CN106540473A - 一种核酸适配体修饰磁性光子晶体微球富集赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents
一种核酸适配体修饰磁性光子晶体微球富集赭曲霉毒素a的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种核酸适配体修饰磁性二氧化硅光子晶体微球富集赭曲霉毒素A的方法，该方法通过将单分散纳米二氧化硅和磁性四氧化三铁共组装为磁性光子晶体微球，通过对多孔微球表面的氨基化修饰，1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐/N‑羟基琥珀酰亚胺修饰固定赭曲霉毒素A的适配体，通过微球表面的核酸适配体能与赭曲霉毒素特异性结合原理，对赭曲霉毒素进行富集，通过高效液相色谱方法对富集效率进行了检测，在6μM赭曲霉毒素A适配体浓度修饰100个微球表面下，富集回收效率达60％左右。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体修饰磁性光子晶体微球富集赭曲霉毒素A的方法。
背景技术
赭曲霉毒素(ochratoxins)是由曲霉属和青霉属等产毒菌株产生的一组结构类似的有毒次级代谢产物，主要存在于谷物及其副产品中，此外在可可、咖啡、干果、酒类中也有存在。赭曲霉毒素一共有A、B、C、D四种化合物等七种结构类似物，其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)的毒性最大、分布最广、对农作物污染最重、与人类健康关系最密切。研究表明，OTA毒素具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，并致癌、致畸、致突变，对动物和人体健康具有极大的潜在危害。赭曲霉毒素A还可以通过母乳传递给下一代，1993年国际癌症研究机构(The International Agency for Research on Cancer，IARC)将OTA列为Ⅱ类致癌物。许多国家和组织对食品及饲料中OTA制定了严格的限量标准[54]，如欧洲委员会规定谷物原料和谷物加工品中OTA限量标准分别为5μg/kg和3μg/kg，我国在国标GB 2761-2011中规定谷物、豆类及其制品中OTA的允许量不得超过5μg/kg。
赭曲霉毒素A(OTA)是一种无色结晶粉末状化合物、分子式为C20H18C1NO6，摩尔分子量为403.82g/mol。OTA微溶于水，易溶于极性有机试剂和碳酸氢钠溶液，其甲醇溶液在冰箱中保存一年不会分解。
高灵敏度、低成本的检测技术方法是预防农产品、食品、饲料中赭曲霉毒素污染和食品安全评估的最有效手段之一。目前常用的赭曲霉毒素检测方法有色谱法、免疫分析法等。但是，色谱技术方法需要昂贵的检测设备，专门的仪器操作技术人员，检测成本高，很难在食品安全生产、销售一线推广和普及；免疫学技术虽然简单易行，但是该技术对有些真菌毒素检测的灵敏度不够，而且检测需要消耗大量的抗体试剂；在这些方法检测之前，样品前处理技术也是保证准确检测赭曲霉毒素的前提。样品前处理目前使用的主要方法有液液萃取和净化、固相萃取和净化、免疫亲和柱富集和净化法、QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)法提取和净化等。这些技术存在很多缺陷，例如液液萃取技术劳动强度大，程序不能实现自动化，且需要大量的有机溶剂，对环境污染大，毒素损失较多；固相萃取对样品中毒素的作用为非特异性吸附，因此对毒素的净化纯度和回收率不可能同时达到很高；免疫亲和柱比较昂贵，且不可重复使用，因此限制其大规模使用等。开发新型赭曲霉度富集、净化和检测为一体的新技术方法具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸适配体修饰磁性光子晶体微球富集赭曲霉毒素A的方法。该方法有效地解决了现有技术中存在的问题。
一种核酸适配体修饰磁性二氧化硅光子晶体微球富集赭曲霉毒素A的方法，是通过一步方法将单分散纳米二氧化硅和磁性四氧化三铁共组装为磁性光子晶体微球，通过对多孔微球表面的氨基化修饰，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺修饰固定赭曲霉毒素A的适配体，通过微球表面的核酸适配体能与赭曲霉毒素特异性结合原理，对赭曲霉毒素进行富集。
本发明的方法包括磁性SiO2三维光子晶体微球的制备、表面修饰、适配体固定、OTA富集、检测步骤，具体如下：
(1)磁性纳米颗粒的制备；
(2)磁性二氧化硅光子晶体微球的制备和修饰；
(3)适配体的固定；
(4)OTA毒素的富集；
其中：
(1)磁性纳米颗粒的制备：应用FeCl3(2mol/L，2mLNa2SO3(1mol/L)和80mL NH3·H2O溶液(0.85mol/L)并强力搅拌，反应30min；反应结束后，用脱氧水洗涤沉淀，至悬浮液的PH小于7.5，然后再用无水乙醇洗涤三次制备纳米磁性Fe3O4颗粒；
(2)磁性二氧化硅光子晶体微球的制备和修饰：
用法制备磁性二氧化硅微球乳液：取一定质量的Fe3O4粉末，分散于无水乙醇和双蒸水的锥形瓶中，超声30min，再加入9mL氨水，充分混匀，置于磁力搅拌器上，将此混合液体作为A液；另取干净的烧杯，加入正硅酸乙酯(TEOS)和无水乙醇，充分混匀，将混匀的溶液作为B液；将B液倒入A液中，强力搅拌2min，然后将搅拌速度减缓，将锥形瓶封口，继续搅拌6h，得到褐色乳液，将此乳液用无水乙醇和双蒸水各洗三遍，并将乳液浓度调整为15％；
以油包水方法制备磁性二氧化硅光子晶体微球；将制备的微球用盛有甲基硅油的容器收集，在60℃的烘箱内加热12h，去除水分；将微球用正己烷进行清洗，去除硅油，用乙醇清洗干净；最后将光子晶体微球放入马弗炉内700℃真空煅烧2h以增加光子晶体的机械强度，得到磁性二氧化硅光子晶体微球；
磁性二氧化硅光子晶体微球的羧基化修饰：将一定数量的微球置于食人鱼洗液中浸泡6h，用双蒸水洗净，100℃烘干3h；将烘干的微球浸入含有5％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)甲苯溶液中，60℃震荡过夜，使之表面带上氨基基团；反应结束后，依次用甲苯、乙醇、双蒸水各洗三遍，并在100℃下烘干30min，使氨基基团结合得更加牢固；然后将氨基化的微球置于琥珀酸溶液(100mg琥珀酸溶于4.7mLDMSO和0.3mL 0.1M NaHCO3)中，震荡反应3h，然后用DMSO除去微球表面多余的琥珀酸，再用双蒸水洗净，备用；
(3)适配体的固定：上述羧基化微球和一定浓度的OTA核酸适配体(5mM Mg2+Tris-HCl缓冲液)共孵育，并在溶液中加入2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3mgN-羟基琥珀酰亚胺；在室温下反应过夜之后，用Tris-HCl缓冲液清洗三遍，每次震荡10min；
(4)OTA毒素的富集：将120μL样品放入装有已固定适配子微球的离心管中，样品用含5mM Mg2+Tris-HCl缓冲液稀释，在37℃下结合1h。反应结束后，除去多余液体，用Tris-HCl缓冲液清洗表面，再加入120μL洗脱液(V乙腈：V甲醇＝1:1)，室温震荡洗脱1h，将洗脱液进行高效液相色谱检测其OTA含量。
进一步地，上述方法步骤(2)中制备磁性光子晶体微球的加磁量，Fe3O4:正硅酸乙酯(TEOS)(mg/mL)＝3.3。
步骤(3)中所述OTA核酸适配体为：5’-NH2-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-3’(SEQ ID NO.1)；OTA核酸适配体浓度为1000ng/mL-6000ng/mL，；100个微球。
本发明的核酸适配体修饰磁性光子晶体微球富集赭曲霉毒素A的方法，通过纳米磁性四氧化三铁和二氧化硅自组装技术和磁性二氧化硅光子晶体微球表面修饰固定赭曲霉毒素适配子技术，以表面修饰赭曲霉毒素适配子的光子晶体为载体对样品中赭曲霉毒素进行富集，富集回收效率达60％左右。
附图说明
图1磁性SiO2光子晶体微球磁性；A为磁性微球在液体中悬浮状态正面照片，B为加磁场后微球的照片。
图2磁性SiO2光子晶体微球表面光学结构特性；A为四种磁性光子晶体微球普通显微镜照片，B为该四种磁性微球的反射峰。
图3磁性SiO2光子晶体微球表面扫描电镜照片；A为微球的单个磁性光子晶体微球的照片，B为一破碎小球的电镜照片，C和D微球白色部分电镜照片，E和F为微球黑色部分电镜照片，G和H为元素分析。
图4赭曲霉毒素A富集回收效率。
具体实施方式
本发明所用赭曲霉毒素A标准品，四氧乙基硅烷(TEOS)，丁二酸(琥珀酸)，二甲基亚砜(DMSO)、APTES购于Sigma-Aldrich；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐购于赛默飞世尔科技公司，N-羟基琥珀酰亚胺购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；甲醇、乙腈、乙酸购于德国默克公司；FeCl3·6H2O，Na2SO3，浓盐酸，无水乙醇(≥99.7％)，氨水(25～28％)、甲基硅油购于国药集团化学试剂有限公司；正己烷购于南京化学试剂公司；OTA-aptamer序列和对应荧光标记互补序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司SangonBiotech(Shanghai)Co.,Ltd.合成。
本发明所用的仪器主要有：
微型漩涡混合仪QL-866 海门麒麟医用仪器厂
全自动立式高压灭菌器YXQ-LS-30SII 上海博讯事业有限公司
精密pH计 上海三信仪表厂
电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140上海精宏实验设备有限公司
震荡培养箱ZQTY-70-T上海知楚仪器有限公司
晶芯微阵列芯片扫描仪 上海博奥生物有限公司
磁力搅拌器 AM-3250B型 天津奥特赛恩斯仪器有限公司
超声波清洗器 KQ-300B型昆山市超声仪器有限公司
台式低速自动平衡离心机 TDZ5-WS型 长沙湘智离心机仪器有限公司
电热恒温鼓风干燥箱 DHG-914型上海精宏实验设备有限公司
管式炉OTL1200 南京南大仪器厂
微流注射泵 LSP01-1A 河北保定兰格恒流泵有限公司
强磁铁牌号N50 亘昌磁材店
透射电子显微镜 H600-II型 日本日立公司
金相显微镜 MJ33型 广州明美光电技术有限公司
光纤光谱仪 USB2000+ 蔚海光学仪器(上海)有限公司
震荡培养箱ZQTY-70-T上海知楚仪器有限公司摇床
高效液相色谱仪Agilent 1100 美国Agilent公司
实施例1
(1)磁性纳米颗粒制备：将3mL FeCl3(2mol/L溶解于2mol/L HCl)加入含有10.33mL双蒸水的三角瓶中，然后将2mLNa2SO3(1mol/L)在磁力搅拌的作用下在1min内逐滴加入。刚滴入时，颜色由浅黄变为红色，当颜色再变为浅黄色时，将此溶液加入到80mLNH3·H2O溶液(0.85mol/L)中并强力搅拌，黑色沉淀迅速形成，继续搅拌，反应30min。反应结束后，用脱氧水洗涤沉淀，至悬浮液的PH小于7.5，然后再用无水乙醇洗涤三次。将沉淀在室温真空下干燥得到黑色粉末，得到的纳米颗粒存放在真空干燥皿中备用。
(2)磁性二氧化硅光子晶体微球的制备和修饰：
用法制备磁性二氧化硅微球乳液：取一定质量的Fe3O4粉末，加入到含有16.25mL无水乙醇和24.75mL双蒸水的锥形瓶中，超声30min，再加入9mL氨水，充分混匀，置于磁力搅拌器上，将此混合液体作为A液。另取干净的烧杯，加入4.5mL正硅酸乙酯(TEOS)和45.5mL无水乙醇，充分混匀，将混匀的溶液作为B液。将B液倒入A液中，强力搅拌2min，然后将搅拌速度减缓，将锥形瓶封口，继续搅拌6h，得到褐色乳液，将此乳液用无水乙醇和双蒸水各洗三遍，并将乳液浓度调整为15％，应用微流体自组装器件以油包水方法制备磁性二氧化硅光子晶体微球；将制备的微球用盛有甲基硅油的容器收集，在60℃的烘箱内加热12h，去除水分。将微球用正己烷进行清洗，去除硅油，最后用乙醇清洗干净。最后将光子晶体微球放入马弗炉内700℃真空煅烧2h以增加光子晶体的机械强度，得到磁性光子晶体微球。得到的磁性SiO2光子晶体微球其磁性特性见图1，图1A表明该磁性微球在溶液中具有很好的悬浮性，图B表明该微球具有很好的磁性特征，这些为微球用于磁分离、富集真菌毒素提供了条件。光学表面结构特性如图2，图2A是通过该共组装工艺制备的4种磁性微球，表明该工艺可以制备不同种磁性光子晶体微球，图2B为4种不同磁性光子晶体微球的反射光谱，说明这些微球具有很好的光子晶体结构的光学特性。其表面扫描电镜照片为图3。由图3可见该微球表面光滑(图3A)，具有光结构色的一面纳米二氧化硅排列整齐(B、C、D)，黑色结构的一面纳米二氧化硅排列不整齐(E、F、G)，H表面该微球表面主要元素有O、Si、Fe组成。
磁性二氧化硅光子晶体微球的羧基化修饰：将一定数量的微球置于食人鱼洗液中浸泡6h，用双蒸水洗净，100℃烘干3h，尽量保证微球内外的水分去除干净。将烘干的微球浸入含有5％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)甲苯溶液中，60℃震荡过夜，使之表面带上氨基基团。反应结束后，依次用甲苯、乙醇、双蒸水各洗三遍，并在100℃下烘干30min，使氨基基团结合得更加牢固。然后将氨基化的微球置于琥珀酸溶液(100mg琥珀酸溶于4.7mLDMSO和0.3mL 0.1M NaHCO3)中，震荡反应3h，然后用DMSO除去微球表面多余的琥珀酸，再用双蒸水洗净，备用；
(4)OTA适配体的固定：将羧基化微球和一定浓度的OTA核酸适配体于5mM Mg2+Tris-HCl缓冲液中孵育，并在溶液中加入2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3mgN-羟基琥珀酰亚胺，提高偶联效率。在室温下反应过夜之后，用Tris-HCl缓冲液清洗三遍，每次震荡10min，以清除多余的未结合的适配子，通过化学键合方法将赭曲霉毒素A5’氨基化核酸适配体固定于修饰的微球表面；
(5)OTA毒素的富集：将120μL样品放入装有已固定适配子微球的离心管中，样品用Tris-HCl缓冲液(含5mM Mg2+)稀释，在37℃下结合1h。反应结束后，除去多余液体，用Tris-HCl缓冲液清洗表面，再加入120μL洗脱液(V乙腈：V甲醇＝1:1)，室温震荡洗脱1h，将洗脱液进行高效液相色谱检测其OTA含量。结果见图4。图4表明随着适配体浓度的增加，对真菌毒素OTA的富集效率增加，当在6uM适配体浓度时，富集效率可以达到60％左右。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 一种核酸适配体修饰磁性光子晶体微球富集赭曲霉毒素A的方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
Claims (4)
1.一种核酸适配体修饰磁性二氧化硅光子晶体微球富集赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，通过一步方法将单分散纳米二氧化硅和磁性四氧化三铁共组装为磁性光子晶体微球，通过对多孔微球表面的氨基化修饰，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺修饰固定赭曲霉毒素A的适配体，通过微球表面的核酸适配体能与赭曲霉毒素特异性结合原理，对赭曲霉毒素进行富集。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)磁性纳米颗粒的制备：用FeCl3和NH3·H2O溶液强力搅拌，反应30min；反应结束后，用脱氧水洗涤沉淀，至悬浮液的PH小于7.5，然后再用无水乙醇洗涤三次制备纳米磁性Fe3O4颗粒；
(2)磁性二氧化硅光子晶体微球的制备和修饰：
用法制备磁性二氧化硅微球乳液：取一定质量的Fe3O4粉末，分散于无水乙醇和双蒸水的锥形瓶中，超声30min，再加入9mL氨水，充分混匀，置于磁力搅拌器上，将此混合液体作为A液；另取干净的烧杯，加入正硅酸乙酯(TEOS)和无水乙醇，充分混匀，将混匀的溶液作为B液；将B液倒入A液中，强力搅拌2min，然后将搅拌速度减缓，将锥形瓶封口，继续搅拌6h，得到褐色乳液，将此乳液用无水乙醇和双蒸水各洗三遍，并将乳液浓度调整为15％；
以油包水方法制备磁性二氧化硅光子晶体微球；将制备的微球用盛有甲基硅油的容器收集，在60℃的烘箱内加热12h，去除水分；将微球用正己烷进行清洗，去除硅油，用乙醇清洗干净；最后将光子晶体微球放入马弗炉内700℃真空煅烧2h以增加光子晶体的机械强度，得到磁性二氧化硅光子晶体微球；
磁性二氧化硅光子晶体微球的羧基化修饰：将一定数量的微球置于食人鱼洗液中浸泡6h，用双蒸水洗净，100℃烘干3h；将烘干的微球浸入含有5％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)甲苯溶液中，60℃震荡过夜，使之表面带上氨基基团；反应结束后，依次用甲苯、乙醇、双蒸水各洗三遍，并在100℃下烘干30min，使氨基基团结合得更加牢固；然后将氨基化的微球置于琥珀酸溶液中，震荡反应3h，然后用DMSO除去微球表面多余的琥珀酸，再用双蒸水洗净，备用；
(3)适配体的固定：上述羧基化微球和一定浓度的OTA核酸适配体在5mM Mg2+Tris-HCl缓冲液中共孵育，并在溶液中加入2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3mgN-羟基琥珀酰亚胺；在室温下反应过夜之后，用Tris-HCl缓冲液清洗三遍，每次震荡10min；
(4)OTA毒素的富集：将样品放入装有已固定适配子微球的离心管中，样品用含5mM Mg2+Tris-HCl缓冲液稀释，在37℃下结合1h；反应结束后，除去多余液体，用Tris-HCl缓冲液清洗表面，再加入V乙腈：V甲醇＝1:1的洗脱液，室温震荡洗脱1h，将洗脱液进行高效液相色谱检测其OTA含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中制备磁性光子晶体微球的加磁量，Fe3O4:正硅酸乙酯(TEOS)(mg/mL)＝3.3。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述OTA核酸适配体为：5’-NH2-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’；OTA核酸适配体浓度为1000ng/mL-6000ng/mL，100个微球。
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