CN107413313A - 一种基于共价有机骨架材料的磁性固相萃取剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于共价有机骨架材料的磁性固相萃取剂及其制备方法和应用。该磁性固相萃取剂包括四氧化三铁磁纳米颗粒内核以及核外依次包裹的聚多巴胺层和共价有机骨架材料COF‑5层。将功能化的磁纳米颗粒加入待处理的糖蛋白样品中，充分搅拌萃取，然后用磁铁将磁纳米颗粒与溶液分离，再加洗脱液将糖蛋白从磁纳米颗粒上洗脱下来并进行测定。共价有机骨架材料能够选择性富集糖蛋白，有效地将糖蛋白与杂质分离，故该方法对糖蛋白具有良好的萃取效果。本发明提供的固相萃取方法操作步骤简单、时间短、回收率高、有机溶剂消耗少，适用于血浆、尿液等复杂生物样品中糖蛋白的富集和测定。

Description

一种基于共价有机骨架材料的磁性固相萃取剂及其制备方法 和应用

技术领域

本发明涉及磁性固相萃取剂，尤其是涉及一种基于共价有机骨架材料的磁性固相萃取剂及其制备方法和应用。

背景技术

糖蛋白是一类含有寡糖链的蛋白质，其浓度及糖链的变化常与一些肿瘤疾病的发生、发展相关。因此通过监测一些糖蛋白的变化情况，可以实现对疾病的早期诊断和预后评估。含糖蛋白的样品通常为血清、唾液、尿液等较为复杂的生物样品，分析时易受到多种物质的干扰，因此在进行糖蛋白分析之前，通常需要对其进行分离富集。

固相萃取技术是目前比较常用的样品前处理技术，它是通过固相萃取吸附剂选择性地吸附样品中的目标成分，使之与样品的基质和干扰物分离，从而实现目标成分的分离富集。固相萃取吸附剂是固相萃取技术的核心，它直接影响了萃取效果的好坏，因此，固相萃取吸附剂的选择极为重要。随着分析样品越来越复杂，传统的萃取吸附剂已经不能满足样品分析的需求，因此，发展高效、准确、选择性强的新型固相萃取吸附剂是固相萃取技术研究的一个重要方向。

共价有机骨架材料（COFs）是一种由C、H、O、N、B等轻元素通过共价键合形成的多孔聚合物。该材料具有热稳定性好、比表面积大、结构稳定、多孔等特性，具有较好的应用前景。目前，该材料多被应用到气体传输、气体储存、催化应用、光电学、色谱分离等领域。共价有机骨架材料COF-5是由1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯缩合反应形成的二维晶体材料。该材料具有较大的比表面积、合适的孔径，且表面有大量官能团，如硼酸基团。因此，将共价有机骨架材料COF-5用作固相萃取吸附剂可获得高的萃取和富集效率。但目前没有将共价有机骨架材料COF-5用作固相萃取吸附剂对糖蛋白进行分离富集的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较大的比表面积、合适的孔径，且表面有大量官能团的基于共价有机骨架材料的磁性固相萃取剂；本发明的另一目的在于提供一种操作简单、富集效果好、选择性强的糖蛋白固相萃取方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于共价有机骨架材料的磁性固相萃取剂，包括四氧化三铁磁纳米颗粒内核以及核外依次包裹的聚多巴胺层和共价有机骨架材料COF-5层，其通过以下步骤制备：

1）四氧化三铁磁纳米颗粒的制备：将0.5~1.0 g FeCl₂·4H₂O溶解于80 mL水中，在通氮气的情况下依次加入KNO₃溶液(2 M) 10 mL和NaOH溶液(1 M) 10 mL，再加入1.5~2.0 g50% PEI溶液，然后将该混合溶液放于90~95℃加热套反应1.5~2 h, 用磁铁收集磁纳米颗粒，用水和无水乙醇清洗数次，在60℃烘箱内烘干待用；

2）共价有机骨架材料COF-5修饰的四氧化三铁磁纳米颗粒的制备，包括以下步骤：

（1）配置1 mg/mL的多巴胺溶液，加入Tris，调节pH至8.5～9，震荡摇匀，暴露于空气中进行预氧化；

（2）称取1~2 g步骤1）制备的四氧化三铁磁纳米颗粒，加到15~20 mL步骤（1）所得的多巴胺碱性溶液中，40~45℃搅拌反应0.5~1 h，用磁铁收集磁纳米颗粒，洗涤，烘干，得到表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒；

（3）称取50~100 mg步骤（2）得到的表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒，加入1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的混合反应溶液，超声60~90 min，加热反应，反应温度为105～120 ℃，反应时间为18～22 h，同时伴有搅拌；用磁铁收集磁纳米颗粒，用甲醇清洗数次，60℃烘干，得到表面修饰COF-5的磁纳米颗粒；

所述的混合反应溶液中1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的摩尔浓度比为1~3：1，且1,4-苯二硼酸的摩尔浓度为0.1 mM~3 mM，所述的1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯混合反应溶液的溶剂为等体积比的均三甲苯和1,4-二氧六环。

优选地，所述步骤2）的（2）重复2~3次。

优选地，所述步骤2）的（3）中的混合反应溶液中1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的摩尔浓度比为3：2，所述的1,4-苯二硼酸的摩尔浓度为0.3 mM。

第二方面，提供一种基于共价有机骨架材料修饰的四氧化三铁磁纳米颗粒作为固相萃取剂在糖蛋白固相萃取中的应用。

优选地，所述的糖蛋白固相萃取包括以下步骤：

（1）称取5~10 mg 上述制备的基于共价有机骨架材料修饰的四氧化三铁磁纳米颗粒，与糖蛋白样品溶液进行搅拌萃取，搅拌萃取时间为0.5~2 h，糖蛋白样品溶液的pH为9~12，血液、尿液样品用pH为9~12的缓冲液稀释50-500倍后进行萃取；

（2）用磁铁将磁纳米颗粒与溶液分离，得到糖蛋白结合的磁纳米颗粒；

（3）用洗脱液将糖蛋白从磁纳米颗粒上洗脱下来，洗脱液为体积份数为0.1~0.5%的三氟乙酸或甲酸水溶液，乙腈含量为30~55%。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

（1）共价有机骨架材料COF-5具有较大的比表面积、合适的孔径，且表面有大量官能团，如硼酸基团，用作固相萃取吸附剂具有高的萃取和富集效率。

（2）本发明提供的固相萃取方法操作步骤简单、时间短、有机溶剂消耗少，对环境污染小。

（3）本发明提供的固相萃取方法对糖蛋白有良好的富集效果，适用于血浆、尿液等复杂生物样品中糖蛋白的富集和测定。

附图说明

图1为基于共价有机骨架材料的糖蛋白固相萃取方法的流程图。

图2为本发明萃取糖蛋白辣根过氧化物酶标准液前后的液相色谱图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】

（1）制备四氧化三铁磁纳米颗粒：将0.7 g FeCl₂·4H₂O溶解于水中，在通氮气的情况下依次加入KNO₃ 溶液(2.0 M) 10 mL和NaOH溶液(1.0 M) 10 mL，再加入1.7 g 50% PEI溶液，然后将该混合溶液放于90℃反应2 h, 用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用水和无水乙醇清洗数次，在60℃烘箱内烘干待用。

（2）制备共价有机骨架材料修饰的磁纳米颗粒：称取多巴胺20 mg，溶于20 mL浓度为10 mmol/L 的Tris缓冲液中，调节pH至8.5，暴露在空气中搅拌至溶液呈淡红褐色，称取1.5 g磁纳米颗粒加到配好的多巴胺溶液中，40℃反应1 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用水和甲醇清洗数次，60℃烘干，此步骤重复2次，得到表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒。

配制2 mL 1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的均三甲苯/1,4-二氧六环（v/v，1:1）混合反应液（1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的浓度分别为0.3mM、0.2 mM），称100 mg 表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒，加到上述溶液中，超声60 min，110℃加热套加热搅拌20 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用甲醇清洗数次，60℃烘干。

（3）固相萃取：称5 mg共价有机骨架材料修饰的磁纳米颗粒加到10 mL 1 μg/mL辣根过氧化物酶溶液（20 mM pH 9.5 磷酸盐缓冲液），搅拌萃取1 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，加入200 μL 0.2%三氟乙酸水溶液（含55% 乙腈），超声3 min，将辣根过氧化物酶从磁纳米颗粒上洗脱下来，与高效液相色谱联用，对辣根过氧化物酶进行分析。结果如图2所示，实施例1所制得的磁纳米颗粒对水溶液中的辣根过氧化物酶具有良好的富集效果。

【实施例2】

（1）制备四氧化三铁磁纳米颗粒：将0.7 g FeCl₂·4H₂O溶解于水中，在通氮气的情况下依次加入KNO3 溶液(2.0 M) 10 mL和NaOH溶液(1.0 M) 10 mL，再加入1.7 g 50% PEI溶液，然后将该混合溶液放于95℃反应1.5 h, 用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用水和无水乙醇清洗数次，在60℃烘箱内烘干待用。

（2）制备共价有机骨架材料修饰的磁纳米颗粒：称取多巴胺20 mg，溶于20 mL浓度为10 mmol/L 的Tris缓冲液中，调节pH至8.5，暴露在空气中搅拌至溶液呈淡红褐色，称取1.5 g磁纳米颗粒加到配好的多巴胺溶液中，40℃反应1 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用水和甲醇清洗数次，60℃烘干，此步骤重复3次，得到表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒。

配制2 mL 1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的均三甲苯/1,4-二氧六环（v/v，1:1）混合反应液（1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的浓度分别为0.3mM、0.2 mM），称50 mg 表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒，加到上述溶液中，超声60 min，120℃加热套加热搅拌18 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用甲醇清洗数次，60℃烘干。

（3）固相萃取：称5 mg共价有机骨架材料修饰的磁纳米颗粒加到10 mL 1 μg/mL辣根过氧化物酶溶液（20 mM pH 9.5 磷酸盐缓冲液），搅拌萃取2 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，加入200 μL 0.4%三氟乙酸水溶液（含35% 乙腈），超声3 min，将辣根过氧化物酶从磁纳米颗粒上洗脱下来，与高效液相色谱联用，对辣根过氧化物酶进行定量分析。

【实施例3】

（1）制备四氧化三铁磁纳米颗粒：将0.7 g FeCl₂·4H₂O溶解于水中，在通氮气的情况下依次加入KNO₃ 溶液(2.0 M) 10 mL和NaOH溶液(1.0 M) 10 mL，再加入1.7 g 50% PEI溶液，然后将该混合溶液放于95℃反应1.5 h, 用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用水和无水乙醇清洗数次，在60℃烘箱内烘干待用。

（2）制备共价有机骨架材料修饰的磁纳米颗粒：称取多巴胺20 mg，溶于20 mL浓度为10 mmol/L 的Tris缓冲液中，调节pH至9，暴露在空气中搅拌至溶液呈淡红褐色，称取1 g磁纳米颗粒加到配好的多巴胺溶液中，45℃反应0.5 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用水和甲醇清洗数次，60℃烘干，此步骤重复3次，得到表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒。

配制2 mL 1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的均三甲苯/1,4-二氧六环（v/v，1:1）混合反应液（1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的浓度分别为0.3mM、0.2 mM），称100 mg 表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒，加到上述溶液中，超声60 min，110℃加热套加热搅拌22 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，收集得到的颗粒用甲醇清洗数次，60℃烘干。

（3）固相萃取：称10 mg共价有机骨架材料修饰的磁纳米颗粒加到20 mL 1 μg/mL辣根过氧化物酶溶液（20 mM pH 11 磷酸盐缓冲液），搅拌萃取1 h，用磁铁将磁纳米颗粒从溶液中分离出来，加入200 μL 0.5%甲酸水溶液（含35% 乙腈），超声3 min，将辣根过氧化物酶从磁纳米颗粒上洗脱下来，与高效液相色谱联用，对辣根过氧化物酶进行定量分析。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (5)

1.一种基于共价有机骨架材料的磁性固相萃取剂，其特征在于，包括四氧化三铁磁纳米颗粒内核以及核外依次包裹的聚多巴胺层和共价有机骨架材料COF-5层，其通过以下步骤制备：

1）四氧化三铁磁纳米颗粒的制备：将0.5~1.0 g FeCl₂·4H₂O溶解于水中，在通氮气的情况下依次加入2 M的 KNO₃溶液10 mL和1 M的NaOH溶液10 mL，再加入1.5~2.0 g 50% PEI溶液，然后将该混合溶液放于90~95℃加热套反应1.5~2 h, 用磁铁收集磁纳米颗粒，用水和无水乙醇清洗数次，在60℃烘箱内烘干待用；

2）共价有机骨架材料COF-5修饰的四氧化三铁磁纳米颗粒的制备，包括以下步骤：

（1）配置1 mg/mL的多巴胺溶液，加入Tris，调节pH至8.5～9，震荡摇匀，暴露于空气中进行预氧化；

（2）称取1~2 g步骤1）制备的四氧化三铁磁纳米颗粒，加到15~20 mL步骤（1）所得的多巴胺碱性溶液中，40~45℃搅拌反应0.5~1 h，用磁铁收集磁纳米颗粒，洗涤，烘干，得到表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒；

（3）称取50~100 mg步骤（2）得到的表面修饰有聚多巴胺的磁纳米颗粒，加入2~4 mL 1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的混合反应溶液，超声60~90 min，加热反应，反应温度为105～120 ℃，反应时间为18～22 h，同时伴有搅拌；用磁铁收集磁纳米颗粒，用水和甲醇清洗数次，60℃烘干，得到表面修饰COF-5的磁纳米颗粒；

（3）中所述的混合反应溶液中1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的摩尔浓度比为1~3：1，且1,4-苯二硼酸的摩尔浓度为0.1 mM~3 mM，所述的1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯混合反应溶液的溶剂为等体积比的均三甲苯和1,4-二氧六环。

2.根据权利要求1所述的磁性固相萃取剂，其特征在于，所述步骤2）的（2）重复2~3次。

3.根据权利要求1所述的磁性固相萃取剂，其特征在于，所述步骤2）的（3）中的混合反应溶液中1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的摩尔浓度比为3：2，所述的1,4-苯二硼酸的摩尔浓度为0.3 mM。

4.权利要求1-3所述的基于共价有机骨架材料修饰的四氧化三铁磁纳米颗粒作为固相萃取剂在糖蛋白固相萃取中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的糖蛋白固相萃取包括以下步骤：

（1）称取5~10 mg权利要求1-3所述的基于共价有机骨架材料修饰的四氧化三铁磁纳米颗粒，与糖蛋白样品溶液进行搅拌萃取，搅拌萃取时间为0.5~2 h，糖蛋白样品溶液的pH为9~12；

（2）用磁铁将磁纳米颗粒与溶液分离，得到糖蛋白结合的磁纳米颗粒；

（3）用洗脱液将糖蛋白从磁纳米颗粒上洗脱下来，洗脱液为体积份数为0.1~0.5%的三氟乙酸或甲酸水溶液，乙腈含量为30~55%。