CN1259335C - 一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，以鲜藻为原料，首先提取粗滤液，鲜藻脱水后，加入缓冲液，混匀，然后冰冻，冻结后，取出置室温下融溶，冻融3-5次，用板框过滤；其次是超滤纯化，用截留分子量为1000-20万道尔顿的中空纤维超滤器，经过微滤的粗提液使分子量较小的各种物质，透过超滤膜而被清除；第三是静置一澄清纯化，经过超滤纯化的藻蓝蛋白的部分，除去大部分小分子，同时进行浓缩，经浓缩的藻蓝蛋白部分在一定温度保藏；第四是羟基磷灰石柱层析纯化。本发明方法简便，纯化和浓缩效率高，具有社会、环境和经济效益。

Description

一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法

                       技术领域

本发明涉及水华蓝藻提取天然蓝色素，更具体涉及一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，适用于食品、饮料、化妆品的着(调)色剂。

                       背景技术

近几年来，由于工业迅速发展，人口剧增，城市化加重，环境严重污染，我国许多水体的富营养化程度加剧，引起藻类、特别是蓝藻的大量繁殖，某些水体甚至发生严重的蓝藻水华，直接影响了水体的质量和可利用度，并危害着牲畜和人类的健康。在长江中下游地区湖泊蓝藻水华的大量发生在4-10月，尤其在7-9月的高温季节蓝藻水华的产生量最大。湖泊大量发生的水华蓝藻一方面严重污染环境、危害饮水水源，另一方面给旅游业带来了极大的影响。为减轻湖泊的污染，消除蓝藻异味，有必要对大量堆积的蓝藻水华进行有效地清除。采样机械方法清除蓝藻水华，是一种能直接大量清除湖面蓝藻水华。但是，对收获的水华蓝藻如何有效地加以利用，提高利用价值，达到既能有效地改善环境又可提高经济效益的目的是十分必要的。水华蓝藻中含有丰富的藻蓝蛋白(一种天然蓝色素)，其含量达细胞干重的5～8％。蓝色色素被广泛应用于食品、饮料、医疗保健品及化妆品行业。我国目前主要使用的还是化学合成色素，合成色素不利于人体健康已为医学界和化学工作者所证实。因此，国内外正纷纷寻找可取代合成色素的无毒天然色素。在各种来源的天然色素中，成色所需要的红、黄、蓝三色以天然蓝色素的来源最少有。而蓝藻中富含的藻蓝蛋白就是一种蓝色的色素蛋白，是一种具有保健功能的天然蓝色素。长期以来，提取藻蓝蛋白的原料几乎全部来自人工养殖的螺旋藻，成本相对较高，工艺较复杂，在一定程度上限制了藻蓝蛋白及其制品的推广和应用。经文献检索，国内外目前尚无用水华蓝藻作原料生产藻蓝蛋白的报道。

                       发明内容

本发明的目的在于提供一种水华蓝藻制备蓝藻蛋白的方法，原料来源广泛，成本低廉，方法易行，操作简便，解决了水华蓝藻资源化利用的问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

采用收获的水华蓝藻鲜藻为原料，经过离心得脱水藻糊，加入磷酸缓冲液(pH5-9)，冻融3-5次，冷冻温度为-10至-20℃，离心，弃去沉淀，收集上清，即为藻蓝蛋白粗提液，纯度为(A620/A280)0.6左右。然后经过微滤预处理及超滤纯化处理，得到的藻蓝蛋白的纯度超过1.00，浓度提高7倍，色彩鲜艳，呈宝石蓝色，可直接分装成液态浓缩食用色素。经冷却干燥，获得固态藻蓝蛋白的食用色素，重溶性好。每100克干重的鲜藻，可提取4-10克藻蓝蛋白。

其步骤是：

1、从富营养化水体中收获水华蓝藻，经浓缩、脱水分后得到鲜蓝藻藻糊(常规方法)。

2、提取蓝藻蛋白粗提液，采用冻融法处理鲜藻藻糊，往鲜藻藻糊中加入0.05M-0.2M磷酸缓冲液，鲜藻与磷酸缓冲液的重量体积比为1∶1-1∶10，pH值为5-9，混匀，冷冻，温度为-10至-20℃，待冻结之后，取出置室温(20-30℃)下使之融溶，冻融3-5次，藻细胞周围的水先结冰，这种冰晶会刺破或挤压破藻细胞，从而使藻细胞内的藻蓝蛋白溶出。然后利用板框过滤或离心分离法使粗提液与细胞碎片相分离。

3、微滤、预处理，使用孔径为2-3μm和0.45-0.22μm的二种微滤器，对藻蓝蛋白的粗提液进行微滤处理。然后进一步去除粗提物中的细胞膜碎片，避免它们堵塞超滤膜。同时经过0.22μm微滤膜滤过之后，可清除掉粗提物中的微生物，防止在以下加工过程中微生物的分解作用。

4、超滤纯化(去毒)，采用截留分子量为十万道尔顿的超滤膜，经过微滤的粗提液，使分子在十万道尔顿以下各种物质，经过超滤膜而被清除。现在化工行业使用一种超滤设备，在蛋白质化工中主要用于浓缩，对粗提液进行纯化。超滤设备的主要部件是超滤膜，制造商可以控制这种膜的孔径，使这种小孔只允许“小”的分子通过，“大”的分子则被截留。这样，“大”分子和“小”分子便分开了，得到了“小”分子组份和“大”分子组份，从而进行了纯化，而被截留的部分则同时被浓缩。使用截留孔径为10万道尔顿的超滤膜，可除去分子量小于10万道尔顿的各种分子，其中包括毒素，蓝藻毒素的分子量在1千左右，所以很容易除去，藻蓝蛋白则被截留，既被纯化，又除去了蓝藻毒素，且被浓缩，以便下道工序进行。

5、静止-澄清纯化工序，经超滤工序后，分子量大于10万道尔顿的大分子被浓缩。在3-5℃静置时，一部分被浓缩的杂蛋白形成絮状沉淀，从溶液中析出。此时，只要经过离心，弃去沉淀，收集上清，便去除了这部分沉淀的杂蛋白，藻蓝蛋白的纯度得以提高。

6、羟基磷灰石层析工序(纯化)，羟基磷灰石层析工艺在化工行业被广泛地使用。原理是使用其对一些不同结构的分子吸附能力不同，然后选用4-8种浓度不同的洗脱液(0.001M-1M磷酸缓冲液)，分步洗脱，每种磷酸缓冲液使用剂量为1-3个柱体积。通过洗脱，藻蓝蛋白在低浓度(0.001M-0.125M磷酸缓冲液)的洗脱液中被洗脱出来，而别藻蓝蛋白在较高浓度(0.125M-1M磷酸缓冲液)的洗脱液中被洗脱出来。羟基磷灰石对别藻蓝蛋白吸附力较强，对藻蓝蛋白吸附力较弱，因而，在低浓度洗脱液洗脱时得到鲜艳的宝石蓝色的藻蓝蛋白分部分，在高浓度的洗脱液洗脱时，得到灰蓝色的别藻蓝蛋白部分。有些蓝藻水华中含别藻蓝素相当多，它掩盖了藻蓝蛋白的颜色，所以必须把它们分开，从而得到二种色泽有别的色素蛋白。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明利用天然水体中的水华蓝藻作为原料，其成本大大低于靠人工高成本养殖的螺旋藻，同时又节省了从水体去除COD、BOD和氮磷等营养或污染物的费用，以及减少了水工业、养殖业、旅游业遭受的经济损失。本发明可带来的双向利益将为社会带来显著的经济、社会与环境效益。

2、本发明方法简便，适应不同来源的蓝藻资源，变害为利，变废为宝，纯化效率和浓缩效率高，与国外同行相比，提高了十倍。

3.、本发明在以天然水体中的水华蓝藻作为原料提取藻蓝蛋白的同时，同时能清除混杂的蓝藻藻毒素，达到生产食用安全级别的藻蓝蛋白的目的。

                       具体实施方式

下面对本发明作进一步详细描述：

实施例：

1、采样机械方法从富营养化水体中收获水华蓝藻，经浓缩、脱水分后得到鲜蓝藻藻糊(常规方法)，藻糊含水量92％左右。

2、提取蓝藻蛋白粗提液：取蓝藻鲜藻，经脱水后，按鲜藻与磷酸缓冲液重量体积比1∶1-1∶10的比例加入0.05M-0.2M的磷酸缓冲液(pH5.0-9.0)，混匀，然后置-15℃冰冻，待冻结之后，取出置室温20℃或22℃或25℃下使之融溶，冻融处理4次，绝大部分藻蓝蛋白被从细胞内提取出来，然后利用板框过滤或离心分离法，使粗提液与细胞碎片相分离而得到蓝藻蛋白粗提液。

3、微滤、预处理：上步骤的蓝藻蛋白的粗提液，依次通过孔径为2-3μm和0.45-0.22μm的二种微滤器，进行微滤处理。操作阀门及流量，控制压力在0.02-0.1Mpa以下。当压力过高时，应将微滤器拆开进行清洗。此步骤可以进一步去除粗提物中的细胞碎片，同时经过0.22μm微滤膜滤过之后，可清除掉粗提物中的微生物，防止在以下加工过程中微生物的分解作用。

4、超滤纯化工序：选用截留分子量1000-20万道尔顿的中空纤维超滤器，与蠕动泵配套使用，处理经过微滤处理的粗提液。调节阀门及流量，控制超滤的流量为1-5升/分钟。通过超滤，小分子量的杂蛋白，小分子的有机物，多肽，及其它无机小分子，包括分子量1千左右的蓝藻毒素，均透过超滤膜而被清除，而藻蓝蛋白及其它大分子则滞留在超滤膜内。这样，藻蓝蛋白的纯度得以提高。一方面，藻蓝蛋白纯度可从0.39提高到1.00-1.20，另一方面，可以完全消除藻蓝蛋白中混杂的蓝藻藻毒素，从而达到生产食用安全级的藻蓝蛋白的目的。(目前国际上藻蓝蛋白的纯度指标A620/A280仅从0.62提高到0.72，且只能局限用于以螺旋藻为材料的藻蓝蛋白提取。)

5、静置-澄清纯化工序：经过超滤纯化的藻蓝蛋白部分，由于除去了分子量较小的部分，所以，也同时进行了浓缩。具体操作方法是：将浓缩后的藻蓝蛋白部分在3-5℃保藏2-3天后，便会出现一些絮状沉淀，这是淡黄色的，是杂蛋白形成的沉淀。只要经过1000-5000g离心或过滤处理，可以很容易地除掉这一部分杂蛋白，从而使产品纯度从1.0-1.20提高到1.40-1.50。此步工序操作相当简单，而纯化效果又相当好。经检索，未见过国内外文献资料中有类似纯化方法的报道。

6、羟基磷灰石柱层析纯化工序：在蓝藻水华的提取物中，除含有藻蓝蛋白外，还含有一种别藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白呈灰蓝色，它掩盖了藻蓝蛋白鲜艳的宝石蓝色。采用实验室常用的羟基磷灰石柱层析法，使二种物质分开。具体操作方法是：将通过静置-澄清纯化工艺处理的材料上羟基磷灰石柱，使柱的1/3着染，然后用0.001M-1M不同浓度的磷酸缓冲液分步洗脱，按磷酸缓冲液浓度高低依次选用浓度梯度，选用4-8种浓度不同的洗脱液(0.001M-1M磷酸缓冲液)，每种磷酸缓冲液使用剂量为1-3个柱体积。通过洗脱，先可得到色彩鲜艳的宝石蓝色部分，这就是藻蓝蛋白部分，在0.125-1M浓度的洗脱液洗脱时，灰蓝色蛋白的别藻蓝蛋白才洗脱下来。经过此工序，藻蓝蛋白分部的纯度可提高到1.6-2.0，至此，产品纯度远超过食用色素级的标准。

Claims (1)

1、一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，包括下列步骤：

A、从富营养化水体中收获水华蓝藻，经浓缩、脱水分后得到鲜蓝藻藻糊；

B、提取蓝藻蛋白粗提液：取蓝藻鲜藻，经脱水后，按鲜藻与磷酸缓冲液重量体积比1∶1-1∶10的比例加入0.05M-0.2M的磷酸缓冲液，pH5.0-9.0，混匀，然后置-10至-20℃，冰冻，待冻结之后，取出置室温20-25℃下使之融溶，冻融处理3-5次，然后利用板框过滤或离心分离法，使粗提液与细胞碎片相分离而得到蓝藻蛋白粗提液；

C、微滤、预处理：上步骤的蓝藻蛋白的粗提液，依次通过孔径为2-3μm和0.45-0.22μm的二种微滤器，进行微滤处理，控制压力在0.02-0.1Mpa以下；

D、超滤纯化工序：选用截留分子量为1000-20万道尔顿的中空纤维超滤器与蠕动泵配套使用，处理经过微滤处理的粗提液，控制超滤的流量为1-5升/分钟，通过超滤，小分子量的杂蛋白，小分子的有机物，多肽，及其它无机小分子，包括分子量1千的蓝藻毒素，均透过超滤膜而被清除，而藻蓝蛋白及其它大分子则滞留在超滤膜内，藻蓝蛋白的纯度得以提高；

E、静置-澄清纯化工序：经过超滤纯化的藻蓝蛋白部分，除去了分子量，浓缩，将浓缩后的藻蓝蛋白部分在3-5℃保藏2-3天后，经过1000-5000g离心或过滤处理；

F、羟基磷灰石柱层析纯化工序：将通过静置-澄清纯化工艺处理的材料上羟基磷灰石柱，使柱的1/3着染，然后用0.001M-1M不同浓度的磷酸缓冲液分步洗脱，按磷酸缓冲液浓度高低依次选用浓度梯度，磷酸缓冲液使用剂量为1-3个柱体积，通过洗脱，在0.125-1M浓度的磷酸缓冲液洗脱时，灰蓝色蛋白的别藻蓝蛋白才洗脱下来。