CN105056915A - 一种核酸适配体修饰磁性金属有机骨架介质的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于材料科学和现代分离分析领域，涉及一种新型核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架介质的制备方法和应用，步骤如下：首先制备纳米级的氨基功能化磁性四氧化三铁(NH₂-Fe₃O₄)，然后采用水热合成法合成磁性金属有机骨架介质，最后采用偶联剂链霉亲和素为中间体制备赭曲霉素A核酸适配体修饰磁性金属有机骨架101介质(OTA？Apt-MMIL-101)。采用四氧化三铁与3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应功能化，将NH₂-Fe₃O₄与金属有机骨架101介质(MIL-101)合成试剂在水热反应条件下，化学键合法合成OTA？Apt-MMIL-101，洗涤，真空干燥。本发明的OTA？Apt-MMIL-101具有稳定性好和高选择性识别性能，适用于生物、环境和食品等复杂样品的选择性富集分离。

Description

一种核酸适配体修饰磁性金属有机骨架介质的制备及应用

技术领域

本发明属于材料科学与现代分离分析领域，涉及到新型磁性MIL-101的制备及修饰核酸适配体。该磁性固相萃取介质对特定的赭曲霉素A具有高特异性识别性能，适用于生物、环境和食品等复杂样品的选择性分离富集。

背景技术

对于复杂生物样品中痕量、超痕量组分分析而言，因其基体复杂、分析对象含量低，使样品前处理变得极其不易。简单、快速、高效、绿色、高选择性的样品前处理技术是分析复杂样品如血浆、尿液、环境样品和食品中痕量或超痕量待测组分的重要步骤。因样品前处理技术受到越来越多的关注与重视，如固相萃取、固相微萃取、液相微萃取、基质固相分散萃取、微波辅助萃取、加速溶剂萃取等技术。其中固相萃取和固相微萃取是研究最为广泛的两种技术，两种技术的核心是介质材料的制备，近年来，为了解决复杂体系分离分析的问题，国内外众多研究组对固相萃取的新型分离介质研发、新方法的探索、分离分析联用方面进行了深入研究，其中，磁性固相萃取(Magneticsolid-phaseextraction,MSPE)的前处理研究取得了长足的发展，MSPE借助外磁场作用实现分离，避免了高速离心，简化了操作，同时具有高通量和高富集能力等优点。基于固相吸附萃取原理，核心在于所用的固相涂层材料及涂渍技术，但目前商品化分离介质种类有限，其中大多数都存在萃取容量小、选择性较低，萃取时易受样品中基体或杂质干扰等影响。

金属-有机骨架(Metal-organicframeworks,MOFs)材料是一种通过金属离子和多齿有机配体间的组装作用而构成的结晶多孔材料。MOFs材料的骨架结构、孔径分布和比表面积等结构参数可以方便地通过选择合适的金属和有机配体并控制它们间的连接方式来进行调节，使其具有良好的可修饰性，可通过各种功能基团来实现专一性、复杂性、可控性的应用。MOFs材料因其多孔、孔径可调、比表面积大、易于修饰以及具有不饱和配位的金属离子中心而在在样品前处理领域中的表现更加令学者们期待，值得深入研究，但是该材料存在耐溶剂性能差问题，而MIL-101具有良好的耐溶剂性能，在前处理中具有良好的应用前景，但其吸附性能主要靠介质间的非特异性吸附，选择性较差，急需对其进行修饰，以满足复杂样品高选择性前处理和高灵敏、快速检测的要求。

适配体(Aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)经体外筛选得到的，是一类能与靶目标专一性特异性结合的单链DNA或RNA。具有以下优点，适配体靶分子范围广，亲和力高，特异性强，筛选制备方便且纯度高、批次间重现性好，性质稳定，容易修饰功能团，适配体在化学修饰后作为配基可固定在各种材料表面，如金属有机骨架材料、硅胶、玻璃等，应用于各类分离技术，包括液相色谱、亲和色谱、毛细管电色谱、生物传感器等，因核酸适配体在分析化学等领域得到了广泛应用，已成为国内外研究者关注的焦点。结合MIL-101的表面积大、易修饰以及适配体高选择性的特点，发展核酸适配体修饰的MIL-101在复杂样品前处理中具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明针对样品前处理技术重要性及其分析过程中关键地位的认识，结合目前国内外MSPE方法及核酸适配体和金属有机骨架材料研究存在的问题及发展趋势，将磁性Fe₃O₄氨基功能化与硝酸铬、对苯二甲酸和氢氟酸高温下化学反应，再采用高亲和作用固载核酸适配体，获得具有简单、高选择、高效的适配体修饰的磁性MIL-101。

本发明的内容包括一种新型分离介质核酸适配体修饰的磁性MIL-101的制备方法，按以下步骤进行：

(1)将Fe²⁺和Fe³⁺混合，加入氨水生成磁性Fe₃O₄，然后采用Fe₃O₄与正硅酸乙酯在加入氨水引发制备Fe₃O₄SiO₂，再采用Fe₃O₄SiO₂与APTES、无水乙醇反应生成NH₂-Fe₃O₄。

(2)将硝酸铬于超纯水中充分溶解，依次加入对苯二甲酸和氢氟酸，混合均匀，得到合成MIL-101的反应溶液。

(3)在(2)所述合成MIL-101的反应溶液中加入NH₂-Fe₃O粒子，混合均匀，放入水热反应釜中密封，水热合成反应制备磁性MIL-101；

(4)将上述制备的磁性MIL-101加入PBS缓冲液中，活化反应，加入链霉亲和素溶液，室温振摇反应，制得磁性MIL-101/链霉亲和素，PBS缓冲液清洗，低温保存。

(5)取上述制备所得磁性MIL-101/链霉亲和素，加入Tris-HCl缓冲溶液，混合均匀后加入赭曲霉素A核酸适配体溶液，37℃振摇反应，再用Tris-HCl缓冲溶液清洗，制得所述核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料，于缓冲液中低温保存。进一步地，所述步骤(3)的反应温度为200℃，反应时间为8h，NH₂-Fe₃O₄的用量为900mg。

进一步地，所述步骤(4)的反应温度为25℃，反应溶液为PBS缓冲液，pH为6.0，反应时间为24h，链霉亲和素用量为50μL，浓度为5mg/L。

进一步地，所述步骤(5)中所述的Tris-HCl缓冲溶液赭曲霉素A核酸适配体的缓冲液为为pH＝7.4，30mmolTris-HCl(pH＝7.4，30mmol)，赭曲霉素A适配体用量为1.25nmol，反应温度37℃，反应时间24h。

进一步地，所述步骤(4)中，磁性MIL-101的用量为10mg。

进一步地，所述步骤(5)中磁性MIL-101/链霉亲和素用量为10mg。

进一步地，所述步骤(1)中所述Fe2+和Fe3+的摩尔比为1:2。

本发明的内容还包括按照上述的方法制备得到的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料OTAApt-MMIL-101。

进一步地，所述核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料OTAApt-MMIL-101，具有在水、甲醇、乙腈、乙酸溶剂中具有良好的耐溶剂性能，确保材料可以重复使用及较好的重现性。

进一步地，所述核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料OTAApt-MMIL-101显示出磁分离的简单，对小分子赭曲霉素A具有特异性识别性能。

具体地，本发明的技术方案为：

本发明采用一种简单、有效的化学键合策略合成了耐溶剂稳定的新型OTAApt-MMIL-101的MSPE介质，其对赭曲霉毒素具有具有高特异性识别性能，及高萃取容量，修饰不同的核酸适配体对相应的靶目标具有良好的选择性富集能力。具有高效、高选择的特点，满足复杂样品中超痕量对象的分析要求。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1.本发明的OTAApt-MMIL-101的合成流程图。

图2.本发明的OTAApt-MMIL-101的磁滞曲线。(a)NH₂-Fe₃O₄；(b)MagneticMIL-101；(c)OTAApt-MMIL-101。

图3.本发明的OTAApt-MMIL-101对不同物质的选择性。

图4.本发明的OTAApt-MMIL-101对不同物质的吸附容量。

图5.本发明的OTAApt-MMIL-101分析水稻和花生样品的色谱图。(a)标准溶液50μg/L直接进样；(b)水稻或花生样品；(c)1.0ng/kg加标样品。1.赭曲霉素A。

具体实施例

以下结合本发明的实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1核酸适配体修饰的磁性MIL-101的制备

本发明的OTAApt-MMIL-101的合成示意图如图1所示：

(1)NH₂-Fe₃O₄的制备：准确称量28.1gFeCl₃·6H₂O,14.4gFeSO₄·7H₂O,用150mL蒸馏水溶解，倒入500mL三口烧瓶，机械搅拌，通氮除氧10min。快速逐滴加入70mL25％的氨水，之后以0.5mL/min恒定速率将10mL油酸滴入烧瓶中，恒温搅拌1h。将所得磁流体置于磁铁上沉降20min后倒掉上层液，采用去蒸馏水超声清洗磁分离。量取15mL磁流体置于200mL正丙醇中，超声15min后，在机械搅拌下加入NH₃·H₂O(25％)(5.0mL)，连续加入TEOS(2.0mL)，在30℃下保持12h。用CH₃OH和蒸馏水各清洗4次，在150℃下真空干燥。取上述Fe₃O₄SiO₂250mg分散在300.0mLCH₃CH₂OH和H₂O(v/v，149/1)的混合溶液中，超声30min，滴加入APTES2.0mL，在室温下搅拌8h，离心30min(转速为10000r/min)，用CH₃CH₂OH清洗5次。在150℃下真空干燥。

(2)磁性MIL-101的制备：称量1200mgCr(NO₃)₃·9H₂O使用14.4mL超纯水充分溶解后依次加入498mg对苯二甲酸和0.5mLHF，混合均匀后放入水热反应釜中密封，加入NH₂-Fe₃O₄900mg，水热合成反应在220℃下进行8h。反应完成后待反应釜冷却至室温，所得产物分别使用二甲基甲酰胺和热乙醇浸泡清洗，每次3h，各清洗三次，150℃真空干燥12h.

(3)OTAApt-MMIL-101的制备：取10mg磁性MIL-101于10mM，pH为6.01mL磷酸缓冲液中，置于离心管，涡旋3min，加入2mLEDC/NHS(4:1)混合液，静置10min，再加入50μL，浓度为5mg/mL链霉亲和素溶液，室温下密封振摇，反应24h，反应完成后采用磷酸缓冲液洗涤3次。再加入1.25μmolTris-HCl缓冲液(25mM,pH＝7.4)配制的赭曲霉素A核酸适配体溶液，37℃振摇反应12h.反应结束后采用Tris-HCl缓冲液清洗3次，并于Tris-HCl缓冲液中4℃保存。

以下实施例应用OTAApt-MMIL-101的选择性分离富集相应的化合物，开展了磁性固相萃取应用。

实施例2OTAApt-MMIL-101的选择性和富集能力

(1)选择性

OTAApt-MMIL-101对其目标物具有特异性识别性能，选取6种赭曲霉素A的类似物，赭曲霉素B(OchratoxinB,OTB)、黄曲霉素B1、黄曲霉素G1、黄曲霉素G2、乙酰甲喹和喹烯酮。OTAApt-MMIL-101对不同化合物的吸附能力通过MSPE萃取浓度为10μg/L绝对吸附量进行评估。采用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶液配制10μg/L的各物质的标准溶液，萃取体积为10mL，结果如表1所示。

表1OTAApt-MMIL-101对不同物质的吸附性能

如表1所示，本发明制备的OTAApt-MMIL-101对赭曲霉素A(OTA)具有很高的选择性萃取能力。而对于OTA的结构类似物，如赭曲霉素B、黄曲霉素B1、黄曲霉素G1、黄曲霉素G2、乙酰甲喹和喹烯酮的萃取量较低。基于OTB与OTA的结构有较高的相似度，该适配体修饰磁性MIL-101对OTB的选择性相对其它类似物较大，由此说明OTA适配体修饰的磁性MIL-101对OTA及高度结构类似物OTB具有较高的选择性。相比之下，乱序OTAApt-MMIL-101，及未经赭曲霉素A核酸适配体修饰的磁性MIL-101对OTA及其他6种结构类似物的萃取选择性较差，结果如图3所示，进一步证明赭曲霉素A核酸适配体修饰的磁性MIL-101对赭曲霉毒素具有高选择性。

(2)利用OTAApt-MMIL-101富集HEPES缓冲溶液配制一系列浓度的的赭曲霉素A的标准溶液，研究OTAApt-MMIL-101吸附容量，如图4所示，OTAApt-MMIL-101的吸附容量可达到222.2ng/mg，具有较高的萃取容量。

实施例3OTAApt-MMIL-101与HPLC-FLD联用分析食品中的痕量赭曲霉毒素的应用

(1)HPLC-FLD分析方法的建立

配制一系列浓度梯度为20.0、10.0、2.00、1.50、1.00、0.500、0.100、0.0500、0.0250μg/L等的赭曲霉素A标准溶液，通过赭曲霉素A核酸适配体修饰磁性MIL-101固相萃取与UPLC-FLD联用测定赭曲霉素A的标准曲线、线性范围、相关系数、检出限。在设定的浓度范围内，赭曲霉素A的标准方程为Y＝3.71×10⁵X+1.14×10⁴，在0.025-20μg/L的线性关系良好(相关系数为0.9998)，采用1μg/L标准溶液考察方法精密度(n＝5)RSD为3.2％，检出限6.7ng/L(检出限按信噪比3:1估算)。

(2)分析实际样品

称取粉碎的水稻或花生样品10.0g粉末于离心管中，加入30mL60％甲醇和水混合液，将其混匀后在室温下振摇5mim，分别萃取两次，合并萃取液，萃取液在10000rpm下离心10mim，减压旋干，加入20mLHEPES缓冲液重溶(如果有沉淀再次10000rpm离心)，备10mgOTAApt-MMIL-101萃取解析，并用HPLC-FLD联用进行检测，将所得峰面积代入线性方程中，计算赭曲霉素A的含量。加标浓度为1.0ng/g和10ng/g，采用上述步骤进行处理，加标验证，考察基体的影响，分析结果见表2和图5。

表2.MSPE-HPLC-FLD分析水稻和花生样品中赭曲霉毒素A(n＝5)

建立的方法具有良好的线性(相关系数为0.9998)，灵敏度较高，对所选的赭曲霉素A的检出限为6.7ng/L。将所建方法应用于花生和大米样品中赭曲霉素A的分析检测，在水稻中检测出赭曲霉素A，含量为3.53ng/Kg，对方法其进行加标验证，加标浓度为1.0ng/g和10ng/g，水稻和小麦样品的加标回收率较好为85.6～109％，RSD为3.5～8.2％，方法的精密度较好。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (10)

1.一种核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，按以下步骤进行：

(1)将Fe²⁺和Fe³⁺混合，加入氨水生成磁性Fe₃O₄，然后采用Fe₃O₄与正硅酸乙酯在加入氨水引发制备Fe₃O₄SiO₂，再采用Fe₃O₄SiO₂与APTES、无水乙醇反应生成NH₂-Fe₃O₄粒子；

(2)将硝酸铬于超纯水中充分溶解，依次加入对苯二甲酸和氢氟酸，混合均匀，得到合成MIL-101的反应溶液；

(3)在(2)所述合成MIL-101的反应溶液中加入NH₂-Fe₃O₄粒子，混合均匀，放入水热反应釜中密封，水热合成反应制备磁性MIL-101；

(4)将上述制备的磁性MIL-101加入PBS缓冲液中，活化反应，加入链霉亲和素溶液，室温振摇反应，制得磁性MIL-101/链霉亲和素，PBS缓冲液清洗，低温保存；

(5)取上述制备所得磁性MIL-101/链霉亲和素，加入Tris-HCl缓冲溶液，混合均匀后加入赭曲霉素A核酸适配体溶液，37℃振摇反应，再用Tris-HCl缓冲溶液清洗，制得所述核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料，于缓冲液中低温保存。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的反应温度为200℃，反应时间为8h，NH₂-Fe₃O₄的用量为90mg。

3.根据权利要求1所述的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)的反应温度为25℃，反应溶液为PBS缓冲液，pH为6.0，反应时间为24h，链霉亲和素用量为50μL，浓度为5mg/L。

4.根据权利要求1所述的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的Tris-HCl缓冲溶液为pH＝7.4，30mmol，赭曲霉素A适配体用量为1.25nmol，反应温度37℃，反应时间24h。

5.根据权利要求1所述的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，磁性MIL-101的用量为10mg。

6.根据权利要求1所述的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中磁性MIL-101/链霉亲和素用量为10mg。

7.根据权利要求1所述的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料OTAApt-MMIL-101的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述Fe²⁺和Fe³⁺的摩尔比为1:2。

8.按照上述权利要求1～7中任意一条所述的方法制备得到的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料。

9.根据权利要求8所述的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料，其特征在于：所述核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料，具有在水、甲醇、乙腈、乙酸溶剂中具有良好的耐溶剂性能，确保材料可以重复使用及较好的重现性。

10.根据权利要求8所述的核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料，其特征在于：所述核酸适配体修饰的磁性金属有机骨架材料显示出磁分离的简单，对小分子赭曲霉素A具有特异性识别性能。