CN1417227A - 制备强荧光藻蓝蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明制备强荧光藻蓝蛋白的方法是以新鲜藻泥为原料，用含EDTA的磷酸缓冲液洗涤，经超声波破碎细胞，释放出色素蛋白，通过离心分离，去除不溶性细胞膜及细胞器。收集上清液，经分级盐析，收集藻蓝蛋白沉淀。沉淀溶于含EDTA的磷酸缓冲液中，通过Sephadex G－25脱盐，上DEAE－Sepharose FF柱，去掉碱性杂质蛋白，然后上羟基磷灰石柱，获得藻蓝蛋白洗脱液。接着上CM－Sepharose FF柱，去掉酸性杂质蛋白。最后再上第二次羟基磷灰石，获得高纯度强荧光的藻蓝蛋白。本发明既省力又省时，适合工业化大规模生产。

Description

制备强荧光藻蓝蛋白的方法
                    技术领域
本发明涉及制备强荧光藻蓝蛋白的方法。
                    背景技术
藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)是红蓝藻等海藻中重要的捕光色素蛋白藻胆蛋白组成部分，由α，β两种亚基构成，其分子量约为34000-36000道尔顿，在280nm和360nm处具有特异性荧光激发峰，在650nm具荧光吸收峰。藻蓝蛋白具有提高人体免疫力，促进动物血细胞再生等功能，能抑制癌细胞生长，对癌细胞有很强的杀伤力，是一种无毒无副作用的理想光敏剂，可减轻肿瘤化疗的副作用。藻蓝蛋白作为一种天然色素，色调为极美丽的天蓝色，也可作为高级天然色素应用于食品和化妆品中。藻蓝蛋白由于还具有强烈的荧光性，在分子生物学上可用于制备荧光探针，适用于免疫学、细胞学、生理学和分子生物学等方面的研究。此外，藻蓝蛋白可用于信电产品中的光子开关，利用色素蛋白在一定波长光照下的蛋白构象变化快速开关电路，适用作高速通信元件。基于藻蓝蛋白独特的理化性质，因而其在科研、医疗、信电、保健、食品等领域有着广泛的应用，是一种急待开发和推广应用的生物活性制品。
                         发明内容
本发明的目的是提供制备强荧光藻蓝蛋白的方法。
本发明方法以新鲜藻泥为原料，用含EDTA的磷酸缓冲液洗涤，经超声波破碎细胞，释放出色素蛋白，通过高速冷冻离心分离，去除不溶性细胞膜及细胞器。收集上清液，经分级盐析，收集藻蓝蛋白沉淀。沉淀溶于含EDTA的磷酸缓冲液中，通过Sephadex G-25脱盐，上DEAE-Sepharose FF柱，去掉碱性杂质蛋白，然后上羟基磷灰石柱，获得藻蓝蛋白洗脱液。接着上CM-Sepharose FF柱，去掉酸性杂质蛋白。最后再上第二次羟基磷灰石，获得高纯度强荧光的藻蓝蛋白，经冷冻干燥获得蓝色冻干粉。全部生产过程需控制在低温条件(0～4℃)下操作，以保持荧光藻蓝蛋白的分子空间构象和生物学活性。
本发明方法包括以下步骤：
1)新鲜藻泥加入pH值7.0-7.6、浓度50mmol/L、含0.1～0.5mmol/LEDTA的磷酸缓冲液，冰浴超声波破，将破碎液离心后去沉淀，收集上清液；
2)分级盐析上清液，量取上清液体积，按30％饱和(NH4)2SO4计算用量，缓慢加入上清液中，加毕后静置8～12小时，离心、取上清，上清液再缓慢加至55％饱和度(NH4)2SO4，静置10小时以上，离心、留沉淀备用；
3)沉淀物用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸缓冲液溶解，上Sephadex G-25柱脱盐，用10mmol/L、pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸缓冲液洗脱，收集荧光藻蓝蛋白部分；
4)脱盐后的荧光藻蓝蛋白上预先用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0～0.5mol/LNaCl的10mmol/L、pH值7.0～7.6的磷酸缓冲液作线性梯度洗脱，流速控制在5～10ml/min，收集荧光藻蓝蛋白部分；
5)将步骤4)收集的荧光藻蓝蛋白部分上羟基磷灰石柱，用pH值7.0～7.6、浓度10～100mmol/L的磷酸缓冲液作梯度洗脱，收集吸收峰在620nm处的荧光藻蓝蛋白部分；
6)将步骤5)收集液再上CM-Sepharose FF柱，用pH值5～6、浓度10～200mmol/L的乙酸缓冲液作梯度洗脱，收集荧光藻蓝蛋白部分；
7)将步骤6)收集的荧光藻蓝蛋白部分再上羟基磷灰石柱，以pH值7.0～7.6、浓度10～100mmol/L的磷酸缓冲液作梯度洗脱，收集吸收峰在620nm处的荧光藻蓝蛋白部分；
8)将步骤7)收集的荧光藻蓝蛋白部分上Sephadex G-100柱，用10mmol/L、pH值7.0～7.6的磷酸缓冲液洗脱，控制流速在5～10ml/min，收集荧光藻蓝蛋白部分，经A620/280双波长检测，将色价比达4.5以上的荧光藻蓝蛋白液用聚乙二醇20000浓缩，浓缩液经冷冻、干燥，得本发明强荧光藻蓝蛋白。
本发明采用了Sephadex G-25层析柱动态脱盐，既省力又省时，适合工业化大规模生产。采用鲜藻作原料，工艺中始终在低温(0～4℃)下操作制备出的是一种具生物活性的蓝色荧光藻蓝蛋白(FPC)，它与用藻粉制备的无荧光、或弱荧光藻蓝蛋白有根本的区别。本发明制备出的蓝色荧光藻蓝蛋白是一种高纯度(A620/A280＞4.5)的产品。
                    具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此实施例。
实施例：
取钝顶螺旋藻藻泥5Kg，加入10000ml pH值7.6、浓度50mmol/L、含0.5mmol/LEDTA的磷酸缓冲液，搅拌均匀。4℃下置于1800W超声波破碎器中破碎45分钟，破碎好的藻液置于预冷的高速冷冻离心机中，10000rpm离心45分钟，保留上清液。量取上清液体积，按30％饱和(NH4)2SO4计算用量，缓慢加入上清液中，4℃下静置10小时，待沉淀完全。在12000rpm条件下离心45分钟，保留上清液。上清液再缓慢加至50％饱和度(NH4)2SO4，4℃下静置10小时以上，15000rpm离心30分钟，沉淀物用浓度10mmol/L、含0.5mmol/LEDTA的磷酸磷酸缓冲液溶解，上Sephadex G-25(φ100×1000mm.V＝8L)柱脱盐，收集荧光藻蓝蛋白部分。
脱盐后的荧光藻蓝蛋白上预先用浓度pH值7.6、10mmol/L、含0.5mmol/LEDTA的磷酸缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0～0.5mol/LNaCl的pH值7.6、10mmol/L的磷酸缓冲液作线性梯度洗脱，控制流速在5～10ml/min，收集的荧光藻蓝蛋白液上羟基磷灰石柱，用pH值7.6、浓度10～100mmol/L的磷酸缓冲液作梯度洗脱，收集吸收峰在620nm处的荧光藻蓝蛋白部分，收集的荧光藻蓝蛋白液再上CM-Sepharose FF柱，用pH值5.5、浓度10～200mmol/L的乙酸缓冲液作梯度洗脱，然后将收集的荧光藻蓝蛋白再上一次羟基磷灰石柱，以pH值7.6、浓度10～100mmol/L的磷酸缓冲液作梯度洗脱，收集吸收峰在620nm处的荧光藻蓝蛋白部分，最后将收集的荧光藻蓝蛋白液上Sephadex G-100柱，用10mmol/L，pH值7.6的磷酸缓冲液洗脱，控制流速在5～10ml/min，收集荧光藻蓝蛋白部分。经A620/280双波长检测，色价比达4.5以上即为合格产品。G-100收集的荧光藻蓝蛋白液用聚乙二醇20000浓缩，浓缩液置冷冻室冷冻，然后置于冷冻干燥机上，干燥成蓝色粉末，总重量1800mg，A620/A280＞4.5。

Claims (1)

1.制备强荧光藻蓝蛋白的方法，其特征是控制温度在0～4℃下，包括以下步骤：
1)新鲜藻泥加入pH值7.0-7.6、浓度50mmol/L、含0.1～0.5mmol/LEDTA的磷酸缓冲液，冰浴超声波破，将破碎液离心后去沉淀，收集上清液；
2)分级盐析上清液，量取上清液体积，按30％饱和(NH4)2SO4计算用量，缓慢加入上清液中，加毕后静置8～12小时，离心、取上清，上清液再缓慢加至55％饱和度(NH4)2SO4，静置10小时以上，离心、留沉淀备用；
3)沉淀物用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸缓冲液溶解，上Sephadex G-25柱脱盐，用10mmol/L、pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸缓冲液洗脱，收集荧光藻蓝蛋白部分；
4)脱盐后的荧光藻蓝蛋白上预先用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0～0.5mol/LNaCl的10mmol/L、pH值7.0～7.6的磷酸缓冲液作线性梯度洗脱，流速控制在5～10ml/min，收集荧光藻蓝蛋白部分；
5)将步骤4)收集的荧光藻蓝蛋白部分上羟基磷灰石柱，用pH值7.0～7.6、浓度10～100mmol/L的磷酸缓冲液作梯度洗脱，收集吸收峰在620nm处的荧光藻蓝蛋白部分；
6)将步骤5)收集液再上CM-Sepharose FF柱，用pH值5～6、浓度10～200mmol/L的乙酸缓冲液作梯度洗脱，收集荧光藻蓝蛋白部分；
7)将步骤6)收集的荧光藻蓝蛋白部分再上羟基磷灰石柱，以pH值7.0～7.6、浓度10～100mmol/L的磷酸缓冲液作梯度洗脱，收集吸收峰在620nm处的荧光藻蓝蛋白部分；
8)将步骤7)收集的荧光藻蓝蛋白部分上Sephadex G-100柱，用10mmol/L、pH值7.0～7.6的磷酸缓冲液洗脱，控制流速在5～10ml/min，收集荧光藻蓝蛋白部分，经A620/280双波长检测，将色价比达4.5以上的荧光藻蓝蛋白液用聚乙二醇20000浓缩，浓缩液经冷冻、干燥，得本发明强荧光藻蓝蛋白。
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