CN110272486B - 一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法 - Google Patents

一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白提取技术领域；具体涉及一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括：破壁、粗过滤、纯化；所述粗过滤是将破壁所得物用0.5‑1μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.5‑1μm的微滤膜过滤；本发明具有产率高、纯度高、蛋白稳定性强、提取周期短，成本低，操作简单，资源利用率好的特点。

Description

一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法
技术领域
本发明涉及蛋白提取技术领域；具体涉及一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法。
背景技术
蓝藻中含有有效物质包括氨基酸、多糖、藻胆蛋白、藻毒素；藻蓝蛋白是存在于蓝藻、红藻、隐藻中的一类水溶性捕光色素蛋白，研究表表明，藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生等功效，被广泛用作天然色素、医药保健品和分子新生物学研究中的荧光试剂。藻蓝蛋白多从螺旋藻、眉藻、席藻等中提取，关于蓝藻藻蓝蛋白的提取研究较少。
目前藻蓝蛋白主要通过抽提、粗过滤、微滤、超滤、低温静置离心等提纯方法进行提取；如专利号CN201510692709.7公开的一种活性炭预处理联合盐析法提取纯化藻蓝蛋白的方法，包含如下步骤：A.将蓝藻进行破壁以产生藻液；B.将所述藻液进行固液分离，然后将所得液体进行离心，之后取上清液，以获得藻蓝蛋白粗提液；C.向上述藻蓝蛋白粗提液中加入适量活性炭，搅拌并静置后离心，再次获得上清液；D.向步骤C中获得的上清液中加入硫酸铵，搅拌并静置后离心，第三次获得上清液；E.向步骤D中获得的上清液中追加适量硫酸铵，搅拌并静置后离心，获得沉淀，将沉淀用磷酸缓冲液溶解，获得藻蓝蛋白溶液。又如专利号CN201410409170.5公开的一种藻蓝蛋白的提取方法，包括将含有藻蓝蛋白的鲜藻或经过预浸泡的藻粉加入-50℃～-10℃的冰粉中，将搅拌速度控制在1000r/min～3000r/min的条件下进行破壁处理，得到含有藻蓝蛋白的破壁液；再将得到的含有藻蓝蛋白的破壁液进行分离、纯化和干燥，得到成品藻蓝蛋白。但现有技术在产率、纯度、成本方面均不太理想，故难以实现产业化。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括：破壁、粗过滤、纯化；所述粗过滤是将破壁所得物用0.5-1μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.5-1μm的微滤膜过滤。
所述油脂的用量为蓝藻质量15-20％，混合时间为5-10min。
所述去离子水的用量为蓝藻质量50-60％，混合时间为5-10min。
所述破壁的方法为：将蓝藻与食盐按1：(0.1-0.2)的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下20-零下10℃后研磨至过50-80目，再加热至温度为30-35℃，然后加入等温的提取液进行恒温浸泡15-20min。
所述提取液用量为蓝藻质量1.5-2倍。
所述提取液由如下质量份物质组成：5-8份柠檬酸钠、13-17份十二烷基硫酸钠、2-6份酒石酸钠、10-12份磷酸二氢钠、80-90份去离子水。
所述纯化的方法为：
(1)将粗过滤液与吸附填料混合搅拌10-15min后，固液分离，洗脱固形物，收集洗脱液；
(2)将洗脱液以10-20mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；
(3)将二次洗脱液用中空纤维膜进行超滤。
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：(0.05-0.07)。
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量5-8％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量20-25％。
所述混合搅拌中粗过滤液与吸附填料按照1：(1.2-1.6)的质量比，温度为50-70℃。
所述洗脱是用浓度为0.01-0.03mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱。
所述中空纤维膜的截留分子量为60-80KDa。
有益效果：
本发明具有产率高、纯度高、蛋白稳定性强、提取周期短，成本低，操作简单，资源利用率好的特点，具体表现在以下几个方面：
(1)利用真空冷冻技术防止了蛋白破壁、提取过程中变性，保障了蓝藻的有效成分含量和活性，进而有助于藻蓝蛋白提取以及有效成分的再利用，并有助于细胞破碎；再进一步结合加热和食盐渗透作用，使得蓝藻细胞壁得以迅速、充分涨破，进而克服了溶胀法周期长、反复冻融成本高、化学试剂易造成蛋白变性的缺点；
(2)在粗过滤过程中利用油脂进行混合，有助于分离藻蓝蛋白，提高藻蓝蛋白纯度，降低杂质对提取、纯化影响，回收其他脂溶性有效成分，还节约了后期纯化成本；
(3)在纯化过程中利用羟基磷灰石、改性牡蛎壳作为吸附材料，降低了纯化成分，操作简单，并且利用两种吸附材料的微孔性能，进一步提高了藻蓝蛋白与其他水溶成分的分离程度，并降低了大量化学试剂的使用，进而保证了藻蓝蛋白的稳定性；并且羟基磷灰石、改性牡蛎壳具有吸附容量高、稳定性好、价格低廉、操作简单的特点。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
本发明的藻蓝蛋白的纯度检测由紫外吸收光谱仪检测，计算方法如下为：
藻蓝蛋白纯度P＝A620/A280；
藻蓝蛋白浓度PC＝(A620-0.7×A650)/7.38；单位mg/mL
藻蓝蛋白产率PC％＝(PC×V×k1)/(m×k2×1000)；单位％
A650：650nm波长处的吸光度；A620：620nm波长处的吸光度；A280：280nm波长处的吸光度；V：藻蓝蛋白体积(mL)；m：蓝藻质量(g)；k1：藻蓝蛋白提取液稀释倍数；k2：蓝藻干物质的量。
实施例1
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将蓝藻与食盐按1：0.2的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下20℃后研磨至过80目，再加热至温度为30-35℃，然后加入蓝藻质量2倍、等温的提取液进行恒温浸泡20min；提取液由如下质量份物质组成：8份柠檬酸钠、17份十二烷基硫酸钠、6份酒石酸钠、12份磷酸二氢钠、90份去离子水；
(2)粗过滤：将破壁所得物用0.5μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.5μm的微滤膜过滤；油脂的用量为蓝藻质量20％，混合时间为10min；去离子的用量为蓝藻质量60％，混合时间为10min；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.6的质量比，于70℃条件下混合搅拌15min后，固液分离，用浓度为0.03mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以10-20mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为80KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：0.07；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量8％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量25％；
经检测：藻蓝蛋白纯度为19.6；产率为98.2％。
实施例2
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将蓝藻与食盐按1：0.1的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下10℃后研磨至过50目，再加热至温度为30-35℃，然后加入蓝藻质量1.5倍、等温的提取液进行恒温浸泡15-20min；提取液由如下质量份物质组成：5份柠檬酸钠、13份十二烷基硫酸钠、2份酒石酸钠、10份磷酸二氢钠、80份去离子水；
(2)粗过滤：将破壁所得物用1μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用1μm的微滤膜过滤；油脂的用量为蓝藻质量15％，混合时间为5min；去离子的用量为蓝藻质量50％，混合时间为5min；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.2的质量比，于50℃条件下混合搅拌10min后，固液分离，用浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以10mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为60KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：0.05；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量5％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量20％；
经检测：藻蓝蛋白纯度为18.9；产率为98.4％。
实施例3
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将蓝藻与食盐按1：0.15的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下15℃后研磨至过60目，再加热至温度为30-35℃，然后加入蓝藻质量1.8倍、等温的提取液进行恒温浸泡18min；提取液由如下质量份物质组成：6份柠檬酸钠、15份十二烷基硫酸钠、4份酒石酸钠、11份磷酸二氢钠、85份去离子水；
(2)粗过滤：将破壁所得物用0.8μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.8μm的微滤膜过滤；油脂的用量为蓝藻质量18％，混合时间为8min；去离子的用量为蓝藻质量55％，混合时间为8min；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.5的质量比，于60℃条件下混合搅拌12min后，固液分离，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以15mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为70KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：0.06；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量6％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量22％；
经检测：藻蓝蛋白纯度为19.3；产率为99.1％。
实施例4
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将蓝藻与食盐按1：0.15的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下15℃后研磨至过60目，再加热至温度为30-35℃，然后加入蓝藻质量1.8倍、等温的提取液进行恒温浸泡18min；提取液由如下质量份物质组成：5份柠檬酸钠、17份十二烷基硫酸钠、6份酒石酸钠、10份磷酸二氢钠、90份去离子水；
(2)粗过滤：将破壁所得物用0.8μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.8μm的微滤膜过滤；油脂的用量为蓝藻质量18％，混合时间为8min；去离子的用量为蓝藻质量55％，混合时间为8min；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.5的质量比，于60℃条件下混合搅拌12min后，固液分离，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以15mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为70KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：0.06；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量6％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量22％；
经检测：藻蓝蛋白纯度为18.9；产率为98.6％。
实施例5
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将蓝藻与食盐按1：0.2的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下20℃后研磨至过80目，再加热至温度为30-35℃，然后加入蓝藻质量2倍、等温的提取液进行恒温浸泡20min；提取液由如下质量份物质组成：6份柠檬酸钠、15份十二烷基硫酸钠、4份酒石酸钠、11份磷酸二氢钠、85份去离子水；
(2)粗过滤：将破壁所得物用0.5μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.5μm的微滤膜过滤；油脂的用量为蓝藻质量20％，混合时间为10min；去离子的用量为蓝藻质量60％，混合时间为10min；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.6的质量比，于70℃条件下混合搅拌15min后，固液分离，用浓度为0.03mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以10-20mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为80KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：0.07；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量8％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量25％；
经检测：藻蓝蛋白纯度为19.3；产率为98.2％。
对比例1
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将蓝藻与食盐按1：0.15的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下15℃后研磨至过60目，再加热至温度为30-35℃，然后加入蓝藻质量1.8倍、等温的提取液进行恒温浸泡18min；提取液由如下质量份物质组成：6份柠檬酸钠、15份十二烷基硫酸钠、4份酒石酸钠、11份磷酸二氢钠、85份去离子水；
(2)粗过滤：将破壁所得物用0.8μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.8μm的微滤膜过滤；油脂的用量为蓝藻质量18％，混合时间为8min；去离子的用量为蓝藻质量55％，混合时间为8min；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.5的质量比，于60℃条件下混合搅拌12min后，固液分离，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以15mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为70KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石；
经检测：藻蓝蛋白纯度为10.5；产率为89.7％。
对比例2
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将蓝藻与食盐按1：0.15的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下15℃后研磨至过60目，再加热至温度为30-35℃，然后加入蓝藻质量1.8倍、等温的提取液进行恒温浸泡18min；提取液由如下质量份物质组成：6份柠檬酸钠、15份十二烷基硫酸钠、4份酒石酸钠、11份磷酸二氢钠、85份去离子水；
(2)粗过滤：将破壁所得物用0.8μm的微滤膜过滤二次；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.5的质量比，于60℃条件下混合搅拌12min后，固液分离，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以15mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为70KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：0.06；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量6％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量22％；
经检测：藻蓝蛋白纯度为5.2；产率为83.5％。
对比例3
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：将蓝藻与食盐按1：0.15的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下15℃后研磨至过60目，再加热至温度为30-35℃，然后加入蓝藻质量1.8倍、等温的提取液进行恒温浸泡18min；提取液为体积浓度25％的十二烷基硫酸钠溶液；
(2)粗过滤：将破壁所得物用0.8μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.8μm的微滤膜过滤；油脂的用量为蓝藻质量18％，混合时间为8min；去离子的用量为蓝藻质量55％，混合时间为8min；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.5的质量比，于60℃条件下混合搅拌12min后，固液分离，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以15mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为70KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：0.06；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量6％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量22％；
经检测：藻蓝蛋白纯度为4.6；产率为89.4％。
对比例4
一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)破壁：反复冻融二次；
(2)粗过滤：将破壁所得物用0.8μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.8μm的微滤膜过滤；油脂的用量为蓝藻质量18％，混合时间为8min；去离子的用量为蓝藻质量55％，混合时间为8min；
(3)纯化；先将粗过滤液与吸附填料按照1：1.5的质量比，于60℃条件下混合搅拌12min后，固液分离，用浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱固形物，收集洗脱液；再将洗脱液以15mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；最后将二次洗脱液用截留分子量为70KDa的中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：0.06；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量6％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量22％；
经检测：藻蓝蛋白纯度为4.2；产率为83.87％。

Claims (4)

1.一种蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，包括：破壁、粗过滤、纯化；其特征在于，所述粗过滤是将破壁所得物用0.5-1μm的微滤膜过滤后，依次加入油脂、去离子水进行混合，经水油分离去除油脂后，再用0.5-1μm的微滤膜过滤；
所述破壁的方法为：将蓝藻与食盐按1：(0.1-0.2)的质量比混合后，置于真空冷冻至温度为零下20-零下10℃后研磨至过50-80目，再加热至温度为30-35℃，然后加入等温的提取液进行恒温浸泡15-20min；
所述纯化的方法为：
(1)将粗过滤液与吸附填料混合搅拌10-15min后，固液分离，洗脱固形物，收集洗脱液；
(2)将洗脱液以10-20mL/min的流速，通过树脂进行脱色纯化，收集二次洗脱液；
(3)将二次洗脱液用中空纤维膜进行超滤；
所述吸附填料为羟基磷灰石、改性牡蛎壳按质量比为1：(0.05-0.07)；
所述改性牡蛎壳是将牡蛎壳研磨至过100目筛后，然后加入羧甲基纤维素钠及聚乙二醇进行改性；羧甲基纤维素钠的用量为牡蛎壳质量5-8％，聚乙二醇的用量为牡蛎壳质量20-25％；
所述混合搅拌中粗过滤液与吸附填料按照1：(1.2-1.6)的质量比，温度为50-70℃；
所述中空纤维膜的截留分子量为60-80KDa。
2.如权利要求1所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述油脂的用量为蓝藻质量15-20％，混合时间为5-10min。
3.如权利要求1所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述去离子水的用量为蓝藻质量50-60％，混合时间为5-10min。
4.如权利要求1所述蓝藻中藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，所述提取液由如下质量份物质组成：5-8份柠檬酸钠、13-17份十二烷基硫酸钠、2-6份酒石酸钠、10-12份磷酸二氢钠、80-90份去离子水。
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