CN103197059B - 一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒及其检测方法和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒及其检测方法和制备方法，该试剂盒包括：电化学传感阵列、酶结合物工作液、酶底物、阴性对照品、阳性对照品、样本稀释液和洗涤液，电化学传感阵列包括印刷碳电极以及表面共组装的血吸虫抗原层和吸附的封闭剂层，血吸虫抗原为SjE16和SEA的混合物，酶结合物工作液为含有辣根过氧化酶标记的二抗的BSA溶液，酶底物为四甲基联苯胺与双氧水的混合物，阴性对照品为正常血清，阳性对照品为血吸虫感染血清，样本稀释液和洗涤液均为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。本发明的试剂盒制备简单、成本低廉、可进行多样本分析，且检测灵敏度、特异性及重现性好，有望用于疫区血吸虫病患者筛查及监测。

Description

一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒及其检测方法和制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒及其检测方法和制备方法。

背景技术

血吸虫病是世界上分布最广泛的人畜共患寄生虫病之一，其严重危害着人类健康并直接影响着全球经济发展。在我国，血吸虫病虽然得到了一定的控制，但其仍然是一个重要的公共卫生问题。目前，血吸虫病的诊断仍然是血吸虫病防治工作的关键，它是寻找并确定指示血吸虫在机体存在的直接或间接证据，为血吸虫感染的临床诊断提供依据。血吸虫病传统的检测方法为粪检等病原学检测，但该方法在中度或低度血吸虫病流行区域的敏感性并不令人满意，且费时、费力、漏检率较高，而且不能对该病进行早期诊断。为了解决这一问题，至今逾半个世纪研究者们一直致力于免疫学诊断方法的研制，目前免疫学诊断已被广泛用于血吸虫病的筛查及监测，并成为血防工作的主要手段，常用的方法主要包括换卵沉淀实验（COPT），酶联免疫吸附实验（ELISA）、间接血凝实验（IHA）等，但由于这些方法均有一定的缺陷，灵敏度仍不够高，操作复杂费时，且需要昂贵的仪器及技术熟练的分析人员，严重阻碍了其在现场大规模筛查中的应用，不能完全适应目前血吸虫病防治工作的需要。

目前，比较常用的商业化日本血吸虫抗体检测试剂盒大多是采用粗制的虫卵抗原，虽然其诊断灵敏度高，但由于其常常含有宿主抗原或其他寄生虫抗原的共有成分，易产生交叉反应，特异性较低。此外由于天然抗原的来源有限，且虫卵抗原的提取及纯化过程比较复杂，难以控制且耗资大，大大限制了其在大规模筛查中的应用。为了实现对血吸虫病的有效控制，我们迫切需要开发新型快速诊断方法及试剂，实现血吸虫的快速、灵敏、便携检测，为血吸虫病的现场筛查及监测提供技术支撑。

电化学免疫传感器是将免疫测定技术与电化学传感技术相结合的一类新型生物传感器。其工作原理类似于传统的免疫分析技术，即把抗原或抗体固定在固相载体表面（即电极上），通过抗原抗体特异性结合来检测样品中的抗体或抗原。目前，其已发展成为一种分析浓度范围宽，适用于多种生物基质的有力分析工具。通过特定的标记物进行标记，该方法还能实现信号的放大，因此，具有较高的灵敏性。对于混合样品中微量的待测物，不论从灵敏度、特异性，还是分析时间和可操作性方面考虑，电化学免疫传感器都将成为首选的检测方法且有着巨大的应用前景。前期已有研究报道将电化学免疫传感技术用于血吸虫抗体的检测，例如俞汝勤课题组通过在玻碳电极上修饰Nafion来固定血吸虫抗原，用免疫竞争的方法进行血吸虫抗体的检测，其主要采用重组血吸虫抗原作为诊断抗原，灵敏度并不够高，且其所用的电极多为单一圆盘电极，前处理及抗原固定方法比较复杂，且需配合其他辅助电极进行检测，不太适合多样本分析。近年来，随着丝网印刷技术的发展，批量制备成本低廉、重现性好的丝网印刷电极已成为可能并广泛应用于生物检测。印刷电极芯片的发展为开发适用于实际检测的便携式、可弃型电化学免疫传感器提供了便利。迄今为止，仍没有基于电化学传感阵列技术的血吸虫快速测定方法及试剂被研制出来。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中血吸虫病检测方法敏感性不高，费时、费力、漏检率较高，而且不能对该病进行早期诊断的缺陷，提供一种具有高敏感性及特异性的血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒及其检测方法和制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种血吸虫病电化学传感快速测定（ECISA）试剂盒，所述试剂盒包括：电化学传感阵列、酶结合物工作液、酶底物、阴性对照品、阳性对照品、样本稀释液和洗涤液，所述电化学传感阵列包括印刷碳电极、共组装在所述印刷碳电极表面的血吸虫抗原层和吸附的封闭剂层，所述血吸虫抗原为日本血吸虫重组抗原SjE16和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA的混合物，所述酶结合物工作液为含有辣根过氧化酶标记的二抗的BSA溶液，所述酶底物为四甲基联苯胺与双氧水的混合物，所述阴性对照品为正常血清，所述阳性对照品为血吸虫感染血清，所述样本稀释液和洗涤液均为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。

所述日本血吸虫重组抗原SjE16具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以4:1～64:1质量比混合。

所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以8:1质量比混合。采用该质量比时灵敏度最高。

所述印刷碳电极由碳糊工作电极，碳糊对电极以及银/氯化银参比电极组成。

所述封闭剂是牛血清白蛋白或酪蛋白。

还提供一种血吸虫抗体的检测方法，所述检测方法包括：1）样本稀释：用样本稀释液将待检血清按1:100稀释；2）加样反应：向每个工作电极上分别滴加已稀释的样本血清，每个样本平行检测2孔，同时设阴性、阳性及空白对照各2孔，取阴性、阳性对照品分别滴加于工作电极表面，空白对照孔仅加入样本稀释液，将电极阵列于湿盒内室温反应20-40分钟后，甩去电极表面液体，并用洗涤液冲洗，吹干电极表面；3）加酶反应：每个工作电极表面滴加酶结合物工作液，于湿盒内室温反应20-40分钟，甩去电极表面液体，并用洗涤液冲洗；4）电化学检测：每个通道滴加酶底物，覆盖三电极区域，于多通道电化学分析仪上进行时间电流曲线扫描，扫描电压为-100mv,扫描时间是50s。50s时的稳态电流值作为检测信号；5）数据分析与结果判断：定性检测：所有电流值都扣除空白对照的电流值，以阴性对照品的平均电流值的2.1倍作为阈值，待检样本电流值大于或等于阈值的样本判定为阳性样本，电流值小于阈值的样本判定为阴性样本；半定量检测：待检样品所含的血吸虫抗体的效价为样品连续稀释电极中判定为阳性电极的最高稀释倍数的倒数，该阳性电极结果判定方法与定性检测相同。

还提供一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒的制备方法，所述制备方法包括：电化学传感阵列的制备：滴加磷酸缓冲液覆盖三电极，于多通道电化学检测仪上进行循环伏安法扫描，冲洗电极，再在工作电极表面滴加碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的羧基活化溶液，室温反应后用超纯水冲洗，再在所述工作电极表面滴加含有日本血吸虫重组抗原SjE16和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA的PBS溶液，室温反应1～3h后冲洗电极，滴加封闭剂覆盖三电极，室温孵育后冲洗电极，吹干表面，备用。

所述制备方法还包括：酶结合物工作液的配置：将辣根过氧化物酶标记的二抗用1%BSA溶液稀释1000倍；酶底物工作液的配置：将四甲基联苯胺与双氧水配置为混合溶液，棕色试剂瓶避光保存；样本稀释液或洗涤液的配置：将Tween20加入磷酸盐缓冲液中混匀；阴性对照品的制备：将10份正常人标准血清混合并用稀释液稀释100倍；阳性对照品的制备：将10份血吸虫感染人标准血清混合并用稀释液稀释100倍。

所述日本血吸虫重组抗原SjE16具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：MSDENRWIAV FNSLDKDGNK LLTRDEIEQC LKSLGVSESF AEKIIKETDLNKDGKISLDE YLKALPKIPP RDKCSSVERW KEVFQSIDKD NSGKVSAKELDEFLKSTGND INKSCLENWM ATNDKNKDGE LDYAEFLAYV RQTYE。

所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以4:1～64:1质量比混合。

所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以8:1质量比混合。

由于天然抗原常常含有宿主抗原或不同亚型及虫株抗原的共有成分，易产生交叉反应，因而免疫检测的特异性不理想，此外由于天然抗原的来源有限，且其提取及纯化过程比较复杂，难以控制且耗资大，因此不易标准化和规模生产；而重组抗原所获抗原纯度高，可以批量生产，易于质量控制，但是与抗体的亲和力仍有限，导致其检测灵敏度并不够高。本发明创造性地将重组抗原与天然抗原进行共组装，从而有效克服了天然抗原特异性不够高、重组抗原灵敏度不理想的缺陷，提供了一种特异性好、灵敏度高的电化学传感检测试剂盒。

本发明中的ECISA试剂盒是采用电化学间接免疫传感法检测抗体，首先印刷电极阵列表面已共组装了血吸虫天然及重组抗原，然后滴加待检血清或血浆，经过孵育后，若样品中含有血吸虫特异性抗体，则该抗体与电极上的抗原结合，再与酶标记的抗抗体结合形成抗原-抗体-酶标二抗免疫复合物，滴加底物TMB，用电化学检测仪检测电极界面酶催化底物产生的氧化还原电流即可判断特异性抗体是否存在。

本发明的有益效果在于：1、试剂盒采用印刷电极阵列作为固相载体，采用重组蛋白与天然蛋白共组装的策略固定诊断抗原，大大减少了天然抗原的用量，制作成本低廉，可批量生产，且便于携带、并可多样本分析；2、检测血吸虫的敏感性及特异性高，与其他寄生虫病的交叉反应性低；3、检测步骤少，操作简单，且反应快速，能大大缩短血吸虫检测时间，且可在室温条件下进行，无需恒温恒湿箱等专门的设备，具有快速、简单、现场应用等优点；4、检测所用样本体积小，试剂少，且无有害物质及放射性物质，安全可靠，适用于血吸虫病的诊断；5、检测所需的仪器是自主研发的多通道电化学检测仪，设备简单，成本低廉，操作方便、且便于携带，并可实现微型化、自动化和数字化等。

总之，本发明所提供的试剂盒制备简单、成本低廉、便于携带、可进行多样本分析，且检测灵敏度、特异性及重现性好，检测快速，操作简单，无须昂贵复杂的仪器设备，适用于血吸虫病的现场快速诊断，有望用于疫区血吸虫病患者筛查及监测。

附图说明

图1是实施例1中以印刷碳电极为传感元件电化学定性检测人血清血吸虫抗体的结果。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1以印刷碳电极为传感元件电化学检测血吸虫抗体

印刷碳电极表面处理：印刷碳电极在PB缓冲液中进行循环伏安法扫描以活化电极，电压范围-0.3V～0.6V，扫速0.5V/s，扫描10个循环，然后超纯水冲洗，氮气吹干。

传感界面构建：在电极上滴加10ul含有200mM EDC与50mM NHS的水溶液于电极表面，室温反应15min活化羧基。将单一SEA抗原及不同比例混合的SjE16与SEA混合抗原，分别滴加10ul于电极表面，室温反应2h,用PBST冲洗电极，氮气吹干。再在电极表面滴加50ul1%BSA室温封闭1h,然后冲洗电极，吹干表面。

免疫反应：将100倍稀释的正常血清（即阴性对照血清）、不同倍比稀释的血吸虫感染血清（即阳性对照血清）分别滴加10ul至印刷碳电极上；室温下孵育30min，PBST清洗电极表面。然后将稀释1000倍的辣根过氧化物酶标记二抗滴加于电极表面，室温反应30min。

电化学检测：将酶底物TMB滴加于上述反应后的电极表面，采用时间电流曲线法进行检测，读取稳态电流值作为检测信号。

采用印刷碳电极作为传感元件构建不同比例混合抗原共组装的传感界面，其检测血清抗体的结果见附图1，结果表明重组抗原SjE16与天然抗原SEA的质量比在4:1～64:1的范围内时，共组装Sj16EA检测血吸虫阳性参比血清的信号及其与阴性参比血清的P/N比值均大于单独组装SEA的，说明共组装能够提高人血清中SjAb检测的灵敏度，但与单度组装SEA组相比，共组装组阳性信号及P/N比值增加的幅度先变大，后变小，最终我们选取阳性信号及P/N比值增加幅度均为最大的点也即250ng SjE16与30ng SEA（8:1）共组装作为最佳比例。

实施例2血吸虫电化学传感快速测定试剂盒的制备方法

1.电化学传感阵列的制备：将多通道印刷碳糊电极用超纯水冲洗干净，滴加50ul10mM磷酸缓冲液（PB）覆盖三电极，于多通道电化学检测仪上进行循环伏安法扫描，用超纯水冲洗电极。再在工作电极表面滴加10ul含200mM碳二亚胺（EDC）和50mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的羧基活化溶液，于室温反应15分钟，用超纯水冲洗电极，然后再在工作电极表面滴加5ul含50mg/L日本血吸虫重组抗原SjE16（由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供）和6mg/L日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA（由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供）的PBS溶液，于湿盒内室温反应2h，冲洗电极。滴加50ul1%BSA溶液覆盖三电极，于湿盒内室温封闭1h，然后冲洗电极，吹干表面。于冰箱中冷藏保存。

2.酶结合物工作液的配置：将辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体（购自sigma公司）用1%BSA稀释1000倍，充分混匀，冷藏保存备用。

3.酶底物工作液的配置：采用Neogen公司生产的TMB原液，于棕色试剂瓶中避光冷藏保存。

4.样本稀释液或洗涤液的配置：将0.5ml Tween20加入1000ml10mMpH7.2的磷酸盐缓冲液中，配置成为样本稀释液，或洗涤液。

5.阴性对照品的制备：将10份正常人标准血清混合并用稀释液稀释100倍。

6.阳性对照品的制备：将10份血吸虫感染人标准血清混合并用稀释液稀释100倍。

本实施例中所采用的SjE16与SEA的质量比为8:1，为最优比值，此时该试剂盒的灵敏度最高。

实施例3血吸虫抗体的检测方法

1.样本稀释：

定性检测：用样本稀释液将待检血清按1:100稀释，例如将1μl血清加入99μl稀释液，充分混匀，阴阳对照品不用稀释。

半定量检测：用样本稀释液将待检血清按1:100稀释，然后再连续倍比稀释到3200倍（可根据抗体浓度高低适当增加或降低稀释倍数），阴阳对照不用稀释。

2.加样反应：

2.1每个工作电极上分别加已稀释样本血清10ul，每个样本平行检测2孔，同时设阴性、阳性及空白对照各2孔，取阴性、阳性对照品各10ul分别滴加于工作电极表面，空白对照孔加入10ul样本稀释液；

2.2电极阵列于湿盒内室温（20-30℃）反应30分钟后，甩去电极表面液体，并用稀释液或洗涤液冲洗3次，吹干电极表面。

3.加酶反应：每个工作电极表面加酶结合物工作溶液10ul，于湿盒内室温反应30分钟后，甩去电极表面液体，如上洗涤电极表面。

4.电化学检测：每个通道滴加酶底物50ul,覆盖三个电极区域，于多通道电化学分析仪上进行时间电流曲线扫描，扫描电压为-100mv,扫描时间是50秒。50s时的稳态电流值作为检测信号。

5.数据分析与结果判断：

定性检测：所有电流值都扣除空白对照的电流值，以阴性对照品平均电流值的2.1倍作为阈值。待检样本电流值大于或等于阈值的样本判定为阳性样本，电流值小于阈值的样本判定为阴性样本。

半定量检测：待检样品所含的血吸虫抗体的效价为样品连续稀释电极中判定为阳性电极的最高稀释倍数的倒数。阳性电极结果判定方法与定性检测相同。

注意事项：试剂盒在2-8℃下保存，每次取出后先平衡至室温使用。

实施例4血吸虫电化学传感快速测定试剂盒在快速检测血吸虫病中的应用

将人体血清作为阴性对照和阳性对照对本发明的试剂盒进行检测，并与常用的ELISA试剂盒进行对比，以得出本试剂盒的检验效果及临床上的应用前景。

1.评价天然可溶性虫卵抗原SEA及重组抗原蛋白SjE16用于血吸虫电化学传感快速测定试剂盒快速诊断血吸虫病的敏感性、特异性及交叉反应性

其中，临床人体血清由中国疾病预防控制中心寄生虫病研究所提供，包括15份正常人血清、35份粪检阳性的血吸虫感染人血清，5份肝吸虫感染人血清、9份旋毛虫感染人血清、10份囊虫感染人血清及7份肺吸虫感染人血清。

2.检测

2.1血吸虫病ELISA检测试剂盒：采用深圳康百得试剂公司出品的检测试剂盒。

2.2实验室检测：采用上述实施例2中的血吸虫电化学免疫传感测定(ECISA)试剂盒。

诊断抗原：SjE16与SEA以8:1的质量比混合联合组装。

阳性标准：以非疫区的正常人血清为参照。

3．结果分析：结果表明，基于联合抗原的电化学传感阵列（ECISA/Sj16EA）检测试剂盒的敏感性为97.1%，特异性为100%，均与商品试剂盒相当，并且ECISA/Sj16EA与其他寄生虫病人血清的交叉反应性比ELISA试剂盒低很多，具体统计结果如下表所示:ECISA/Sj16EA与肝吸虫及囊虫基本不存在交叉反应，与旋毛虫的交叉反应性为11%，与肺吸虫的交叉反应性为42.9%。而ELISA试剂盒与肝吸虫、旋毛虫、囊虫及肺吸虫的交叉反应性分别为20%，33.3%，60%和100%。

表1：ECISA与ELISA检测临床血清样本的敏感性、特异性及交叉反应性比较

通过对多样本血清进行检测，结果表明，本发明基于混合抗原组装方法的电化学传感测定试剂盒的检测敏感性接近成熟试剂盒（ELISA kit），与其他寄生虫病的交叉反应较少，其特异性略高于成熟的ELISA试剂盒，且其可以实现微量、快速、便携、低成本检测血吸虫抗体的目的，有望作为诊断试剂盒用于现场检测。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (11)

1.一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：电化学传感阵列、酶结合物工作液、酶底物、阴性对照品、阳性对照品、样本稀释液和洗涤液；所述电化学传感阵列包括印刷碳电极、共组装在所述印刷碳电极表面的血吸虫抗原层和吸附的封闭剂层，其中，所述血吸虫抗原为日本血吸虫重组抗原SjE16和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA的混合物；所述酶结合物工作液为含有辣根过氧化酶标记的二抗的BSA溶液；所述酶底物为四甲基联苯胺与双氧水的混合物；所述阴性对照品为正常血清；所述阳性对照品为血吸虫感染血清；所述样本稀释液和洗涤液均为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述日本血吸虫重组抗原SjE16为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以4:1～64:1质量比混合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以8:1质量比混合。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述印刷碳电极由碳糊工作电极，碳糊对电极以及银/氯化银参比电极组成。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭剂是牛血清白蛋白或酪蛋白。

7.一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

电化学传感阵列的制备：滴加磷酸缓冲液覆盖三电极，于多通道电化学检测仪上进行循环伏安法扫描，冲洗电极，再在工作电极表面滴加碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的羧基活化溶液，室温反应后用超纯水冲洗，再在所述工作电极表面滴加含有日本血吸虫重组抗原SjE16和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA的PBS溶液，室温反应后冲洗电极，滴加封闭剂覆盖三电极，室温孵育后冲洗电极，吹干表面，备用。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：

酶结合物工作液的配置：将辣根过氧化物酶标记的二抗用1％BSA溶液稀释1000倍；

酶底物工作液的配置：将四甲基联苯胺与双氧水配置为混合溶液，棕色试剂瓶避光保存；

样本稀释液或洗涤液的配置：将Tween20加入磷酸盐缓冲液中混匀；

阴性对照品的制备：将10份正常人标准血清混合并用稀释液稀释100倍；

阳性对照品的制备：将10份血吸虫感染人标准血清混合并用稀释液稀释100倍。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述日本血吸虫重组抗原SjE16为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以4:1～64:1质量比混合。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以8:1质量比混合。