CN102061463B - 一种表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，它是在金片或金颗粒表面以化学结合方法将3-噻吩硼酸和巯基乙胺通过自组装进行硼酸功能化修饰得到的硼酸修饰的金片或金颗粒，生成的硼酸修饰表面具有分子间B-N配位作用，能在中性条件下抓取顺式的1,2-二羟基化合物，因此，本发明的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，可应用于含顺式二羟基生物分子的识别、固载、传感、富集、分离或检测。
Description
技术领域
本发明涉及以硼酸表面修饰的金片或金颗粒，本发明也涉及顺式二羟基生物分子的识别、固载、传感、富集、分离或检测。
背景技术
顺式二羟基生物分子，包含糖蛋白、糖肽、核苷、核苷酸、儿茶酚胺、糖类和RNA等，是一类特别的化合物，是目前蛋白质组学、代谢组学、糖组学和RNA研究等领域中的重要研究对象。对这些生物分子的选择性富集和高效分离具有重要意义。糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用[参见Science , 2001, 291(5512): 2364-2369]，并参与受体激活、信号转导、免疫应答等诸多重要的生物进程[参见Cell, 2006, 126(5): 855-867]。蛋白质的糖基化普遍发生在细胞外环境的蛋白质中，许多临床的生物标志物及治疗的靶标都是糖蛋白。核苷、核苷酸、儿茶酚胺是多种疾病的临床生物标志物。多糖在自然界分布极广，有的是构成动植物骨架结构的组成成分，如纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，如人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。
取代硼酸是一类独特的配基，能与顺式二羟基化合物在碱性条件下结合形成稳定的络合物，当介质的pH切换为酸性时，络合物解吸释放出顺式二羟基化合物。取代硼酸具有三个显著的优点：1）共价结合，亲和力强；2）可逆反应，结合/解吸过程容易控制；3）在酸性条件下解吸，解吸条件的质谱兼容性好。这些优点使得取代硼酸是非常理想的亲和配基，特别适合于以质谱为核心的组学分析方法。近年来，以硼酸功能化纳米材料为基础的样品分离富集方法也在蛋白质组学研究领域得到广泛应用。然而，由于中性条件下硼酸亲和能力极弱，导致操作过程要求在碱性环境中进行，这增加了目标生物分子降解的风险以及操作的不便。
目前，有三种方法可以克服上述常规硼酸亲和能力弱的缺点。第一，在苯环硼酸基对位或间位引入强吸电子基团，如砜基[参见Anal. Biochem., 2008, 372, 227-236]；第二，Wulff等人[参见Pure and Applied Chemistry, 1982, 54,2093-2102.; Angewandte Chemie, 1995, 107,1958-1979.]提出，在苯环硼酸基邻位引入引入胺基，其氮原子与硼原子形成B-N配位（Wulff Type）；第三，在苯环硼酸基邻位引入含有氧原子的基团，其氧原子与氮原子形成B-O配位[J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 4226-4227; J. Org. Chem., 2008, 73, 6471-6479]。上述三种方式都可以有效的提高硼酸在中性pH环境下亲和能力，但是他们同时也有一个明显的缺陷：在含有功能化基团的苯硼酸苯环上引入基团需要繁琐的步骤和大量的工作，例如合成4-（3-烯丁基砜基）苯硼酸和Wulff类型对烯基本硼酸分别需要3步和5步，且产率分别不足30%和15%。
发明内容
本发明的克服现有技术路线的不足，提供一种便捷地制备高亲和力硼酸修饰材料的方法，所得材料可应用于生物分子的识别、固载化、提纯、富集、分离和检测等领域。
本发明的技术方案如下：
一种表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，它是在金片或金颗粒表面以化学结合方法将3-噻吩硼酸和巯基乙胺通过自组装进行硼酸功能化修饰得到的硼酸修饰的金片或金颗粒，生成的硼酸修饰表面具有分子间B-N配位作用，能在中性条件下抓取顺式的1,2-二羟基化合物。
上述的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，所述的金颗粒可以是金纳米颗粒。
上述的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，所述的金片可以是载体上涂布或化学制备有金膜层的材料。
一种制备上述表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒的方法，它包括以下步骤：
步骤1. 配制3-噻吩硼酸-巯基乙胺溶液：
将3-噻吩硼酸和巯基乙胺以物质的量之比为1:1的比例溶于体积比为1:9的乙醇-超纯水中，浓度为2.5 mM；
步骤2. 将金片、金颗粒或者载体上涂布或化学制备有金膜层的材料置于步骤1配制的3-噻吩-巯基乙胺溶液中，在室温下反应12小时，即得到自组装的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，其原理见图1所示。
上述的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，具有在中性条件下抓取顺式的1,2-二羟基化合物的能力，可应用于含顺式二羟基生物分子的识别、固载、传感、富集、分离或检测中。
本发明首次描述了一种高亲和力硼酸修饰材料及其制备方法，该方法使硼酸基团对顺式二羟基化合物的亲和力大幅度提升。实验结果表明，存在B-N配位作用的硼酸修饰材料在中性pH条件下亲和能力得到提高，弥补了硼酸在中性pH条件下亲和力弱的缺陷。此外，常规硼酸在碱性环境中具有对顺式二羟基化合物的亲和能力，但呈电负性，这对带电目标分子产生电荷的吸引或排斥，导致特异性降低；相比而言，存在B-N配位作用的硼酸在生理pH条件下即具备顺式二羟基化合物的高亲和力，且整个硼酸修饰基团呈电中性，电荷引入的影响消除，提高了特异性。
附图说明
图1. 金表面自组装硼酸修饰材料原理示意图。
图2.高亲和力硼酸修饰材料（a）和传统硼酸修饰材料（b）对腺苷在不同pH值下的萃取物的毛细管电泳分析结果比较，腺苷浓度为1 mg/mL，样品背景为不同pH值的100 mM磷酸盐缓冲液。
图3. 对糖蛋白的专一萃取的基体辅助激光解吸离子化时间飞行质谱（MALDI-TOF MS）分析比较。i) RNase A和RNase B（摩尔的量的比1:1）混合样品质谱谱图；ii) 高亲和力硼酸修饰材料在RNase A和RNase B（摩尔的量的比1:1）样品中的萃取物质谱谱图；iii)传统硼酸修饰材料在RNase A和RNase B（摩尔的量的比1:1）样品中的萃取物质谱谱图。混合样品中RNase A和RNase B均为浓度7 ′ 10-5 M的100 mM醋酸胺溶液，pH 7.4。
图4. 高亲和力硼酸修饰MALDI-TOF MS靶板对糖蛋白的特异性抓取。i) RNase B和Myoglobin（摩尔的量的比1:1）混合样品质谱谱图；ii) 高亲和力硼酸修饰靶板抓取RNase B和Myoglobin（摩尔的量的比1:100）样品中的糖蛋白质谱谱图。Myoglobin的浓度为7 ′ 10-6 M。
图5. （a）高亲和力硼酸修饰材料扫描电镜形貌（放大倍数30万）；（b）高亲和力硼酸修饰靶板外形照片。
具体实施方式
实施例1
高亲和力硼酸修饰金表面芯片
将金表面芯片放入80%乙醇溶液中超声波处理15分钟，取出用流水缓慢冲洗后氮气吹干。将芯片置于离心管中，加入98 % H2SO4和30 % H2O2（体积比7:3）混合溶液，室温孵化2小时。取出用超纯水洗净，氮气吹干。将金表面芯片固定于支架上，4℃储存。清洗处理过的金表面芯片置于3-噻吩硼酸和巯基乙胺按照物质的量之比1:1配制的乙醇与超纯水（体积比1:9）的溶液中，室温反应12小时，得到高亲和力硼酸修饰金表面芯片。该金表面芯片可应用于表面等离子共振技术和石英晶体微天平等进行生物分子相互作用的表征。
实施例2
高亲和力硼酸修饰磁性纳米材料
金纳米颗粒制备（参见J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 1959-1964）。胺基功能化磁性Fe3O4纳米材料制备（参见Chem. Eur. J. , 2006, 12, 6341-6347）。Fe3O4/Au纳米材料的合成，取胺基功能化磁性Fe3O4纳米材料（自制或市购）分散在乙醇中（4 mL，～ 4×1012 颗粒/mL）置于圆底烧瓶内，加入金纳米颗粒（40 mL，～ 7×1012 颗粒/mL），室温搅拌2小时，制得Fe3O4/Au纳米材料，将所得的Fe3O4/Au纳米材料称取30 mg在乙醇中超声分散，加入3-噻吩硼酸和巯基乙胺按照物质的量之比1:1配制在乙醇与超纯水（体积比1:9）的溶液40 mL，室温搅拌12小时，得高亲和力硼酸修饰磁性纳米材料，其扫描电镜形貌如图5（a）所示。
称取所得Fe3O4/Au纳米材料30 mg在乙醇中超声分散，加入3-噻吩硼酸的乙醇与超纯水（体积比1:9）的溶液40 mL，室温搅拌12小时，得传统硼酸修饰磁性纳米材料。所得材料经真空干燥备用。
各称取1 mg高亲和力硼酸修饰磁性纳米材料和传统硼酸修饰磁性纳米材料置于200微升塑料离心管中，加入含有分析物腺苷的溶液20微升（pH 7.4或8.5），震荡1小时。用100微升100mM含600mM NaCl的醋酸铵溶液和100微升100mM的醋酸铵溶液个清洗3次后，加入20微升10mM醋酸进行解吸。解吸液利用毛细管电泳仪和MALDI-TOF MS进行检测分析。
对传统硼酸修饰磁性纳米材料和高亲和力硼酸修饰磁性纳米材料在不同pH条件下的亲和能力分别进行考察（见图2）。高亲和力硼酸修饰磁性纳米材料在pH 3 7.0时能够对腺苷进行抓取，而传统硼酸修饰磁性纳米材料在pH 3 8.0时才能够对腺苷进行抓取，高亲和力硼酸修饰磁性纳米材料相比于传统硼酸修饰磁性纳米材料的抓取pH降低了1个pH单位。两种材料的亲和能力也通过对RNase A和RNase B（摩尔的量的比1:1）混合样品中RNase B的特异性抓取得到验证（见图3）。N-糖蛋白RNase B被高亲和力硼酸修饰磁性纳米材料特异性萃取，非糖蛋白RNase A保留在萃取液中；而在相同pH条件下N-糖蛋白RNase B不能被传统硼酸修饰磁性纳米材料萃取。这说明在中性条件下B-N配位作用使硼酸的亲和能力得到提升。
实施例3
高亲和力硼酸修饰MALDI MS靶板
在Bal-Tec SCD 500溅射镀膜系统对云母片表面涂布金纳米涂层，系统设定压力6×10-4 mbar，电流25 mA ，时间200 s。得到的具有金涂层云母置于3-噻吩硼酸和巯基乙胺按照物质的量之比1:1配制的乙醇与超纯水（体积比1:9）的溶液中，反应12小时，得到高亲和力硼酸修饰的云母片。将该云母片用导电胶粘在MALDI MS靶板上，如图5（b）所示。在高亲和力硼酸修饰靶板上样2微升，一小时后移除，用5微升100mM含600mM NaCl的醋酸铵溶液和5微升100mM的醋酸铵溶液各清洗3次后，进行2微升醋酸上样，待样品干燥后滴加基质，进行质谱分析。第一次上样为待分析样品，上样的过程是萃取分离的过程，其中萃取物是目标分子被固载至靶板表面，移除的是萃余液。经反复清洗后，表面不再有萃余液。第二次上样为醋酸，醋酸为解吸液，目的是使目标分子与靶板脱离，以便质谱分析。
高亲和力硼酸修饰靶板对含有RNase B和Myoglobin混合样品中N-糖蛋白RNase B进行了纯化，结果也证明高亲和力硼酸基团对RNase B的亲和能力以及特异性（见图4）。
Claims (2)
1.一种表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，其特征是：它是在金片或金颗粒表面以化学结合方法将3-噻吩硼酸和巯基乙胺通过自组装进行硼酸功能化修饰得到的硼酸修饰的金片或金颗粒，生成的硼酸修饰表面具有分子间B-N配位作用，能在中性条件下抓取顺式的1,2-二羟基化合物。
2.根据权利要求1所述的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，其特征是：所述的金颗粒是金纳米粒。
3. 根据权利要求1所述的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，其特征是：所述的金片是金金属片或者是载体上涂布或化学制备有金膜层的材料。
4. 一种制备权利要求1所述表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒的方法，其特征是它包括以下步骤：
步骤1. 配制3-噻吩硼酸-巯基乙胺溶液：
将3-噻吩硼酸和巯基乙胺以物质的量之比为1:1的比例溶于体积比为1:9的乙醇-超纯水中，浓度为2.5 mM；
步骤2. 将金片或金颗粒置于步骤1配制的3-噻吩-巯基乙胺溶液中，在室温下反应12小时，即得到自组装的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：所述的金片是载体上涂布或化学制备有金膜层的材料。
6. 权利要求1所述的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，在含顺式二羟基生物分子的识别、固载、传感、富集或分离中的应用。
7. 权利要求1所述的表面具有高亲和力硼酸修饰的金片或金颗粒，在含顺式二羟基生物分子的检测中的应用。
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