CN114660300B - 一种采用dtt试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法 - Google Patents

一种采用dtt试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114660300B
CN114660300B CN202210164640.0A CN202210164640A CN114660300B CN 114660300 B CN114660300 B CN 114660300B CN 202210164640 A CN202210164640 A CN 202210164640A CN 114660300 B CN114660300 B CN 114660300B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dtt
time
solution
reagent
preparing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210164640.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114660300A (zh
Inventor
刘章泉
单博文
赵海洋
谭慧
张继明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LABNOVATION TECHNOLOGIES Inc
Original Assignee
LABNOVATION TECHNOLOGIES Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LABNOVATION TECHNOLOGIES Inc filed Critical LABNOVATION TECHNOLOGIES Inc
Priority to CN202210164640.0A priority Critical patent/CN114660300B/zh
Publication of CN114660300A publication Critical patent/CN114660300A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114660300B publication Critical patent/CN114660300B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明公开一种采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，包括如下步骤：活化液配制；偶联液配制；封闭液配制；保存液配制；时间分辨荧光微球标记RBD的配制；第一次清洗；活化；第二次清洗；偶联；第三次清洗；封闭：第四次清洗；保存；DTT处理时间分辨荧光微球标记RBD；样品垫配制；划膜包被液配制；最后进行组装、切条，然后用组卡测试效果用。本发明采用适量DTT处理时间分辨荧光微球标记RBD造成微球聚集现象，是一种条件温和，操作简便，效果好的方式；通过改善试剂的检测重复性，为线性，批间差，批内差检测奠定基础；与传统的超声解决微球聚集问题，有利于保持时间分辨荧光微球结构和性能。

Description

一种采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法
技术领域
本发明涉及抗体层析试剂技术领域，特别涉及一种采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法。
背景技术
SARS-CoV-2属于β冠状病毒，是一种有包膜的正义单链RNA病毒。它通过飞沫或直接接触在人与人之间传播。许多确诊的SARS-COV-2患者出现发烧或急性呼吸道疾病症状(例如咳嗽、呼吸困难)。SARS-CoV-2具有多种结构蛋白，包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。刺突蛋白(S)包含一个受体结合结构域(RBD)，它负责识别细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)。发现SARS-CoV-2S蛋白的RBD与人ACE2受体强烈相互作用，导致内吞作用进入深肺的宿主细胞和病毒复制。科学家已经证明，中和表位是病毒刺突的S蛋白的特定受体结合域，称为S-RBD。感染SARS-CoV-2后，人类将启动免疫反应，包括产生抗体。在病毒的总抗体中，中和抗体会与S-RBD结合，阻断病毒的细胞浸润和复制。目前尚不清楚产生中和抗体需要多长时间，以及它们是否总是在SARS-CoV-2感染或疫苗后产生。虽然感染SARS-CoV-2的个体会产生与病毒结合的抗体，但并非所有人都会产生针对SARS-CoV-2的中和抗体。
目前市场上用于中和抗体检测试剂涉及胶体金法，化学发光法，酶联免疫法、荧光免疫层析法。时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是当代最先进的免疫分析方法之一，结合纳米信号的放大作用，具有广泛的应用前景，适用于肿瘤标志物、激素等高灵敏度免疫试剂盒的开发。
与经典的时间分辨荧光免疫分析方法DELFIA法不同，时间分辨荧光免疫层析技术采用荧光纳米微球作为标记物，每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了标记效率，有效的提高了灵敏度；同时纳米荧光微球表面修饰有合适密度的羧基，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高标记物的稳定性。
DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性。它的氧化还原电势在pH为7时为-0.33伏。由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低；DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下。这种二聚化大大降低了一些偶联反应实验(如DNA在生物感应器中的固定)的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，就可以降低DNA的二聚化DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部(溶剂不可及)的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性(高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1％SDS)。
采用竞争抑制法，ACE2重组蛋白和山羊抗鼠IgG抗体分别包被在膜检测线和质控线上。在检测过程中，样本中存在的中和抗体将与S-RBD标记的时间分辨荧光微球，并阻断S-RBD和ACE2之间的蛋白质-蛋白质相互作用。当样品中的中和抗体滴度低或不存在时，时间分辨荧光微球标记的S-RBD重组蛋白与检测线ACE2重组蛋白结合，在检测线处形成一条暗带。无论样本中是否含有SARS-CoV-2中和抗体，时间分辨荧光微球标记质控抗体(兔IgG)都会在C线与包被抗体(羊抗兔IgG)结合形成复合物并显色(C线)。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。时间分辨荧光微球具有优势：灵敏度高，比金标、普通荧光灵敏度高2-3个数量级；可定量检测，根据内置的标准曲线，可给出待测物的具体浓度；标记物稳定，抗干扰强，检测结果重复性好操作简便，检测时间短，可用于现场筛查；成本便宜，性价比高。但是基于病毒S蛋白的的受体结合域(S-RBD)的特殊序列的造成试剂重复性的差问题，我们需找出一种有效改善试剂重复性的方法来提高试剂的性能指标。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，包括如下步骤：
步骤S1：活化液配制；
步骤S2：偶联液配制；
步骤S3：封闭液配制；
步骤S4：保存液配制；
步骤S5：时间分辨荧光微球标记RBD的配制；
步骤S6：用DTT处理时间分辨荧光微球标记RBD：对DTT进行配制，并将配制好的DTT溶液加入到时间分辨荧光微球标记RBD溶液中进行还原，然后离心，并使用保存液补充至初始体积后超声混匀，再进行离心，然后用中和抗体稀释液进行稀释；
步骤S7：样品垫配制；
步骤S8：划膜包被液配制；
步骤S9：最后进行组装、切条，然后用主卡测试效果。
优选地，所述步骤S1中的活化液具体配制的步骤为：选取2-(N-吗啉代)乙磺酸0.956-0.996g加入到99-101ml Mill-Q纯化水中，用NaOH调PH值为6.0±0.1，然后进行搅拌混匀。
优选地，所述步骤S2中的偶联液具体配制的步骤为：取2-(N-吗啉代)乙磺酸0.956-0.996g加入到99-101ml Mill-Q纯化水中，用NaOH调PH值为6.5±0.1，然后进行搅拌混匀。
优选地，所述步骤S3中的封闭液具体配制步骤为：选取Mill-Q纯化水78-82ml、牛血清白蛋白0.95-1.05g、酪蛋白钠盐4.95-5.05g、100mM甘氨酸0.495-0.505ml、吐温-200.495-0.505ml、Proclin300 0.018-0.022ml进行混合搅拌，最后定容至100ml。
优选地，所述步骤S4中的保存液具体配制步骤为：选取Mill-Q纯化水78-82ml、牛血清白蛋白0.495-0.505g、100mM甘氨酸7.95-8.05ml、吐温-20 0.295-0.305ml、Proclin300 0.018-0.022ml进行混合搅拌，最后定容至100ml。
优选地，所述步骤S5中时间分辨荧光微球标记RBD的配制具体步骤为：步骤S501：第一次清洗:取活化液及时间分辨荧光微球于离心管中，然后进行混匀后离心，并用活化液补充至初始体积，使用超声波清洗仪使得时间分辨荧光微球均匀分散于缓冲液中；
步骤S502：活化；
步骤S503：第二次清洗：活化完成后进行离心，并用偶联液补充至初始体积后超声混匀；
步骤S504：偶联：第二次清洗完成后加入RBD抗原进行混匀；
步骤S505:第三次清洗:偶联完成后进行离心，并用封闭液补充至初始体积后超声混匀；
步骤S506：封闭：
步骤S507：第四次清洗：封闭完后进行离心，并用保存液补充至初始体积后超声混匀，再在进行离心；
步骤S508：保存。
优选地，所述步骤S501中选取的活化液为4份，时间分辨荧光微球为1份；所述步骤S502中的活化具体步骤为：将步骤S501第一次冲洗后的缓冲液，分别加入配置好的交联剂A和交联剂B中，交联剂A终浓度为0.95-1.05mg/ml，交联剂B终浓度为1.45-1.55mg/ml，并置于涡旋混合器中室温混匀；所述步骤S506中的封闭具体步骤为，将步骤S505中的第三次清洗后的溶液置于涡旋混合器中室温混匀；所述步骤S508中的保存是在2-8℃下进行保存。
优选地，所述步骤S6中还原的具体步骤为：将配制好的DTT溶液取1.9-2.1μl分别加入到500μl标记有RBD时间分辨荧光微球溶液中，分别在室温(48-52)rpm旋转混合仪中还原30min，45min，60min；所述步骤S6中用中和抗体稀释液进行稀释的具体步骤为：将时间分辨荧光微球直接标记RBD与还原好的时间分辨荧光微球标记RBD用中和抗体稀释液进行稀释三个不同的梯度，然后在溶度为0.1mg/ml进行喷垫处理，然后烘干后进行切条组装测试效果。
优选地，所述步骤S7中的样品垫具体配制步骤为：选取Mill-Q纯化水78-82ml、酪蛋白4.95-5.05g、海藻糖1.98-2.02g、Tween-20 7.98-8.02ml、Tris 6.00-6.10g、PEG200000.95-1.05g进行混合搅拌，并调PH至8.5±0.1，最后定容至1000ml，并将配制好的样品垫溶液50ml喷垫于6613，然后烘干后，切成17mm宽备用。
优选地，所述步骤S8中的划膜包被液具体配制步骤为：选取海藻糖20％24.9-25.1ml、甲醇4.98-5.02ml、1×PBS 79.5-80.5ml进行混合搅拌制得划膜包被液，并将配制好的划膜包被液稀释ACE2至1.0mg/ml，进行划膜包被，然后烘干后备用。
采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：
1、采用适量DTT处理时间分辨荧光标记RBD造成微球聚集现象，是一种条件温和，操作简便，效果好的方式。
2、通过改善试剂的检测重复性，为线性，批间差，批内差检测奠定基础。
3、与传统的超声解决微球聚集问题，有利于保持时间分辨荧光微球结构和性能。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步说明。
为了实现上述目的，本发明提供一种采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，包括如下步骤：
步骤S1：活化液(A液)配制；
步骤S2：偶联液(C液)配制；
步骤S3：封闭液(S液)配制；
步骤S4：保存液(P液)配制；
步骤S5：时间分辨荧光微球标记RBD的配置；
步骤S501：第一次清洗:取活化液(A液)及时间分辨荧光微球于离心管中，然后进行混匀后离心(在4℃、15000g因素下离心15min)，并用A液(PH＝6.0)补充至初始体积，使用超声波清洗仪使得时间分辨荧光微球均匀分散于缓冲液中；
步骤S502：活化；
步骤S503：第二次清洗：活化完成后进行离心(在4℃、15000g因素下离心15min)，去除上清液，并用偶联液(C液)补充至初始体积后超声混匀；
步骤S504：偶联：第二次清洗完成后加入RBD抗原进行混匀；
步骤S505:第三次清洗:偶联完成后进行离心(在4℃、15000g因素下离心15min)，去除上清液，并用封闭液(S液)补充至初始体积后超声混匀；
步骤S506：封闭：
步骤S507：第四次清洗：封闭完后进行离心(在4℃、15000g因素下离心15min)，去除上清液，并用保存液(P液)补充至初始体积后超声混匀，再在进行离心；
步骤S508：保存；
步骤S6：用DTT处理时间分辨荧光微球标记RBD：对DTT进行配制，并将配制好的DTT溶液加入到RBD时间分辨荧光微球溶液中进行还原，然后离心(在4℃、15000g因素下离心15min)，并使用保存液P补充至初始体积后超声混匀，再进行离心，然后用中和抗体稀释液进行稀释；
步骤S7：样品垫配制；
步骤S8：划膜包被液配制；
步骤S9：最后进行组装、切条，然后用组卡测试效果。
所述步骤S1中的活化液(A液)具体配制的步骤为：选取2-(N-吗啉代)乙磺酸0.976g加入到100ml Mill-Q纯化水中，用NaOH调PH值为6.0±0.1，然后进行搅拌混匀。
所述步骤S2中的偶联液(C液)具体配制的步骤为：取2-(N-吗啉代)乙磺酸0.976g加入到100ml Mill-Q纯化水中，用NaOH调PH值为6.5±0.1，然后进行搅拌混匀。
参照下表1，所述步骤S3中的封闭液(S液)具体配制步骤为：选取Mill-Q纯化水80ml、牛血清白蛋白1g、酪蛋白钠盐5g、100mM甘氨酸0.5ml、吐温-20 0.5ml、Proclin3000.02ml进行混合搅拌，最后定容至100ml。
表1
Figure GDA0003632593500000071
参照下表2，所述步骤S4中的保存液(P液)具体配制步骤为：选取Mill-Q纯化水80ml、牛血清白蛋白0.5g、100mM甘氨酸8ml、吐温-20 0.3ml、Proclin300 0.02ml进行混合搅拌，最后定容至100ml。
表2
Figure GDA0003632593500000072
所述步骤S501中选取的活化液(A液)为4份，时间分辨荧光微球为1份。
所述步骤S502中的活化具体步骤为：将步骤S501第一次冲洗后的缓冲液，分别加入配置好的交联剂A和交联剂B中，交联剂A终浓度为1.0mg/ml，交联剂B终浓度为1.5mg/ml，并置于涡旋混合器中室温混匀20min；
所述步骤S504中终浓度为0.2mg/ml，并置于涡旋混合器中室温混匀2.5h。
所述步骤S506中的封闭具体步骤为，将步骤S505中的第三次清洗后的溶液置于涡旋混合器中室温混匀1.5h；所述步骤S508中的保存是在2-8℃下进行保存。
所述步骤S6中DTT具体配制的步骤为：分别取0.75mg、1.0mg、1.25mg、1.50mg DTT加入到20ml Mill-Q纯化水涡旋混匀，使其浓度分别为：37.5ug/ml、50ug/ml、62.5ug/ml、75ug/ml。
所述步骤S6中还原的具体步骤为：将配制好的DTT溶液取2μl分别加入到500μl标记有RBD时间分辨荧光微球溶液中，分别在室温50rpm旋转混合仪中还原30min，45min，60min。所述步骤S6中用中和抗体稀释液进行稀释的具体步骤为：将时间分辨荧光微球直接标记RBD与还原好的时间分辨荧光微球标记RBD用中和抗体稀释液进行稀释三个不同的梯度，然后在溶度为0.1mg/ml进行喷垫处理，置于45℃烘干24h后进行切条(17mm)组装测试效果。
参照表3，所述步骤S7中的样品垫具体配制步骤为：选取Mill-Q纯化水80ml、酪蛋白5g、海藻糖2g、Tween-20 8ml、Tris 6.05g、PEG20000 1g进行混合搅拌，并调PH至8.5，最后定容至1000ml，并将配制好的样品垫溶液50ml喷垫于6613，并置于45℃下烘干24h后，切成17mm宽备用。
表3
Figure GDA0003632593500000081
参照表4，所述步骤S8中的划膜包被液具体配制步骤为：选取海藻糖20％25ml、甲醇5ml、1×BS 80ml进行混合搅拌制得划膜包被液，并将配制好的划膜包被液稀释ACE2至1.0mg/ml，进行划膜包被，并在45℃温度下烘干48h后备用。
表4
Figure GDA0003632593500000091
所述步骤S9中组装物质包括制备好的样品垫、铺有RBD荧光垫、划好ACE2 NC膜、吸水纸。
用以上配方制作的层析试剂测试内部参考品，对试剂的性能指标进行评价。
表1 –a为：时间分辨荧光微球直接标记RBD喷垫重复性实验结果。
表1–a
Figure GDA0003632593500000101
表1–b时间分辨荧光微球直接标记RBD喷垫批间差实验结果。
表1–b
Figure GDA0003632593500000111
表1-c时间分辨荧光微球直接标记RBD喷垫线性实验结果。
表1–c
Figure GDA0003632593500000112
表2-a DTT(37.5ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD喷垫重复性实验结果。
表2-a
Figure GDA0003632593500000121
表2–b DTT(37.5ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表2–b
Figure GDA0003632593500000131
表2–c DTT(37.5ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表2–c
Figure GDA0003632593500000132
表3-a DTT(50ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表3-a
Figure GDA0003632593500000141
表3-b DTT(50ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表3-b
Figure GDA0003632593500000151
表3–c DTT(50ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表3–c
Figure GDA0003632593500000152
表4-a DTT(62.5ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表4-a
Figure GDA0003632593500000161
表4-b DTT(62.5ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表4-b
Figure GDA0003632593500000171
表4-c DTT(62.5ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表4-c
Figure GDA0003632593500000172
表5-a DTT(75ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表5-a
Figure GDA0003632593500000181
表5-b DTT(75ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表5-b
Figure GDA0003632593500000191
表5-c DTT(75ug/mlDTT，还原30min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表5-c
Figure GDA0003632593500000192
表6-a DTT(37.5ug/ml DTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表6-a
Figure GDA0003632593500000201
表6-b DTT(37.5ug/ml DTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表6-b
Figure GDA0003632593500000211
表6-c DTT(37.5ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表6-c
Figure GDA0003632593500000212
表7-a DTT(50ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表7-a
Figure GDA0003632593500000221
表7-b DTT(50ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表7-b
Figure GDA0003632593500000231
表7-c DTT(50ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表7-c
Figure GDA0003632593500000232
表8-a DTT(62.5ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表8-a
Figure GDA0003632593500000241
表8-b DTT(62.5ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表8-b
Figure GDA0003632593500000251
表8-c DTT(62.5ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表8-c
Figure GDA0003632593500000252
表9-a DTT(75ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表9-a
Figure GDA0003632593500000261
表9-b DTT(75ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表9-b
Figure GDA0003632593500000271
表9-c DTT(75ug/mlDTT，还原45min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表9-c
Figure GDA0003632593500000272
表10-a DTT(37.5ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表10-a
Figure GDA0003632593500000281
表10-b DTT(37.5ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表10-b
Figure GDA0003632593500000291
表10-c DTT(37.5ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表10-c
Figure GDA0003632593500000292
表11-a(50ug/mlDTT，还原60min)DTT还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表11-a
Figure GDA0003632593500000301
表11-b DTT(50ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表11-b
Figure GDA0003632593500000311
表11-c DTT(50ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表11-c
Figure GDA0003632593500000312
表12-a DTT(62.5ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表12-a
Figure GDA0003632593500000321
表12-b DTT(62.5ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表12-b
Figure GDA0003632593500000331
表12-c DTT(62.5ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表12-c
Figure GDA0003632593500000332
表13-a DTT(75ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD重复性实验结果。
表13-a
Figure GDA0003632593500000341
表13-b DTT(75ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD批间差实验结果。
表13-b
Figure GDA0003632593500000351
表13-c DTT(75ug/mlDTT，还原60min)还原时间分辨荧光微球直接标记RBD线性实验结果。
表13-c
Figure GDA0003632593500000352
由上述实验结果分析：该层析试剂性能评估实验结果表明，用DTT试剂进行还原时间分辨荧光微球标记的RBD明显改善了试剂的性能指标包括：重复性、批间差、通过筛选DTT用量和还原时间，得出最佳还原条件为：DTT浓度(62.5ug/mlDTT，还原60min)，此时测试内部参考品(0.31ug/ml、1.25ug/ml)重复性分别为7.11％、7.52％；测试内部参考品(0.31ug/ml、1.25ug/ml)批间差分别为9.03％、8.45％；测试内部参考品(0.12ug/ml、0.69ug/ml、1.39ug/ml、2.08ug/ml、2.77ug/ml、3.47ug/ml、4.16ug/ml)线性方程：y＝0.6436x-0.7229，R2＝0.9917，该方法在0.12-4.16ug/ml浓度范围内线性较好。
本发明是通过DTT试剂还原时间分辨荧光标记微球上标记的RBD中半胱氨酸形成的二硫键导致形成时间分辨荧光微球聚集的现象，本发明的优点在于：
1.由于本发明采用适量DTT还原时间分辨荧光微球标记的RBD，反应条件温和，不会对抗原S-RBD造成结构的破坏，从而解决利用物理特性如超声改变时间分辨微球聚集问题(对时间分辨荧光微球超声时间长可能会引起其结构和性能变化)。
2.由于本发明通过改善时间分辨荧光微球聚集问题，改善了检测试剂的重复性，批间差，批内差，线性等一系列性能指标。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：活化液配制；
步骤S2：偶联液配制；
步骤S3：封闭液配制；
步骤S4：保存液配制；
步骤S5：时间分辨荧光微球标记RBD的配制；
所述步骤S5中时间分辨荧光微球标记RBD的配制具体步骤为：
步骤S501：第一次清洗:取活化液及时间分辨荧光微球于离心管中，然后进行混匀后离心，并用活化液补充至初始体积，使用超声波清洗仪使得时间分辨荧光微球均匀分散于缓冲液中；
步骤S502：活化；
步骤S503：第二次清洗：活化完成后进行离心，并用偶联液补充至初始体积后超声混匀；
步骤S504：偶联：第二次清洗完成后加入RBD抗原进行混匀；
步骤S505:第三次清洗:偶联完成后进行离心，并用封闭液补充至初始体积后超声混匀；
步骤S506：封闭；
步骤S507：第四次清洗：封闭完后进行离心，并用保存液补充至初始体积后超声混匀，再在进行离心；
步骤S508：保存；
步骤S6：用DTT处理时间分辨荧光微球标记RBD：对DTT进行配制，并将配制好的DTT溶液加入到时间分辨荧光微球标记RBD溶液中进行还原，然后离心，并使用保存液补充至初始体积后超声混匀，再进行离心，然后用新冠中和抗体稀释液进行稀释；
步骤S7：样品垫配制；
步骤S8：划膜包被液配制；
步骤S9：最后进行组装、切条，然后用组卡测试效果。
2.根据权利要求1所述的采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，所述步骤S1中的活化液具体配制的步骤为：选取2-(N-吗啉代)乙磺酸0.956-0.996g加入到99-101ml Mill-Q 纯化水中，用NaOH调PH值为6.0±0.1，然后进行搅拌混匀。
3.根据权利要求1所述的采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，所述步骤S2中的偶联液具体配制的步骤为：取2-(N-吗啉代)乙磺酸0.956-0.996g 加入到99-101ml Mill-Q 纯化水中，用NaOH调PH值为6.5±0.1，然后进行搅拌混匀。
4.根据权利要求1所述的采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，所述步骤S3中的封闭液具体配制步骤为：选取Mill-Q 纯化水78-82ml 、牛血清白蛋白0.95-1.05g、酪蛋白钠盐4.95-5.05g、100mM甘氨酸0.495-0.505ml、吐温-20 0.495-0.505ml、Proclin300 0.018-0.022ml进行混合搅拌，最后定容至100ml。
5.根据权利要求1所述的采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，所述步骤S4中的保存液具体配制步骤为：选取Mill-Q 纯化水78-82ml、牛血清白蛋白0.495-0.505g、100mM甘氨酸7.95-8.05ml、吐温-20 0.295-0.305ml、Proclin300 0.018-0.022ml进行混合搅拌，最后定容至100ml。
6.根据权利要求1所述的采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，所述步骤S501中选取的活化液为4份，时间分辨荧光微球为1份；所述步骤S502中的活化具体步骤为：将步骤S501第一次冲洗后的缓冲液，分别加入配置好的交联剂A和交联剂B中，交联剂A终浓度为0.95-1.05mg/ml，交联剂B终浓度为1.45-1.55mg/ml，并置于涡旋混合器中室温混匀；所述步骤S506中的封闭具体步骤为，将步骤S505中的第三次清洗后的溶液置于涡旋混合器中室温混匀；所述步骤S508中的保存是在2-8℃下进行保存。
7.根据权利要求1所述的采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，所述步骤S6中还原的具体步骤为：将配制好的DTT溶液取1.9-2.1μl分别加入到500μl标记有RBD时间分辨荧光微球溶液中，分别在室温48-52rpm旋转混合仪中还原30min，45min，60min；所述步骤S6中用中和抗体稀释液进行稀释的具体步骤为：将时间分辨荧光微球直接标记RBD与还原好的时间分辨荧光微球标记RBD用中和抗体稀释液进行稀释三个不同的梯度，然后在溶度为0.1mg/ml进行喷垫处理，然后烘干后进行切条组装测试效果。
8.根据权利要求1所述的采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，所述步骤S7中的样品垫具体配制步骤为：选取Mill-Q 纯化水78-82ml 、酪蛋白4.95-5.05g、海藻糖1.98-2.02g、Tween-207.98-8.02ml、Tris6.00-6.10g、PEG200000.95-1.05g进行混合搅拌，并调PH至8.5±0.1，最后定容至1000ml，并将配制好的样品垫溶液50ml喷垫于6613，然后烘干后，切成17mm宽备用。
9.根据权利要求1所述的采用DTT试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法，其特征在于，所述步骤S8中的划膜包被液具体配制步骤为：选取海藻糖20% 24.9-25.1ml、甲醇4.98-5.02ml、1×PBS 79.5-80.5ml进行混合搅拌制得划膜包被液，并将配制好的划膜包被液稀释ACE2至1.0mg/ml，进行划膜包被，然后烘干后备用。
CN202210164640.0A 2022-02-22 2022-02-22 一种采用dtt试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法 Active CN114660300B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210164640.0A CN114660300B (zh) 2022-02-22 2022-02-22 一种采用dtt试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210164640.0A CN114660300B (zh) 2022-02-22 2022-02-22 一种采用dtt试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114660300A CN114660300A (zh) 2022-06-24
CN114660300B true CN114660300B (zh) 2022-12-02

Family

ID=82027148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210164640.0A Active CN114660300B (zh) 2022-02-22 2022-02-22 一种采用dtt试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114660300B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107290520A (zh) * 2017-06-14 2017-10-24 邵超鹏 测定孕妇IgG抗‑A和抗‑B血型抗体或人血型反定型的免疫层析试纸条
CN109813693A (zh) * 2019-01-09 2019-05-28 北京丹大生物技术有限公司 一种检测万古霉素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN111060691A (zh) * 2020-03-17 2020-04-24 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 检测covid-19的荧光免疫层析装置及其使用方法
CN113156131A (zh) * 2021-04-23 2021-07-23 深圳市爱康试剂有限公司 新型冠状病毒（covid-19）中和抗体检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107290520A (zh) * 2017-06-14 2017-10-24 邵超鹏 测定孕妇IgG抗‑A和抗‑B血型抗体或人血型反定型的免疫层析试纸条
CN109813693A (zh) * 2019-01-09 2019-05-28 北京丹大生物技术有限公司 一种检测万古霉素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN111060691A (zh) * 2020-03-17 2020-04-24 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 检测covid-19的荧光免疫层析装置及其使用方法
CN113156131A (zh) * 2021-04-23 2021-07-23 深圳市爱康试剂有限公司 新型冠状病毒（covid-19）中和抗体检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
荧光免疫层析法检测全血2019-nCoVIgM 和IgG 抗体在新型冠状病毒肺炎诊断中的应用;陈泽衍等;《现代检验医学杂志》;20200531;第35卷(第3期);84-86、93 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114660300A (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107413313B (zh) 一种基于共价有机骨架材料的磁性固相萃取剂及其制备方法和应用
CN108333344A (zh) 高灵敏度的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用
CN101551394A (zh) 以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法
CN109444434A (zh) 双抗原夹心检测抗体的方法
CN112649601B (zh) 一种酶标偶联二抗及其制备方法
CN106556592A (zh) 定量检测人tk1的化学发光试剂盒及其制备方法
CN112462061A (zh) 检测h1n1、rsv-a和adv3的试剂盒及其应用
US6723502B2 (en) Hepatitis C antigen—antibody combination assay for the early detection of infection
CN106771149B (zh) 传染性法氏囊病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用
CN114544934A (zh) 一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用
CN104374921A (zh) 一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用
CN104849458B (zh) 一种基于KNbO3-Au NPs@Bi2S3构建的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用
CN104931685B (zh) 一种基于携带His标签重组抗原的发光免疫检测方法
CN114660300B (zh) 一种采用dtt试剂改善新冠中和抗体层析试剂性能的方法
CN105445475B (zh) 一种三抗体双通道同时检测人核基质蛋白和癌胚抗原免疫传感器的制备方法及应用
JP4975601B2 (ja) Ｈｃｖ抗体測定用試薬キット及びｈｃｖ抗体測定方法
EP1978365B1 (en) Reagent kit and method for measuring HCV antibody
CN114478716B (zh) 一种多肽组合及其在新型冠状病毒抗体检测中的应用
CN103197059B (zh) 一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒及其检测方法和制备方法
JP2003202345A (ja) Ｈｃｖコア抗原及び抗体の同時検出試薬
CN109444116A (zh) 一种增强型ecl化学发光试剂
CN104297494A (zh) 一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制备方法
WO2022041055A1 (zh) 用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒以及检测方法
CN114720700A (zh) 检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤试剂盒的应用
CN104330566B (zh) 梅毒试纸条及其制备方法、梅毒检测卡及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant