TWI835609B - 具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架、其製備方法及電化學感測套組 - Google Patents
具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架、其製備方法及電化學感測套組 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提供一種具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架，包括磁性鐵金屬有機骨架、化學修飾物及捕獲探針，其中磁性鐵金屬有機骨架是由三價鐵離子、2-甲基咪唑及L-組胺酸形成的金屬有機骨架。其中磁性鐵金屬有機骨架內包括有容置空間，磁性奈米粒子位於磁性鐵金屬有機骨架的容置空間中，化學修飾物及捕獲探針共價連接至磁性鐵金屬有機骨架的表面。另外也提出具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架結合電化學感測器的電化學感測套組，並證實得以克服傳統金屬有機骨架結合電化學感測器靈敏度不足的問題。
Description
本發明關於一種金屬有機骨架的領域，特別關於金屬有機骨架的應用於電化學感測器進行目標生物物質分析的領域。
金屬有機骨架(metal-organic framework,MOF)是由金屬離子和配體藉由配位反應自組裝形成的具有分子內孔隙的有機-無機雜化材料，為目前無機材料領域及有機材料領域結合的代表，目前已有研究將金屬有機骨架應用於物質分離、物質吸附、催化劑、醫藥及生物感測等領域皆有相關的應用與發展。
一般金屬有機骨架應用於生物物質檢測是採用電化學方法，因此一般會結合電化學感測器，以形成基於金屬有機骨架的電化學感測器，其中電化學感測器通常為三電極系統，包括工作電極(working electrode,WE)、輔助電極(counter electrode,CE)與參考電極(reference electrode,RE)，其中工作電極可以於電解質環境下隨著電壓變化作為電子提供者或電子接收者，其中輔助電極則是與工作電極對應的角色，當工作電極作為電子提供者時，輔助電極則作
為電子接收者，而當工作電極作為電子接收者時，輔助電極則作為電子提供者，其中參考電極則是提供穩定的相對電位作為參考。
不過金屬有機骨架結合電化學感測器應用於生物感測領域上仍有不少瓶頸，由於金屬有機骨架是由金屬離子和配體共同組成，然而金屬離子和配體的分子軌域和電子態的重疊性較差，導致電子轉移受到限制，造成電荷在金屬有機骨架移動速率較低，並且金屬有機骨架外金屬有機骨架受到化學不穩定性、導電性不足和粒徑較大之影響，影響金屬有機骨架結合電化學感測器對目標生物物質分析的靈敏度，導致許多基於金屬有機骨架的電化學感測器有靈敏度不足的問題。
本發明的一目的為解決基於金屬有機骨架的電化學感測器有靈敏度不足的問題。
因此基於本發明的一目的，本發明提供一種具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架，包括：磁性鐵金屬有機骨架、化學修飾物及捕獲探針，其中磁性鐵金屬有機骨架是由三價鐵離子、2-甲基咪唑及L-組胺酸經配位結合形成的金屬有機骨架，且磁性鐵金屬有機骨架內包括有容置空間，磁性奈米粒子位於磁性鐵金屬有機骨架的容置空間中，化學修飾物及捕獲探針共價連接至磁性鐵金屬有機骨架的表面；其中化學修飾物為硫堇；其中捕獲探針用於與檢體中的目標生物物質結合，且捕獲探針可為寡核苷酸、抗體或肽鏈。
其中檢體為唾液、尿液、血清、血漿、全血、細胞、細胞萃取物、淋巴液、腦脊髓液、羊水、肺泡沖洗液、汗液、淚液、痰液、胸水、腹水、關節液、精液或糞便。
其中生物物質為核酸、胜肽、蛋白質或化合物。
本發明提供具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法，步驟包括將1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞、N-羥基琥珀醯亞胺、磁性鐵金屬有機骨架及水於室溫(25℃)下混合反應，再來以純水沖洗，接著添加硫堇、捕獲探針及水後，於室溫(25℃)下混合反應，以獲得具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架。
其中本發明提供具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法中，進一步包括在完成添加硫堇、捕獲探針及水後，先以純水沖洗，再於烘箱進行烘乾，以獲得具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架。
其中磁性鐵金屬有機骨架是由磁性奈米粒子、L-組胺酸、聚乙烯吡咯烷酮及水與甲醇混合反應，再來添加氯化鐵六水合物及水後於4℃靜置反應，最後加入2-甲基咪唑及甲醇後於室溫下混合反應形成。
其中磁性奈米粒子的粒徑小於1,000奈米(nanometer,nm)。
本發明提供一種第一電化學感測套組，包括電化學感測器、如前所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架、檢測探針及氧化還原酵素；其中電化學感測器包括有工作電極，工作電極包括有用於偵測電流變化的表面，以及與表面相對的背面，工作電極的背面設置有磁鐵；其中檢測探針，用於與目標生物物質結合，且檢測探針上修飾有第一標記物；其中氧化還原酵素用於進行氧化還原反應，且氧化還原酵素上修飾有第二標記物，第二標記物用於與第一標記物結合。
一種第二電化學感測套組，包括電化學感測器、如前所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架、捕獲探針及嵌入劑；其中電化學感測器，用於進行電化學分析，電化學感測器包括有工作電極，工作電極包括有用於偵測電流變化的表面，以及與表面相對的背面，工作電極的背面設置有磁鐵；其中捕獲探針為寡核苷酸；其中嵌入劑用於嵌入捕獲探針與目標生物物質的結合處，並進行氧化還原反應；其中捕獲探針為寡核苷酸；其中目標生物物質為核酸。
其中第二電化學感測套組，進一步包括檢測探針，檢測探針用於與目標生物物質結合，且嵌入劑會嵌入檢測探針與目標生物物質的結合處，其中檢測探針為寡核苷酸。
其中電化學分析為微分脈衝伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)、循環伏安法(cyclic voltammetry,CV)、電化學阻抗譜法(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)或方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)。
綜上所述，本發明為基於磁性鐵金屬有機骨架的電化學感測器的不僅克服一般金屬有機骨架結合電化學感測器靈敏度不足的問題，同時還具有良好的特異性，以及具有寬廣的定量範圍。
圖1為MNP、骨架A、骨架B、骨架C及骨架D的傅立葉轉換紅外光譜儀分析的光譜圖。
圖2為骨架A的晶體經掃描式電子顯微鏡拍攝的圖像。
圖3為骨架B的晶體經掃描式電子顯微鏡拍攝的圖像。
圖4為MNP的晶體經掃描式電子顯微鏡拍攝的圖像。
圖5為骨架C的晶體經掃描式電子顯微鏡拍攝的圖像。
圖6為骨架D的晶體經掃描式電子顯微鏡拍攝的圖像。
圖7為MNP、骨架C及骨架D的超導量子干涉儀器分析的磁滯曲線圖。
圖8為對目標核酸水溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，測量檢體分別為唾液、尿液及血清時，不同濃度的目標核酸水溶液所產生的電流強度的回歸分析圖。
圖9為對目標核酸水溶液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，測量檢體分別為唾液、尿液及血清時，不同濃度的目標核酸水溶液所產生的電流強度的回歸分析圖。
圖10為對目標病毒溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試及使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，測量檢體為血清時，不同濃度的目標病毒溶液所產生的電流強度的回歸分析圖。
圖11為對目標萃取液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試及使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，測量檢體為血清時，不同濃度的目標萃取液所產生的電流強度的回歸分析圖。
圖12為對副甲狀腺素水溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，測量檢體為血清時，不同濃度的副甲狀腺素水溶液所產生的電流強度的回歸分析圖。
圖13為對S蛋白溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，測量檢體為血清時，不同濃度的S蛋白溶液所產生的電流強度的回歸分析圖。
圖14為對微小核糖核酸溶液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，測量檢體為血清時，不同濃度的微小核糖核酸溶液所產生的電流強度的回歸分析圖。
雖然用以界定本發明的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準差。在此處，「約」通常系指實際數值在一特定數值或一範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，是本發明所屬領域中具有通常知識者的考慮而定。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
於本發明的各個實施例中，所述「水溶液」中的溶劑皆為超純水，舉例如氯化鐵六水合物水溶液，即指以氯化鐵六水合物作為溶質，並以超純水作為溶劑，其他依此類推，但實際實施時不以超純水為限，亦可使用純水、去離子、水蒸餾水或二次蒸餾水作為溶劑。
於本發明的各個實施例中，所述「甲醇溶液」中的溶劑皆為甲醇，舉例如2-甲基咪唑甲醇溶液，即指以2-甲基咪唑作為溶質，並以甲醇作為溶劑，其他依此類推。
以下於的電化學分析中皆以網版印刷三電極(TE-100,Zensor，台中)作為電化學感測器，網版印刷三電極包括工作電極(working electrode,WE)、輔助電極(counter electrode,CE)與參考電極(reference electrode,RE))，其中工作電極可以於電解質環境下隨著電壓變化作為電子提供者或電子接收者；其中輔助電極則是與工作電極對應的角色，當工作電極作為電子提供者時，輔助電極則作為電子接收者，而當工作電極作為電子接收者時，輔助電極則作為電子提供者；其中參考電極則是提供穩定的相對電位作為參考，其中電化學分析包括微分脈衝伏安法，但實際實施時不限於此，亦可為循環伏安法、電化學阻抗譜法或方波伏安法等電化學的分析方法；其中於循環伏安法及電化學阻抗譜法中，使用的電解質溶液為3mM鐵氰化鉀溶液，其中3mM鐵氰化鉀溶液的製備方法為將98.8mg的鐵氰化鉀並加入10ml的0.1M磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline,PBS)混合後即完成製備；其中於微分脈衝伏安法及方波伏安法中，使用的電解質溶液為對苯二酚/過氧化氫溶液或10mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCL)水溶液；其中於微分脈衝伏安法中使用的對苯二酚/過氧化氫溶液的製備方法，為混合為10mM的對苯二酚溶液及10mM的過氧化氫溶液以1：1的體積比進行混合即完成製備；其中10mM的對苯二酚溶液的製備方法為取11.2mg對苯二酚溶於0.1M的磷酸鹽緩衝液1mL後形成100mM的對苯二酚溶液，再來取100μL的100mM的對苯二酚溶液加入900μL的0.1M磷酸鹽緩衝液，以獲得10mM的對苯二酚溶液；
其中10mM的過氧化氫溶液為取1μL的10M的過氧化氫溶液，再來加入999μL的0.1M的磷酸鹽緩衝液，以獲得10mM的過氧化氫溶液。
本發明提供一種具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架，包括：磁性鐵金屬有機骨架、化學修飾物及捕獲探針，其中磁性鐵金屬有機骨架是由三價鐵離子、2-甲基咪唑及L-組胺酸經配位結合形成的金屬有機骨架，且磁性鐵金屬有機骨架內包括有容置空間，磁性奈米粒子位於磁性鐵金屬有機骨架的容置空間中，化學修飾物及捕獲探針共價連接至磁性鐵金屬有機骨架的表面；其中化學修飾物為硫堇；其中捕獲探針用於與檢體中的目標生物物質結合，且捕獲探針可為寡核苷酸、抗體或肽鏈。
於本發明的一實施例中，檢體為唾液、尿液、血清、血漿、全血、細胞、細胞萃取物、淋巴液、腦脊髓液、羊水、肺泡沖洗液、汗液、淚液、痰液、胸水、腹水、關節液、精液或糞便等臨床上常使用的檢體。
於本發明的一實施例中，生物物質為核酸、胜肽、蛋白質或化合物。
於本發明的一實施例中，磁性奈米粒子的粒徑小於1,000奈米。
為了使本發明所屬技術領域中具有通常知識者易於理解本發明的內容，以下結合實施例與圖式對本發明作進一步的說明，各個實施例僅用於說明本發明的技術特徵，提及的內容並非對本發明的限定。
製備例1：具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法
步驟包括將1mL的0.064g/mL的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞水溶液及1mL的0.128g/mL的N-羥基琥珀醯亞胺水溶液至燒杯混合，以形成第一庫存溶液，接著取1mL的第一庫存溶液及1mL的1mg/mL的磁性鐵金屬有機骨架水溶液至離心管，接著於室溫(25℃)下以震盪器震盪反應1小時，使磁性鐵
金屬有機骨架上的L-組胺酸上的羧基活化後，再來以磁力座分離磁性鐵金屬有機骨架以移除上清液並使用超純水沖洗2次，接著於離心管中加入500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL的捕獲探針水溶液後，於室溫(25℃)下以震盪器震盪反應1小時，再來以磁力座分離完成修飾的磁性鐵金屬有機骨架並移除殘餘的液體，最後以超純水潤洗2次後於烘箱進行烘乾，即可獲得「修飾有捕獲探針及硫堇的磁性鐵金屬有機骨架」；其中硫堇乙酸鹽水溶液中所提供的硫堇即為化學修飾物；其中修飾有捕獲探針及硫堇的磁性鐵金屬有機骨架指於磁性鐵金屬有機骨架上經由與1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞水溶液及1mL的0.128g/mL的N-羥基琥珀醯亞胺水溶液反應，使磁性鐵金屬有機骨架上的L-組胺酸的羧酸活化，進而得以與硫堇及捕獲探針形成共價連結，使磁性鐵金屬有機骨架的表面上修飾有捕獲探針及硫堇，而修飾有捕獲探針及硫堇的磁性鐵金屬有機骨架即為本發明所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架；以下於各實施例中「修飾有捕獲探針及硫堇的磁性鐵金屬有機骨架」皆以「骨架E」表示；於以下的實施例中，捕獲探針分別以第一捕獲探針、第二捕獲探針、第三捕獲探針及第四捕獲探針作為示範例，其中第一捕獲探針為寡核苷酸，且第一捕獲探針的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，第一捕獲探針的核苷酸序列由5’往3’方向依序為TTTTTTTTTTGCGCGACATTCCGAAGAA，總計有28個核苷酸、分子量為8,559.6Da且解鏈溫度(melting temperature,Tm)為55.5℃，而當捕獲探針為第一捕獲探針時，於「具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法」中的「......接著於離心管中加入500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL的捕獲探針水溶液後......」的步驟中，捕獲探針水溶液的濃度為0.2μM；其中第二捕獲探針為抗體，且為抗副甲狀腺素抗體的抗體(Anti-Parathyroid Hormone/PTH Antibody,Mouse Monoclonal，貨品編號：13192-MM02,SinoBiological)，而當捕獲探針為第二捕獲探針時，於「具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法」中的「......接
著於離心管中加入500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL的捕獲探針水溶液後......」的步驟中，捕獲探針水溶液的濃度為500ng/mL；其中第三捕獲探針為抗體，且為抗新型冠狀病毒的S蛋白(Spike Protein)的抗體(COVID-19 S-Protein(S1RBD)ELISA Kit，貨品編號：ELV-COVID19S1-1,RayBiotech)，而當捕獲探針為第三捕獲探針時，於「具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法」中的「......接著於離心管中加入500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL的捕獲探針水溶液後......」的步驟中，捕獲探針水溶液的濃度為500ng/mL；其中第四捕獲探針為寡核苷酸，且第四捕獲探針的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示，第四捕獲探針的核苷酸序列由5’往3’方向依序為AGTGAATTCTACCAGTGCCATA，總計有22個核苷酸、分子量為6,927.6Da且解鏈溫度(melting temperature,Tm)為40.9℃，並且於檢測探針的3’端修飾有3'-胺基-修飾基C7，而當捕獲探針為第四捕獲探針時，於「具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法」中的「......接著於離心管中加入500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL的捕獲探針水溶液後......」的步驟中，捕獲探針水溶液的濃度為0.2μM；其中第一捕獲探針及第四捕獲探針皆為向生工有限公司(MDBio,Inc.)訂製合成，並且溶於純水中，原始濃度皆為100μM，於使用前再以純水分別稀釋至0.2μM；前述僅為捕獲探針的示範例，實際實施時不限於此，可以根據所欲偵測的目標生物物質設計對應的捕獲探針，並且捕獲探針不限於寡核苷酸或抗體，亦可為肽鏈等其他適體。
製備例2：具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架中的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法
步驟包括將122.4mg的磁性奈米粒子、1mL的0.184M的L-組胺酸水溶液、2.75mL的甲醇及0.5g的聚乙烯吡咯烷酮添加至燒杯中，使用超音波
破碎機進行超音波震盪混合30分鐘完成混合，以形成第二庫存溶液，再來取250μL的0.2M氯化鐵六水合物水溶液及282μL的第二庫存溶液於離心管中進行混合，接著將離心管放置於冰箱於4℃反應1個小時，再來於離心管中加入141μL的0.54M的2-甲基咪唑甲醇溶液及327μL的甲醇，再來離心管於室溫(25℃)下以震盪器進行震盪混合反應2小時，接著將離心管放入離心機以3,000rpm離心1分鐘，再來移除上清液並留下沉澱物，此處的沉澱物即完成合成的磁性鐵金屬有機骨架，接著以甲醇沖洗3次，再來以丙酮沖洗1次，接著加入丙酮，並使丙酮的液面蓋過沉澱物，再來使用超音波破碎機以超音波震盪使沉澱物溶解於丙酮中，最後使用真空烘箱進行真空乾燥，即可完成磁性鐵金屬有機骨架的製備；其中磁性鐵金屬有機骨架指由氯化鐵六水合物提供的三價鐵離子為金屬離子，及以2-甲基咪唑和L-組胺酸為配體，其中金屬離子和配體經配位反應所形成的磁性鐵金屬有機骨架，磁性鐵金屬有機骨架包含有容置空間，而磁性奈米粒子則被包覆於容置空間中；其中聚乙烯吡咯烷酮用作為穩定劑，且使用的聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量為10,000Da；以下於各實施例中「磁性鐵金屬有機骨架」皆以「骨架C」表示，因此前述的「具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架」亦可以「具有修飾的骨架C」表示。
製備例3：骨架C中的磁性奈米粒子的製備方法
步驟包括將1.72g的氯化鐵六水合物及0.403g的氯化亞鐵放置於燒杯，並以80mL的超純水進行溶解以形成鐵離子溶液，再來將鐵離子溶液加熱至80℃後，其中氯化鐵六水合物及氯化亞鐵的莫耳比約為2：1，接著加入6.7mL的25-30wt%的氨水並於80℃的溫度下攪拌混合1小時，即完成初步磁性奈米粒子的製備，其中初步磁性奈米粒子為鐵離子溶液與氨水反應形成的具有
磁性的四氧化三鐵，再來添加20mL的0.04165g/mL的檸檬酸鈉水溶液後升溫至90℃，並於90℃的溫度下攪拌混合1小時，接著靜置於室溫(25℃)環境進行冷卻，直到冷卻至室溫(25℃)，其中檸檬酸鈉水溶液中的檸檬酸根會結合至初步磁性奈米粒子的表面達到穩定結構的功效而表面結合有檸檬酸根的初步磁性奈米粒子，即為所述的磁性奈米粒子，且粒徑為1,000奈米以下，再來以磁力座分離磁性奈米粒子以移除上清液並使用超純水沖洗2次後，最後以烘箱烘乾，即完成磁性奈米粒子的製備；以下於各實施例中將「磁性奈米粒子」皆簡稱為「MNP」表示。其中磁性奈米粒子不以經本發明提供的製備磁性奈米粒子的方法製備獲得的磁性奈米粒子為限，亦可為其他粒徑小於1,000奈米的磁性粒子。
實驗例1：測試對骨架C進行不同化學修飾對電子傳遞速率常數的影響：
為了確認不同化學修飾對骨架C的電子傳遞能力的影響，其中因此分別對骨架C進行化學修飾，使骨架C上帶有化學修飾物，其中化學修飾物分別為甲苯胺藍(toluidine blue,TBO)、中性紅(neutral red,NR)及硫堇(thionine,Thi)，以形成具有甲苯胺藍修飾的骨架C、具有中性紅修飾的骨架C及具有硫堇修飾的骨架C，其中具有甲苯胺藍修飾的骨架C及具有中性紅修飾的骨架C的製備方法與「具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法」基本一致，差異在於「......接著於離心管中加入500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL的捕獲探針水溶液後......」的步驟中的將「500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL的捕獲探針水溶液」分別取代為「1mL的4mM的甲苯胺藍水溶液」、「1mL的4mM的中性紅水溶液」及「1mL的4mM的硫堇乙酸鹽水溶液」，因此最後獲得的產物分別為具有甲苯胺藍修飾的骨架C、具有中性紅修飾的骨架C及具有硫堇修飾的骨架C，再來以0.1M磷酸鹽緩衝液為溶劑分別將具有甲苯胺藍修
飾的骨架C、具有中性紅修飾的骨架C及具有硫堇修飾的骨架C分別稀釋為1mg/mL的濃度後各取5μL添加至工作電極的表面，接著添加95μL的3mM鐵氰化鉀溶液於工作電極的表面作為電解質溶液，最後進行循環伏安法分析，並進行二重複實驗；其中工作電極包括有用於偵測電流變化的表面，以及與表面相對的背面，工作電極的背面設置有磁鐵，藉由磁力使具有甲苯胺藍修飾的骨架C、具有中性紅修飾的骨架C及具有硫堇修飾的骨架C可以固定於工作電極的表面；其中循環伏安法分析中分別以10、12、14及16mV/s的掃描速率進行分析並以經由Lavagnini改良的Nicholson方程式換算得出電子傳遞速率常數(ks)，電子速率常數的單位為「平方公分/秒(cm2/s)」；其中由於為進行二重複實驗，因此電子傳遞速率常數的數值表示為「平均值±標準差」，實驗結果顯示具有甲苯胺藍修飾的骨架C的電子傳遞速率常數為0.001293±0.000249cm2/s，具有中性紅修飾的骨架C的電子傳遞速率常數為0.00147±0.0000099cm2/s，具有硫堇修飾的骨架C的電子傳遞速率常數為0.002813±0.000377cm2/s具有硫堇修飾的骨架C的電子傳遞速率常數大於具有甲苯胺藍修飾的骨架C的電子傳遞速率常數及具有中性紅修飾的骨架C的電子傳遞速率常數，代表具有硫堇修飾的骨架C具有最佳的電子傳遞能力。
為了進行後續的定性分析，因此底下提出製備例4、製備例5及製備例6，藉以製備獲得鐵-咪唑有機骨架、鐵-組胺酸-咪唑有機骨架及具有硫堇修飾的骨架C作為定性分析中的比較例。
製備例4：製備鐵-咪唑有機骨架的製備方法
步驟包括將250μL的0.2M的氯化鐵六水合物水溶液、375μL的0.54M的2-甲基咪唑甲醇溶液及375μL的甲醇至離心管於室溫(25℃)下以震盪器震盪反應2小時，再來將離心管放入離心機以3,000rpm離心1分鐘，接著移除上清液並留下沉澱物，其中沉澱物即完成合成的鐵-咪唑有機骨架，再來先對沉澱
物以甲醇沖洗3次，接著丙酮沖洗1次，以洗去殘餘的液體，再來於離心管中加入丙酮，並使丙酮的液面蓋過沉澱物，接著使用超音波破碎機以超音波震盪使沉澱物溶解於丙酮中，最後使用真空烘箱進行乾燥，即可完成鐵-咪唑有機骨架的製備，其中鐵-咪唑有機骨架指由氯化鐵六水合物提供的三價鐵離子為金屬離子，及以2-甲基咪唑為配體經配位反應所形成的金屬有機骨架；以下於各實施例中「鐵-咪唑有機骨架」皆以「骨架A」表示。
製備例5：製備鐵-組胺酸-咪唑有機骨架的製備方法
步驟包括：將250μL的0.2M氯化鐵六水合物水溶液及100μL的0.184M的L-組胺酸水溶液至離心管，再來放置於冰箱於4℃反應1小時，完成鐵-組胺酸溶液的製備，接著添加375μL的0.54M的2-甲基咪唑甲醇溶液及275μL的甲醇至鐵-組胺酸溶液中，再來於室溫(25℃)下以震盪器震盪反應2小時，接著將離心管放入離心機以3,000rpm離心1分鐘，再來移除上清液並留下沉澱物，其中沉澱物即完成合成的鐵-組胺酸-咪唑有機骨架，接著先對沉澱物以甲醇沖洗3次，再來以丙酮沖洗1次，以洗去殘餘的液體，接著於離心管中加入丙酮，並使丙酮的液面蓋過沉澱物，並使用超音波破碎機以超音波震盪使沉澱物溶解於丙酮中，最後使用真空烘箱進行真空乾燥，即可完成鐵-組胺酸-咪唑有機骨架的製備，其中鐵-組胺酸-咪唑有機骨架指由氯化鐵六水合物提供的三價鐵離子為金屬離子，及以2-甲基咪唑和L-組胺酸為配體經配位反應所形成的金屬有機骨架；以下於各實施例中「鐵-組胺酸-咪唑有機骨架」皆以「骨架B」表示。
製備例6：製備具有硫堇修飾的骨架C的製備方法
步驟與「具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法」基本一致，差異在於「......接著於離心管中加入500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL
的捕獲探針水溶液後......」的步驟中的「500μL的8mM的硫堇乙酸鹽水溶液及500μL的捕獲探針水溶液」改為「1mL的4mM的硫堇乙酸鹽水溶液」，即可獲得「具有硫堇修飾的骨架C」，其中具有硫堇修飾的骨架C指於骨架C上經由與1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞水溶液及1mL的0.128g/mL的N-羥基琥珀醯亞胺水溶液反應，使骨架C上的L-組胺酸的羧酸活化，進而得以與硫堇形成共價連結，使骨架C上帶有硫堇修飾；以下於各實施例中「具有硫堇修飾的骨架C」皆以「骨架D」表示，並且骨架D即不包括捕獲探針的骨架E，換言之，骨架E即為進一步修飾有捕獲探針的骨架D。
為方便後續理解，於此綜合前述各項簡稱，MNP為「磁性奈米粒子」，骨架A為「鐵-咪唑有機骨架」，骨架B為「鐵-組胺酸-咪唑有機骨架」，骨架C為「磁性鐵金屬有機骨架」，骨架D為「具有硫堇修飾的骨架C」，骨架E為「修飾有捕獲探針及硫堇的磁性鐵金屬有機骨架」。
於以下進行定性分析，其中定性分析包括動態光散射粒徑分析儀及界面電位分析儀(particle size and zeta potential analyzer)分析、傅立葉轉換紅外光譜儀(Fouries transform infrared,FITR)分析、掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)分析及超導量子干涉元件磁量儀(superconducting quantum interference devicema gnetometer)分析。
實驗例2：動態光散射粒徑分析儀及界面電位分析儀分析
藉由將各個樣品溶於超純水以形成對應的樣品水溶液，並以動態光散射粒徑分析儀及界面電位分析儀以光散射法分析各個樣品溶液中各個樣品的平均粒徑，其中樣品包括MNP、骨架A、骨架B、骨架C及骨架D，其中各個樣品的平均粒徑的數值呈現方式皆為「平均值±標準差」，平均粒徑的單位為「奈
米(nanometer,nm)」，實驗結果顯示MNP的平均粒徑為308.0±26.28nm、骨架A的平均粒徑為253.7±22.49nm，而引入L-組胺酸形成的骨架B的平均粒徑為281.6±20.33nm，再進一步引入MNP形成的骨架C的平均粒徑為439.2±17.23nm，而加上硫堇修飾後形成的骨架D的平均粒徑則為491.7±42.72nm。
實驗例3：傅立葉轉換紅外光譜儀分析
請參閱圖1，傅立葉轉換紅外光譜儀用於分析各個樣品中的分子震動狀況以識別出各個官能基，各個樣品於分析前皆先以加壓錠劑法進行前處理，其中於加壓錠劑法中使用的分散劑皆為溴化鉀(KBr)，其中樣品包括骨架A、骨架B、MNP、骨架C及骨架D，X軸為波數，其中波數為波長的倒數，因此X軸的單位為cm-1，Y軸為穿透度(Transmittance)，Y軸單位為%，為實驗結果顯示骨架B於可以觀察到1633cm-1處的C=C官能基、3743cm-1處的N-H官能基、2349cm-1處的C=N-C官能基及3416cm-1處的O-H官能基，其中2349cm-1處的C=N-C官能基為2-甲基咪唑的官能基特徵；MNP由於主體結構為四氧化三鐵，因此可以明顯觀察到585cm-1處的Fe-O官能基，為MNP的主要官能基特徵；骨架C及骨架D因為皆包含有L-組胺酸，因此可以觀察到1099cm-1處的C-H官能基，並且因為骨架C及骨架D皆包含有MNP，因此也可以觀察到585cm-1處的Fe-O官能基，同時由於骨架C及骨架D也包含2-甲基咪唑，因此也可以觀察到2349cm-1處的C=N-C官能基，此外骨架D由於修飾有硫堇，因此3416cm-1處的O-H官能基的訊號更加明顯證明硫堇有成功修飾在樣品上。
實驗例4：掃描式電子顯微鏡分析
請參閱圖2、圖3、圖4、圖5及圖6，為掃描式電子顯微鏡於相同放大倍率下拍攝各個樣品的晶體結構的圖像，其中樣品包括骨架A、骨架B、
MNP、骨架C、骨架D；如圖2所示，骨架A的晶體結構呈現為接近立方體結構；如圖3所示，骨架B的晶體結構則是呈現不規則塊狀結構；如圖4、圖5及圖6所示，MNP的晶體、骨架C的晶體及骨架D的晶體皆呈現顆粒堆疊狀結構。
實驗例5：超導量子干涉元件磁量儀分析
請參閱圖7，使用超導量子干涉元件磁量儀對各個樣品進行分析，其中超導量子干涉儀器(Superconducting quantum interference devicema gnetometer)對各個樣品施加不同強度的磁場，使得各個樣品的磁性產生強度變化，其中對各個樣品施加磁場強度範圍為-10,000至10,000奧斯特(Oersted,Oe)，並觀察各個樣品根據施加的磁場強度產生的對應的磁性變化，其中磁性的單位為電磁單位/公克(emu/g)，以獲得各個樣品的磁滯曲線圖，其中樣品包括MNP、骨架C、骨架D，其中MNP由於主體為具有磁性的四氧化三鐵，因此可以觀察到偵測到的磁性強度隨著磁場有明顯的變化，因此以MNP作為的參考標的；其中MNP的磁性強度變化範圍為-60.5827emu/g至60.64334emu/g，骨架C的磁性強度變化範圍為-62.0049emu/g至61.98947emu/g，骨架D的磁性強度變化範圍為-55.8825emu/g至55.82392emu/g，其中骨架C的磁性強度變化範圍與MNP的磁性強度變化範圍相近；其中骨架D的磁性強度變化範圍較MNP的磁性強度變化範圍及骨架C的磁性強度變化範圍窄，不過本實驗證實即使骨架D仍然隨著磁場強度變化有明顯的磁性強度變化，因此證實骨架C及骨架D皆成功包覆磁性奈米粒子，並且證實骨架C及骨架D皆具有磁性。
經由前述實驗例2、實驗例3、實驗例4及實驗例5的實驗結果證明本發明的骨架D與其他比較例之間於平均粒徑、官能基、晶體外觀上確實具有差異性，並且骨架D具有磁性，因此可以藉由如磁力座或磁鐵進行吸引，藉
以分離骨架D，因此以下測試進一步修飾有捕獲探針的骨架D結合電化學感測器應用於對所欲檢測的目標生物物質進行檢測的功效，即骨架E結合電化學生物感測器應用於對所欲檢測的目標生物物質進行檢測領域的功效，因此本發明提供以下的電化學感測套組，並於後續進行以各個實驗條件進行山葵過氧化酶測試及嵌入劑測試。
本發明的提供一種電化學感測套組，包括：電化學感測器、骨架E、檢測探針及氧化還原酵素，其中電化學感測器用於進行電化學分析，電化學感測器包括有工作電極，工作電極包括有用於偵測電流變化的表面，以及與表面相對的背面，工作電極的背面設置有磁鐵；其中檢測探針用於與目標生物物質結合，且檢測探針上修飾有第一標記物；其中氧化還原酵素用於進行氧化還原反應，且氧化還原酵素上修飾有第二標記物，第二標記物用於與第一標記物結合；其中捕獲探針可為寡核苷酸、抗體或肽鏈；其中檢測探針可為寡核苷酸、抗體或肽鏈；其中目標生物物質可為核酸、胜肽、蛋白質或化合物；以下稱此電化學感測套組為第一電化學感測套組，後續進行山葵過氧化酶測試的實驗例中皆為使用第一電化學感測套組進行測試。
於本發明提供另一種電化學感測套組，包括：電化學感測器、骨架E、檢測探針及嵌入劑，其中電化學感測器用於進行電化學分析，電化學感測器包括有工作電極，工作電極包括有用於偵測電流變化的表面，以及與表面相對的背面，工作電極的背面設置有磁鐵；其中檢測探針用於與目標生物物質結合；其中嵌入劑用於嵌入捕獲探針與目標生物物質的結合處，以及嵌入檢測探針與目標生物物質的結合處，並進行氧化還原反應；其中捕獲探針及檢測探針皆為寡核苷酸；其中該目標生物物質為核酸；以下稱此電化學感測套組為
第二電化學感測套組，後續進行嵌入劑測試的實驗例中皆為使用第二電化學感測套組進行測試。於本發明的一實施例中，第二電化學感測套組可不包括檢測探針。
於以下使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試及使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試中，使用的目標生物物質樣品為包括第一目標生物物質的樣品或包括第二目標生物物質的樣品、包括第三目標生物物質的樣品及包括第四目標生物物質的樣品的樣品進行測試，其中第一目標生物物質、第二目標生物物質、第三目標生物物質及第四目標生物物質皆作為目標生物物質的示範例，其中第一目標生物物質為人工合成的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的N基因(N-gene)的部分片段，第一目標生物物質如序列表中的SEQ ID NO：3所示，第一目標生物物質的核苷酸序列由5’往3’方向依序為TTCTTCGGAATGTCGCGCTTTTTTCAATGCTGCAATCGTGCGTCA，總計有45個核苷酸、分子量為13,774.9Da且解鏈溫度為69.1℃；其中包括有第一目標生物物質的樣品以下提供三種態樣，第一種態樣為向生工有限公司(MDBio,Inc.)訂製合成第一目標生物物質，其中第一目標生物物質為溶於純水中，並且第一目標生物物質的濃度為100μM，以下將第一種態樣稱為「目標核酸水溶液」；第二種態樣為向中央研究院的RNAiCore核心設施訂製的攜帶有第一目標生物物質的質體的重組慢病毒，以下稱為「目標病毒」，目標病毒於後續進行各項測試前會先以聚合酶連鎖反應進行目標病毒的複製，使目標病毒達到所欲的複製數；第三種態樣為進一步使用開啟基因(CatchGene)股份有限公司的病毒DNA/RNA萃取套組(Vrial DNA/RNA Kit)萃取目標病毒的病毒核酸，其中病毒核酸即包括第一目標生物物質，萃取方法依照病毒DNA/RNA萃取套組的產品操作指引步驟進行，以獲得包括第一目標
生物物質的核酸萃取液，以下將包括第一目標生物物質的核酸萃取液稱為「目標萃取液」，目標萃取液於後續進行各項測試前會進行核酸定量以確認目標萃取液的濃度；其中第二目標生物物質為副甲狀腺素，其中包括第二目標生物物質的樣品為副甲狀腺素溶液(Parathyroid Hormone/PTH Protein,Human,Recombinant(aa 32-65,GST Tag)，貨品編號：13192-H09E,SinoBiological)；其中第三目標生物物質為新型冠狀病毒的S蛋白，其中包括第三目標生物物質的樣品為新型冠狀病毒的棘蛋白溶液(COVID-19 S-Protein(S1RBD)ELISA Kit，貨品編號：ELV-COVID 19S1-1,RayBiotech)，以下簡稱為「目標蛋白溶液」；其中第四目標生物物質為人工合成的微小核糖核酸(microRNA)的序列，其中微小核糖核酸以miRNA-183作為示範例，第四目標生物物質如序列表中的SEQ ID NO：4所示，第四目標生物物質的核苷酸序列由5’往3’方向依序為UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU，總計有22個核苷酸，包括第四目標生物物質的樣品為為向生工有限公司(MDBio,Inc.)訂製合成第四目標生物物質，其中第四目標生物物質為溶於純水中，並且第四目標生物物質的濃度為100μM，以下稱為「微小核糖核酸溶液」；另外，為了模擬臨床上所欲檢測的目標生物物質存在於檢體中的狀態，因此將檢體先經由離心機以15,000rpm離心3分鐘使雜質沉澱，並取檢體離心後的上清液作為稀釋液，其中稀釋液用於稀釋包括第一目標生物物質的樣品或包括第二目標生物物質的樣品，於以下測試中用於製備稀釋液的檢體包括唾液、尿液及血清，但實際實施時不限於此，檢體除了唾液、尿液及血清外，亦可為血漿、全血、細胞、細胞萃取物、淋巴液、腦脊髓液、羊水、肺泡沖洗液、汗液、淚液、痰液、胸水、腹水、關節液、精液或糞便等其它於臨床上使用的檢體。
使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法：
步驟包括製備各個檢測樣品，其中製備各個檢測樣品的方法為以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備；再來將骨架E浸泡於3wt%的牛血清蛋白水溶液中以震盪器震盪混合10分鐘，以對骨架E的進行封閉，其中3wt%牛血清蛋白水溶液為封閉緩衝液；接著以磁力座分離完成封閉的骨架E，並以0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗5次，以移除殘餘的封閉緩衝液；再來以0.1M的磷酸鹽緩衝液完成沖洗的骨架E變為1mg/mL的濃度，以形成1mg/mL的骨架E溶液；接著將20μL的1mg/mL的骨架E溶液分別添加至20μL的各個檢測樣品，並以震盪器震盪混合反應15分鐘，使各個檢測樣品中的目標生物物質被骨架E上的捕獲探針所捕獲；再來以磁力座分離各個檢測樣品中的骨架E，並以0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗3次，以移除殘餘的液體；接著將與各個檢測樣品反應完成的各個骨架E分別加入檢測探針水溶液靜置反應，使檢測探針與被骨架E上的捕獲探針捕獲的目標生物物質結合；再來以磁力座分離與檢測探針水溶液反應完成的各個骨架E，並先以0.1wt%的十二烷基硫酸鈉水溶液沖洗1次，再以0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗2次，以移除殘留的液體，其中於本步驟使用0.1wt%的十二烷基硫酸鈉水溶液後，再以0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗，相較於僅使用十二烷基硫酸鈉水溶液沖洗，或僅使用0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗，更能將未與骨架E反應的檢測探針沖洗乾淨，藉以降低後續進行電流強度偵測時的背景值訊號干擾；接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針的第一標記物；再來以磁力座分離與氧化還原酵素反應完成的的各個骨架E，並以0.1M磷酸鹽緩衝液沖洗5次，以移除殘餘的液體；接著將完成沖洗的各個骨架E分別加入20μL的0.1M磷酸鹽緩衝液以配製為1mg/mL的濃度，再分別取5μL添加
至電化學感測器的工作電極的表面，而工作電極的背面設置的磁鐵會藉由磁力使骨架E固定於工作電極的表面；再來添加95μL的電解質溶液於工作電極表面，最後進行電化學分析，其中電化學分析使用微分脈衝伏安法進行分析進行電流強度的測量，並進行三重複實驗，因此電流強度的數值根據三重複實驗結果表示為「平均值±標準差」；其中電解質溶液為對苯二酚/過氧化氫溶液；其中電化學感測器、骨架E、檢測探針及氧化還原酵素皆為第一電化學感測套組所提供；其中微分脈衝伏安法分析使用的參數中，幅度為75mV，電壓範圍為200mV至-400mV、脈衝週期為125ms、脈衝寬度為115ms及增量參數為20mV；其中氧化還原酵素以標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶(Streptavidin conjugated Horseradish peroxidase,SHRP，貨品編號：DY998,R&D,USA Florida)作為示範例，其中鏈球親生物素蛋白即為第二標記物，並且於「......接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針上的第一標記物......」的步驟中，為以0.1M的磷酸鹽緩衝液對標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶進行25倍稀釋或200倍稀釋，且反應的時間為10分鐘或15分鐘；於以下的實施例中，檢測探針分別以第一檢測探針、第二檢測探針、第三檢測探針作為示範例，其中第一檢測探針為寡核苷酸，且檢測探針的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：5所示，檢測探針的核苷酸序列由5’往3’方向依序為TGTAGCACGATTGCAGCATTG，總計有21個核苷酸、分子量為6,886.7Da且解鏈溫度為52.4℃，並且於檢測探針的5’端修飾有第一標記物，其中第一標記物為生物素(biotin)，而當檢測探針為第一檢測探針時，於「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」中的「......接著將與各個檢測樣品反應完成的各個骨架E分別加入檢測探針水溶液靜
置反應，使檢測探針與被骨架E上的捕獲探針捕獲的目標生物物質結合......」的步驟中，加入的檢測探針水溶液的體積為20μL，並且檢測探針的濃度為0.25μM，而靜置反應時間為15分鐘，其中第一檢測探針為向生工有限公司(MDBio,Inc.)訂製合成，並且第一檢測探針溶於純水中，且濃度為100μM，於使用前再以純水稀釋至0.25μM；其中第二檢測探針為修飾有第一標記物的抗副甲狀腺素抗體(Anti-Parathyroid Hormone/PTH Antibody,Rabbit Polyclonal，貨品編號：13192-T08,SinoBiological)，其中第一標記物為生物素，而當檢測探針為第二檢測探針時，於「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」中的「......接著將與各個檢測樣品反應完成的各個骨架E分別加入檢測探針水溶液靜置反應，使檢測探針與被骨架E上的捕獲探針捕獲的目標生物物質結合......」的步驟中，加入的檢測探針水溶液的體積為20μL，並且檢測探針的濃度為500ng/mL，而靜置反應時間為10分鐘；其中第三檢測探針為修飾有第一標記物的二級抗體(Anti-Parathyroid Hormone/PTH Antibody,Rabbit Polyclonal，貨品編號：13192-T08,SinoBiological)，其中第一標記物為生物素，而當檢測探針為第三檢測探針時，於「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」中的「......接著將與各個檢測樣品反應完成的各個骨架E分別加入檢測探針水溶液靜置反應，使檢測探針與被骨架E上的捕獲探針捕獲的目標生物物質結合......」的步驟中，加入的檢測探針水溶液的體積為20μL，並且檢測探針的濃度為500ng/mL，而靜置反應時間為10分鐘；前述僅為檢測探針的示範例，實際實施時不限於此，可以根據所欲偵測的生物物質及使用的捕獲探針類型設計對應的檢測探針，並且檢測探針不限於寡核苷酸或抗體，亦可為肽鏈等適體。
使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法：
步驟包括製備各個檢測樣品，其中製備各個檢測樣品的方法為以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備；再來將骨架E浸泡於3wt%的牛血清蛋白水溶液中以震盪器震盪混合10分鐘，以對骨架E的進行封閉，其中3wt%牛血清蛋白水溶液為封閉緩衝液；接著以磁力座分離完成封閉的骨架E，並以0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗5次，以移除殘餘的封閉緩衝液；再來以0.1M的磷酸鹽緩衝液完成沖洗的骨架E變為1mg/mL的濃度，以形成1mg/mL的骨架E溶液；接著將20μL的1mg/mL的骨架E溶液分別添加至10μL的各個檢測樣品，並加入檢測探針水溶液及嵌入劑後，以震盪器震盪混合反應10分鐘，使各個檢測樣品中的目標生物物質被骨架E上的捕獲探針所捕獲，並使檢測探針與被骨架E上的捕獲探針捕獲的目標生物物質結合，而嵌入劑則會嵌入捕獲探針和目標生物物質的雜交處，以及嵌入檢測探針和目標生物物質的雜交處；再來以磁力座分離與各個檢測樣品、檢測探針水溶液及嵌入劑反應完成的各個骨架E，並先以0.1wt%的十二烷基硫酸鈉水溶液沖洗1次，再以0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗2次，以移除殘留的液體，其中於本步驟使用0.1wt%的十二烷基硫酸鈉水溶液後，再以0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗，相較於僅使用十二烷基硫酸鈉水溶液沖洗，或僅使用0.1M的磷酸鹽緩衝液沖洗，更能將未與骨架E反應的檢測探針沖洗乾淨，藉以降低後續進行電流強度偵測時的背景值訊號干擾；接著將完成沖洗的各個骨架E分別加入20μL的0.1M磷酸鹽緩衝液以配製為1mg/mL的濃度，再分別取5μL添加至電化學感測器的工作電極的表面，而工作電極的背面設置的磁鐵會藉由磁力使骨架E固定於工作電極的表面；再來添加95μL的電解質溶液於工作電極表面，最後進行電化學分析，其中電化學分析使用微分脈衝伏安法，以進行電流強度的測量，並進行三重複實驗，因此電流強度的數值根據三重複實
驗結果表示為「平均值±標準差」；其中電解質溶液為10mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽水溶液；其中電化學感測器、骨架E、檢測探針及嵌入劑皆為第二電化學感測套組所提供；其中微分脈衝伏安法分析使用的參數中，幅度為75mV，電壓範圍為0mV至-800mV、脈衝週期為125ms、脈衝寬度為115ms及增量參數為20mV；其中嵌入劑以中性紅(neutral red)作為示範例，並且於「......接著將20μL的1mg/mL的骨架E溶液分別添加至10μL的各個檢測樣品，並加入檢測探針水溶液及嵌入劑後，以震盪器震盪混合反應10分鐘，使各個檢測樣品中的目標生物物質被骨架E上的捕獲探針所捕獲，並使檢測探針與被骨架E上的捕獲探針捕獲的目標生物物質結合，而嵌入劑則會嵌入捕獲探針和目標生物物質的雜交處，以及嵌入檢測探針和目標生物物質的雜交處......」的步驟中為加入5μL的4mM的中性紅；於以下的實施例中，檢測探針以前述「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的步驟」所述的第一檢測探針作為示範例，且於「使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法」中的「......接著將20μL的1mg/mL的骨架E溶液分別添加至10μL的各個檢測樣品，並加入檢測探針水溶液及嵌入劑後，以震盪器震盪混合反應10分鐘，使各個檢測樣品中的目標生物物質被骨架E上的捕獲探針所捕獲，並使檢測探針與被骨架E上的捕獲探針捕獲的目標生物物質結合，而嵌入劑則會嵌入捕獲探針和目標生物物質的雜交處，以及嵌入檢測探針和目標生物物質的雜交處.......」的步驟中，加入的檢測探針水溶液的體積為5μL，並且檢測探針水溶液的濃度為1μM；前述僅為檢測探針的示範例，實際實施時不限於此，可以根據所欲偵測的生物物質及使用的捕獲探針類型設計對應的檢測探針。
實驗例6：對目標核酸水溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試
請參閱表1及圖8，於實驗例6中對目標核酸水溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，步驟請參照「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」，其中使用的目標生物物質樣品為包括第一目標生物物質的樣品，其中包括第一目標生物物質的樣品為目標核酸水溶液；其中檢體分別為唾液、尿液及血清，並取各個檢體離心後的上清液作為稀釋液；其中骨架E上的捕獲探針為第一捕獲探針，由於第一捕獲探針具有與第一目標生物物質的一部分核苷酸序列互補的核苷酸序列，因此骨架E上的第一捕獲探針可以透過雜交的方式捕獲第一目標生物物質；其中於「以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備」的步驟中，為對目標核酸水溶液進行序列稀釋，使目標核酸水溶液的濃度分別為0.005fM、0.05fM、0.5fM、5fM、50fM、500fM、5,000fM及50,000fM以作為各個檢測樣品；其中檢測探針為第一檢測探針，第一檢測探針包括有與第一目標生物物質的另一部分核苷酸序列互補的核苷酸序列，因此第一檢測探針可以透過雜交的方式與第一目標生物物質結合，並且由於第一檢測探針的5’端修飾有生物素(biotin)，因此標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶上的鏈球親生物素蛋白會與生物素結合，因此當骨架E上的第一捕獲探針捕獲第一目標生物物質後，第一檢測探針會結合至被骨架E捕獲的第一目標生物物質，並且第一檢測探針上的生物素會與標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶上的鏈球親生物素蛋白結合，而標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶中的山葵過氧化酶會進行氧化還原反應，因此於電化學分析中可以偵測到進行氧化還原反應時產生的電流變化，且隨著標記有鏈球親生物素蛋白的山葵
過氧化酶的濃度越高，電流強度也會越大；其中於「......接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針上的第一標記物......」的步驟中，為以0.1M的磷酸鹽緩衝液對標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶進行25倍稀釋，且反應的時間為15分鐘；實驗例6的實驗結果如表1及圖8所示，表1為使用的檢體分別為唾液、尿液及血清時，於各個濃度的目標核酸水溶液下測量到的電流強度，其中目標核酸水溶液的濃度單位為fM，其中電流強度的單位為μA，並且根據使用的檢體種類進行分組，分別為唾液、血清及尿液；另外根據表1的實驗數據，分別對檢體為唾液、尿液及血清的組別進行回歸分析，經由回歸分析獲得回歸直線的回歸方程式如下所述，其中檢體為唾液的回歸方程式表示為：I=0.4217×ln(x)+7.8546，回歸方程式的決斷係數為0.9548，斜率為0.4217μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.1340μA，計算出偵測極限(limit of detection,LOD)值為0.9533fM；其中檢體為尿液的回歸方程式表示為：I=0.3059×ln(x)+9.4438，回歸方程式的決斷係數為0.9873，斜率為0.3059μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.0391μA，計算出偵測極限值為0.3067fM；其中檢體為血清的回歸方程式表示為：I=0.445×ln(x)+7.0396，回歸方程式的決斷係數為0.9873，斜率為0.445μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.1115μA，計算出偵測極限值為0.4511fM；於各個回歸方程式中，其中I代表電流強度，單位為μA；其中ln(x)代表目標核酸水溶液的濃度，單位為fM；其中斜率指回歸直線的斜率，單位為μA/fM；其中最低偵測濃度的標準差指於目標核酸水溶液的濃度為0.005fM的組別中，由三重複實驗結果獲得的電流強度值計算獲得的標準差，單位為μA；其中偵測極限值的單位為fM，其中偵測極限值的計算方式為以3倍的最低偵測濃度訊號標準差除以回歸直線
的斜率，以下於各個實施例中偵測極限值的計算皆依此方式計算。偵測極限值的計算式如下：
圖8為根據表1的實驗數據，及根據表1的實驗數據分別對檢體為唾液、尿液及血清的組別進行回歸分析的結果，所繪成的回歸分析圖；圖8中X軸為目標核酸水溶液的濃度，X軸單位為fM，Y軸為測得的電流強度，Y軸單位為μA，並且根據使用的檢體種類進行分組，分別為唾液、血清及尿液。
實驗例7：對目標核酸水溶液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試
請參閱表2及圖9，於實驗例7中對目標核酸水溶液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，步驟請參照「使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法」，其中使用的目標生物物質樣品為包括第一目標生物物質的樣品，其中包括第一目標生物物質的樣品為目標核酸水溶液；其中檢體分別為唾液、尿液及血清，並取各個檢體離心後的上清液作為稀釋液；其中骨架E上的
捕獲探針為第一捕獲探針；其中於「以各個稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備」的步驟中，為對目標核酸水溶液進行序列稀釋，使目標核酸水溶液的濃度分別為0.005fM、0.05fM、0.5fM、5fM、50fM、500fM、5,000fM及50,000fM以作為各個檢測樣品；其中檢測探針為第一檢測探針，由於嵌入劑會嵌入核酸雜交處，因此嵌入劑會嵌入第一捕獲探針和第一目標生物物質的雜交處，以及嵌入第一檢測探針和第一目標生物物質的雜交處，並且嵌入劑會進行氧化還原反應，因此於電化學分析中可以偵測到進行氧化還原反應時產生的電流變化，且隨著標記有嵌入劑的濃度越高，電流強度也會越大；實驗例7的實驗結果如表2及圖9所示，表2為使用的檢體分別為唾液、尿液及血清時，於各個濃度的目標核酸水溶液測量到的電流強度，其中目標核酸水溶液的濃度單位為fM，其中電流強度的單位為μA，並且根據使用的檢體種類進行分組，分別為唾液、血清及尿液；另外根據表2的實驗數據，分別對檢體為唾液、尿液及血清的組別進行回歸分析，經由回歸分析獲得回歸直線的回歸方程式如下所述，其中檢體為唾液的回歸方程式表示為：I=0.1131×ln(x)+6.9965，回歸方程式的決斷係數為0.9581，斜率為0.1131μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.1457μA，計算出偵測極限值為3.8647fM；其中檢體為尿液的回歸方程式表示為I=0.1844×ln(x)+7.4896，回歸方程式的決斷係數為0.9879，斜率為0.1844μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.1709μA，計算出偵測極限值為2.7804fM；其中檢體為血清的回歸方程式表示為：I=0.3942×ln(x)+7.1625，回歸方程式的決斷係數為0.977，斜率為0.3942μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.0252μA，計算出偵測極限值為0.1918fM；於各個回歸方程式中，其中I代表電流強度，單位為μA；其中ln(x)代表目標核
酸水溶液的濃度，單位為fM；其中斜率指回歸直線的斜率，單位為μA/fM；其中最低偵測濃度的標準差指於目標核酸水溶液的濃度為0.005fM的組別中，由三重複實驗結果獲得的電流強度值計算獲得的標準差，單位為μA；其中偵測極限值的單位為fM。圖9為根據表2的實驗數據，及根據表2的實驗數據分別對檢體為唾液、尿液及血清的組別進行回歸分析的結果，所繪成的回歸分析圖；圖9中X軸為目標核酸水溶液的濃度，X軸單位為fM，Y軸為測得的電流強度，Y軸單位為μA，並且根據使用的檢體種類進行分組，分別為唾液、血清及尿液。
經由實驗例6及實驗例7的實驗結果，證實本發明提供的第一電化學感測套組及第二電化學感測套組於進行第一目標生物物質的檢測上，不僅具有高靈敏度，並且隨著添加的目標核酸溶液的濃度越高，產生的電流強度也越大，並且可以經由回歸方程式由偵測到的電流大小推算出目標核酸溶液的濃度，進而達到定量的效果且可定量的濃度範圍為0.005fM至50,000fM。
本發明進一步測試使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試及使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試中，是否會受到非目標生物物
質的干擾，因此使用第一目標生物物質作為目標生物物質的示範例，使用六鹼基錯配位序列、三鹼基錯配位序列、單鹼基錯配位序列及隨機序列作為非目標生物物質的示範例；其中六鹼基錯配位序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：6所示，六鹼基錯配位序列的核苷酸序列由5’往3’方向依序為TTCTTCGGAATGTCGCGCTTTTTTTGGCATTGCAATCGTGCTACA，總計有45個核苷酸、分子量為13,790Da且解鏈溫度為68.2℃，其中第26至第31個核苷酸為與第一目標生物物質具有差異的核苷酸；其中三鹼基錯配位序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：7所示，三鹼基錯配位序列的核苷酸序列由5’往3’方向依序為TTCTTCGGAATGTCGCGCTTTTTTTGGTGCTGCAATCGTGCTACA，總計有45個核苷酸、分子量為13,805Da且解鏈溫度為69.1℃，其中第25至第27個核苷酸為與第一目標生物物質具有差異的核苷酸；其中單鹼基錯配位序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：8所示，單鹼基錯配位序列的核苷酸序列由5’往3’方向依序為TTCTTCGGAATGTCGCGCTTTTTTCAATGCTGCAATCGTGCTGCA，總計有45個核苷酸、分子量為13,775Da且解鏈溫度為69.0℃，其中第43個核苷酸為與第一目標生物物質具有差異的核苷酸；其中隨機序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：9所示，隨機序列的核苷酸序列由5’往3’方向依序為AAGTAATACGACTCACTATAGGGATGGTAGCGTGAGCAAGG，總計有41個核苷酸、分子量為13,060Da且解鏈溫度為68.4℃；其中六鹼基錯配位序列、三鹼基錯配位序列、單鹼基錯配位序列及隨機序列序列皆是向生工有限公司(MD Bio,Inc.)訂製合成，並且皆溶於純水中，且濃度皆為100μM，因此分別獲得100μM的六鹼基錯配位序列水溶液、100μM的三鹼基錯配位序列水溶液、100μM的單鹼基錯配位序列水溶液、100μM的隨機序列水溶液及100μM的六鹼基錯
配位序列水溶液。
實驗例8：對目標生物物質及非目標生物物質使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試
請參閱表3，於實驗例8中對目標生物物質及非目標生物物質使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，步驟與「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」基本一致，其中檢體分別為血清，並取檢體離心後的上清液作為稀釋液；其中骨架E上的捕獲探針為第一捕獲探針；其中檢測探針為第一檢測探針；其中於「......接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針上的第一標記物......」的步驟中，為以0.1M的磷酸鹽緩衝液對標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶進行25倍稀釋，且反應的時間為15分鐘；實驗例8與「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」差異在於「......以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備......」的步驟中，改以稀釋液分別將目標核酸水溶液、六鹼基錯配位序列水溶液、三鹼基錯配位序列水溶液、單鹼基錯配位序列水溶液及隨機序列水溶液稀釋至50,000fM以作為各個檢測樣品，並且進一步包括一個空白對照組，空白對照組為僅使用稀釋液作為檢測樣品的對照組；實驗例8的實驗結果如表3所示，表3為使用的檢體為血清，於各個檢測樣品測量到的電流強度，其中以檢測樣品中所包含的溶質作為分組，因此分組包括第一目標生物物質、六鹼基錯配位序列、三鹼基錯配位序列、單鹼基錯配位序列及隨機序列，另外還包括有空白對照組；其中電流強度的單位為μA；實驗例8的實驗結果顯示檢測樣品包括第一目標生物物質的電流強度明顯大於檢測樣品包括其他非目標生物物質的電流強度及空白
對照組的電流強度。
實驗例9：對目標生物物質及非目標生物物質使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試中的影響
請參閱表4，於實驗例9中對目標生物物質即非目標生物物質使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，步驟與「使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法」基本一致，其中檢體分別為血清，並取檢體離心後的上清液作為稀釋液；其中骨架E上的捕獲探針為第一捕獲探針；其中檢測探針為第一檢測探針；實驗例9與「使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法」差異在於「......以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備......」的步驟中，改以稀釋液分別將目標核酸水溶液、六鹼基錯配位序列水溶液、三鹼基錯配位序列水溶液、單鹼基錯配位序列水溶液及隨機序列水溶液稀釋至50,000fM以作為各個檢測樣品，並且進一步包括一個空白對照組，空白對照組為僅使用稀釋液作為檢測樣品的對照組；實驗例9的實驗結果如表4所示，表4為使用的檢體為血清，於各個檢測樣品測量到的電流強度，其中以檢測樣品中所包括的目標生物物質或非目標生物物質作為分組，因此分組
包括第一目標生物物質、六鹼基錯配位序列、三鹼基錯配位序列、單鹼基錯配位序列及隨機序列，另外還包括有空白對照組；其中電流強度的單位為μA；實驗例9的實驗結果顯示目標核酸水溶液的電流強度明顯大於其他非目標生物物質的電流強度及空白對照組的電流強度，進一步驗證本發明提供的骨架E結合電化學感測器具有良好的特異性。
經由實驗例8的實驗結果及實驗例9的實驗結果，證實本發明提供的第一電化學感測套組及第一電化學感測套組皆具有良好的特異性，可以區別與第一目標生物物質與其他非目標生物物質。
實驗例10：對目標病毒溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，以及對目標病毒溶液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試
請參閱表5及圖10，實驗例10中對目標病毒使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，步驟請參照「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」，其中使用的目標生物物質樣品為包括第一目標生物物質的樣品，其中包括第一目標生物物質的樣品為目標病毒，其中檢體為血清，並取檢體離心後的上清液作為稀釋液，其中骨架E上的捕獲探針為第一捕獲探
針，其中於「以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備」的步驟中，為先對目標病毒進行聚合酶連鎖反應進行擴增後再以稀釋液進行序列稀釋以形成目標病毒溶液，並使目標病毒溶液的濃度分別為6.5複製數/μL、65複製數/μL、650複製數/μL、6,500複製數/μL、65,000複製數/μL、650,000複製數/μL及6,500,000複製數/μL作為各個檢測樣品；其中檢測探針為第一檢測探針，其中檢測探針為第一檢測探針；其中於「......接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針上的第一標記物......」的步驟中，為以0.1M的磷酸鹽緩衝液對標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶進行25倍稀釋，且反應的時間為15分鐘；另外，實驗例10中對目標病毒使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，步驟請參照「使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法」，其中使用的目標生物物質樣品為包括第一目標生物物質的樣品，其中包括第一目標生物物質的樣品為目標病毒，其中檢體為血清，並取各個檢體離心後的上清液作為稀釋液，其中骨架E上的捕獲探針為第一捕獲探針，其中於「以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備」的步驟中，為對目標病毒進行序列稀釋以形成目標病毒溶液，並使目標病毒的濃度分別為6.5複製數/μL、65複製數/μL、650複製數/μL、6,500複製數/μL、65,000複製數/μL、650,000複製數/μL及6,500,000複製數/μL作為各個檢測樣品，其中檢測探針為第一檢測探針；實驗例10的實驗結果如表5及圖10所示，表5為使用的檢體分別為血清時，於各個濃度的目標病毒溶液測量到的電流強度，其中目標病毒溶液的濃度單位為複製數/μL，其中電流強度的單位為μA，並且根據使用的測試方法進行分組，分別為山葵過氧化酶測試及嵌入劑
測試；另外根據表5的實驗數據，分別對使用的測試方法為山葵過氧化酶測試及嵌入劑測試的組別進行回歸分析，經由回歸分析獲得回歸直線的回歸方程式如下所述，其中於山葵過氧化酶測試的回歸方程式為I=0.3252×ln(x)+5.6362，
回歸方程式的決斷係數為0.9653，斜率為0.3252
，最低偵測濃度的標準
差為0.3037μA，計算出偵測極限值為2.8017複製數/μL；其中於嵌入劑測試的回歸方程式為I=0.3372×ln(x)+3.6967，回歸方程式的決斷係數為0.8884，斜率為
0.3372
，最低偵測濃度的標準差為0.2554μA，計算出偵測極限值為2.2
722複製數/μL；於各個回歸方程式中，其中I代表電流強度，單位為μA；其中ln(x)代表目標病毒溶液的濃度，單位為複製數/μL；斜率指回歸直線的斜率，單
位為
；其中最低偵測濃度的標準差指於目標病毒溶液的濃度為0.005複
製數/μL的組別中，由三重複實驗結果獲得的電流強度值計算獲得的標準差，單位為μA；其中偵測極限值的單位為複製數/μL。圖10為根據表5的實驗數據，及根據表5的實驗數據分別對使用的測試方法為山葵過氧化酶測試及嵌入劑測試的組別進行回歸分析的結果，所繪成的回歸分析圖；圖10中X軸為目標病毒溶液的濃度，X軸單位為複製數/μL，Y軸為測得的電流強度，Y軸單位為μA，並且根據使用的測試方法為山葵過氧化酶測試及嵌入劑測試。
實驗例11：對目標萃取液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，以及對目標萃取液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試
請參閱表6及圖11，實驗例11中對目標萃取液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，步驟請參照與「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」，其中使用的目標生物物質樣品為包括第一目標生物物質的樣品，其中包括第一目標生物物質的樣品為目標萃取液，其中檢體為血清，並取檢體離心後的上清液作為稀釋液，其中骨架E上的捕獲探針為第一捕獲探針，其中於「以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備」的步驟中，為對目標萃取液進行序列稀釋，使目標萃取液的濃度分別為0.005fM、0.05fM、0.5fM、5fM、50fM、500fM、5,000fM及50,000fM作為各個檢測樣品，其中檢測探針為第一檢測探針，其中於「......接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針上的第一標記物......」的步驟中，為以0.1M的磷酸鹽緩衝液對標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶進行25倍稀釋，且反應的時間為15分鐘，其中檢測探針為第一檢測探針；其中於「......接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針上的第一標記物......」的步驟中，為以0.1M的磷酸鹽緩衝液對標記
有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶進行25倍稀釋，且反應的時間為15分鐘；另外，實驗例11中對目標萃取液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，步驟請參照「使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法」，其中使用的目標生物物質樣品為包括第一目標生物物質的樣品，其中包括第一目標生物物質的樣品為目標萃取液，其中檢體為血清，並取各個檢體離心後的上清液作為稀釋液，其中骨架E上的捕獲探針為第一捕獲探針，其中於「以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備」的步驟中，為對目標萃取液進行序列稀釋，使目標萃取液的濃度分別為0.005fM、0.05fM、0.5fM、5fM、50fM、500fM、5,000fM及50,000fM，其中檢測探針為第一檢測探針；實驗例11的實驗結果如表6及圖11所示，表6為使用的檢體分別為血清時，於各個濃度的目標萃取液測量到的電流強度，其中目標萃取液的濃度單位為fM，其中電流強度的單位為μA，並且根據測試方法進行分組，分為山葵過氧化酶測試及嵌入劑測試；另外根據表6的實驗數據，分別對使用的測試方法為山葵過氧化酶測試及嵌入劑測試的組別進行回歸分析，經由回歸分析獲得回歸直線的回歸方程式如下所述，其中於山葵過氧化酶測試的回歸方程式為I=0.3249×ln(x)+1.9529，回歸方程式的決斷係數為0.9653，斜率為0.3249μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.0416μA，計算出偵測極限值為0.3841fM；其中於嵌入劑測試的回歸方程式為為I=0.8411×ln(x)+6.9862，回歸方程式的決斷係數為0.9653，斜率為0.3252μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.2183μA，計算出偵測極限值為2.0138fM；於各個回歸方程式中，其中I代表電流強度，單位為μA；其中ln(x)代表目標萃取液的濃度，單位為fM；斜率指回歸直線的斜率，單位為μA/fM；其中最低偵測濃度的標準差指於目標萃取液的濃度為0.005fM的組別中，由三重複
實驗結果獲得的電流強度值計算獲得的標準差，單位為μA；其中偵測極限值的單位為fM。圖11為根據表6的實驗數據，及根據表6的實驗數據分別對使用的測試方法為山葵過氧化酶測試及嵌入劑測試的組別進行回歸分析的結果，所繪成的回歸分析圖；圖11中X軸為目標萃取液的濃度，X軸單位為fM，Y軸為測得的電流強度，Y軸單位為μA，並且根據使用的測試方法為山葵過氧化酶測試及嵌入劑測試。
實驗例12：對副甲狀腺素溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試
請參閱圖12，實驗例12中對副甲狀腺素溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，步驟請參照「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」，其中使用的目標生物物質樣品為包括第二目標生物物質的樣品，其中包括第二目標生物物質的樣品為副甲狀腺素溶液，其中檢體為血清，並取檢體離心後的上清液作為稀釋液，其中骨架E上的捕獲探針為第三捕獲探針，其中於「以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢
測樣品的製備」的步驟中，為對副甲狀腺素溶液進行序列稀釋，使副甲狀腺素溶液的濃度分別為0.0001pg/mL、0.001pg/mL、0.01pg/mL、0.1pg/mL、1pg/mL、10pg/mL及100pg/mL作為各個檢測樣品，其中檢測探針為第二檢測探針，其中於「......接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針上的第一標記物......」的步驟中，為以0.1M的磷酸鹽緩衝液對標記有鏈球親生物素蛋白的山葵過氧化酶進行200倍稀釋，且反應的時間為10分鐘；實驗例12的實驗結果如表7及圖12所示，表7為使用的檢體為血清，對各個濃度的副甲狀腺素溶液分別進行山葵過氧化酶測試所測量到的電流強度，其中副甲狀腺素溶液的濃度單位為pg/mL，其中電流強度的單位為μA；另外根據表7實驗的實驗數據進行回歸分析，經由回歸分析獲得回歸直線的回歸方程式如下所述，其中檢體為唾液的回歸方程式表示為：I=0.2371×ln(x)+9.3338，斜率為0.2
371
，回歸方程式的決斷係數為0.9812，最低偵測濃度的標準差為0.12
μA，計算出偵測極限值為1.51pg/mL，於回歸方程式中，其中I代表電流強度，單位為μA；其中ln(x)代表副甲狀腺素溶液的濃度，單位為pg/mL；斜率指回歸
直線的斜率，單位為
其中最低偵測濃度的標準差指於副甲狀腺素溶液
的濃度為0.0001pg/mL的組別中，由三重複實驗結果獲得的電流強度值計算獲得的標準差，單位為μA；其中偵測極限值的單位為pg/mL。圖12為根據表7的實驗數據，及根據表7的實驗數據進行回歸分析的結果，所繪成的回歸分析圖；圖12中X軸為副甲狀腺素溶液的濃度，X軸單位為pg/mL，Y軸為測得的電流強度，Y軸單位為μA。
實驗例13：對目標蛋白溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試
請參閱圖13，實驗例13中對目標蛋白溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，步驟請參照「使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試的方法」，其中使用的目標生物物質樣品為包括第二目標生物物質的樣品，其中包括第二目標生物物質的樣品為目標蛋白溶液，其中檢體為血清，並取檢體離心後的上清液作為稀釋液，其中骨架E上的捕獲探針為第三捕獲探針，其中於「以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備」的步驟中，為對目標蛋白溶液進行序列稀釋，使目標蛋白溶液的濃度分別為3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL及200ng/mL作為各個檢測樣品，其中檢測探針為第三檢測探針，其中於「......接著將沖洗後的各個骨架E，分別加入以0.1M的磷酸鹽緩衝液進行稀釋的氧化還原酵素進行反應，使氧化還原酵素上的第二標記物結合至檢測探針上的第一標記物......」的步驟中，為以0.1M的磷酸鹽緩衝液對標記有鏈球親生物
素蛋白的山葵過氧化酶進行200倍稀釋，且反應的時間為10分鐘；實驗例12的實驗結果如表7及圖12所示，表7為使用的檢體為血清，對各個濃度的目標蛋白溶液分別進行山葵過氧化酶測試所測量到的電流強度，其中目標蛋白溶液的濃度單位為ng/mL，其中電流強度的單位為μA；另外根據表8實驗的實驗數據進行回歸分析，經由回歸分析獲得回歸直線的回歸方程式如下所述，其中檢體為
唾液的回歸方程式表示為：I=0.9999×ln(x)+3.2009，斜率為0.9999
，
回歸方程式的決斷係數為0.9812，最低偵測濃度的標準差為0.11μA，計算出偵測極限值為0.33ng/mL，於回歸方程式中，其中I代表電流強度，單位為μA；其中ln(x)代表目標蛋白溶液的濃度，單位為ng/mL；斜率指回歸直線的斜率，單
位為
其中最低偵測濃度的標準差指於目標蛋白溶液的濃度為3.125ng/
mL的組別中，由三重複實驗結果獲得的電流強度值計算獲得的標準差，單位為μA；其中偵測極限值的單位為ng/mL。圖13為根據表8的實驗數據，及根據表8的實驗數據進行回歸分析的結果，所繪成的回歸分析圖；圖13中X軸為目標蛋白溶液的濃度，X軸單位為ng/mL，Y軸為測得的電流強度，Y軸單位為μA。
實驗例14：對微小核糖核酸溶液使用第一電化學感測套組進行山葵過氧化酶測試，以及對目標萃取液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試
請參閱表9及圖14，實驗例14中對微小核糖核酸溶液使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試，步驟與「使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法」基本一致，其中使用的目標生物物質樣品為包括第四目標生物物質的樣品，其中包括第四目標生物物質的樣品為微小核糖核酸溶液，其中檢體為血清，並取各個檢體離心後的上清液作為稀釋液，其中骨架E上的捕獲探針為第四捕獲探針，其中於「以稀釋液對目標生物物質樣品進行稀釋，以完成各個檢測樣品的製備」的步驟中，為對微小核糖核酸溶液進行序列稀釋，使微小核糖核酸溶液濃度分別為5fM、50fM、500fM及5,000fM；實驗例14與「使用第二電化學感測套組進行嵌入劑測試的方法」差異在於「......接著將20μL的1mg/mL的骨架E溶液分別添加至10μL的各個檢測樣品，並加入檢測探針水溶液及嵌入劑後，以震盪器震盪混合反應10分鐘，使各個檢測樣品中的目標生物物質被骨架E上的捕獲探針所捕獲，並使檢測探針與被骨架E上的捕獲探針捕獲的目標生物物質結合，而嵌入劑則會嵌入捕獲探針和目標生物物質的雜交處，以及嵌入檢測探針和目標生物物質的雜交處......」的步驟中的「......並加入檢測探針水溶液及嵌入劑後......」改為僅加入嵌入劑，且加入的嵌入劑為10μL的2mM的中性紅；實驗例14的實驗結果如表9及圖14所示，表9為使用的檢體分別為血清時，於各個濃度的微小核糖核酸溶液測量到的電流強度，其中微小核糖核酸溶液的濃度單位為fM，其中電流強度的單位為μA，另外根據表9的實驗數據進行回歸分析，經由回歸分析獲得回歸直線的回歸方程式如下所述，回歸方程式為I
=1.6875×ln(x)+6.698，回歸方程式的決斷係數為0.984，斜率為1.6875μA/fM，最低偵測濃度的標準差為0.31μA，計算出偵測極限值為0.55fM；其中I代表電流強度，單位為μA；其中ln(x)代表目標萃取液的濃度，單位為fM；斜率指回歸直線的斜率，單位為μA/fM；其中最低偵測濃度的標準差指於目標萃取液的濃度為5fM的組別中，由三重複實驗結果獲得的電流強度值計算獲得的標準差，單位為μA；其中偵測極限值的單位為fM。圖14為根據表9的實驗數據，及根據表9的實驗數據進行回歸分析的結果，所繪成的回歸分析圖；圖11中X軸為目標萃取液的濃度，X軸單位為fM，Y軸為測得的電流強度，Y軸單位為μA。
綜上所述，本發明提供一種具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架、其製備方法及包含具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的電化學感測套組，並經由各個實施例證實具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架結合電化學感測器進行目標生物物質的分析，不僅克服一般金屬有機骨架結合電化學感測器靈敏度不足的問題，同時還具有良好的特異性，以及具有寬廣的定量範圍，為金屬有機框架結合電化學感測器用於生物物質分析的領域作出貢獻。
A0101_OR_PSEQ.xml
Claims (10)
- 一種具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架，包括：一磁性鐵金屬有機骨架、一化學修飾物及一捕獲探針，其中該磁性鐵金屬有機骨架是由三價鐵離子、2-甲基咪唑及L-組胺酸經配位結合形成的金屬有機骨架，且該磁性鐵金屬有機骨架內包括有一容置空間，該容置空間中容置有一磁性奈米粒子，該化學修飾物及該捕獲探針共價連接至該金屬有機骨架的表面；其中該化學修飾物為硫堇；其中該捕獲探針用於與一檢體中的一目標生物物質結合；其中該捕獲探針為寡核苷酸、抗體或肽鏈。
- 如請求項1所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架，其中該目標生物物質為核酸、胜肽、蛋白質或化合物。
- 如請求項1所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架，其中磁性鐵金屬有機骨架是由磁性奈米粒子、L-組胺酸、聚乙烯吡咯烷酮及水與甲醇混合反應，再來添加氯化鐵六水合物及水後於4°C靜置反應，最後加入2-甲基咪唑及甲醇後於室溫下混合反應形成。
- 如請求項3所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架，其中磁性奈米粒子的粒徑小於1,000奈米。
- 如請求項1所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架，其中該檢體為唾液、尿液、血清、血漿、全血、細胞、細胞萃取物、淋巴液、腦脊髓液、羊水、肺泡沖洗液、汗液、淚液、痰液、胸水、腹水、關節液、精液或糞便。
- 一種如請求項1所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架的製備方法，步驟包括將1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞、N-羥基琥珀醯亞胺、磁性鐵金屬有機骨架及水於室溫下混合反應，再來以純水沖洗，接著添加硫堇、捕獲探針及水後於室溫下混合反應，以獲得具有修飾的金屬有機骨架。
- 如請求項6所述的製備方法，進一步包括：於完成添加硫堇、捕獲探針及水後於室溫下混合反應後，先以純水沖洗，再於烘箱進行烘乾，以獲得具有修飾的金屬有機骨架。
- 一種電化學感測套組，包括：一電化學感測器，包括一工作電極，該工作電極包括有用於偵測電流變化的一表面，以及與該表面相對的一背面，該工作電極的該背面設置有一磁鐵；一如請求項1所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架；一檢測探針，用於與該目標生物物質結合，且該檢測探針上修飾有一第一標記物；以及一氧化還原酵素，用於進行一氧化還原反應，且該氧化還原酵素上修飾有一第二標記物，該第二標記物用於與該第一標記物結合。
- 一種電化學感測套組，包括：一電化學感測器，用於進行一電化學分析，該電化學感測器包括一工作電極，該工作電極包括有用於偵測電流變化的一表面，以及與該表面相對的一背面，該工作電極的該背面設置有一磁鐵；一如請求項1所述的具有修飾的磁性鐵金屬有機骨架；以及一嵌入劑，用於嵌入該捕獲探針與該目標生物物質的結合處，並進行一氧化還原反應；其中該捕獲探針為寡核苷酸；其中該目標生物物質為核酸。
- 如請求項9所述的電化學感測套組，進一步包括一檢測探針，該檢測探針用於與該目標生物物質結合，且該嵌入劑會嵌入該檢測探針與該目標生物物質的結合處，其中該檢測探針為寡核苷酸。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TWI835609B true TWI835609B (zh) | 2024-03-11 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114146686A (zh) | 2020-09-07 | 2022-03-08 | 天津科技大学 | 一种磁性金属有机骨架材料的制备方法及其应用 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114146686A (zh) | 2020-09-07 | 2022-03-08 | 天津科技大学 | 一种磁性金属有机骨架材料的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Yanzi Wu, Yujie Ma, Guanhong Xu, Fangdi Wei, Yunsu Ma, Quan Song, Xu Wang, Tang Tang, Yueyue Song, Menglan Shi, Xiaoman Xu, Qin H ., Metal-organic framework coated Fe3O4 magnetic nanoparticles with peroxidase-like activity for colorimetric sensing of cholesterol" Sensors and Actuators B: Chemical Volume 249, October 2017, Pages 195-202 |
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