CN115043888A - β-烟酰胺单核苷酸的富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种β‑烟酰胺单核苷酸的富集方法。其包括以下步骤：利用二氧化钛和吸附液对β‑烟酰胺单核苷酸粗产物进行吸附处理，然后固液分离收集固体；对所述固体进行至少一次洗脱处理，各次洗脱处理后，收集液体，完成所述β‑烟酰胺单核苷酸的富集。上述方法高效低廉、适合规模化生产。

Description

β-烟酰胺单核苷酸的富集方法

技术领域

本发明涉及化合物分离和纯化技术领域，特别涉及β-烟酰胺单核苷酸的富集方法。

背景技术

NMN（Nicotinamide mononucleotide，全称β-烟酰胺单核苷酸）是一种自然存在的生物活性核苷酸，同时也是人体中的一种重要辅酶NAD⁺ （Nicotinamide adeninedinucleotide，全称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ，又叫诺加因子）的前体物质。NAD⁺存在于人体、西兰花、卷心菜、黄瓜、毛豆等各种生物体内，广泛参与生物体内的多种基础生理活动，借此干预能量代谢、DNA修复、遗传修饰、炎症、生物节律和压力抗性等关键细胞功能。有研究认为，NAD⁺ 能够激活长寿蛋白Sirtuins，从而达到延缓衰老的作用。人体内的 NAD⁺ 浓度会伴随年龄的增长而降低，导致细胞功能下降，进一步引起人体衰老、新陈代谢失调等问题。因此，如何提高人体内的NAD⁺ 浓度一直是生化医学界的一项热点研究。由于NAD⁺ 分子无法直接进入细胞，所以补充NAD⁺ 需要依靠NAD⁺ 前体物质进入细胞后转化。近年来，NMN作为NAD⁺ 重要的前体物质逐渐成为保健品、食品等领域研究的热点。

NMN在自然界动植物中微量存在，难以大规模提取，只能靠人工合成。2010 年之前，NMN主要由化学方式合成，由于技术、路线等问题，价格居高不下。随着2010-2015年全酶法制备工艺的应用，以及2018年诺奖成果酶定向进化技术的成熟，NMN原料的生产成本大大降低，产量也不断提升，大批生产厂家进入NMN生产和销售领域。目前NMN国内市场正处于高速增长期。

但是，市场及临床使用对NMN的纯度有要求，而对NMN纯化就需要先对NMN进行富集。传统的NMN富集的方法主要还集中以离子交换树脂、大孔树脂、硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶等作为固相吸附材料对NMN粗产物进行色谱法富集。这些方法普遍存在效率较低或成本太高的问题，不适合规模化生产。

因此，寻找高效低廉、适合规模化生产的方法富集NMN具有重要意义。

发明内容

基于此，本发明提供一种高效低廉、适合规模化生产的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法。

技术方案如下：

一种β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，包括以下步骤：

利用二氧化钛和吸附液对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行吸附处理，然后固液分离收集固体；

对所述固体进行至少一次洗脱处理，各次洗脱处理后，收集液体，完成所述β-烟酰胺单核苷酸的富集。

在其中一个实施例中，利用二氧化钛和吸附液对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行吸附处理之前，还包括利用活化液对所述二氧化钛进行活化处理的步骤。

在其中一个实施例中，所述活化液为乙醇和氨水的混合溶液。

在其中一个实施例中，所述二氧化钛为金红石型二氧化钛。

在其中一个实施例中，所述吸附液呈酸性。

在其中一个实施例中，所述吸附液的量满足：使吸附环境的pH值为1.0~3.0。

在其中一个实施例中，所述吸附液的量满足：使吸附环境的pH值为2.03。

在其中一个实施例中，所述吸附液为盐酸溶液。

在其中一个实施例中，利用二氧化钛和吸附液对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行吸附处理包括以下步骤：

混合所述β-烟酰胺单核苷酸粗产物和吸附液，收集液体，向所述液体中加入二氧化钛，搅拌吸附。

在其中一个实施例中，所述搅拌吸附的时间为0.3h~2h。

在其中一个实施例中，各次洗脱处理的洗脱液呈碱性。

在其中一个实施例中，各次洗脱处理的洗脱液的pH值为8.5 ~ 11.0。

在其中一个实施例中，各次洗脱处理的洗脱液的pH值为9.92。

在其中一个实施例中，各次洗脱处理的洗脱液各自独立地为乙醇和氨水的混合溶液。

在其中一个实施例中，各次洗脱处理各自独立地包括以下步骤：

混合所述固体和洗脱液，搅拌洗脱，固液分离。

在其中一个实施例中，所述搅拌洗脱的时间为0.3h~0.8h。

在其中一个实施例中，各次洗脱处理各自独立地包括以下步骤：

以所述洗脱液作为流动相，对所述固体进行柱层析处理。

在其中一个实施例中，所述β-烟酰胺单核苷酸粗产物中包括β-烟酰胺单核苷酸以及杂质，所述杂质包括六偏磷酸钠、烟酰胺、核糖、ATP（三磷酸腺苷）和ADP（二磷酸腺苷）中的一种或几种。

与传统方案相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的NMN富集方法，利用TiO₂ 在不同的 pH值下, 可以表现为路易斯酸或路易斯碱的特性，选取TiO₂作为固相吸附材料对NMN进行富集。具体地，在酸性条件下，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合；在碱性条件下, 则表现为路易斯碱，可以与阳离子结合。本发明先通过TiO₂对吸附液中NMN粗产物的不同组分进行吸附，再用洗脱液进行洗脱，由于各组分在TiO₂上被吸附的强度有差异，所以各组分被洗脱下来的程度和先后也不同，借此使NMN和其他组分分离，完成NMN的富集。整个工艺过程成本低廉、操作简单、富集效率高、对环境友好。且对于某些与NMN难以分离的杂质如六偏磷酸钠，有很好的分离效果。

附图说明

图1为实施例1中洗脱处理后收集的上清液样品³¹P-NMR检测图谱；

图2为对比例1中洗脱处理后收集的上清液样品³¹P-NMR检测图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本发明中，所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

本发明中，“一种或几种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。其中，“几种”指任两种或任两种以上。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。

本发明中，涉及到百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。

本发明中，涉及到百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。

本发明中，涉及到温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。

面对市场及临床使用对NMN的纯度有要求，研究者主要在以下两个方面进行相关研究，来提高NMN的纯度：一是开发新的制备方法或者对原有工艺进行改进以降低所得产物中的副产物。但是该方法所需的研发投入过大且周期过长。二是进行NMN富集工艺的研究，再通过浓缩干燥收集NMN。

传统的NMN富集的方法主要还集中以离子交换树脂、大孔树脂、硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶等作为固相吸附材料对NMN粗产物进行色谱法富集，大多是基于NMN的极性或电负性。然而，NMN与多种类似物如NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）带电荷和极性极为相似，用这些方法进行富集时很难将这些类似物杂质完全分离，影响后续纯度。例如：用离子交换树脂法获得产品纯度只有60%左右，收率只有40%，生产效率低，不适合规模化生产；用大孔吸附树脂对NMN进行富集时，也很难将其与某些杂质如偏磷酸钠等分离。而且，十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相的反相高效液相色谱柱成本高昂，也无法在规模化生产中适用。

基于此，本发明的发明人尝试从NMN含有的磷酸基团入手，选择以TiO₂作为固相吸附材料，考察其对NMN的富集效果。

前置实验1：

本次实验考察TiO₂对NMN纯品的吸附洗脱能力，具体步骤如下：

（1）溶液配置：配置pH = 9.92的30%乙醇的氨水溶液，作活化液和洗脱液备用。配置pH = 2.03的盐酸溶液，作吸附液备用。

（2）TiO₂活化：称取10 g TiO₂，置于50 mL 离心管中，加入搅拌子和25 mL 活化液，室温搅拌1 h后于4500 r条件下离心5 min，弃去上清液，保留含活化TiO₂的离心管备用。

（3）吸附实验：称取0.4 g NMN纯品于小烧杯，加入25 mL吸附液溶解，溶液加入到上述含活化TiO₂的离心管中，室温搅拌2 h，分别于0 h、0.5 h、1 h、2 h时离心取上清样，HPLC检测上清液中NMN浓度，结果见表1。吸附实验结束后弃去上清液，收集固体。

（4）洗脱实验：向上述固体中加入25 mL洗脱液，搅拌0.5 h进行第一次洗脱处理，第一次洗脱处理后，离心后分别收集上清液和固体，HPLC检测上清液中NMN浓度，结果见表1。向固体中再加入25 mL洗脱液，搅拌0.5 h进行第二次洗脱处理，第二次洗脱处理后，离心收集上清液，HPLC检测上清液中NMN浓度，结果见表1。

表1前置实验1的各上清液中NMN的浓度

前置实验2：

本次实验考察不同pH的吸附液对TiO₂吸附NMN纯品能力的影响，具体步骤如下：

（1）溶液配置：配置pH = 9.92的30%乙醇的氨水溶液，作活化液备用。分别配置pH= 1.29 、pH = 2.03、 pH = 2.84的盐酸溶液，作吸附液备用。

（2）TiO₂活化：平行称取三份10 g TiO₂，置于三个50 mL 离心管中，分别加入搅拌子和25 mL 活化液，室温搅拌1 h后于4500 r条件下离心5 min，弃去上清液，保留含活化TiO₂的离心管备用。

（3）吸附实验：平行称取三份0.4 g NMN纯品于三个小烧杯，分别加入25 mL 上述不同pH的吸附液溶解，溶液分别加入到上述含活化TiO₂的离心管中，室温搅拌1 h，分别于0h、0.5 h时离心取上清样，HPLC检测上清液中NMN浓度，结果见表2。

表2 前置实验2的各上清液中NMN的浓度

前置实验3：

本次实验进一步考察，当NMN纯品与六偏磷酸钠按照1:1的质量比混合后，TiO₂对NMN的吸附洗脱能力，与上述前置实验1的主要区别在于：步骤3）中加入了0.4 g六偏磷酸钠，具体步骤如下：

（1）溶液配置：配置pH = 9.92的30%乙醇的氨水溶液，作活化液和洗脱液备用。配置pH = 2.03的盐酸溶液，作吸附液备用。

（2）TiO₂活化：称取10 g TiO₂，置于50 mL 离心管中，加入搅拌子和25 mL 活化液，室温搅拌1 h后于4500 r条件下离心5 min，弃去上清液，保留含活化TiO₂的离心管备用。

（3）吸附实验：称取0.4 g NMN纯品和0.4 g六偏磷酸钠于小烧杯，加入25 mL吸附液溶解，溶液加入到上述含活化TiO₂的离心管中，室温搅拌1 h，分别于0 h、0.5 h、1 h时离心取上清样，HPLC检测上清液中NMN浓度，结果见表3。吸附实验结束后弃去上清液，收集固体。

（4）洗脱实验：向上述固体中加入25 mL洗脱液，搅拌0.5 h进行第一次洗脱处理，第一次洗脱处理后，离心收集上清液和固体，HPLC检测上清液中NMN含量，结果见表3。向上述固体中再加入25 mL洗脱液，搅拌0.5 h进行第二次洗脱处理，第二次洗脱处理后，离心收集上清液，HPLC检测上清液中NMN含量，结果见表3。

表3前置实验3的各上清液中NMN的浓度

经上述实验，发明人发现：

（1）10 g TiO₂在上述条件下大约能吸附0.1 g NMN，且0.5 h内吸附就能达到饱和。考虑到过饱和环境有利于提高吸附效率，后续试验以此为基础调整原料用量。

（2）在一定范围内，吸附环境的pH对吸附有较弱的影响，低pH有利于吸附。

（3）有无六偏磷酸钠的存在对NMN在TiO₂上的吸附和洗脱均无显著影响，这意味着六偏磷酸钠和NMN在TiO₂上的结合方式或结合位点不同，这将表现为吸附力度的差异，因此可以利用TiO₂实现NMN和六偏磷酸钠的分离，并有望于实现NMN粗产物的中NMN的富集和纯化。

由此，形成本发明的技术方案，具体如下：一种NMN的富集方法，包括以下步骤：

利用TiO₂和吸附液对NMN粗产物进行吸附处理，然后固液分离收集固体；

对所述固体进行至少一次洗脱处理，各次洗脱处理后，收集液体，完成所述NMN的富集。

本发明提供了一种新的NMN富集方法，利用TiO₂ 在不同的 pH值下, 可以表现为路易斯酸或路易斯碱的特性，选取TiO₂作为固相吸附材料对NMN进行富集。具体地，在酸性条件下，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合；在碱性条件下, 则表现为路易斯碱，可以与阳离子结合。本发明先通过TiO₂和吸附液先对NMN粗产物进行吸附，再用洗脱液进行洗脱，由于各组分在TiO₂上被吸附的强度有差异，所以各组分被洗脱下来的程度和先后也不同，借此使NMN和其他组分分离，完成NMN的富集，整个工艺过程成本低廉、操作简单、富集效率高、对环境友好。且对于某些与NMN难以分离的杂质如六偏磷酸钠，有很好的分离效果。

本发明从NMN含有的磷酸基团入手，选择以TiO₂作为固相吸附材料，达到了理想的富集效果。

可选地，利用TiO₂和吸附液对NMN粗产物进行吸附处理之前，还包括利用活化液对所述TiO₂进行活化处理的步骤。通过活化处理，去除来自商业渠道购买到的TiO₂中的一些可能的杂质。

可选地，所述活化液为乙醇和氨水的混合溶液。

在一些实施例中，所述TiO₂为金红石型TiO₂。

在一些实施例中，所述TiO₂的粒径为0.1 μm~5 μm。

可以理解地，TiO₂可以是但不限于跃江化工R102金红石型TiO₂。R102金红石型TiO₂是一种硫酸法生产的金红石型钛白粉，表面未经无机和有机处理，金红石转化率高，具有良好的光学性能和颜料性能。

可选地，所述吸附液呈酸性。

优选地，所述吸附液的量满足：使吸附环境的pH值为1.0-3.0。进一步可选地，所述吸附液的量满足：使吸附环境的pH值为2.03。TiO₂在酸性条件下，钛原子带正电表现为路易斯酸，与NMN结合。

优选地，所述吸附液为盐酸溶液。在一些实施例中，所述盐酸溶液通过加入质量分数为36%~38%的浓盐酸制成。

可选地，利用TiO₂和吸附液对NMN粗产物进行吸附处理包括以下步骤：

混合所述NMN粗产物和吸附液，收集液体，向所述液体中加入TiO₂，搅拌吸附。

可选地，混合NMN粗产物和吸附液后，离心，收集液体。

可选地，所述NMN粗产物中，含有的每（0.1~0.3）g的NMN，对应加入8g~30g的TiO₂。

该方法通过搅拌吸附NMN，可选地，所述搅拌吸附的时间为0.3h~2h。搅拌吸附后，可通过离心实现NMN与六偏磷酸钠或其它相关杂质的首次分离。

吸附完成后，对所述固体进行至少一次洗脱处理。洗脱处理工业生产中，可根据各次洗脱收集的液体的浓度进行不同的后处理，得到NMN。

可选地，各次洗脱处理的洗脱液呈碱性，可选地，各次洗脱处理的洗脱液的pH值为8.5-11。进一步可选地，各次洗脱处理的洗脱液的pH值为9.92。TiO₂在碱性条件下，钛原子带负电表现为路易斯碱，释放NMN。

可选地，各次洗脱处理的洗脱液各自独立地为乙醇和氨水的混合溶液。

各次洗脱处理可以独立通过以下两种方法实现：

一种方法中，混合所述固体和洗脱液，搅拌洗脱，固液分离。

可选地，所述搅拌洗脱的时间为0.3h~0.8h。

另一种方法中，以所述洗脱液作为流动相，对所述固体进行柱层析处理。

可以理解地，采用柱层析处理时，可以将吸附处理后的固液混合物倒入层析柱中，从层析柱下端放出液体实现固液分离，回收液体，保留固体。然后以洗脱液作为流动相，对保留的固体进行柱层析处理，收集特定时间段的洗脱后的液体。柱层析处理的方法适用于更大规模生产且对NMN富集效果更佳。

可选地，所述NMN粗产物中包括NMN以及杂质，所述杂质包括六偏磷酸钠、烟酰胺、核糖、ATP和ADP中的一种或几种。

可以理解地，本发明完成对NMN的富集后，可通过浓缩干燥等后续处理后得高纯度NMN。

以下结合具体实施例和对比例进行进一步说明，以下具体实施例中所涉及的原料，若无特殊说明，均可来源于市售，所使用的仪器，若无特殊说明，均可来源于市售，所涉及到的工艺，如无特殊说明，均为本领域技术人员常规选择。

以下实施例和对比例中，NMN粗产物来源于叁爻生物科技（上海）有限公司，为发酵后酶催化所得的转化液，其中，HPLC检测NMN含量为8.65g/L，³¹P-NMR检测NMN纯度为22.35％，杂质主要有六偏磷酸钠、烟酰胺、核糖、六偏磷酸钠和蛋白质。

实施例1

本实施例提供一种NMN的富集方法，步骤如下：

（1）溶液配置：配置pH = 9.92的30%乙醇的氨水溶液，作活化液和洗脱液备用。

（2）TiO₂活化：称取10 g TiO₂，置于50 mL 离心管中，加入搅拌子和25 mL 活化液，室温搅拌1 h后于4500 r条件下离心5 min，弃去上清液，保留含活化TiO₂的离心管备用。

（3）吸附实验：量取25 mL 转化液（NMN粗产物）于50 mL 离心管，加入25 μL质量分数36%-38%的浓盐酸，使体系 pH值约为2.03，涡旋混匀后将离心管于12000 r/min离心20min，取上清液加入到上述含活化TiO₂的离心管中，室温搅拌0.5 h，弃去上清液，收集固体。

（4）洗脱实验：向所述固体中加入25 mL洗脱液，搅拌0.5 h进行第一次洗脱处理，第一次洗脱处理后，离心收集上清液和固体。向上述固体中再加入25 mL洗脱液，搅拌0.5 h进行第二次洗脱处理，第二次洗脱处理后，离心收集上清液。

（5）合并两次洗脱处理后收集的上清液，HPLC检测NMN含量为2.13 g/L，³¹P-NMR检测其纯度为 83.8%，³¹P-NMR检测图谱如图1所示。

对比例1

本对比例提供一种NMN的富集方法，与实施例1的主要区别在于：将TiO₂替换为HZ-818大孔树脂，步骤如下：

（1）溶液配置：配置pH = 9.92的30%乙醇的氨水溶液，作活化液和洗脱液备用。

（2）活化：称取10 g HZ-818大孔树脂，置于50 mL 离心管中，加入搅拌子和25 mL活化液，室温搅拌1 h后于4500 r条件下离心5 min，弃去上清液，保留含活化HZ-818大孔吸附树脂的离心管备用。

（3）吸附实验：量取25 mL 转化液（NMN粗产物）于50 mL 离心管，加入25 μL质量分数36%-38%的浓盐酸，使体系 pH值约为2.03，涡旋混匀后将离心管于12000 r/min离心20min，取上清液加入到上述含活化HZ-818大孔吸附树脂的离心管中，室温搅拌0.5 h，弃去上清液，收集固体。

（4）洗脱实验：向所述固体中加入25 mL洗脱液，搅拌0.5 h进行第一次洗脱处理，第一次洗脱处理后，离心收集上清液和固体。向上述固体中再加入25 mL洗脱液，搅拌0.5 h进行第二次洗脱处理，第二次洗脱处理后，离心收集上清液。

（5）合并两次洗脱处理后收集的上清液，HPLC检测NMN含量为3.93 g/L，³¹P-NMR检测其纯度为 50.8%，³¹P-NMR检测图谱如图2所示。

通过上述实验可知，以TiO₂作为固相吸附材料，成功地实现了NMN的吸附洗脱以及与某些难除杂质的分离，该方法成本低廉、高效且对环境友好，在规模化生产中有巨大潜力。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用二氧化钛和吸附液对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行吸附处理，然后固液分离收集固体；

对所述固体进行至少一次洗脱处理，各次洗脱处理后，收集液体，完成所述β-烟酰胺单核苷酸的富集。

2.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，利用二氧化钛和吸附液对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行吸附处理之前，还包括利用活化液对所述二氧化钛进行活化处理的步骤。

3.根据权利要求2所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，所述活化液为乙醇和氨水的混合溶液。

4.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，所述吸附液呈酸性。

5.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，利用二氧化钛和吸附液对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行吸附处理包括以下步骤：

混合所述β-烟酰胺单核苷酸粗产物和吸附液，收集液体，向所述液体中加入二氧化钛，搅拌吸附。

6.根据权利要求5所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，所述搅拌吸附的时间为0.3h~2h。

7.根据权利要求1~6任一项所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，各次洗脱处理的洗脱液呈碱性。

8.根据权利要求7所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，各次洗脱处理各自独立地包括以下步骤：

混合所述固体和洗脱液，搅拌洗脱，固液分离。

9.根据权利要求7所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，各次洗脱处理各自独立地包括以下步骤：

以所述洗脱液作为流动相，对所述固体进行柱层析处理。

10.根据权利要求1~6、8和9任一项所述的β-烟酰胺单核苷酸的富集方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸粗产物中包括β-烟酰胺单核苷酸以及杂质，所述杂质包括六偏磷酸钠、烟酰胺、核糖、ATP和ADP中的一种或几种。

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