CN103275940A - 一种以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法 - Google Patents

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张馨元
李乾学
李志萍
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Abstract

本发明公开了一种以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，包括以下步骤：（1）用涡旋仪将羧基化磁性微球进行震荡分散；（2）用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）,将羧基化磁性微球的羧基活化，得到具有羧基活性的磁性微球；（3）将溶解的胎球蛋白直接加入到（2）所活化的磁性微球中进行共价结合；（4）将（3）中结合上胎球蛋白的磁性微球直接加入到待检液体中进行病毒的富集。 本发明方法将建立好的胎球蛋白磁性微球直接加入到待检液体中进行病毒富集，富集后即可检测，不需要经过离心、沉淀等中间环节，节省时间，且不需要特殊仪器，具有快速敏感、抗干扰能力强、方便经济、简单实用，不污染环境等优点。

Description

一种以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法
技术领域
本发明提供一种以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，涉及一种在液相中富集流感病毒的方法，尤其是可以富集大体积和低浓度的各亚型流感病毒，属于生物医学领域。
背景技术
目前，公知的富集流感病毒的一种方法是红细胞富集流感病毒法。利用流感病毒能够凝集红细胞，并在一定条件下能从红细胞上解离下来的特性，将红细胞进行醛化后,在4℃时凝集病毒，并在37℃解凝释放病毒以达到富集流感病毒的目的。但是，红细胞富集流感病毒的富集效率较低。
另一种方法是免疫磁珠富集流感病毒法。它是以磁珠为载体，表面包被上抗体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的。但是此方法中包被磁珠的单克隆抗体制备流程复杂，而商品化的单克隆抗体价格昂贵，且一种单克隆抗体只能特异性结合一种亚型的流感病毒，一种免疫磁珠只能富集一种亚型的流感病毒。
发明内容
为了解决现有技术所存在的问题，本发明公开了一种以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，目的旨在提高流感病毒的富集效率，降低成本并增加富集的适用范围。本发明的原理是根据流感病毒可以附着在细胞表面的唾液酸受体上的特性，将含唾液酸胎球蛋白结合在磁珠上，使得胎球蛋白中的唾液酸富集流感病毒，再通过外加磁场的作用分离富集的流感病毒。
本发明公开的一种以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，解决其技术问题所采用的技术方案是：
用 1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基-碳二亚胺]（ 英文缩写EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺（英文缩写NHS）联合活化羧基化磁柱的羧基，将含有唾液酸（含有75%的α2,3-唾液酸与25%的α2,6-唾液酸）的胎球蛋白与活化后的磁珠进行共价结合。将结合上胎球蛋白的磁珠放入待检液体中，富集流感病毒。
本发明一种以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，其具体步骤如下：
（1）、用涡旋仪将羧基化磁珠进行震荡分散，直至磁珠均一悬浮于溶液中（约10分钟）。
（2）、用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(英文缩写：EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（英文缩写：NHS）将羧基化磁珠的羧基活化，得到具有羧基活性的磁珠；
（3）、将（2）所活化的羧基磁珠加入到溶解后的含唾液酸胎球蛋白溶液中，进行共价结合；
（4）、将（3）中结合上含唾液酸胎球蛋白的磁珠直接加入到待检液体中，在4℃进行2h（或多于2h）流感病毒的富集。
其中，步骤（2）中所述的活化方法按照以下质量比例进行制备:
EDC：磁性微球=（20±2:1），NHS：EDC=1：4
整个反应在4℃，无菌的pH 4.2～4.6 PBS中进行。
步骤（3）中所述的胎球蛋白是含有α2,3-唾液酸与25%的α2,6-唾液酸的胎球蛋白粉末，用无菌pH 7.2～7.6 PBS将其溶解，存于-20℃备用。
共价结合的条件是4℃作用6h。
步骤（4）中所述的病毒包括各个亚型的流感病毒。
本发明的积极效果在于：以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒，不仅能富集到大体积，低浓度液相中的流感病毒，而且能同时富集不同亚型的流感病毒，操作简单，成本较低且不需要特殊的设备与仪器。
附图说明
图1为试验例1 H5N1亚型流感病毒检测电泳图；
图2为试验例2 H1N1亚型流感病毒检测电泳图；
图3为试验例3 H3N2亚型流感病毒检测电泳图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
（1）、用涡旋仪将羧基化磁性微球进行震荡分散10分钟。用无菌pH 7.6 PBS将磁性微球洗涤2次，后再用无菌pH 7.6 PBS重悬，储存于4℃备用。
（2）、称取0.01g磁性微球（约0.5×106 个），用磁性分离架将磁珠与溶液分离，用5ml 无菌pH 4.5 PBS将分离得到的磁性微球重悬。向悬液中加入0.2g的EDC于4℃反应15分钟，再加入0.05g的NHS于4℃反应4小时。反应结束后将磁珠从液体中分离出来，并用无菌pH 7.6 PBS洗涤三次后加入1ml无菌pH 7.6 PBS重悬，存于4℃。用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(英文缩写：EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（英文缩写：NHS）将羧基化磁珠的羧基活化，得到具有羧基活性的磁珠；
（3）、将含唾液酸胎球蛋白粉末用无菌pH 7.6 PBS中，配制成1mg/ml的溶液。将步骤（2）中活化的羧基磁珠加入到配制好的含唾液酸胎球蛋白1ml的溶液中，于4℃作用6h，进行共价结合；反应结束后用无菌pH 7.6 PBS洗涤三次后加入1ml无菌pH 7.6 PBS重悬，存于4℃
（4）、将步骤（3）中结合上含唾液酸胎球蛋白的磁珠直接加入到含H5N1亚型流感病毒的溶液中，在4℃作用2h，进行流感病毒的富集。
实施例2
（1）、用涡旋仪将羧基化磁性微球进行震荡分散8分钟。用无菌pH 7.6 PBS将磁性微球洗涤2次，后再用无菌pH 7.6 PBS重悬，储存于4℃备用。
（2）、称取0.01g磁性微球（约0.5×106 个），用磁性分离架将磁珠与溶液分离，用5ml 无菌pH 4.2 PBS将分离得到的磁性微球重悬。向悬液中加入0.22g的EDC于4℃反应15分钟，再加入0.055g的NHS于4℃反应4小时。反应结束后将磁珠从液体中分离出来，并用无菌pH 7.6 PBS洗涤三次后加入1ml无菌pH 7.6 PBS重悬，存于4℃。用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(英文缩写：EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（英文缩写：NHS）将羧基化磁珠的羧基活化，得到具有羧基活性的磁珠；
（3）、将含唾液酸胎球蛋白粉末用无菌pH 7.4 PBS中，配制成1mg/ml的溶液。将步骤（2）中活化的羧基磁珠加入到配制好的含唾液酸胎球蛋白1ml的溶液中，于4℃作用6h，进行共价结合；反应结束后用无菌pH 7.6 PBS洗涤三次后加入1ml无菌pH 7.6 PBS重悬，存于4℃
（4）、将步骤（3）中结合上含唾液酸胎球蛋白的磁珠直接加入到含H1N1亚型流感病毒的溶液中，在4℃作用2h，进行流感病毒的富集。
实施例3
（1）、用涡旋仪将羧基化磁性微球进行震荡分散12分钟。用无菌pH 7.6 PBS将磁性微球洗涤2次，后再用无菌pH 7.6 PBS重悬，储存于4℃备用。
（2）、称取0.01g磁性微球（约0.5×106 个），用磁性分离架将磁珠与溶液分离，用5ml 无菌pH 4.5 PBS将分离得到的磁性微球重悬。向悬液中加入0.18g的EDC于4℃反应15分钟，再加入0.45g的NHS于4℃反应4小时。反应结束后将磁珠从液体中分离出来，并用无菌pH 7.6 PBS洗涤三次后加入1ml无菌pH 7.6 PBS重悬，存于4℃。用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(英文缩写：EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（英文缩写：NHS）将羧基化磁珠的羧基活化，得到具有羧基活性的磁珠；
（3）、将含唾液酸胎球蛋白粉末用无菌pH 7.6 PBS中，配制成1mg/ml的溶液。将步骤（2）中活化的羧基磁珠加入到配制好的含唾液酸胎球蛋白1ml的溶液中，于4℃作用6h，进行共价结合；反应结束后用无菌pH 7.6 PBS洗涤三次后加入1ml无菌pH 7.6 PBS重悬，存于4℃
（4）、将步骤（3）中结合上含唾液酸胎球蛋白的磁珠直接加入到含H3N2亚型流感病毒的溶液中，在4℃作用2h，进行流感病毒的富集。
试验例1
采用实施例1制备的含唾液酸胎球蛋白磁珠可以富集并检测到20ml液体中的H5N1亚型流感病毒，其富集浓度可达病毒原液的10-10（原病毒液TCID50=10-6.5/100μl）。见图1，图中从右向左依次为DL2000maker,H5N1亚型禽流感病毒液稀释10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10,10-11,10-12,10-13倍的的检测结果。目的条带为320bp。
试验例2
采用实施例2制备的含唾液酸胎球蛋白磁珠可以富集并检测到30ml液体中H1N1亚型流感病毒,其富集浓度可达病毒原液的10-10（原病毒液TCID50=10-6.3/100μl）。见图2，从右向左依次为H1N1亚型禽流感病毒液稀释10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,DL500Maker,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10倍的的检测结果。目的条带为260bp。
试验例3
采用实施例3制备的含唾液酸胎球蛋白磁性微球可以富集并检测到18ml液体中H3N2亚型流感病毒，其富集浓度可达病毒原液的10-10（原病毒液TCID50=10-6.8/100μl）。见图3，图中从右向左依次为DL2000maker,H3N2亚型禽流感病毒液稀释10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10倍的检测结果。目的条带为265bp。

Claims (5)

1.一种以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，其特征在于：
用 1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基-碳二亚胺]与N-羟基琥珀酰亚胺联合活化羧基化磁柱的羧基，将含有唾液酸的胎球蛋白与活化后的磁珠进行共价结合；将结合上胎球蛋白的磁珠放入待检液体中，富集流感病毒。
2.实现权利要求1所述以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，包括以下步骤：
（1）用涡旋仪将羧基化磁珠进行震荡分散，直至磁珠均一悬浮于溶液中；
（2）用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺将羧基化磁珠的羧基活化，得到具有羧基活性的磁珠；
（3）将步骤（2）所活化的羧基磁珠加入到溶解后的含唾液酸胎球蛋白溶液中，进行共价结合；
（4）将步骤（3）中结合上含唾液酸胎球蛋白的磁珠直接加入到待检液体中，在4℃进行2h~4h流感病毒的富集。
3. 根据权利要求2所述的以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的活化方法按照以下质量比例进行制备:
EDC：磁性微球=（20±2:1），NHS：EDC=1：4；整个反应在4℃，无菌的pH 4.2～4.6 PBS中进行。
4. 根据权利要求2所述的以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的胎球蛋白是含有α2,3-唾液酸与25%的α2,6-唾液酸的胎球蛋白粉末，用无菌pH 7.2～7.6 PBS将其溶解，存于-20℃备用。
5. 根据权利要求2所述的以含唾液酸胎球蛋白磁珠富集流感病毒的方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的病毒包括各个亚型的流感病毒。
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