNA），能与靶分子高特异性、高亲和力结合。经SELEX技术筛选得到的适配体，与抗体相比具有以下突出优点：(1)适配体的筛选是通过体外过程完成的，不依赖于细胞或动物，其特性可根据需要而改变；(2)适配体可通过化学合成来制备，具有很高的精确性和重复性；(3)适配体具可逆变性，变性后的适配体能在数分钟之内复原，并能长期储存和在常温下运输。目前，SELEX技术已成功筛选出300种以上能够与目标分子结合的适配体，如生长因子、抗体、抗生素、病原体以及细胞等的适配体。核酸适配体通过氢键、静电作用、范德华力、碱基互补配对等分子内的相互作用，可形成多种特定的空间结构，与目标分子产生特异性的结合。例如，Penner小组筛选出可特异性识别赭曲霉素A的DNA适配体，构建了DNA适配体亲和柱用于检测小麦样品中的赭曲霉素A，该DNA适配体对赭曲霉素A具有高选择性，而对于赭曲霉素A结构类似物丙酮苄羟香豆素及N-乙酰苯丙氨酸没有识别能力(Cruz-Aguado J A,Penner G.Determination of ochratoxin A with a DNA aptamer[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(22):10456?10461)。Geiger A等人利用反淘汰法分离抗精氨酸适配体时采用D-精氨酸对映体筛选出来的适配体显示出的对映选择性值高达10000。(Geiger A,Burgstaller P,von der Eltz H,et al.RNA aptamersthat bind L-arginine with sub-micromolar dissociation constants and high enantioselectivity[J].Nucleic acidsresearch,1996,24(6):1029?1036)。
基于适配体高亲和力、强特异性以及相对于抗体/抗原传统生物识别体系的众多优点，其应用成为人们关注的焦点。适配体通过化学修饰后可固定在各种材料表面，如玻璃、磁性微球、金属、硅胶、量子点等，应用于各类分离技术，包括生化分析、生物传感器、适配子信标、毛细管电泳、亲和色谱、生物质谱、流式细胞分析、荧光偏振分析、靶向治疗等。例如，Mccauley等发展了一种基于适配体的荧光偏振生物传感器，可同时对多个蛋白样品进行检测(McCauley T G,Hamaguchi N,Stanton M.Aptamer-based biosensor arraysfor detection and quantification of biological macromolecules[J].Analytical biochemistry,2003,319(2):244?250)；Tan课题组采用核酸适配体修饰的微流控通道实现了对癌细胞的分离纯化，其捕获效率达到80%(Xu Y,Phillips J A,Yan J,et al.Aptamer-based microfluidic device for enrichment,sorting,and detection ofmultiple cancer cells[J].Analytical chemistry,2009,81(17):7436?7442)。
发明内容
针对传统样品前处理技术在选择性、稳定性及生物样品兼容性等方面存在的问题，本发明将微球材料高比表面积、核酸适配体强特异选择性与磁性微球外磁场作用下快速定向分离等优点结合在一起，制备一种单链DNA核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球。该微球可实现复杂生物样品中生物碱、抗生素或核苷酸类小分子物质高效、高选择性分离与富集，清除样品基体干扰，从而降低检出限，提高分析的准确性和精度。
一种单链DNA核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法，按以下步骤进行：
（1）采用化学共沉淀法合成四氧化三铁（Fe3O4）纳米微粒，用油酸对其改性，得到粒径均一、分散性好并具有超顺磁性的Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）采用溶胶凝胶法对步骤（1）制得的Fe3O4磁性纳米粒子进行二氧化硅（SiO2）包覆，得到粒径均匀、分散性好并具有超顺磁性的SiO2/Fe3O4磁性微球；
（3）将步骤（2）制得的SiO2/Fe3O4磁性微球分散于无水乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，对磁性微球表面进行氨基改性，得到-NH2基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球；
（4）将步骤（3）制得的-NH2基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球分散于水中，加入二乙基三胺五乙酸(DTPA)，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作用下，通过酰胺反应，得到-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球；
（5）将步骤（4）制得的-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球分散于Tris-HCl缓冲溶液中，加入EDC、NHS及核酸适配体溶液，室温反应后，磁分离后用Tris-HCl溶剂多次清洗，磁分离，得到核酸适配体修饰的SiO2/Fe3O4磁性微球，分散于Tris-HCl溶剂中保存。
具体地，所述步骤（2）中对Fe3O4进行二氧化硅包覆是通过正硅酸乙酯(TEOS)在氨水的弱碱性条件下水解生成SiO2包覆在Fe3O4表面，量取4mLFe3O4磁性纳米粒子流体倒入盛有50mL正丙醇的烧杯中，超声15min后转移到250mL三口烧瓶中，搅拌，分别加入5mL氨水及2mL TEOS继续搅拌反应。优选地，所述步骤（2）中所采用的反应条件为：所述TEOS用量为1～5mL，反应时间为3～24h，反应温度为30～70℃，搅拌速度为100～600rpm，TEOS加入方式为迅速加入、间隔10min、间隔20min或逐滴加入。更进一步，步骤2中所采用的SiO2包覆条件为：所述TEOS用量为2mL，反应温度为30℃，搅拌速度为400rpm，TEOS加入方式为间隔10min加入，反应时间为12h。
优选地，步骤（5）中所采用的适配体键合条件为：反应溶剂为10mmol/L的PBS缓冲液(0.1mol/L NaCl、10mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4、5mmol/L MgCl2、pH=7.4)、10mM/L TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、5mmol/L MgCl2、pH=7.4)、20mmol/L Tris缓冲液(20mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2、pH7.4)或超纯水，反应溶剂pH为4.5～8.5，EDC/NHS比例为1:4～8:1，键合时间为0.5～30h。进一步地，步骤（5）所采用的核酸适配体化学键合条件为：反应溶剂为20mmol/L Tris缓冲液，反应溶剂pH为5.5，EDC/NHS比例为4:1，键合时间为45min。
SiO2/Fe3O4磁性微球易于制备，其比表面积大，磁性强，并且SiO2有很好的生物相容性，易于功能化改性，将SiO2/Fe3O4磁性离子表面经过羧基改性后通过化学键合的方法将核酸适配体固载在表面上，能够克服物理吸附固载率低、易脱落、不稳定等缺点，且显著提高核酸适配体固载量和磁性微球富集效率。
为了能更清晰的理解本发明，以下将结合附图说明阐述本发明的具体实施方式。
附图说明
图1为核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球制备过程示意图。
图2为SiO2/Fe3O4磁性微球的透射电子显微镜照片，放大倍率为8000。
图3为SiO2/Fe3O4磁性微球的透射电子显微镜照片，放大倍率为30000。
图4为Fe3O4(a)和SiO2/Fe3O4(b)磁性微球能谱定量分析谱图。
图5为Fe3O4(a)和SiO2/Fe3O4(b)磁性微球的磁滞回线图。
图6为腺苷及其结构类似物鸟苷、尿苷、胞苷、β-胸苷分子结构式。
图7为腺苷核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球(Apt-SiO2/Fe3O4MNPs)、乱序核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球(SApt-SiO2/Fe3O4MNPs)、-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球(COOH-SiO2/Fe3O4MNPs)萃取1μg/mL腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、β-胸苷标准溶液萃取量对比图。
图8为腺苷核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球萃取不同浓度腺苷标准溶液萃取量曲线。
具体实施方式
本实施例以腺苷靶标分子为例，对本发明进行详细地描述，但并不以此限定本发明的保护范围。
如图1所示，单链DNA核酸适配体-SiO2/Fe3O4磁性微球的制备方法如下：
（1）准确称量14.04g FeCl3·6H2O及7.19g FeSO4·7H2O，用60mL煮沸后冷却的去离子水溶解，倒入500mL三口烧瓶中，用90mL煮沸后冷却的去离子水洗涤烧杯并全部转移到三口烧瓶中，机械搅拌，通氮除氧10min。将三口烧瓶转移入90℃水浴锅中，用分液漏斗逐滴加入40mL25%的氨水，之后恒定速率0.5mL/min将5mL油酸滴入烧瓶中，恒温搅拌1h。将得到的磁流体置于磁铁上沉降20min后倒掉上层液，用去离子水超声清洗磁分离。最后将剩余的磁流体稀释为60mL。
（2）量取4mL步骤（1）制得的磁流体倒入盛有50mL正丙醇的烧杯中，超声15min后转移到250mL三口烧瓶中，搅拌，分别加入5mL氨水及1mL正硅酸乙酯(TEOS)，10min后再次加入1mL TEOS，在30℃、400rpm条件下搅拌反应12h。之后将用无水乙醇将微球多次洗涤磁分离，60℃真空干燥得到SiO2/Fe3O4磁性微球。
（3）称取0.5g步骤（2）制得的SiO2/Fe3O4磁性微球，置于75mL无水乙醇中，超声分散，转移到三口烧瓶中，加入1mL APTES，60℃、400rpm条件下冷凝回流6h，混合液用无水乙醇清洗，磁分离，60℃真空干燥得-NH2基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球。
（4）称取0.5g步骤（3）制得的-NH2基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球，分散于100mL3.5g/L二乙烯三胺五乙酸溶液(pH=6.0)中，转移到250mL三口烧瓶中，加入0.04g NHS、0.15g EDC，室温下400rpm搅拌反应12h。混合液用0.5mol/L NaOH溶液清洗3次后，去离子水多次清洗次，磁分离，60℃真空干燥得-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球。
（5）在100mL小烧杯中加入0.2420g Tris、0.5844g NaCl，用20mL超纯水溶解后，用0.1mol/L HCl调节pH至7.4，倒入100mL容量瓶中，加水至刻度，配成20mmol/L Tris-HCl溶液。在20mL试剂瓶中加入5mg步骤（4）制得的-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球、0.75mL Tris-HCl溶液，超声10min，加入1.2mL EDC(5mmol/L)和NHS(2mmol/L)混合溶液活化10min，之后加入50μL腺苷适配体溶液(66μg/mL)，25℃下振荡反应45min。磁分离，用Tris-HCl溶液清洗3次，得到核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球。
本实施例制备单链DNA核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球的制备方法具有以下优点：
（1）采用化学键合方法，通过-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球与适配体氨基端基发生酰胺反应制备的核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球，呈规则球形，粒径均一，平均粒径为400nm左右，见图2和图3，其元素组成与能谱分析结果相符合，见图4，且具有较强的磁响应性及超顺磁性，见图5。同一批次磁性微球适配体平均化学键合率为98.4%，适配体键合量达到3.25μg（5mg磁性微球），相对标准偏差为0.4%(n=6)，而采用物理吸附方法时适配体平均固载率仅为0.8%。不同批次磁性微球适配体平均化学键合率为99.4%，适配体键合量为3.28μg（5mg磁性微球），相对标准偏差为0.6%(n=6)，该方法重现性高、稳定性好。
（2）以-COOH基修饰SiO2/Fe3O4微球、乱序腺苷适配体修饰SiO2/Fe3O4微球为对照，研究腺苷适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球对腺苷及4种腺苷结构类似物（鸟苷、尿苷、胞苷、β-胸苷，分子结构式如图6所示）的萃取选择性，腺苷及4种腺苷结构类似物分别配成1μg/mL标准溶液。其结果如图7所示：腺苷核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4微球对腺苷的萃取量为36.9ng，而对鸟苷、尿苷、胞苷、β-胸苷的萃取量仅为2.8～5.4ng，腺苷萃取量为其他4种结构类似物的6～14倍，腺苷萃取容量达到45.8ng，见图8。相比之下，乱序腺苷核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4微球对腺苷及其他4种结构类似物的萃取量仅为3.1～4.1ng，-COOH基修饰SiO2/Fe3O4微球对腺苷及其他四种结构类似物的萃取量范围仅为2.1～2.8ng。这表明腺苷适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球对特定目标分子腺苷有很高的选择性，适用于复杂样品中痕量腺苷的快速分离与富集。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型。
Claims (3)
1.一种单链DNA核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行：
（1）采用化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子，用油酸对其改性，得到粒径均一、分散性好并具有超顺磁性的Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）采用溶胶凝胶法对步骤（1）制得的Fe3O4磁性纳米粒子进行SiO2包覆，得到粒径均匀、分散性好并具有超顺磁性的SiO2/Fe3O4磁性微球；
（3）将步骤（2）制得的SiO2/Fe3O4磁性微球分散于无水乙醇中，加入APTES，对磁性微球表面进行氨基改性，得到-NH2基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球；
（4）将步骤（3）制得的-NH2基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球分散于水中，加入DTPA，在EDC和NHS作用下，通过酰胺反应得到-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球；
（5）将步骤（4）制得的-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球分散于Tris-HCl(20mmol/L tris,100mmol/LNaCl,5mmol/L MgCl2)缓冲溶液中，加入EDC、NHS及核酸适配体溶液，室温下反应后，磁分离后用Tris-HCl溶剂多次清洗，磁分离，得到核酸适配体修饰SiO2/Fe3O4磁性微球，分散于Tris-HCl溶剂中保存。
2.如权利要求1所述单链DNA核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法，其特征在于：以SiO2/Fe3O4磁性微球为底材，表面通过化学键合修饰核酸适配体。
3.如权利要求1所述单链DNA核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球键合适配体的条件为，-COOH基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球用量为50mg；键合溶剂为Tris-HCl缓冲溶液(20mmol/L tris,100mmol/L NaCl,5mmol/LMgCl2,pH=5.5)，用量为0.75mL；EDC/NHS混合液用量为1.2mL，EDC浓度为6～10mmol/L，NHS浓度为1～4mmol/L；核酸适配体溶液浓度为66μg/mL，用量为50～200μL。
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