CN112415189A - 偶联新型冠状病毒s2蛋白的磁珠及其制备方法与应用 - Google Patents

偶联新型冠状病毒s2蛋白的磁珠及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用。所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠是将表面修饰有链霉亲和素的磁珠与生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白结合制得的。本发明还提供偶联后磁珠的冻干过程，以及偶联后磁珠的酵母展示scFv文库的筛选。该磁珠具有结合能力强，特异性好，稳定性高，便于操作的特点，既可用于新冠病毒S2抗体的富集，也可用于表达S2抗体的酵母细胞的淘选。利用本发明磁珠进行S2蛋白抗体的富集和表达S2蛋白抗体的细胞筛选，可将低浓度的特异性抗体捕获后进行浓缩，提高了灵敏度。在酵母展示scFv文库细胞筛选上，比流式细胞分选方法所需周期短，可快速筛出目标克隆酵母细胞，提高筛选效率。

Description

偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2可导致人类病毒性肺炎或肺部感染，与2002年的SARS冠状病毒和2012年的MERS冠状病毒同属于β冠状病毒属。新型冠状病毒由膜表面的四种糖蛋白（棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核蛋白）以及RNA核酸链组成，其中棘突蛋白（SpikeGlycoprotein）担负新冠病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，通过结合人的血管紧张素转换酶2（ACE2），从而介导病毒膜和细胞膜的融合，感染人的呼吸道上皮细胞，与病毒的传染能力相关，是新冠病毒最重要的表面膜蛋白。棘突蛋白含有S1与S2两个亚基，S1主要包含有受体结合区（Receptor binding domain，RBD），负责识别细胞的受体，S2则含有膜融合过程所需的基本元件，促进病毒细胞融合。
开发新的抗新型冠状病毒S2蛋白抗体并构建快速高效的抗体筛选技术，将为新型冠状病毒的诊断和治疗提供有力工具。
发明内容
本发明的目的是提供偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠，所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠是将表面修饰有链霉亲和素（SA）的磁珠与生物素（Biotin）标记的新型冠状病毒S2蛋白（生物素化的S2蛋白）结合制得的
其中，新型冠状病毒S2蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i）如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii）i）或ii）的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
蛋白偶联到磁珠的方式多种多样，可以通过羧基或氨基共价偶联的方式，直接将蛋白共价偶联到磁珠上，也可以通过标签抗体，将带有标签的蛋白偶联到磁珠上，在进行抗体捕获时，由于抗原蛋白的结合位点通常不止一个，因此用抗原去筛选出不同表位的抗体，需要抗原的结合表位能够全部暴露出来，通过羧基或氨基共价偶联到磁珠表面的抗原，都存在部分结合位点暴露不充分的可能性，而通过标签抗体偶联的抗原蛋白，则要求标签抗体和抗原蛋白间能很牢固结合在一起，也即需要高亲和力。由于SA和Biotin的解离常数在10-14M数量级，一旦结合往往是不可逆的强结合，因此链霉亲和素（SA）偶联的磁珠去结合生物素（Biotin）标记的抗原蛋白会更牢固，且抗原蛋白的结合位点也能更好地暴露出来。
优选地，磁珠的平均粒径大小为1-5μm左右，链霉亲和素共价偶联于磁珠表面，每mg磁珠偶联500-2000pmol链霉亲和素；所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠可结合游离生物素的量为500-2000pmol/mg磁珠。
更优选地，磁珠的平均粒径大小为2μm左右，链霉亲和素共价偶联于磁珠表面，每mg磁珠偶联1000pmol链霉亲和素；所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠可结合游离生物素的量为1000pmol/mg磁珠。
所述生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白中，生物素与新型冠状病毒S2蛋白的摩尔比为0.5-1:1。
本发明中使用的S2蛋白的生物素标记度大于0.5，检测生物素标记度使用的是HABA检测试剂盒（Thermo Fisher，Cat. No. 28005）。
所述新型冠状病毒S2蛋白是通过Avi酶定点标记生物素的蛋白，分子量为61.5KDa，通过生物素与SA不可逆地强结合方式，定向偶联到修饰有SA的磁珠上。
所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠中新型冠状病毒S2蛋白的含量为30-60μg/mg磁珠（初始偶联量为60μg/mg磁珠）。
本发明中，表面修饰有链霉亲和素的磁珠，即链霉亲和素磁珠购自Acrobiosystems，Cat. No. SMB-B01。
第二方面，本发明提供偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠的制备方法，包括以下步骤：
（1）将表面修饰有链霉亲和素的磁珠，用缓冲液洗涤3-5次；用磁性分离器进行分离，弃上清；
（2）加入生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白，室温混合孵育；
（3）孵育结束后，用磁性分离器分离反应后的磁珠，弃上清，用缓冲液洗涤3-5次。
前述的方法，步骤（1）包括：取1mg表面修饰有链霉亲和素的磁珠，加入1mL洗涤液混匀，将体系置于磁性分离器上2-3分钟，使磁珠完全被磁性分离器吸附住，弃上清，重复洗涤2次。
其中，所述洗涤液为PBST液（PBST缓冲液），其成分为含0.01-0.1%（优选0.05%）吐温20的0.01M PBS液。
步骤（2）包括：向洗涤后的磁珠中加入1mL用PBST液稀释到60μg/mL的生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白，涡旋混匀，于室温孵育0.5-2小时（优选1小时）。
步骤（3）包括：孵育结束后，将磁珠置于磁性分离器上2-3分钟，使磁珠完全被磁性分离器吸附住，收集上清用于测定新型冠状病毒S2蛋白的偶联量；磁珠用缓冲液洗涤3-5次（优选3次）。
采用酶联免疫吸附（ELISA）方法测定S2蛋白的偶联量，对偶联后剩余上清进行S2蛋白的定量检测，从而计算出偶联到磁珠上的蛋白量。
前述的方法，步骤（3）之后，还包括对磁珠进行冷冻干燥的步骤：用含0.01-0.1%（优选0.05%）吐温20和5-20%（优选10%）海藻糖的0.01M PBS液配制浓度为10mg/mL的磁珠悬液，然后进行冷冻干燥。
海藻糖作为冻干过程中使用的赋形剂，能让产品冻干后具有良好的干粉状态的外观，吐温20是表面活性剂，能够使磁珠在溶液中更好地分散均匀，防止沉淀或黏附到瓶壁上。其中，海藻糖可以被蔗糖、甘露醇替代，在进行单独的蛋白冻干工艺优化时，发现蔗糖需要的量较高且容易形成晶状物质散落开，不容易形成完整的干粉状；甘露醇和海藻糖含量基本一致，但是甘露醇对蛋白的保护效果要比海藻糖差，从保护偶联到磁珠上的蛋白的角度考虑，在冻干磁珠时，优选使用海藻糖。
前述的方法，可以将磁珠悬液装入棕色无菌西林瓶内，于-80℃冷冻干燥20-40小时。
冻干规格为2mg和5mg：2mg规格的磁珠，取200μL混合均匀的磁珠重悬液到2mL棕色无菌西林瓶进行冻干；5mg规格的磁珠，取500μL混合均匀的磁珠重悬液到7mL棕色无菌西林瓶进行冻干，在无菌洁净室进行分装操作。
进一步地，比较冻干前后磁珠的差异，包括：冻干前后磁珠的外观比较，冻干后的磁珠冻融前后的外观比较，冻干前后和冻融前后的磁珠的活性比较。
前述的方法，冻干前后磁珠的外观比较，是用电镜对磁珠外观形态扫描。
前述的方法，冻干后的磁珠冻融前后的外观比较，是用电镜进行磁珠外观形态的扫描，冻融磁珠分别为1次、2次和3次。
前述的方法，冻干前后和冻融前后的磁珠的活性比较，是检测磁珠与抗新型冠状病毒S2蛋白抗体的结合情况，比较磁珠的结合曲线差异。
第三方面，本发明提供所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠或按照上述方法制备的磁珠在抗新型冠状病毒S2蛋白抗体筛选中的应用（含非诊断和治疗目的）。
第四方面，本发明提供所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠或按照上述方法制备的磁珠在表达抗新型冠状病毒S2蛋白抗体的酵母展示文库筛选（酵母细胞的生物淘选，Bio-panning）中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）本发明提供的偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠，该磁珠具有结合能力强，特异性好，稳定性好，便于操作的特点，既可用于新冠病毒S2抗体的富集，也可用于表达S2抗体的酵母细胞的生物淘选。
（二）本发明用共价偶联SA的磁珠来偶联生物素化的新型冠状病毒S2蛋白，借助SA和Biotin的强亲和力结合，能够使S2蛋白定向不可逆偶联到磁珠上，保证S2蛋白的抗体结合位点能充分暴露。
（三）本发明提供的磁珠冻干方法，使磁珠能够更好地长期保存，便于运输。
（四）本发明提供的磁珠富集抗体的方法，能够有效筛出目标抗体。
（五）利用本发明磁珠进行S2蛋白抗体的富集和表达S2蛋白抗体的细胞筛选，可以将低浓度的特异性抗体捕获后进行浓缩，提高了灵敏度。在酵母展示scFv文库细胞筛选上，比流式细胞分选方法所需周期短，可以快速筛出目标克隆酵母细胞，提高筛选效率。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中生物素化新冠病毒刺突糖蛋白S2定量标准曲线。
图2A为本发明较佳实施例中冻干前磁珠外观的电镜扫描结果。
图2B为本发明较佳实施例中冻干后磁珠外观的电镜扫描结果。
图3A为本发明较佳实施例中冻干后磁珠冻融1次的外观电镜扫描结果。
图3B为本发明较佳实施例中冻干后磁珠冻融2次的外观电镜扫描结果。
图3C为本发明较佳实施例中冻干后磁珠冻融3次的外观电镜扫描结果。
图4为本发明较佳实施例中冻干前后磁珠和抗体的结合数据。
图5为本发明较佳实施例中磁珠冻融验证数据。
图6为本发明较佳实施例中S2抗体定量标准曲线。
图7为本发明较佳实施例中两轮磁珠分选后双阳性酵母百分比。
图8为本发明较佳实施例中第三轮流式分选后双阳性酵母百分比。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
以下实施例中偶联新型冠状病毒S2蛋白（SARS-CoV-2 S2）的磁珠制备过程主要使用的生物材料及试剂包括：生物素化的新型冠状病毒S2蛋白（生物素与新型冠状病毒S2蛋白的摩尔比为0.623:1），共价偶联SA的磁珠，含0.05%吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液（PBST）。
磁珠的平均粒径大小为2μm左右，链霉亲和素共价偶联于磁珠表面（SA磁珠），每mg磁珠偶联1000pmol链霉亲和素；表面修饰有链霉亲和素的磁珠可结合游离生物素的量为1000pmol/mg磁珠。
本发明涉及的磁珠偶联量检测方法为ELISA，使用的试剂和材料包括：包被液、TBST洗涤液、柠檬酸钠缓冲液、底物显色液（TMB显色液）均购自于索莱宝公司，牛血清白蛋白购自于Sigma公司。
本发明涉及到磁珠和抗体的结合实验，所用抗体为HEK293细胞表达的抗S2抗体。
本发明采用的仪器和工具为：
Milli-Q纯水系统（Millipore公司），全波长多功能酶标仪（BMG，CLARIOSTAR）,磁性分离器（赛默飞公司），移液器购自美国瑞宁公司，离心机为德国艾本德离心机，5430R。
实施例1 新冠病毒S2蛋白磁珠的制备和偶联量测定
一、实验材料
1. 主要试剂：
链霉亲和素磁珠(Acrobiosystems，Cat. No. SMB-B01)；生物素化新冠病毒刺突糖蛋白S2 (Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) S2 protein, His, Avitag™，Acrobiosystems，Cat. No. S2N-C52E8)；抗S2抗体（Acrobiosystems，Cat. No.S2N-S86 )；Streptavidin，horseradish peroxidase conjugated (Thermo Fisher，Cat. No. 21126)；10×ELISA包被液（索莱宝，Cat. No. C1055）；20×TBST缓冲液（索莱宝，Cat. No.T1082）；0.1mol/L无菌柠檬酸钠缓冲液，pH4.5（索莱宝，Cat. No. C1013）；单组分TMB显色液（索莱宝，Cat. No. PR1200）；ELISA终止液（索莱宝，Cat. No. C1058）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，Sigma-Aldrich，Cat. No. SRE0098-100G）；KH2PO4（国药，Cat. No. 10017692)，十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，国药，Cat. No. 10020392)，氯化钠（NaCl，国药，Cat. No. 10019318)，氯化钾（KCl，国药，Cat. No. 10016392)。可拆卸96孔酶标板（Costar，Cat. No. 42592）；封板膜(博特森生物技术有限公司，SF-400)。
2. 主要耗材与仪器：
15ml无菌离心管（TrueLine，Cat. No. TR2010）；50ml无菌离心管（TrueLine，Cat. No.TR2012）；超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，DL-CJ-2ND）；磁性分离器（ThermoFisher Scientific）；多功能酶标仪(BMG CLARIOSTAR)；隔水恒温培养箱（天津泰斯特，GH4500）；自动洗板机（BioTek，405LS）；不同量程移液器和配套的无菌枪头（美国瑞宁公司）。
3. 溶液配制：
0.01M磷酸盐缓冲液的配制方法：称取 0.2722g KH2PO4，3.58g Na2HPO4·12H2O，8.0063g NaCl，0.2066g KCl溶于900mL超纯水，搅拌至全部溶解，定容至1L，测定pH应在7.3-7.4，用0.22μm滤膜进行无菌过滤。
PBST缓冲液：向0.01M磷酸盐缓冲液中加入0.05%吐温-20。
1×ELISA包被液：量取100mL 10×ELISA包被液（索莱宝，Cat. No. C1055），加入900mL超纯水，配制成1×ELISA包被液。
1×TBST缓冲液：用超纯水将20×TBST缓冲液（索莱宝，Cat. No. T1082）稀释20倍，如取100mL 20×TBST缓冲液，加入1900mL超纯水。
BSA封闭液：称取2g BSA，加入100mL 1×TBST缓冲液混匀溶解完全，配制成2% BSA封闭液。
底物缓冲液（柠檬酸钠缓冲液）：将0.1mol/L无菌柠檬酸钠缓冲液，pH4.5（索莱宝，Cat. No. C1013）稀释100倍，如取10mL 0.1mol/L无菌柠檬酸钠缓冲液，加入990mL超纯水。
二、磁珠偶联S2蛋白
1. 在超净台中，取SA磁珠到无菌离心管，每毫克SA磁珠，加1000μL PBST缓冲液作为洗涤液，用磁性分离器进行吸附2分钟，磁珠全部被吸附后，去洗涤液上清，重复洗涤3次并去掉上清。
2. 用PBST缓冲液稀释生物素标记的S2蛋白至60μg/mL，向每毫克的洗涤后的磁珠中加入1mL稀释至60μg/mL的S2蛋白，盖紧离心管盖子，置于涡旋混合反应器上，室温混合充分反应1小时。
3. 用磁性分离器分离反应后的磁珠，首先将反应后的上清，收集至另一个无菌离心管（用于测定上清蛋白残留量，从而计算磁珠上的蛋白偶联量），再加入PBST缓冲液，按照步骤1的操作过程，洗涤磁珠4次，最后加入PBST缓冲液将磁珠完全重悬混匀备用。
三、新冠病毒刺突糖蛋白S2偶联磁珠的偶联量测定（ELISA方法）
1. 包被：将抗S2抗体用ELISA包被液稀释到1μg/mL，以100μL每孔的量加入到96孔板对应的孔，封板膜将酶标板封好，水平放置于4℃冰箱过夜反应（16小时）。
2. 洗板：用1×TBST缓冲液，300 μL每孔，洗板机洗板3次，最后一次将板子在干净的卫生纸上拍打至纸上无液体印迹（卫生纸上拍过的地方不可以重复再拍打，防止污染）。
3. 封闭：用2%BSA封闭液，300 μL每孔，加入到孔板内，水平放置于37℃恒温隔水培养箱孵育封闭1小时。
4. 洗板：重复步骤2。
5. 加入标准品和待测偶联后上清样品：将标准品，用样品稀释液从0.1 μg/mL梯度稀释到0.0000048μg/mL，2倍梯度稀释，共12个浓度点。待测的上清样品，从1000倍稀释到64000倍，2倍梯度稀释。样品稀释液为含0.5%BSA的TBST缓冲液，标准品和待测样品均按每孔加样100μL，加到对应的孔中，将板子水平放置于37℃恒温箱孵育反应1小时。
6. 洗板：重复步骤2。
7. 加检测二抗（HRP-SA）：用含0.5%BSA的TBST缓冲液将检测辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（Streptavidin，horseradish peroxidase conjugated，Thermo Fisher，Cat.No. 21126) 按1:10000的比例稀释，混匀，100μL每孔，水平放置于37℃恒温箱孵育反应1小时。
8. 洗板：重复步骤2。
9. 显色：用排枪200μL每孔加入TMB显色液到板孔中，水平放置于37℃恒温箱反应20分钟。
10. 终止：用ELISA终止液，排枪50μL每孔加入到板孔中，则终止反应。并在微量振荡器上混匀1min。
11. 读数：将终止后的板子，在多功能酶标仪上读数，读数波长为450 nm和630nm，450 nm为测定波长，630 nm为参比波长。
四、实验结果
实验得到标准的标准曲线数据（表1），并根据标准曲线拟合的线性方程（图1），以及待测样品的OD450值，计算出每个稀释倍数对应的待测上清中Biotin-S2的含量，选择稀释2000倍到16000倍线性好的4个浓度，计算平均值，从而计算出偶联到磁珠上的蛋白量（表2）。
Figure 392437DEST_PATH_IMAGE001
Figure 981681DEST_PATH_IMAGE002
实施例2 新冠病毒S2蛋白偶联磁珠的冻干和性能测定
一、实验材料
1. 主要试剂：
链霉亲和素预包板（Streptavidin Coated Plates，Clear，96-Well，Acrobiosystems，Cat. No. SP-11)；生物素化新冠病毒刺突糖蛋白S2 (Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) S2 protein，His,Avitag™，Acrobiosystems，Cat. No. S2N-C52E8)；抗S2抗体（Acrobiosystems，Cat. No.S2N-S86 )；PE标记抗人抗体（PE anti-Human IgG Fc，Biolegend，Cat. No. 409304) ；辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（Streptavidin，horseradish peroxidase conjugated，Thermo Fisher，Cat. No. 21126) ；10×ELISA包被液（索莱宝，Cat. No. C1055）；20×TBST缓冲液（索莱宝，Cat. No. T1082）；0.1mol/L无菌柠檬酸钠缓冲液，pH4.5（索莱宝，Cat. No. C1013）；单组分TMB显色液（索莱宝，Cat. No.PR1200）；ELISA终止液（索莱宝，Cat. No. C1058）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，Sigma-Aldrich，Cat. No. SRE0098-100G）；D-(+)-海藻糖二水合物（Sigma-Aldrich，Cat. No. T9531-10G）；磷酸二氢钾（KH2PO4，国药，Cat. No. 10017692)，十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，国药，Cat. No. 10020392)，氯化钠（NaCl，国药，Cat. No.10019318)，氯化钾（KCl，国药，Cat. No. 10016392)。可拆卸96孔酶标板（Costar，Cat. No.42592）；封板膜(博特森生物技术有限公司，SF-400)。
2. 主要耗材与仪器：
15ml无菌离心管（TrueLine，Cat. No. TR2010）；50ml无菌离心管（TrueLine，Cat. No.TR2012）；磁性分离器（Thermo Fisher Scientific）；西林瓶（肖特新康药品包装有限公司，中硼260）；冻干机（Telstar，lyobeta 5PS）；多功能酶标仪(BMG CLARIOSTAR)；隔水恒温培养箱（天津泰斯特，GH4500）；自动洗板机（BioTek，405LS）；不同量程移液器和配套的无菌枪头（美国瑞宁公司）。
3. 溶液配制：
32%海藻糖母液：称取32g D-(+)-海藻糖二水合物，加入80mL超纯水，搅拌完全溶解后补加超纯水定容至100mL，再经0.22μm过滤器过滤除菌，备用。
其他溶液的配制参考实施例1的溶液配制方法。
二、磁珠冻干
1. 重悬偶联后的磁珠：用PBST缓冲液将偶联洗涤后的磁珠完全重悬混匀备用。每10mg磁珠，加入1mL含有0.05%吐温20和10%海藻糖的0.01M磷酸盐缓冲液，并充分混合均匀，得到10mg/mL的磁珠重悬液。
2. 将重悬后的磁珠，充分混合均匀，按照2mg和5mg规格冻干，2mg规格的磁珠，取200μL混合均匀的磁珠重悬液到2mL棕色无菌西林瓶进行冻干，5mg规格的磁珠，取500μL混合均匀的磁珠重悬液到7mL棕色无菌西林瓶进行冻干。分装后，盖上胶塞，留出胶盖的冻干孔缝隙，将西林瓶置于冻干托盘上，并送进-80℃真空冷冻干燥机中进行冻干，冻干1天。
三、磁珠冻干前后的比较（外观以及结合抗体的能力）
磁珠的外观，用电镜进行扫描检测，分别扫描冻干前的磁珠和冻干后的磁珠，并比较冻干前后的磁珠和抗体的结合能力，同时对冻干后的磁珠进行冻融实验：将磁珠的冻干品重构到1mg/mL，-20℃冻融1次、2次和3次，用电镜扫描磁珠形态，并比较冻融前后的磁珠和抗体的结合能力变化，磁珠和抗体的结合能力实验操作步骤如下：
1. 准备新鲜偶联的磁珠，用于和冻干后的磁珠进行比较，现偶联磁珠的方法参考实施例1中磁珠的偶联过程。
2. 冻干磁珠的重构：用超纯水，按1mg/mL浓度将磁珠重构，并将磁珠从西林瓶转移至反应管。
3. 洗涤磁珠：每毫克SA磁珠，加1mL PBST缓冲液作为洗涤液，用磁性分离器进行吸附2分钟，磁珠全部被吸附后，去洗涤液上清，重复洗涤3次并去掉上清，每毫克磁珠用1mLPBST缓冲液重悬至1mg/mL并混匀备用。
4. 将重悬的磁珠加入到孔板中，每孔100μL，并将孔板水平置于板式磁力吸附器，静置3分钟，去掉上清。
5. 加入抗体：用PBST缓冲液将抗S2抗体从100μg/mL稀释到0.0244μg/mL，加入到去掉上清的磁珠的孔中，置于酶标板的微量振荡器上，室温混合充分反应1小时。
6. 收集反应后的抗体上清：将孔板水平置于板式磁力吸附器，静置3分钟，收集100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL的抗体反应后的上清，用于测定抗体的结合量。
7．洗涤磁珠：每孔加200μL PBST缓冲液，将孔板水平置于板式磁力吸附器，静置3分钟，去掉洗涤液上清，重复洗涤4次。
8．加入检测二抗：用含PBST缓冲液将检测PE标记抗人抗体（PE anti-Human IgGFc，Biolegend，Cat. No. 409304)按1:200的比例稀释，100μL每孔，置于酶标板的微量振荡器上，室温混合避光反应1小时。
9. 洗涤磁珠：重复步骤7。
10. 转移磁珠到黑色孔板：每孔加100μL PBST缓冲液，将磁珠充分混匀，并转移到黑色孔板中。
11. 读数：设定检测波长，激发波长（excitation）488 nm，发射波长（emission）575nm，带宽10nm，保持磁珠悬浮混匀状态，在10分钟内测定信号值，并拟合数据。
12. 结果：得到冻干前后磁珠的电镜扫描图（图2A~图2B）以及冻融1次、2次、3次的磁珠电镜扫描图（图3A~图3C），并得到冻干前后磁珠和抗体的结合数据（表3），拟合数据，得到对应的数据图（图4），以及冻融前后的磁珠和抗体的结合数据（表4），拟合数据，得到对应的数据图（图5）。
四、磁珠的抗体结合量测定（ELISA方法）
1. 包被：将生物素化新冠病毒刺突糖蛋白S2用1×TBST缓冲液稀释到1μg/mL，加入到链霉亲和素预包板（Acrobiosystems，Cat. No. SP-11)，每孔100μL，封板膜将酶标板封好，水平放置于37℃恒温隔水培养箱孵育封闭1小时。
2. 洗板：用1×TBST缓冲液，300 μL每孔，洗板机洗板3次，最后一次将板子在干净的卫生纸上拍打至纸上无液体印迹（卫生纸上拍过的地方不可以重复再拍打，防止污染）。
3. 加入标准品和待测抗体上清样品：标准品为抗S2抗体，用样品稀释液（含0.5%BSA的TBST缓冲液）从0.05μg/mL梯度稀释到0.0000244μg/mL，2倍梯度稀释，共12个浓度点。待测的抗体上清样品，反应前浓度在25μg/mL到100μg/mL的样品从1000倍稀释到64000倍，2倍梯度稀释，反应前浓度在12.5μg/mL的样品从100倍稀释到6400倍，2倍梯度稀，反应前浓度在6.25μg/mL的样品从20倍稀释到1280倍，2倍梯度稀释。标准品和待测样品均按每孔加样100μL，加到对应的孔中，将板子水平放置于37℃恒温箱孵育反应1小时。
4. 洗板：重复步骤2。
5. 加检测二抗：用含0.5%BSA的TBST缓冲液将检测二抗辣根过氧化物酶标记抗人Fc抗体（Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ fragment specific (minX Bov，Hrs，Ms Sr Prot) (Jackson，Cat. No. 109-035-098)）按1:15000的比例稀释，混匀，100μL每孔，水平放置于37℃恒温箱孵育反应1小时。
6. 洗板：重复步骤2。
7. 显色：用排枪200μL每孔加入TMB显色液到板孔中，水平放置于37℃恒温箱反应20分钟。
8. 终止：用ELISA终止液，排枪50μL每孔加入到板孔中，则终止反应。并在微量振荡器上混匀1min。
9. 读数：将终止后的板子，在多功能酶标仪上读数，读数波长为450 nm和630 nm，450 nm为测定波长，630 nm为参比波长。
五、实验结果
1. 磁珠冻干前后比较：冻干后的磁珠形态保持完好，与冻干前无差异（图2A~图2B）,冻干后的磁珠，冻融3次，磁珠依然保持了良好的外观形态（图3A~图3C），冻干前后磁珠和抗体的结合无差异，偏差为3%，偏差小于10%，说明冻干后的磁珠依然保持了很好的活性（表3），拟合数据，得到对应的数据图（图4），冻融3次的磁珠活性下降2.48%，说明冻融3次对磁珠的抗体结合没有明显影响（表4和表5），拟合数据，得到对应的数据图（图5）。
2. 冻干后磁珠的抗体结合量检测结果：实验得到标准的标准曲线数据（表6），并根据标准曲线拟合的线性方程（图6），以及待测样品的OD450值，计算出每个稀释倍数对应的待测上清中抗体的含量，选择线性好的稀释梯度，计算平均值，从而计算出结合到磁珠上的最大的结合量为63.281μg抗体/mg磁珠（表7）。
Figure 558156DEST_PATH_IMAGE003
Figure 999371DEST_PATH_IMAGE004
Figure 876060DEST_PATH_IMAGE005
Figure 245993DEST_PATH_IMAGE006
Figure 575343DEST_PATH_IMAGE007
实施例3 新冠病毒S2蛋白偶联磁珠用于酵母表面展示scFv文库的筛选
一、实验材料
1. 主要试剂：
生物素化新冠病毒刺突糖蛋白S2 (Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) S2protein, His,Avitag™，Acrobiosystems, Cat. No. S2N-C52E8)；PE anti-Human IgGFc (Biolegend, Cat. No. 409304)；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA,Sigma-Aldrich, Cat. No. SRE0098-100G）；胎牛血清FBS (CellMax, Cat. No.SA212.02)；磷酸二氢钾（KH2PO4，国药，Cat. No. 10017692)，十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，国药，Cat. No. 10020392)，氯化钠（NaCl，国药，Cat. No. 10019318)，氯化钾（KCl，国药，Cat. No. 10016392)。酵母 YPD 培养基（Thermo Fisher Scientific）、酵母生长培养基SDCAA（Thermo Fisher Scientific）和酵母诱导培养基SGCAA（ThermoFisher Scientific）；偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠；抗cmyc抗体（Anti-cmyc，Abcam）；FITC羊抗鸡（Biolegend）、APC标记链霉亲和素抗体（Streptavidin-APC 抗体，Biolegend）、PE标记链霉亲和素抗体（Streptavidin-PE，Biolegend）。
2. 主要耗材与仪器：
15ml无菌离心管（TrueLine, Cat. No. TR2010）；50ml无菌离心管（TrueLine, Cat.No. TR2012）；磁性分离器（Thermo Fisher Scientific）；10mL磁力分选柱（Thermo FisherScientific）；恒温培养摇床；流式分选仪AriaII（BD）；流式细胞仪（BD FACSCelesta™flow cytometer）；不同量程移液器和配套的无菌枪头（美国瑞宁公司瑞宁）。
3. 溶液配制：
溶液的配制参考实施例1的溶液配制方法。
二、酵母表面展示scFv文库的复苏和诱导表达
1. 取一支1×1010的冻存酵母，加入到100mL YPD培养基中，于30℃，200-250转摇床过夜培养12-15小时。
2. 取50mL复苏后的酵母(约为1×1010)，在4000转速下离心10分钟，去上清，用500mL SDCAA培养基重悬，于30℃，200-250转摇床过夜培养12-15小时。
3. 取50mL培养的酵母(约为1×1010)，在4000转的转速下离心10分钟，去上清，用500mL SGCAA培养基重悬（OD600=0.5），于20℃，200-250转摇床，诱导培养30-40小时，测定OD600，浓度达到原来的2-4倍。
三、用磁珠进行酵母表面展示scFv文库的第一轮分选
1. 将经过诱导表达的酵母库取1010，在3500转的转速下离心10分钟，去上清，加入20mL PBS(含1%FBS)，洗涤酵母2次，用5mL PBS（含1%FBS）重悬酵母，并加入到2mg新冠病毒刺突糖蛋白S2偶联磁珠中，于冰上4℃孵育10分钟，并在反应过程中，每2分钟翻转混匀一次，保证磁珠和酵母充分接触。
2. 加入40mL PBS(含1%FBS)至反应后的酵母，在3000 rpm离心3-5分钟，去掉上清。再加入50ml PBS（含1%FBS）将酵母重悬，轻轻混匀，并用200目的无菌尼龙网过滤到一个新的50ml无菌离心管中。
3. 将磁力分选柱放入磁性分选器中，加入3mL预冷的PBS（含1%FBS），冲洗分选柱。
4. 加入7-10mL重悬的酵母液至分选柱，等悬液流尽后，将柱子从磁性分选器上取出，再立即放回让磁力分选柱上的酵母重排均匀，防止局部聚集。
5. 加2mL PBS（含1% FBS）轻轻冲洗酵母，待洗液流尽，再加入7-10mL重悬的酵母液至分选柱，重复步骤4，直至所有酵母悬液全部流过分选柱。
6. 加3mL预冷的PBS（含1%FBS），冲洗分选柱3次，从磁性分选器上取下磁力分选柱，加7-10mL PBS（含1%FBS），用活塞将柱子上的酵母全部推至15mL无菌离心管。
第一轮分选得到106-107个酵母细胞，将这些细胞进行扩大培养（SDCAA培养基）和诱导表达（SGCAA培养基），具体操作方法参考步骤二。
四、用磁珠进行酵母表面展示scFv文库的第二轮分选
将第一轮得到的酵母库中取 1010 离心，在3500转的转速下离心10分钟，去上清，加入20mL PBS(含1% FBS)，洗涤酵母2次，用5mL PBS（含1%FBS）重悬酵母，并加入到2mg新冠病毒刺突糖蛋白S2偶联磁珠（实施例1制备）中，于冰上4℃孵育10分钟，并在反应过程中，每2分钟翻转混匀一次，保证磁珠和酵母充分接触。后续步骤和第一轮分选步骤一致。
五、流式分选技术对酵母表面展示scFv文库的第三轮分选
向500µL含有1×1010-10×1010个第二轮分选后的酵母细胞的悬液中加入抗cmyc标签抗体（1:200）和终浓度为100nM的生物素化S2蛋白，冰上孵育30分钟。用500µL PBS（含1%FBS）洗涤2次，加入500µL FITC-羊抗鸡的二抗（1:200）和APC标记的链霉亲和素（Streptavidin-APC，1:200），冰浴30分钟。用500µL PBS（含1%FBS）洗涤2次，用4mL PBS（含1%FBS）重悬酵母细胞，冰上避光放置至分选。用流式分选仪AriaII进行分选，将cmyc标记和抗原标记均为阳性的酵母细胞群分选出来继续扩大培养和诱导表达。后续可以进行第四轮甚至更多轮的分选，需要注意的是需要更换其他标记的二抗，如PE标记的链霉亲和素（Streptavidin-PE），以避免筛出直接结合二抗（APC标记的链霉亲和素，Streptavidin-APC）的scFv酵母。
六、实验结果
将经过第一轮和第二轮磁珠分选的最终scFv酵母以及经过流式分选的scFv酵母，用流式分析仪，检测与S2蛋白结合以及Cmyc标签（Cmyc是一种含10个氨基酸的短肽标签EQKLISEEDL，用于检测蛋白在酵母表面表达情况）正确表达的双阳性酵母的百分比，流式数据图，横坐标对应Cmyc的阳性信号（FITC），纵坐标对应抗原S2蛋白的阳性信号（APC），经过两轮磁珠分选后的双阳性酵母的百分比为13.55%，针对抗原S2的阳性酵母百分比74.69%（图7），偶联S2抗原的磁珠可以将特异性结合抗原的酵母筛选出，并便于进行进一步的流式分选。在第三轮的FACS分选之后，双阳性酵母的阳性率从13.55%升高到87%（图8）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司
<120> 偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用
<130> KHP211110137.7YS
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 528
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 1
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn
20 25 30
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys
35 40 45
Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
50 55 60
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
65 70 75 80
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
85 90 95
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
100 105 110
Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
115 120 125
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
130 135 140
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
165 170 175
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
210 215 220
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
225 230 235 240
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
245 250 255
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
260 265 270
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
275 280 285
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
290 295 300
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
305 310 315 320
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
325 330 335
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
340 345 350
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
355 360 365
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
370 375 380
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
385 390 395 400
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
405 410 415
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
420 425 430
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
435 440 445
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
450 455 460
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
465 470 475 480
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
485 490 495
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
500 505 510
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
515 520 525

Claims (4)

1.偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠，其特征在于，所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠是将表面修饰有链霉亲和素的磁珠与生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白结合制得的；
其中，新型冠状病毒S2蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i）如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii）i）或ii）的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白；
磁珠的粒径大小为1-5μm，链霉亲和素共价偶联于磁珠表面，每mg磁珠偶联500-2000pmol链霉亲和素；所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠可结合游离生物素的量为500-2000pmol/mg磁珠；
所述生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白中，生物素与新型冠状病毒S2蛋白的摩尔比为0.5-1:1；
所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠中新型冠状病毒S2蛋白的含量为30-60μg/mg磁珠；
所述磁珠的制备方法包括以下步骤：
（1）将表面修饰有链霉亲和素的磁珠，用缓冲液洗涤3-5次；
（2）加入生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白，室温混合孵育；
（3）孵育结束后，用磁性分离器分离反应后的磁珠，弃上清，用缓冲液洗涤3-5次；
（4）对磁珠进行冷冻干燥：用含0.01-0.1%吐温20和5-20%海藻糖的0.01M PBS液配制浓度为10mg/mL的磁珠悬液，然后于-80℃冷冻干燥20-40小时。
2.根据权利要求1所述的磁珠，其特征在于，步骤（1）包括：取1mg表面修饰有链霉亲和素的磁珠，加入1mL洗涤液混匀，将体系置于磁性分离器上2-3分钟，弃上清，重复洗涤2次；
其中，所述洗涤液为PBST液，其成分为含0.01-0.1%吐温20的0.01M PBS液；
步骤（2）包括：向洗涤后的磁珠中加入1mL用PBST液稀释到60μg/mL的生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白，涡旋混匀，于室温孵育0.5-2小时；
步骤（3）包括：孵育结束后，将磁珠置于磁性分离器上2-5分钟，收集上清用于测定新型冠状病毒S2蛋白的偶联量；磁珠用缓冲液洗涤3-5次。
3.权利要求1或2所述磁珠在抗新型冠状病毒S2蛋白抗体筛选中的应用；所述应用为非诊断和治疗目的。
4.权利要求1或2所述磁珠在表达抗新型冠状病毒S2蛋白抗体的酵母展示文库筛选中的应用。
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