CN103529199B - 一种现场快速检测动物源性样品中克仑特罗含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种现场快速检测动物源性样品中克仑特罗含量的方法。本发明以克伦特罗为检测目标，建立了结合96孔板酶联免疫反应与丝网印刷电极快速检测的方法，实现定量检测动物源性样品中的克仑特罗含量。本发明方法可以快速准确测定动物源性样品中克伦特罗的残留量，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行，满足对克仑特罗进行快速高通量筛选的要求。

Description

一种现场快速检测动物源性样品中克仑特罗含量的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测分析及电化学免疫分析技术领域，具体涉及一种基于丝网印刷电极在现场快速检测动物源性样品中克仑特罗中的应用。
背景技术
克仑特罗（Clenbuterol）俗称瘦肉精，属于β-兴奋剂，近年来被非法添加到饲料中以促进动物骨骼肌的生长和提高瘦肉率，因其添加剂量是治疗剂量的5-10倍，并且在动物体内残留量过高而给消费者带来危害，所以食品中克仑特罗的检测尤为重要。目前克仑特罗检测方法主要有色谱法和免疫分析法。色谱法中主要以高效液相色谱法为主，因其具有灵敏、准确的特点，可以作为实验室确证的方法。但仪器成本高，不适合样品初筛和现场快速检测。免疫分析法主要包括胶体金试纸法和酶联免疫吸附法。胶体金试纸法具有测定简单、快速，成本低等特点，但难于准确定量，只能作为定性的判断。酶联免疫吸附法具有灵敏度高、可定量检测，适合样品快速筛选分析。但目前酶联免疫检测中采用的仪器大都是光学酶标仪，其体积较大，一般不适宜携带进行现场的快速检测。
电化学分析方法具有灵敏度高、仪器易于小型化、操作简单等特点，获得了广泛的关注。电化学分析中计时电流方法已在商业产品中得到成功应用。例如，基于计时电流法的电化学酶传感器已经成功用于便携式血糖仪的研制，具有操作方法简单、成本低。在此基础上，近年来电化学免疫分析方法也获得了广泛关注。电化学免疫的方法就是将电化学分析检测与免疫学特异性分析方法的特点相结合起来的生物传感检测方法，以电化学原理实现对免疫反应形成的抗原-抗体复合物的特异性检测。
丝网印刷电极（Screen printed electrode,SPE）具有制备简单、易于批量生产、低成本、便携和一次性使用等优点，与传统电化学分析方法相比，丝网印刷电极将工作电极、参比电极、辅助电极高度集成，解决了以往三电极体系分散、不易操作以及表面无法更新等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速，高灵敏度，低成本的可定量检测动物源性样品中克仑特罗含量的现场快速检测方法，以满足对克仑特罗进行快速高通量筛选的要求。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种现场快速检测动物源性样品中克仑特罗含量的方法，该方法采用丝网印刷电极检测多孔酶标板试剂盒中克伦特罗的含量。其中，所述的丝网印刷电极采用聚丙烯塑胶纸作为基底，依次分别采用银浆、碳浆、银/氯化银浆以及绝缘浆作为丝网印刷材料，第一层印制银浆作为导电介质，第二层印制碳作为工作电极和辅助电极，第三层印制银/氯化银浆作为参比电极，从而制得丝网印刷电极。
所述丝网印刷电极印制银浆、碳浆、银/氯化银浆的条件为：在60-150℃条件下固化10-60min；印制绝缘浆的条件为：60-150℃条件下烘干1-3h；每层印制的厚度为10～15μm。
所述的银/氯化银浆的体积比为2:8～8:2。
所述采用丝网印刷电极检测多孔酶标板试剂盒中克伦特罗的含量方法包括如下步骤：
（1）多孔酶标板反应：所述的多孔酶标板可以根据实际检测的需要，选择96孔或24孔酶标板等，部分反应孔内加入50～200μL克仑特罗抗体和不同浓度的游离克仑特罗的标准溶液，在剩余反应孔内加入50～200μL克仑特罗抗体和样品溶液，所有反应孔20～37℃水浴反应1～3h，然后使用洗板机洗涤3-5次，在吸水纸上拍干；在每个反应孔内加入50～200μL HRP标记的羊抗鼠IgG，20～37℃水浴反应1～3h，然后使用洗板机洗涤3-5次，在吸水纸上拍干；在每个反应孔内分别加入H2O2和四甲基联苯胺各50～100μL/孔，20-37℃避光显色反应10～30min后，加入2mol/L H2SO4，50～100μL/孔，混匀，终止反应；
（2）丝网印刷电极检测：将制备的丝网印刷电极插入已终止反应的酶标板微孔中，采用计时电流法检测终止反应后产生的电流值，其中，电压可以选择-1V至+1.0V，时间100s，根据不同电流值，利用外标曲线法定量检测样品中克仑特罗的含量。
其中，所述样品溶液是通过如下步骤制备的：
对于液体样品，如动物尿液，血清等，取50μL～1mL于10mL EP管中，用0.01mol/LpH7.4PBS缓冲液稀释1-10倍，用于分析；
对于固体样品，如动物组织，取粉碎样品1-5g，加入3-8mL体积比1:4的0.01mol/LPBS-甲醇混合液，混合5-10min，置30-50℃水浴下放置30min，室温3000-5000r/min离心5-10min，取50μL上清液，加入450μL PBS缓冲液混匀，取50μL用于分析。
所述的动物性样品包括尿液、组织、血清。
本发明首先通过将克仑特罗标准品或样品和包被在酶标板上的抗原与克仑特罗抗体发生间接免疫反应，形成抗原-抗体复合物，随后向孔中加入HRP酶标二抗，二抗与抗原-抗体复合物反应，最后加入酶底物H2O2和TMB发生酶催化反应。通过插入96孔酶标板中的电极对酶催化产生TMB(ox)还原电流值进行计时电流检测，根据不同的还原电流值，利用外标曲线法定量检测样品中克仑特罗的含量。
有益效果：本发明建立了一种能应用于酶联免疫分析的电化学便携式快速检测方法，制备的丝网印刷电极具有制备简单、易于批量生产、低成本、便携和一次性使用等优点，与传统电化学分析方法相比，丝网印刷电极将工作电极、参比电极、辅助电极高度集成，解决了以往三电极体系分散、不易操作以及表面无法更新等问题。
本发明以克伦特罗为检测目标，建立了结合96孔板酶联免疫反应与丝网印刷电极快速检测的方法，用本发明对猪肉和猪尿中克仑特罗进行了测定，结果与ELISA试剂盒检测结果一致，本发明的检测限分别为0.18μg/L和0.05μg/L，比ELISA试剂盒低一个数量级，同时远低于国家规定的最大允许残留量（MRL）1μg/L。克仑特罗抗体的特异性较好，和酒石酸托特罗定、盐酸环仑特罗、盐酸氯丙那林、盐酸妥洛特罗、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富马酸福莫特罗、班布特罗、莱克多巴胺等9种β-兴奋剂无交叉反应。并且孔间CV值低于10%，方法精密度高。对牛猪肉和猪尿中的克仑特罗加样回收率在80%-120%之间，方法的准确度高，适于实际样品的检测。为现场检测动物性食品中的克仑特罗的方法开发提供了研究基础。
附图说明
图1丝网印刷电极印制过程，其中（5）中的1、2、3为导线接口。
图2为本发明实验检测装置示意图，其中包括：
1-印刷电极；2-工作电极；3-对电极；4-参比电极；5-96孔酶标板；6-电化学工作站；7-电脑记录与处理。
图3为本发明检测方法示意图。
图4为克仑特罗检测的标准曲线，其中，克仑特罗浓度为：0.025μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.25μg/L、0.50μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L，曲线在0.025～2.0μg/L范围内线性良好（R2=0.9985），并且孔间CV值低于10%，方法精密度高，且猪肉和猪尿中的克仑特罗加样回收率在80%-120%之间，方法的准确度高。
图5为克仑特罗与其各种类似物质的交叉反应率，其中：
A：克仑特罗B：盐酸环仑特罗C：沙丁胺醇D：盐酸妥洛特罗E：硫酸特布他林F：酒石酸托特罗定G：富马酸福莫特罗H：班布特罗J：盐酸氯丙那林K：莱克多巴胺
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明，使本领域的技术人员容易理解，但实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所需试剂及其来源如下：
克仑特罗抗原标准品（中国兽医药品监察所）；克仑特罗包被抗原和抗体、克仑特罗ELISA检测试剂盒（南京祥中生物科技有限公司）；HRP标记的山羊抗小鼠IgG（北京博奥森生物公司）；3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)（生工生物）；过氧化氢尿素（CO(NH2)·H2O2）（天津希恩思生物公司）；硫酸、甲醇、浓盐酸、氯化钠（分析纯）（南京化学试剂公司）；其他试剂均为分析纯；实验用水均为去离子水（电阻率＞18.3MΩ·cm）；猪肉（购自南京某农贸市场）；猪尿（取自南京某养猪厂）；丝网印刷电极（工作电极和辅助电极为碳浆印制，参比电极为银/氯化银浆印制，南京祥中生物科技有限公司）。实施例1：一种基于丝网印刷电极的现场快速检测克仑特罗的方法。
（1）检测样品处理：
PBS缓冲液的配制：用137mmol/L氯化钠、2.7mmol/L氯化钾、10mmol/L磷酸二氢钠、2mmol/L磷酸二氢钾配制pH7.4的PBS缓冲液。
对猪尿样品，取50μL～1mL于10mL EP管中，用PBS缓冲液稀释1-10倍，用于分析；
对猪肉样品，取粉碎样品1g，加入3mL体积比4:1的PBS-甲醇混合液，混合5min，置30℃水浴下放置30min，室温3000r/min离心5min，取50μL上清液，加入450μL PBS缓冲液混匀，取50μL用于分析；
（2）丝网印刷电极制备
丝网印刷电极A：采用聚丙烯塑胶纸印刷丝网电极，每支电极尺寸规格：0.4mm×7mm×30mm。基底根据自行设计的电极结构图（如图1），第一层（图1(1)）印制银浆作为导电介质，第二层（图1(2)）印制碳作为工作电极和辅助电极，第三层（图1(3)）印制银/氯化银浆，银/氯化银浆的体积比为2:8，作为参比电极。最后印制绝缘浆作为绝缘层（图1(4)），通过各层浆料的叠加，制得丝网印刷电极（图1(4)），每层印制的厚度为10μm。
丝网印刷电极B：方法同丝网印刷电极A的制备，不同的是，银/氯化银浆的体积比为4:6，每层印制的厚度为12μm。
丝网印刷电极C：方法同丝网印刷电极A的制备，不同的是，银/氯化银浆的体积比为5:5，每层印制的厚度为15μm。
丝网印刷电极D：方法同丝网印刷电极A的制备，不同的是，银/氯化银浆的体积比为6:4，每层印制的厚度为13μm。
丝网印刷电极E：方法同丝网印刷电极A的制备，不同的是，银/氯化银浆的体积比为8:2，每层印制的厚度为12μm。
（3）间接竞争ELISA反应
在部分反应孔内加入100μL克仑特罗抗体和不同浓度的游离克仑特罗的标准溶液，在剩余反应孔内加入100μL克仑特罗抗体和样品溶液（猪肉和猪尿样品溶液），所有反应孔37℃水浴反应1h，然后使用洗板机洗涤3次，在吸水纸上排干。
在每个反应孔内加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃水浴反应1h，然后使用洗板机洗涤3次，在吸水纸上排干。
在每个反应孔内分别加入A液（H2O2，过氧化氢）和B液（TMB，四甲基联苯胺）各50μL/孔，37℃避光显色反应15min后，加入2mol/L H2SO4，50μL/孔，混匀，终止反应；
将（2）中制备的丝网印刷电极C插入已终止反应的酶标板微孔中，采用计时电流法（电压：–0.1V；时间：100s）检测终止反应后产生TMB（ox）（四甲基联苯胺的氧化物：4,4′-二（3,5-二甲基-4-氨基）-2,2′,6,6′-四甲基苯）的还原电流值。根据不同的还原电流值，利用外标曲线法定量检测样品中克伦特罗的含量。
本实施例方法中，对方法检测线、精密度等进行了考察。数据见图4。通过测量标准品，从图4中可以看出，本发明的检测限分别为0.025μg/L，比ELISA试剂盒（检测限为0.05μg/L）检测限低，同时远低于国家规定的最大允许残留量（MRL）1μg/L，并且孔间CV值低于10%，方法精密度高。对牛猪肉和猪尿中的克仑特罗加样回收率在80%-120%之间，方法的准确度高，适于实际样品的检测。
实施例2：一种基于丝网印刷电极的现场快速检测克仑特罗的方法。
在本实施例中，检测样品的处理及丝网印刷电极制备的方法同实施例1，不同的是，本实施例中间接竞争ELISA反应的步骤如下：
（1）在部分反应孔内加入200μL克仑特罗抗体和不同浓度的游离克仑特罗的标准溶液，在剩余反应孔内加入200μL克仑特罗抗体和样品溶液（猪肉和猪尿样品溶液），所有反应孔37℃水浴反应1h，然后使用洗板机洗涤5次，在吸水纸上排干。
（2）在每个反应孔内加入200μL HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃水浴反应1h，然后使用洗板机洗涤5次，在吸水纸上排干。
（3）在每个反应孔内分别加入A液（H2O2，过氧化氢）和B液（TMB，四甲基联苯胺）各100μL/孔，37℃避光显色反应10min后，加入2mol/L H2SO4，50μL/孔，混匀，终止反应；
（4）将实施例1中制备的丝网印刷电极B插入已终止反应的酶标板微孔中，采用计时电流法（电压：–0.1V；时间：100s）检测终止反应后产生TMB（ox）的还原电流值。根据不同的还原电流值，利用外标曲线法定量检测样品中克伦特罗的含量。
实施例3：一种基于丝网印刷电极的现场快速检测克仑特罗的方法。
在本实施例中，检测样品的处理及丝网印刷电极制备的方法同实施例1，不同的是，本实施例中间接竞争ELISA反应的步骤如下：
（1）在部分反应孔内加入50μL克仑特罗抗体和不同浓度的游离克仑特罗的标准溶液，在剩余反应孔内加入50μL克仑特罗抗体和样品溶液（猪肉和猪尿样品溶液），所有反应孔37℃水浴反应3h，然后使用洗板机洗涤5次，在吸水纸上排干。
（2）在每个反应孔内加入50μL HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃水浴反应3h，然后使用洗板机洗涤5次，在吸水纸上排干。
（3）在每个反应孔内分别加入A液（H2O2，过氧化氢）和B液（TMB，四甲基联苯胺）各50μL/孔，37℃避光显色反应10min后，加入2mol/L H2SO4，50μL/孔，混匀，终止反应；
（4）将实施例1中制备的丝网印刷电极D插入已终止反应的酶标板微孔中，采用计时电流法（电压：–0.1V；时间：100s）检测终止反应后产生TMB（ox）的还原电流值。根据不同的还原电流值，利用外标曲线法定量检测样品中克伦特罗的含量。
上述实施例结果发现，猪尿和猪肉样品加样回收率在80%-120%之间，方法准确度高，适于实际样品的检测。
实施例4：克仑特罗抗体特异性检测。
将酒石酸托特罗定、盐酸环仑特罗、盐酸氯丙那林、盐酸妥洛特罗、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富马酸福莫特罗、班布特罗、莱克多巴胺标准品配制成10μg/L，分别与克仑特罗抗体竞争包被的克仑特罗抗原，同时与克仑特罗空白样品的检测数据进行比较，得到各物质的交叉反应率。克仑特罗与其各种类似物质的交叉反应率的结果如图5所示。克仑特罗抗体的特异性较好，和酒石酸托特罗定、盐酸环仑特罗、盐酸氯丙那林、盐酸妥洛特罗、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富马酸福莫特罗、班布特罗、莱克多巴胺等9种β-兴奋剂无交叉反应，并且孔间CV值低于10%，方法精密度高。

Claims (4)

1.一种现场快速检测动物源性样品中克仑特罗含量的方法，其特征在于，该方法采用丝网印刷电极检测多孔酶标板试剂盒中克伦特罗的含量，包括如下步骤：(1)多孔酶标板反应：部分反应孔内加入50～200μL克仑特罗抗体和不同浓度的游离克仑特罗的标准溶液，在剩余反应孔内加入50～200μL克仑特罗抗体和样品溶液，所有反应孔20～37℃水浴反应1～3h，然后使用洗板机洗涤3-5次，在吸水纸上拍干；在每个反应孔内加入50～200μL HRP标记的羊抗鼠IgG，20～37℃水浴反应1～3h，然后使用洗板机洗涤3-5次，在吸水纸上拍干；在每个反应孔内分别加入H2O2和四甲基联苯胺各50～100μL/孔，20-37℃避光显色反应10～30min后，加入2mol/L H2SO4，50～100μL/孔，混匀，终止反应；
(2)丝网印刷电极检测：将制备的丝网印刷电极插入已终止反应的酶标板微孔中，采用计时电流法检测终止反应后产生的电流值，其中，电压选择-1V至+1.0V，时间100s，根据不同电流值，利用外标曲线法定量检测样品中克仑特罗的含量；
其中，所述的丝网印刷电极采用聚丙烯塑胶纸作为基底，依次分别采用银浆、碳浆、银/氯化银浆以及绝缘浆作为丝网印刷材料，制得丝网印刷电极；
所述丝网印刷电极印制银浆、碳浆、银/氯化银浆的条件为：在60-150℃条件下固化10-60min；印制绝缘浆的条件为：60-150℃条件下烘干1-3h；每层印制的厚度为10～15μm。
2.根据权利要求1所述的现场快速检测动物源性样品中克仑特罗含量的方法，其特征在于，所述的银/氯化银浆的体积比为2:8～8:2。
3.根据权利要求1所述的现场快速检测动物源性样品中克仑特罗含量的方法，其特征在于，所述样品溶液是通过如下步骤制备的：
对于液体样品，取50μL～1mL于10mL EP管中，用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液稀释1-10倍，用于分析；
对于固体样品，取粉碎样品1-5g，加入3-8mL体积比1:4的0.01mol/L PBS-甲醇混合液，混合5-10min，置30-50℃水浴下放置30min，室温3000-5000r/min离心5-10min，取50μL上清液，加入450μL PBS缓冲液混匀，取50μL用于分析。
4.根据权利要求1所述的现场快速检测动物源性样品中克仑特罗含量的方法，其特征在于，所述的动物性样品包括尿液、组织、血清。
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