CN103293295A - 检测hbv的磁性生物探针、试纸条及其制备和使用方法 - Google Patents
检测hbv的磁性生物探针、试纸条及其制备和使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103293295A CN103293295A CN2013101659064A CN201310165906A CN103293295A CN 103293295 A CN103293295 A CN 103293295A CN 2013101659064 A CN2013101659064 A CN 2013101659064A CN 201310165906 A CN201310165906 A CN 201310165906A CN 103293295 A CN103293295 A CN 103293295A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hbv
- magnetic
- magnetic nanoparticle
- washing
- nanoparticle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
Abstract
本发明公开了用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针、试纸条及其制备和使用方法。该生物探针的制备方法为：对粒径为50-300nm的磁性纳米颗粒进行表面氨基化处理，再进行羧基化处理，在缓冲液中将表面羧基化的磁性纳米颗粒、碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合反应，洗涤，得反应物A；在偶联缓冲液中将反应物A和HBV标记物的抗体混合反应，得反应物B；将反应物B与含氨基的化合物的溶液混合反应，洗涤，即得。该生物探针特异性强，信号灵敏且稳定性好，根据所选择的靶向标记物及其配套的抗体，适用于多种乙肝标记物的检测。该试纸条可经肉眼观察和MAR检测得到的磁信号进行二次判定，能够大大减少人为误差，准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术与纳米材料技术领域，尤其涉及一种用于乙型肝炎病毒检测的磁性纳米颗粒生物探针、磁性免疫层析试纸条及其制备方法和使用方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（简称HBV）感染机体后所引起的疾病。乙型肝炎病毒是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。据世界性卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致肝肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌（HCC）。我国于2006年进行的乙型肝炎流行病毒调查结果表明，我国1-59岁人群乙肝表面抗原携带率为7.18%，5岁以下儿童的HBsAg携带率仅为0.96%，据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中有症状需要治疗的活动性乙型肝炎患者约为2000多万。
乙型肝炎是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的重大传染病，HBV携带者有1.3亿以上，其中10%以上转为慢性肝炎，部分演变为肝硬化，进而引发肝癌。因此，对HBV在体内是否有复制的准确判断及抗病毒治疗后的准确监测就显得特别重要。
乙肝核心抗原（HBcAg）存在于乙肝病毒颗粒中，而不是以游离状态存在于血液中，是乙肝病毒活动的直接指标。但长期以来，临床医生是根据“两对半”五种试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情，根据HBV-DNA PCR荧光定量试剂盒对血清乙肝病毒DNA测定了解药物疗效。但“两对半”试剂不能很好的反映乙肝病毒的存在状况，不能定量。
HBV-DNA定量PCR检测是目前HBV诊断的金标准，但是该技术对实验操作人员的技术要求高以及实验成本高、耗时长（一般需要3天以上才能得到检测结果），使其在所有医院的推广使用受到了限制，而HBV核心抗原和前S1抗原都出现在急性HBV感染的最早期，目前被认为是乙肝病毒存在和复制的标志，而且与HBV-DNA复制水平高度正相关，因此HBV核心抗原和前S1抗原的联合检测可以相互补充，对于乙型肝炎诊断、治疗和预后等方面具有重要的临床指导意义。
磁性纳米材料是以具有超顺磁性的铁氧化物（多为四氧化三铁）为内核，以氧化硅为壳层，当该铁氧化物颗粒体积减小到某一数值时，热扰动能将与总的磁晶各向异性能相当，这样，颗粒内的磁矩方向就可能随着时间的推移，整体保持平行地在一个易磁化方向和另一个易磁化方向之间反复变化。从单畴颗粒集合体看，就具有超顺磁性。在单畴颗粒集合体出现超顺磁性的温度范围内，分别在不同的温度下测量其磁化曲线，这些磁化曲线必定是重合在一起的。且不会出现磁滞，即集合体的剩磁和矫顽力都为零。这种超顺磁性也是磁性纳米材料的生物医学应用的基本保障。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于克服了“两对半”试剂不能很好的反映乙肝病毒的存在状况，不能定量检测HBV，而HBV-DNA定量PCR检测实验成本高、耗时长的缺陷，提供一种用于乙型肝炎病毒检测的磁性纳米颗粒生物探针及其制备方法，以及一种用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条及其制备方法和使用方法。本发明的磁性纳米颗粒生物探针特异性强，信号灵敏且稳定性好。本发明的磁性免疫层析试纸条既可以实现对乙肝单一标记物的检测，也可以实现对乙肝多种标记物的检测，并且能够通过定量的磁信号实现快速检测HBV。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针的制备方法，其包括下述步骤：（1）对粒径为50-300nm的磁性纳米颗粒进行表面氨基化处理，得表面氨基化的磁性纳米颗粒；对所述表面氨基化的磁性纳米颗粒进行羧基化处理，得表面羧基化的磁性纳米颗粒；（2）在缓冲液中将所述表面羧基化的磁性纳米颗粒、碳化二亚胺（EDC，又称碳二亚胺）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合反应，反应后洗涤，得反应物A；（3）在偶联缓冲液中将所述反应物A和HBV标记物的抗体混合反应，得反应物B；（4）将所述反应物B与含氨基的化合物的溶液混合反应，反应后洗涤，即得。
步骤（1）中，所述的磁性纳米颗粒可为纳米材料领域中常规的磁性纳米颗粒。所述的磁性纳米颗粒具有超顺磁性。所述磁性纳米颗粒的比饱和磁化强度较佳地在25-45emu/g。所述的磁性纳米颗粒较佳地为具有核壳结构的磁性粒子/氧化硅复合材料，即：所述的磁性纳米颗粒的内核为磁性粒子，所述的磁性纳米颗粒的壳层为氧化硅。所述的磁性粒子较佳地为铁氧化物，如四氧化三铁。所述磁性粒子/氧化硅复合材料的壳层的厚度较佳地为5-50nm。
其中，所述的磁性粒子可按现有文献制备，例如：Magnetite NanocrystalClusters with Ultra-High Sensitivity in Magnetic Resonance Imagin（Fangjie Xu，Changming Cheng，Du-Xing Chen，Hongchen Gu，Chemphyschem，2012，13，336-341）。所述的磁性粒子/氧化硅复合材料可按现有文献制备，例如：Synthesis of Magnetic Microspheres with Immobilized Metal Ions for Enrichmentand Direct Determination of Phosphopeptides by Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization Mass Spectrometry（Xiuqing Xu，Chunhui Deng，MingxiaGao，Wenjia Yu，Pengyuan Yang，and Xiangmin Zhang，Advanced Materials，2006，18，3289-3293.）。
本发明中，所述的磁性纳米颗粒优选采用下述方法制得：
1）用溶剂热法制备磁性粒子：将无机铁盐、稳定剂和乙二醇混合，于180-220℃下反应8-24小时，洗涤，即得磁性粒子；所述的稳定剂为柠檬酸钠或聚丙烯酸（PAA）；其中，所述的洗涤较佳地是在磁分离的辅助下用乙醇和/或去离子水洗涤多次；其中，所述的溶剂热法为本领域常规的制备磁性粒子的方法；按本领域常识，所述的反应在弱碱性条件下进行，当所述的稳定剂为聚丙烯酸时，在所述的混合时较佳地还添加尿素以控制反应体系的pH值；
2）氧化硅包被磁性粒子：将所述磁性粒子和0.8-1.2mol/L的强酸溶液混合，超声10-40分钟，在磁分离的辅助下用去离子水洗涤5-7次，得活化后的磁性粒子；将所述活化后的磁性粒子和醇水混合液混合，在搅拌状态下加入碱和正硅酸烷基酯，所述正硅酸烷基酯的用量为20-500μL/100mg所述磁性粒子，所述的碱使混合后体系的pH值在8.0-10.5，反应8-24小时，在磁分离的辅助下用醇洗涤3-5次，即得；所述醇水混合液中的醇水比例为60:40-90:10。其中，所述的强酸为本领域常规使用的酸，一般为盐酸；其中，所述的碱为本领域常规使用的碱，较佳地为NH3·H2O；所述的醇水混合液中的醇可为本领域常规使用的任意醇；所述的醇可为本领域常规使用的醇，较佳地为乙醇。按本领域常识，所述的正硅酸烷基酯可以分多批添加，例如，可以在反应初期加入部分，在反应一段时间后加入剩余部分。
步骤（1）中，所述的表面氨基化处理的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述的表面氨基化处理较佳地采用硅烷偶联剂进行。本发明中，所述的表面氨基化处理优选按照下述操作进行：将所述的磁性纳米颗粒与醇水混合液混合，调节pH值至8.0-11.0，得混合液C；再将所述混合液C与氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）混合，所述氨丙基三乙氧基硅烷的用量为15-50μL/15mg所述磁性纳米颗粒，搅拌1-3小时后，于60-85℃下继续搅拌2-4h，洗涤后即得表面氨基化的磁性纳米颗粒。其中，所述醇水混合液可为本领域常规使用的醇水混合液，所述醇水混合液中的醇含量较佳地为60-90v%。所述醇水混合液中的醇较佳地为乙醇。所述调节pH值较佳地采用氨水进行。
步骤（1）中，所述的表面羧基化处理的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述表面羧基化处理较佳地采用酸酐进行。本发明中，所述的表面羧基化处理优选按照下述操作进行：将所述表面氨基化的磁性纳米颗粒、丁二酸酐和溶剂混合，所述丁二酸酐的用量为20-60mg/100mg所述表面氨基化的磁性纳米颗粒，所述的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲亚砜，反应12-36小时，反应后洗涤，即得表面羧基化的磁性纳米颗粒。本发明中，所述表面羧基化的磁性纳米颗粒中的羧基含量较佳地为0.35mmol/g以上，更佳地为0.35-5.0mmol/g。
步骤（2）中，在所述的混合前较佳地还用缓冲液洗涤2-3次，再用缓冲液使所述表面羧基化的磁性纳米颗粒重悬。所述重悬的方法和条件为本领域常规的方法和条件，一般是为了使颗粒在液体中形成胶体溶液。在所述的混合前，所述洗涤时用的所述的缓冲液较佳地为含0.05-1.5v%吐温的2-（N-吗啉代）乙磺酸溶液（简称MEST溶液）。所述重悬后体系的pH值较佳地为4.5-5.5。
步骤（2）中，所述的缓冲液可为本领域常规使用的缓冲液。所述缓冲液的pH值较佳地为4.5-5.5。所述的缓冲液较佳地为含0.05-1.5v%吐温的2-（N-吗啉代）乙磺酸溶液（简称MEST溶液）。
步骤（2）中，所述EDC的用量较佳地为1.2-1.4μmol/1mg所述表面羧基化的磁性纳米颗粒，更佳地为1.25μmol/1mg所述表面羧基化的磁性纳米颗粒。所述NHS的用量较佳地为1.2-1.4μmol/1mg所述表面羧基化的磁性纳米颗粒，更佳地为1.25μmol/1mg所述表面羧基化的磁性纳米颗粒。所述EDC和所述NHS的摩尔比较佳地为1:0.9-0.9:1。
步骤（2）中，所述的反应以反应完全为准。所述反应的时间较佳地为30-60min。
步骤（2）中，在所述的反应后，所述洗涤的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述的洗涤优选按下述操作进行：用含0.05-1.5v%的吐温-20的MEST溶液洗涤2次后，再用硼酸盐吐温溶液（简称BST溶液）洗涤2次。其中，所述的MEST溶液的pH值较佳地为4.5-5.5。
步骤（3）中，所述的HBV标记物的抗体可为生物学领域常规使用的HBV标记物的抗体。所述的HBV标记物较佳地为HBV表面抗原、HBV核心抗原、HBV前S1抗原或HBV e抗原。所述的抗体可以是单克隆抗体（简称单抗）和/或多克隆抗体（简称多抗）。按照本领域常识，所述HBV标记物的抗体的用量相对于所述反应物A是饱和的或者是过量的。
步骤（3）中，所述的偶联缓冲液可为本领域常规使用的偶联缓冲液。所述偶联缓冲液的pH值较佳地为8.8-9.2，更佳地为9.0。所述的偶联缓冲液较佳地为BST溶液。
步骤（3）中，所述的反应以反应完全为准。所述反应的时间较佳地为2-4小时。
步骤（4）中，所述含氨基的化合物的溶液可为生物学领域中常规使用的含有氨基的物质的溶液，较佳地为牛血清白蛋白溶液（BSA溶液）、Tris缓冲液、甘氨酸溶液和多肽溶液中的一种或多种。
步骤（4）中，所述的反应以反应完全为准。所述反应的时间较佳地为30-60min。
步骤（4）中，所述洗涤的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述的洗涤优选按下述操作进行：用BST溶液洗涤2-4次。
本发明还提供了一种由上述制备方法制得的用于乙型肝炎病毒检测的磁性纳米颗粒生物探针，其为一种表面连接有HBV标记物的抗体的磁性纳米颗粒。
本发明中，所述的用于乙型肝炎病毒检测的磁性纳米颗粒生物探针需要在保存液中重悬，于2-8℃下储存。所述的保存液一般可采用所述步骤（4）中所使用的洗涤液。
本发明还提供了一种用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条，其包括一样品垫、一结合垫、一层析膜、一吸水垫和一底板，所述的结合垫上喷点有所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针，所述的层析膜上有一检测线（简称T线）和一质控线（简称C线），所述的样品垫、所述的结合垫、所述的层析膜和所述吸水垫依次衔接于所述的底板上，所述的T线位于靠近所述结合垫的一侧，所述的C线位于靠近所述吸水垫的一侧，所述的T线含有HBV标记物的抗体，所述的C线含有IgG二抗；所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针上的HBV标记物的抗体和所述的检测线含有的HBV标记物的抗体不为相同的单抗。
其中，所述的用于乙型肝炎病毒检测的磁性纳米颗粒生物探针的含量较佳地为4-12μg。
其中，所述的层析膜可为本领域常规使用的层析膜，较佳地为硝酸纤维素膜。
其中，所述的HBV标记物的抗体可为生物学领域常规使用的HBV标记物的抗体。所述的HBV标记物较佳地为HBV表面抗原、HBV核心抗原、HBV前S1抗原或HBV e抗原。所述的HBV标记物的抗体可以是单抗和/或多抗；按照本领域常识，当所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针上的HBV标记物的抗体和所述的T线含有的HBV标记物的抗体均为单抗时，该两种单抗不相同，其应当为针对HBV有特异性反应的不同抗原表位的单抗。
其中，所述的IgG二抗为本领域常规使用的IgG二抗，较佳地为羊抗鼠IgG二抗或兔抗鼠IgG二抗。
其中，所述的衔接为本领域常规意义上的衔接，按本领域常识，所述的样品垫和所述的结合垫，所述的结合垫和所述的层析膜，以及所述的层析膜和所述的吸水垫的衔接处一般有1mm左右的叠合。
按本领域常识，所述的T线和所述的C线之间有一定间距，所述的间距范围为本领域常规的间距范围，一般在0.8cm左右。
本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的规格可为磁性免疫层析领域中常规的规格，能够适用于磁性分析仪（MAR）进行读卡分析即可。所述的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的宽度一般在0.5cm左右。
本发明还提供了一种所述用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的制备方法，其包括下述步骤：将所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针喷点于所述的结合垫上，将所述的HBV标记物的抗体固定于所述的T线上，将所述的IgG二抗固定于所述的C线上，将所述的样品垫、所述的结合垫、所述的层析膜和所述吸水垫依次衔接在所述的底板上，并使所述的T线位于靠近所述结合垫的一侧，使所述的C线位于靠近所述吸水垫的一侧，即得。
其中，所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针的用量较佳地为4-12μg。
其中，所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针在喷点前较佳地还进行重悬的步骤。所述的重悬较佳地采用层析缓冲液进行。所述的层析缓冲液可为本领域常规使用的层析缓冲液，较佳地为含有0.1-1wt%的BSA、0.05-0.5v%的Tween-20和0.02-0.2wt%的蔗糖的硼酸盐缓冲液或含有0.1-1wt%的BSA、0.05-0.5v%的Tween-20和0.02-0.2wt%的蔗糖的磷酸盐缓冲液。所述的层析缓冲液的pH值较佳地为6.5-9.0。
其中，所述喷点的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。
其中，所述固定的方法和条件可为本领域常规的方法和条件，一般可用点膜仪进行。对于所述HBV标记物的抗体的固定较佳地按下述操作进行：用点膜仪以0.75-0.85μL/cm的速度将浓度为0.5-2mg/mL的所述HBV标记物的抗体的溶液喷点在所述T线上。对于所述IgG二抗的固定较佳地按下述操作进行：用点膜仪以0.75-0.85μL/cm的速度将浓度为1-2mg/mL的所述IgG二抗的溶液喷点在所述C线上。
其中，所述的衔接为本领域常规意义上的衔接，按本领域常识，所述的样品垫和所述的结合垫，所述的结合垫和所述的层析膜，以及所述的层析膜和所述的吸水垫的衔接处一般有1mm左右的叠合。
本发明中，所制得的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条可以根据实际情况，在后续使用时进行裁剪，以适用于磁性分析仪（MAR）进行读卡分析。
本发明还提供了所述用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的使用方法，其包括下述步骤：将样本于所述的样品垫处加入，静置5-15min后，观察所述T线和所述C线处的颜色；在静置35min后，用磁性分析仪检测所述的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条在所述T线和所述C线处的磁信号值，即可。
其中，所述的磁性分析仪（MAR）可为本领域常规使用的磁性分析仪。
按本领域常识，所述T线和所述C线处的颜色变化和判断标准如下：以肉眼观察，若T线和C线处有两条明显的条带或者T线的条带浅于C线条带，则样本为阳性；若仅C线处出现一条条带，T线处无条带，则样本为阴性。检测时若C线处无条带，则试纸条体系有问题，其检测结果视为无效。
本发明中，将测得的样本在所述T线3处的定量磁信号与一阴性样本在所述T线3处的定量磁信号进行比较，也可对检测结果进行评价，T样本/T阴值≥2.1的样品其结果视为阳性，T样本/T阴值<2.1的样品其结果视为阴性。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明以表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒为载体，通过EDC和NHS将乙肝标记物的抗体连接到颗粒表面建立了乙肝的磁性纳米颗粒生物探针制备方法。并以此生物探针为标记物，以靶向标记物的抗体为捕获抗体，建立了三明治夹心式免疫层析检测体系。本发明的磁性纳米颗粒生物探针特异性强，信号灵敏且稳定性好，根据所选择的靶向标记物及其配套的抗体，可适用于多种乙肝标记物的检测，也适用于乙肝的高通量检测方法研究和产品开发。本发明的磁性免疫层析试纸条一方面可通过肉眼观察实现乙肝的快速定性检测，另一方面通过所捕获探针的定量磁信号实现乙肝病毒的快速检测。并且，在使用所述用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条时可以通过肉眼观察和MAR检测得到的磁信号进行二次判定，能够大大减少人为误差，准确性高。
附图说明
图1为实施例1的磁性纳米颗粒的TEM照片。
图2为实施例1的磁性纳米颗粒的磁滞曲线。
图3为本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的结构示意图。
图4为采用本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条对HBV阳性血清标准品的检测结果（磁信号值）与ELISA法的检测结果（OD值）的对比。
图5为采用本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条对HBV阳性血清标准品的定性检测图片。其中，1-8分别代表浓度由高到低的HBV阳性血清标准品的系列稀释样品。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所制得的或采用的磁性纳米颗粒的粒径均在50-300nm的范围内。
实施例1磁性纳米颗粒
磁性纳米颗粒的制备方法，其包括下述步骤：
1）用溶剂热法制备磁性粒子：将0.85g FeCl3·6H2O和0.4033g PAA分别溶解在40ml乙二醇中，再加入尿素1.2g溶解，混合后加入带四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜，在220℃下加热反应16h后，在磁分离辅助下，用乙醇和去离子水各洗涤3次，得到平均粒径为90nm的磁性粒子；
2）氧化硅包被磁性粒子：将90mg磁性粒子和1.0mol/L的盐酸溶液混合，超声30分钟，在磁分离辅助下，用去离子水洗涤5次，然后将磁性粒子与醇水体积比为70:30的醇水混合液125mL混合，在搅拌下加入正硅酸乙酯200μL和氨水2.1mL，反应18小时，在磁分离的辅助下用乙醇洗涤3次，真空干燥，即得。
该些磁性纳米颗粒为具有核壳结构的磁性粒子/氧化硅复合材料，其内核为磁性粒子，其壳层为氧化硅。磁性纳米颗粒的TEM照片见图1，其平均粒径为100nm，比饱和磁化强度为29.2emu/g（见图2）。
实施例2磁性纳米颗粒
磁性纳米颗粒的制备方法，其包括下述步骤：
1）用溶剂热法制备磁性粒子：将0.81g FeCl3·6H2O和2.66g柠檬酸钠分别溶解在30ml乙二醇中，混合后加入带四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，旋紧反应釜，在200℃下加热反应24h后，在磁分离辅助下，用乙醇和去离子水各洗涤3次，得到平均粒径为250nm的磁性粒子；
2）氧化硅包被磁性粒子：将110mg磁性粒子和1.0mol/L的盐酸溶液混合，超声15分钟，在磁分离辅助下，用去离子水洗涤7次，然后将磁性粒子与醇水体积比为90:10的醇水混合液125mL混合，在搅拌下加入正硅酸乙酯100μL和氨水2.1mL，反应12小时，然后再加入80μL的正硅酸乙酯，继续反应12小时，在磁分离的辅助下用乙醇洗涤3次，真空干燥，即得。
该些磁性纳米颗粒为具有核壳结构的磁性粒子/氧化硅复合材料，其内核为磁性粒子，其壳层为氧化硅。该些磁性纳米颗粒的平均粒径为280nm，比饱和磁化强度为42emu/g，氧化硅壳层的平均厚度为15nm。
实施例3用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针
用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针的制备方法，其包括下述步骤：
（1）在50g醇水体积比为70:30的乙醇水溶液中加入15mg实施例1或2所制得的磁性纳米颗粒，加入50μL氨水和35μL氨丙基三乙氧基硅烷，常温下搅拌2h，于70℃水浴条件下继续搅拌3h，用乙醇洗涤，得表面氨基化的磁性纳米颗粒；将表面氨基化的磁性纳米颗粒与二甲亚砜（DMSO）混合，加入5.5mg丁二酸酐反应24h，在磁分离辅助下用DMSO洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，得表面羧基化的磁性纳米颗粒，该些表面羧基化的磁性纳米颗粒的羧基含量为0.9-1.5mmol/g；
（2）用500μL的MEST溶液（该MEST溶液中含0.25v%的吐温-20，pH为5.0-5.5）洗涤2mg表面羧基化的磁性纳米颗粒，该洗涤具体地为：将该MEST溶液和表面羧基化的磁性纳米颗粒置于2mL离心管中，在漩涡振荡器上混合均匀，然后磁分离；洗涤2次后，将表面羧基化的磁性纳米颗粒、0.5mol/L的EDC溶液5μL和0.25mol/L的NHS溶液10μL混合，反应30min，用MEST溶液（组分同前）洗涤2次，再用pH值为9.0的BST溶液（该BST溶液中含0.07v%的吐温-20）洗涤2次，得反应物A；
（3）在BST溶液（组分同前）中，将反应物A和150μg的HBV前S1抗原的特异性单抗混合，室温下反应3h，得反应物B；
（4）将反应物B与500μL的0.5～1mg/mL的BSA溶液于室温下封闭反应30min，反应后用BST溶液（组分同前）洗涤3次，即得。
制得的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针用保存液重悬，于4℃下储存备用。
实施例4用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条
图3为用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的结构示意图，该磁性免疫层析试纸条包括一样品垫1、一结合垫2、一层析膜7、一吸水垫6和一底板5，结合垫2上喷点有实施例3所制得的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针，层析膜7上有一T线3和一C线4，样品垫1、结合垫2、层析膜7和吸水垫6依次衔接于底板5上，T线3位于靠近结合垫2的一侧，C线4位于靠近吸水垫6的一侧，T线3和C线4相距0.8cm；T线3含有HBV表面抗原的特异性单抗，C线4含有山羊抗兔IgG抗体，层析膜7为硝酸纤维素膜。
该用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的制备方法，其包括下述步骤：将实施例3所制得的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针用保存液2倍体积的层析缓冲液进行重悬，该层析缓冲液为含有0.1-1wt%的BSA、0.05-0.5wt%的Tween-20和0.02-0.2wt%的蔗糖的硼酸盐缓冲液，该层析缓冲液的pH值为6.5-9.0均可；取5μL重悬后的悬浮液喷点于结合垫2上，该悬浮液中的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针的含量为5μg；用点膜仪以0.8μL/cm的速度将1mg/mL的HBV表面抗原的特异性单抗固定在层析膜7的T线3上，用点膜仪将2mg/mL的山羊抗兔IgG抗体固定在层析膜7的C线4上，该层析膜7为硝酸纤维素膜，T线3和C线4相距0.8cm；将样品垫1、结合垫2、层析膜7和吸水垫6依次衔接于底板5上，样品垫1和结合垫2，结合垫2和层析膜7，层析膜7和吸水垫6的衔接处有1mm左右的叠合T线3位于靠近结合垫2的一侧，C线4位于靠近吸水垫6的一侧，即得。
该用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条可以根据实际情况，在使用时进行裁剪，如剪裁至0.5cm宽，以适用于磁性分析仪（MAR）进行读卡分析。
该用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的使用方法，其包括下述步骤：将样本于样品垫1处加入，静置5-15min后，观察T线3和C线4处的颜色；在静置35min后，用磁性分析仪检测所述的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条在T线3和C线4处的磁信号值，即可。
T线3和C线4处的颜色变化和判断标准如下：以肉眼观察，若T线和C线处有两条明显的条带或者T线的条带浅于C线条带，则样本为阳性；若仅C线处出现一条条带，T线处无条带，则样本为阴性。检测时若C线处无条带，则试纸条体系有问题，其检测结果视为无效。
此外，将测得的样本在T线3处的定量磁信号与一阴性样本在T线3处的定量磁信号进行比较，也可对检测结果进行评价，T样本/T阴值≥2.1的样品其结果视为阳性，T样本/T阴值<2.1的样品其结果视为阴性。
采用该用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条对一血清样本X进行检测，测得其在T线处的磁信号为234；对另一血清样本Y进行检测，测得其在T线处的磁信号为89。对一乙肝阴性血清样本进行检测，测得其在T线处的磁信号为47。依据定量检测值进行计算，则T样本X/T阴值=4.97，该值大于2.1，因而该血清样本X为阳性；而T样本Y/T阴值=1.89，该值小于2.1，因而该血清样本Y为阴性。
实施例5用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针
该实施例中的磁性粒子按文献，如文献①：Magnetite Nanocrystal Clusterswith Ultra-High Sensitivity in Magnetic Resonance Imagin（Fangjie Xu，Changming Cheng，Du-Xing Chen，Hongchen Gu，Chemphyschem，2012，13，336-341）进行制备。该实施例中的磁性纳米颗粒按文献，如文献②：Synthesis of Magnetic Microspheres with Immobilized Metal Ions for Enrichmentand Direct Determination of Phosphopeptides by Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization Mass Spectrometry（Xiuqing Xu，Chunhui Deng，MingxiaGao，Wenjia Yu，Pengyuan Yang，and Xiangmin Zhang，Advanced Materials，2006，18，3289-3293.）进行制备。所制得的磁性纳米颗粒的粒径均在50-300nm的范围内。该些磁性纳米颗粒为具有核壳结构的磁性粒子/氧化硅复合材料，其内核为磁性粒子，壳层为氧化硅。
用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针的制备方法，其包括下述步骤：
（1）在50g醇水体积比为70:30的醇水混合液中加入15mg平均粒径为150nm的磁性纳米颗粒（制备方法参见文献①和文献②，该些磁性纳米颗粒的氧化硅壳层的平均厚度为10nm，比饱和磁化强度为36emu/g），加入50μL氨水和35μL氨丙基三乙氧基硅烷，常温下搅拌1h，于70℃水浴条件下继续搅拌2h，用乙醇洗涤，得表面氨基化的磁性纳米颗粒；将表面氨基化的磁性纳米颗粒与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合，加入7.0mg丁二酸酐反应24h，在磁分离辅助下用DMF洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，得表面羧基化的磁性纳米颗粒，该表面羧基化的磁性纳米颗粒的羧基含量约为1.5mmol/g；
（2）用500μL的MEST溶液（该MEST溶液中含0.05v%的吐温-20，pH为5.0-5.5）洗涤2mg表面羧基化的磁性纳米颗粒，该洗涤具体地为：将该MEST溶液和表面羧基化的磁性纳米颗粒置于2mL离心管中，在漩涡振荡器上混合均匀，然后磁分离；洗涤2次后，将表面羧基化的磁性纳米颗粒、0.5mol/L的EDC溶液5μL和0.25mol/L的NHS溶液10μL混合，反应30min，用MEST溶液（组分同前）洗涤2次，再用pH值为9.0的BST溶液（该BST溶液中含0.1v%的吐温-20）洗涤2次，得反应物A；
（3）在BST溶液（组分同前）中，将反应物A和150μg的HBV前S1抗原的特异性单抗混合，室温下反应3h，得反应物B；
（4）将反应物B与500μL的1mg/mL%的BSA溶液于室温下封闭反应30min，反应后用BST溶液（组分同前）洗涤3次，即得。
制得的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针用保存液重悬，于4℃下储存备用。
实施例6用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条
该用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的结构示意图见图3，该磁性免疫层析试纸条的结构同实施例4，不同之处在于结合垫2上喷点有实施例5所制得的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针。
该用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的制备方法同实施例4，不同之处在于使用实施例5所制得的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针喷点于结合垫2上。
该用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条可以根据实际情况，在使用时进行裁剪，如剪裁至0.5cm宽，以适用于磁性分析仪（MAR）进行读卡分析。
该用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的使用方法和判断方法同实施例4。
效果实施例1
采用实施例4和实施例6的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条对待测样品进行检测。将待测样本于样品垫1处加入，静置5-15min后，观察T线3和C线4处的颜色；在静置35min后，用磁性分析仪检测所述的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条在T线3处的磁信号值，即为表1中的磁信号值。同时，被测样本用常规ELISA法进行检测后的吸光值即为表1中的OD值。检测所用阴性样品为已知是乙肝阴性患者血清，阳性血清为已经确认为乙肝阳性的患者血清。通常，阳性和待检测样本的定量检测所得磁信号与阴性样本的比值即S/N值，即为T样本/T阴值，因此S/N值>2.1的样本为阳性。
表1为采用本发明的磁性免疫层析试纸条及ELISA法对不同样品的检测结果。从表1中可以看出，采用本发明的磁性免疫层析试纸条对于HBV进行检测，其测定结果的变异系数低，误差小。
表1采用本发明的磁性免疫层析试纸条及ELISA法对不同样品的检测结果
| 样品 | OD值（ELISA） | 磁信号值 | CV(%) | S/N |
| 阴性对照血清 | 0.026-0.039 | 43.7±0.9 | 2.10 | / |
| 阳性对照血清 | / | 775.1±15.0 | 1.9 | 17.7 |
| 患者血清A | 1.285 | 1961.3±12.0 | 0.6 | 44.9 |
| 患者血清B | 1.311 | 1858.5±107.0 | 5.8 | 42.5 |
| 患者血清C | 1.355 | 1834.2±100.3 | 5.5 | 42 |
| 患者血清D | 1.477 | 2512.9±29.0 | 1.2 | 57.5 |
效果实施例2
检测方法同效果实施例1。
表2和图4为采用本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条及ELISA法对乙肝阳性血清标准品的系列梯度检测结果。其中，阳性血清标准品1-8分别为浓度由高到低的乙肝阳性血清标准品。从表2和图4中可以看出，其测定结果与ELISA法的测定结果相吻合，其R2=0.9834，线性关系好，说明本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条检测准确性高，特异性强。根据表2和图4数据，采用本发明的磁性免疫层析试纸条对HBV阳性标准品8的定量检测结果的S/N值>2.1。根据本发明前面所述的T样本/T阴值判定方法，该检测结果为阳性。
图5为采用本发明的磁性免疫层析试纸条对乙肝阳性血清标准品1-8的系列梯度检测的定性结果，图中箭头C指示的为C线处，箭头T指示的为T线处。由图可见，随着标准品浓度的降低，试纸条T线处的检测线亦逐渐由深变浅，最后肉眼观察不到，但是由表2的定量检测结果可知，虽然肉眼观察不到检测线，但是其定量检测结果依然有效。由此可见，采用本发明的磁性免疫层析试纸条对HBV进行检测，灵敏度高，且可有效避免因单纯的肉眼观察而出现的假阴性现象。
表2用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条及ELISA法对不同梯度HBV阳性血清标准样品的检测结果
效果实施例3
检测方法同效果实施例1。
表3用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的检测稳定性
表3为采用本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条对乙肝血清样品的稳定性评价实验结果。表3中的阳性血清标准品1-3分别为浓度由高到低的HBV阳性血清标准品，T平均1-3分别为采用本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条对表中的样品的第1天、第2天和第3天检测时的试纸条T线处的磁信号平均值。由表3可知，3次检测的磁信号的最大变化率为11.9%，小于15%，说明本发明的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的检测稳定性较好。
Claims (10)
1.一种用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针的制备方法，其包括下述步骤：（1）对粒径为50-300nm的磁性纳米颗粒进行表面氨基化处理，得表面氨基化的磁性纳米颗粒；对所述表面氨基化的磁性纳米颗粒进行羧基化处理，得表面羧基化的磁性纳米颗粒；（2）在缓冲液中将所述表面羧基化的磁性纳米颗粒、碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合反应，反应后洗涤，得反应物A；（3）在偶联缓冲液中将所述反应物A和HBV标记物的抗体混合反应，得反应物B；（4）将所述反应物B与含氨基的化合物的溶液混合反应，反应后洗涤，即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述磁性纳米颗粒的比饱和磁化强度在25-45emu/g；和/或，步骤（1）中，所述的磁性纳米颗粒为具有核壳结构的磁性粒子/氧化硅复合材料，所述的磁性纳米颗粒的内核为磁性粒子，所述的磁性纳米颗粒的壳层为氧化硅；和/或，步骤（1）中，所述表面羧基化的磁性纳米颗粒中的羧基含量为0.35mmol/g以上；
和/或，步骤（1）中，所述的磁性纳米颗粒采用下述方法制得：
1）用溶剂热法制备磁性粒子：将无机铁盐、尿素、稳定剂和乙二醇混合，于180-220℃下反应8-24小时，洗涤，即得磁性粒子；所述的稳定剂为柠檬酸钠或者聚丙烯酸；
2）氧化硅包被磁性粒子：将所述磁性粒子和0.8-1.2mol/L的强酸溶液混合，超声10-40分钟，在磁分离的辅助下用去离子水洗涤5-7次，得活化后的磁性粒子；将所述活化后的磁性粒子和醇水混合液混合，在搅拌状态下加入碱和正硅酸烷基酯，所述正硅酸烷基酯的用量为20-500μL/100mg所述磁性粒子，所述的碱使混合后体系的pH值在8.0-10.5，反应8-24小时，在磁分离的辅助下用醇洗涤3-5次，即得；其中，醇水混合液中的醇水比例为60:40-90:10。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的磁性粒子为铁氧化物；所述磁性粒子/氧化硅复合材料的壳层的厚度为5-50nm；和/或，步骤（1）中，所述表面羧基化的磁性纳米颗粒中的羧基含量为0.35-5.0mmol/g。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的表面氨基化处理采用硅烷偶联剂进行；和/或，步骤（1）中，所述表面羧基化处理采用酸酐进行；和/或，步骤（2）中，在所述的混合前还用缓冲液洗涤2-3次，再用缓冲液使所述表面羧基化的磁性纳米颗粒重悬；和/或，步骤（2）中，所述缓冲液的pH值为4.5-5.5；和/或，步骤（2）中，所述的缓冲液为含0.05-1.5v%吐温的2-（N-吗啉代）乙磺酸溶液；和/或，步骤（2）中，所述碳化二亚胺的用量为1.2-1.4μmol/1mg所述表面羧基化的磁性纳米颗粒，所述N-羟基琥珀酰亚胺的用量为1.2-1.4μmol/1mg所述表面羧基化的磁性纳米颗粒；和/或，步骤（2）中，所述反应的时间为30-60min；和/或，步骤（2）中，在所述反应后，所述的洗涤按下述操作进行：用含0.05-1.5v%的吐温-20的2-（N-吗啉代）乙磺酸溶液洗涤2次后，再用硼酸盐吐温溶液洗涤2次；和/或，步骤（3）中，所述的HBV标记物为HBV表面抗原、HBV核心抗原、HBV前S1抗原或HBV e抗原，所述的抗体是单抗和/或多抗；和/或，步骤（3）中，所述偶联缓冲液的pH值为8.8-9.2；和/或，步骤（3）中，所述的偶联缓冲液为硼酸盐吐温溶液；和/或，步骤（3）中，所述反应的时间为2-4小时；和/或，步骤（4）中，所述含氨基的化合物的溶液为牛血清白蛋白溶液、Tris缓冲液、甘氨酸溶液和多肽溶液中的一种或多种；和/或，步骤（4）中，所述反应的时间为30-60min；和/或，步骤（4）中，所述的洗涤按下述操作进行：用硼酸盐吐温溶液洗涤2-4次。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的表面氨基化处理按照下述操作进行：将所述的磁性纳米颗粒与醇水混合液混合，调节pH值至8.0-11.0，得混合液C；再将所述混合液C与氨丙基三乙氧基硅烷混合，所述氨丙基三乙氧基硅烷的用量为15-50μL/15mg所述磁性纳米颗粒，搅拌1-3小时后，于60-85℃下继续搅拌2-4h，洗涤后即得表面氨基化的磁性纳米颗粒；
和/或，步骤（1）中，所述的表面羧基化处理按照下述操作进行：将所述表面氨基化的磁性纳米颗粒、丁二酸酐和溶剂混合，所述丁二酸酐的用量为20-60mg/100mg所述表面氨基化的磁性纳米颗粒，所述的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲亚砜，反应12-36小时，反应后洗涤，即得表面羧基化的磁性纳米颗粒；
和/或，步骤（2）中，所述碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:0.9-0.9:1；
和/或，步骤（2）中，在所述的混合前，所述洗涤时用的所述缓冲液为含0.05-1.5v%吐温的2-（N-吗啉代）乙磺酸溶液，所述重悬后体系的pH值为4.5-5.5；
和/或，步骤（2）中，在所述的反应后，所述洗涤时用的所述含0.05-1.5v%的吐温-20的2-（N-吗啉代）乙磺酸溶液的pH值为4.5-5.5。
6.一种由权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针。
7.一种用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条，其包括一样品垫、一结合垫、一层析膜、一吸水垫和一底板，所述的结合垫上喷点有如权利要求6所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针，所述的层析膜上有一检测线和一质控线，所述的样品垫、所述的结合垫、所述的层析膜和所述吸水垫依次衔接于所述的底板上，所述的检测线位于靠近所述结合垫的一侧，所述的质控线位于靠近所述吸水垫的一侧，所述的检测线含有HBV标记物的抗体，所述的质控线含有IgG二抗；所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针上的HBV标记物的抗体和所述的检测线含有的HBV标记物的抗体不为相同的单抗。
8.如权利要求7所述的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条，其特征在于，所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针的含量为4-12μg；和/或，其中，所述的层析膜为硝酸纤维素膜；和/或，所述的HBV标记物为HBV表面抗原、HBV核心抗原、HBV前S1抗原或HBV e抗原，所述的HBV标记物的抗体是单抗和/或多抗。
9.一种如权利要求7或8所述的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的制备方法，其包括下述步骤：将如权利要求6所述的用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针喷点于所述的结合垫上，将所述的HBV标记物的抗体固定于所述的检测线上，将所述的IgG二抗固定于所述的质控线上，将所述的样品垫、所述的结合垫、所述的层析膜和所述吸水垫依次衔接在所述的底板上，并使所述的检测线位于靠近所述结合垫的一侧，使所述的质控线位于靠近所述吸水垫的一侧，即得。
10.一种如权利要求7或8所述的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条的使用方法，其包括下述步骤：将样本于所述的样品垫处加入，静置5-15min后，观察所述检测线和所述质控线处的颜色；在静置35min后，用磁性分析仪检测所述的用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条在所述检测线和所述质控线处的磁信号值，即可。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013101659064A CN103293295A (zh) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | 检测hbv的磁性生物探针、试纸条及其制备和使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013101659064A CN103293295A (zh) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | 检测hbv的磁性生物探针、试纸条及其制备和使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103293295A true CN103293295A (zh) | 2013-09-11 |
Family
ID=49094524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013101659064A Pending CN103293295A (zh) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | 检测hbv的磁性生物探针、试纸条及其制备和使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103293295A (zh) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103558399A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-05 | 昆明云大生物技术有限公司 | 检测乙肝表面抗原的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN103604920A (zh) * | 2013-12-02 | 2014-02-26 | 重庆市肿瘤研究所 | 一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法及检测方法 |
| CN103990423A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-08-20 | 华南师范大学 | 一种单链dna核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法 |
| CN103990443A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-08-20 | 华南师范大学 | 一种单链dna核酸修饰壳聚糖磁性微球的制备方法 |
| CN104483477A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-04-01 | 南京爱思唯志生物科技有限公司 | 偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法 |
| CN104914243A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-09-16 | 苏州万纳生物科技有限公司 | 一种磁性纳米颗粒生物探针及其制备方法和应用 |
| CN103990443B (zh) * | 2014-03-27 | 2016-11-30 | 华南师范大学 | 一种单链dna核酸修饰壳聚糖磁性微球的制备方法 |
| WO2017206714A1 (zh) * | 2016-06-01 | 2017-12-07 | 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 | 一种免疫磁性纳米微粒的制备方法 |
| CN107561272A (zh) * | 2017-08-24 | 2018-01-09 | 苏州万纳生物科技有限公司 | 试纸条、检测承载有磁性聚集体的试纸条的方法及装置 |
| CN109507419A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-03-22 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种检测四环素药物的磁性上转换荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
| CN112080588A (zh) * | 2020-09-10 | 2020-12-15 | 上海市农业科学院 | 一种检测果蔬中诺如病毒的方法 |
| CN112557661A (zh) * | 2020-10-31 | 2021-03-26 | 上海海洋大学 | 一种快速检测乙型肝炎病毒前s2抗原的磁性免疫层析试纸条及方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008122241A1 (en) * | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Diagcor Bioscience Incorporation Limited | Rapid protein analyses and the device thereof |
| CN101750495A (zh) * | 2009-10-16 | 2010-06-23 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN101750498A (zh) * | 2009-10-16 | 2010-06-23 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN101762701A (zh) * | 2009-06-24 | 2010-06-30 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN101799416A (zh) * | 2010-03-10 | 2010-08-11 | 上海交通大学 | 检测诱导多能干细胞的方法 |
| CN102160985A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-24 | 同济大学 | 具有核壳结构及表面各向异性双功能团的磁性二氧化硅微球及其制备方法 |
-
2013
- 2013-05-07 CN CN2013101659064A patent/CN103293295A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008122241A1 (en) * | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Diagcor Bioscience Incorporation Limited | Rapid protein analyses and the device thereof |
| CN101762701A (zh) * | 2009-06-24 | 2010-06-30 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN101750495A (zh) * | 2009-10-16 | 2010-06-23 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN101750498A (zh) * | 2009-10-16 | 2010-06-23 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测乙肝e抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN101799416A (zh) * | 2010-03-10 | 2010-08-11 | 上海交通大学 | 检测诱导多能干细胞的方法 |
| CN102160985A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-24 | 同济大学 | 具有核壳结构及表面各向异性双功能团的磁性二氧化硅微球及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FANGJIE XU,ET AL.: "Magnetite Nanocrystal Clusters with Ultra-High Sensitivity in Magnetic Resonance Imaging", 《CHEMPHYSCHEM》 * |
| XIUQING XU，ET AL.: "Synthesis of Magnetic Microspheres with Immobilized Metal Ions for Enrichment and Direct Determination of Phosphopeptides by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry", 《 ADV. MATER.》 * |
| 袁航: "羧基功能化超顺磁性复合粒子的制备及其在免疫层析中的应用研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103558399A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-05 | 昆明云大生物技术有限公司 | 检测乙肝表面抗原的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN103604920A (zh) * | 2013-12-02 | 2014-02-26 | 重庆市肿瘤研究所 | 一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法及检测方法 |
| CN103604920B (zh) * | 2013-12-02 | 2016-01-06 | 重庆市肿瘤研究所 | 一种诊断卵巢癌的磁性纳米探针的制备方法 |
| CN103990423B (zh) * | 2014-03-27 | 2016-02-03 | 华南师范大学 | 一种单链dna核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法 |
| CN103990423A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-08-20 | 华南师范大学 | 一种单链dna核酸适配体修饰二氧化硅/四氧化三铁磁性微球的制备方法 |
| CN103990443A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-08-20 | 华南师范大学 | 一种单链dna核酸修饰壳聚糖磁性微球的制备方法 |
| CN103990443B (zh) * | 2014-03-27 | 2016-11-30 | 华南师范大学 | 一种单链dna核酸修饰壳聚糖磁性微球的制备方法 |
| CN104483477A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-04-01 | 南京爱思唯志生物科技有限公司 | 偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法 |
| CN104483477B (zh) * | 2014-10-30 | 2017-07-28 | 南京肯辛顿诊断科技有限公司 | 偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法 |
| CN104914243A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-09-16 | 苏州万纳生物科技有限公司 | 一种磁性纳米颗粒生物探针及其制备方法和应用 |
| WO2017206714A1 (zh) * | 2016-06-01 | 2017-12-07 | 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 | 一种免疫磁性纳米微粒的制备方法 |
| CN107561272A (zh) * | 2017-08-24 | 2018-01-09 | 苏州万纳生物科技有限公司 | 试纸条、检测承载有磁性聚集体的试纸条的方法及装置 |
| CN109507419A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-03-22 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种检测四环素药物的磁性上转换荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
| CN109507419B (zh) * | 2018-11-21 | 2021-10-12 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种检测四环素药物的磁性上转换荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 |
| CN112080588A (zh) * | 2020-09-10 | 2020-12-15 | 上海市农业科学院 | 一种检测果蔬中诺如病毒的方法 |
| CN112080588B (zh) * | 2020-09-10 | 2023-10-03 | 上海市农业科学院 | 一种检测果蔬中诺如病毒的方法 |
| CN112557661A (zh) * | 2020-10-31 | 2021-03-26 | 上海海洋大学 | 一种快速检测乙型肝炎病毒前s2抗原的磁性免疫层析试纸条及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103293295A (zh) | 检测hbv的磁性生物探针、试纸条及其制备和使用方法 | |
| CN104914243A (zh) | 一种磁性纳米颗粒生物探针及其制备方法和应用 | |
| US20190219569A1 (en) | Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof | |
| EP2027468B1 (en) | Detection of target molecules in a sample by using a magnetic field | |
| CN106501515A (zh) | Ca215检测试剂盒及其制备方法和使用方法 | |
| Zhang et al. | A silicon dioxide modified magnetic nanoparticles–labeled lateral flow strips for HBs antigen | |
| CN104090106A (zh) | 乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN101975859A (zh) | 一种乙型肝炎病毒表面抗原的磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法 | |
| CN101858914B (zh) | 梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条及其制备方法 | |
| CN104090101A (zh) | 人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN105137066A (zh) | 一种基于聚苯乙烯乳胶的癌症标志物免疫层析试剂盒及其使用方法 | |
| CN103777026B (zh) | 一种用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒 | |
| CN104698185A (zh) | 检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒及其检测方法和应用 | |
| Weng et al. | Utilizing ELISA to monitor protein-protein interaction | |
| Yang et al. | Universal behavior of biomolecule-concentration-dependent reduction in AC magnetic susceptibility of bioreagents | |
| Villalta et al. | Autoantibodies to asialoglycoprotein receptor (ASGPR) in patients with autoimmune liver diseases | |
| CN101825635B (zh) | 梅毒特异性IgG抗体与特异性总抗体联合检测试剂条及其制备方法 | |
| CN102608321A (zh) | 多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒及制备方法 | |
| Khramtsov et al. | Solid-phase nuclear magnetic resonance immunoassay for the prostate-specific antigen by using protein-coated magnetic nanoparticles | |
| Chang et al. | Use of immunomagnetic reduction for C-reactive protein assay in clinical samples | |
| Barnett et al. | Initial trail results of a magnetic biosensor for the rapid detection of Porcine Reproductive and Respiratory Virus (PRRSV) infection | |
| CN105424941B (zh) | Akr1b10蛋白和用于肝硬化诊断的试剂盒 | |
| Wang et al. | Rapid detection of unconjugated estriol in the serum via superparamagnetic lateral flow immunochromatographic assay | |
| CN101738476B (zh) | 乙肝病毒前s1抗原快速诊断试剂盒及其制备方法 | |
| CN103389374B (zh) | 微量全血加样法检测肺炎支原体胶体金试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130911 |