CN107353337A

CN107353337A - 嗜热c‑藻蓝蛋白及从聚球藻属蓝细菌中提取的方法

Info

Publication number: CN107353337A
Application number: CN201710597354.2A
Authority: CN
Inventors: 梁园梅; 江东; 毛睿慈
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2017-07-20
Filing date: 2017-07-20
Publication date: 2017-11-17

Abstract

本发明公开了一种嗜热C‑藻蓝蛋白，其具有如序列1所示的氨基酸序列，并且该氨基酸序列的第21、28、33、37、42及145位中的不超过3个特征位置的氨基酸可调。本发明还提供了从聚球藻属蓝细菌中提取上述嗜热C‑藻蓝蛋白的方法。根据本发明的从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C‑藻蓝蛋白的方法，其获得的嗜热C‑藻蓝蛋白具有良好的热稳定性以及酸碱耐受力；相比现有技术中通过螺旋藻等提取的藻蓝蛋白，其良好的热稳定性和酸碱耐受力能够使得其在工业应用中具有更广泛的应用范围，表现出更为显著的应用优势。

Description

嗜热C-藻蓝蛋白及从聚球藻属蓝细菌中提取的方法

技术领域

本发明属于生化分离工程技术领域，具体地讲，涉及一种嗜热C-藻蓝蛋白、以及从聚球藻属蓝细菌中提取该种嗜热C-藻蓝蛋白的方法。

背景技术

聚球藻属蓝细菌是一种单细胞蓝藻生物，是蓝细菌门最重要的种属之一，在世界范围内被广泛研究。聚球藻属和原绿球藻属是水体微藻类最丰富的成员 (浓度可达10⁵cells·mL^-1～10⁶cells·mL^-1)，同时被认为是海洋地域中CO₂固定最重要的参与者。聚球藻属可存在多元的生境中，包括淡水，海水，淡盐水环境。一些聚球藻属种类的最佳生长温度为55℃～60℃，在如此高温环境下生长的蓝细菌依旧富含一种非常重要的藻胆蛋白。

C-藻蓝蛋白(C-Phycocyanin,C-PC)是藻类中具有非常重要生理活性的色素蛋白，是蓝藻藻胆蛋白中的一种，在藻体中主要以藻胆蛋白体的形式存在。C- 藻蓝蛋白作为天然色素蛋白在医药、食品加工、精细化工以及生物工程(免疫学和细胞生物学)等领域具有广泛的应用，其具有抗辐射、抗癌、免疫调节、促进造血和延缓衰老等功能。但是，目前市场上应用的C-藻蓝蛋白多来自于螺旋藻，多为常温蛋白，对温度耐受性比较低，从而导致在一些高温或对温度有要求的工业领域等应用中存在缺陷。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种嗜热C-藻蓝蛋白及从聚球藻属蓝细菌中提取该种嗜热C-藻蓝蛋白的方法，通过该方法提取获得的嗜热C-藻蓝蛋白具有良好的热稳定性以及酸碱耐受力，可具有更广泛的应用领域。

为了达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种嗜热C-藻蓝蛋白，具有如序列1所示的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列的第21、28、33、37、42及145位中的不超过3个特征位置的氨基酸可调。

本发明的另一目的在于提供一种从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C-藻蓝蛋白的方法，包括步骤：

S1、将聚球藻属蓝细菌置于Bg-11培养基中，在45℃～50℃的温度以及60 μmol·m^-2·s^-1～80μmol·m^-2·s^-1的光照强度下培养14d～20d，获得藻液；

S2、在培养期间每天监测OD730nm的生长情况，确定OD730nm为1时对应的藻液作为提取液；

S3、将所述提取液进行一次离心处理，去除第一上清液，获得藻细胞沉淀物；

S4、将所述藻细胞沉淀物置于PBS缓冲液中重悬，并过夜冻存，室温解冻后进行二次离心处理，保留第二上清液；其中，所述第二上清液中包括嗜热C- 藻蓝蛋白。

进一步地，在所述步骤S1中，将所述聚球藻属蓝细菌置于Bg-11培养基和水溶性碳酸氢盐溶液的混合溶液中。

进一步地，所述水溶性碳酸氢盐溶液的浓度为0.1mol·L^-1～0.3mol·L^-1。

进一步地，所述水溶性碳酸氢盐溶液为碳酸氢钠溶液。

进一步地，所述聚球藻属蓝细菌为蓝细菌PCC6715。

进一步地，所述步骤S3和S4在避光条件下进行。

进一步地，在所述步骤S3中，一次离心处理的时间为5min～10min。

进一步地，在所述步骤S3中，所述提取液的用量为1mL～5mL；在所述步骤S4中，所述PBS缓冲液的用量为4mL～20mL。

进一步地，在所述步骤S4中，过夜冻存的温度为-25℃～-20℃；二次离心处理的时间为5min～10min。

本发明通过简单的工艺即可从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C-藻蓝蛋白，该获得的嗜热C-藻蓝蛋白具有良好的热稳定性以及酸碱耐受力，具体来讲，其可在不超过60℃的环境中维持两周仍能保持不低于50％左右的活性，并且也可在较高温度(50℃左右)下在常规酸性及中性条件下保持活性、以及在弱碱条件下可以保持不低于30％的活性；相比现有技术中通过螺旋藻等提取的藻蓝蛋白，其良好的热稳定性和酸碱耐受力能够使得其在工业应用中具有更广泛的应用范围，表现出更为显著的应用优势。

附图说明

通过结合附图进行的以下描述，本发明的实施例的上述和其它方面、特点和优点将变得更加清楚，附图中：

图1是根据本发明的实施例1的嗜热C-藻蓝蛋白的结构图；

图2是根据本发明的实施例1的从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C-藻蓝蛋白的方法的步骤流程图；

图3是根据本发明的实施例1和实施例2的聚球藻属蓝细菌PCC6715的生长状况对比图；

图4是根据本发明的实施例1的从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C-藻蓝蛋白的方法获得的嗜热C-藻蓝蛋白在不同温度下的吸光度测试对比图；

图5是根据本发明的实施例1的从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C-藻蓝蛋白的方法获得的嗜热C-藻蓝蛋白在不同温度及时间下的相对活性测试对比图；

图6是根据本发明的实施例1的从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C-藻蓝蛋白的方法获得的嗜热C-藻蓝蛋白在不同温度及pH值下的相对活性测试对比图。

具体实施方式

以下，将参照附图来详细描述本发明的实施例。然而，可以以许多不同的形式来实施本发明，并且本发明不应该被解释为限制于这里阐述的具体实施例。相反，提供这些实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施例和适合于特定预期应用的各种修改。

将理解的是，尽管在这里可使用术语“第一”、“第二”等来描述各种物质，但是这些物质不应受这些术语的限制，这些术语仅用于将一个物质与另一个物质区分开来。同时，术语“一次”、“二次”等来描述各种操作，但是这些操作不应受这些这些术语的限制，这些术语仅用于将一个操作与另一个操作区分开来。

实施例1

本实施例提供了一种嗜热C-藻蓝蛋白，其具有如序列1所示的氨基酸序列以及图1中的结构。

值得说明的是，本实施例的嗜热C-藻蓝蛋白与由NCBI(即美国国立生物技术信息中心)查询到的P72509的嗜热藻蓝蛋白具有明显不同的氨基酸序列，这尤其表现在第21、28、33、37、42及145位的6个特征位置的氨基酸；在本实施例的嗜热C-藻蓝蛋白中，以上6个特征位置的氨基酸分别对应为天冬酰胺 (Asn,N)、天冬氨酸(Asp,D)、精氨酸(Arg,R)、丝氨酸(Ser,S)、精氨酸(Arg, R)和谷氨酰胺(Gln,Q)，而在P72509的嗜热藻蓝蛋白中，以上6个特征位置的氨基酸分别对应为丝氨酸(Ser,S)、苯丙氨酸(Phe,F)、谷氨酰胺(Gln,Q)、甘氨酸(Gly,G)、赖氨酸(Lys,K)和天冬氨酸(Asp,D)。由此，即认为若某个嗜热藻蓝蛋白的氨基酸序列中，若在上述至少4个特征位置处与本申请的氨基酸相同，则认为是与本实施例相同的蛋白质；也就是说，根据本实施例的嗜热C-藻蓝蛋白，其氨基酸序列的第21、28、33、37、42及145位中的不超过3 个特征位置的氨基酸是可调的，其可调度不超过3个特征位置的氨基酸。

本实施例还提供了从聚球藻属蓝细菌中提取上述嗜热C-藻蓝蛋白的方法，具体参照图2，该方法包括下述步骤：

步骤S1、将聚球藻属蓝细菌置于Bg-11培养基中进行培养，获得藻液。

具体来讲，该聚球藻属蓝细菌购买于法国巴黎巴斯德研究所蓝细菌保藏中心。

更为具体地，培养温度控制为45℃～50℃，光照强度控制为60μmol·m^-2·s^-1～80μmol·m^-2·s^-1，培养时间控制为14d～20d；本实施例中优选培养温度为45℃，光照强度为70μmol·m^-2·s^-1。

在本实施例中，该聚球藻属蓝细菌优选为蓝细菌PCC6715。

Bg-11培养基的组成如表1所示。

表1 Bg-11培养基的成分表

步骤S2、在培养期间每天监测OD730nm的生长情况，确定OD730nm为 1时对应的藻液作为提取液。

对藻液的吸光度对培养时间的变化进行分析，如图3所示；从图3中可以看出，培养10d左右即可达到OD730nm为1，后续期间即呈现平衡状态。

步骤S3、将提取液进行一次离心处理，去除第一上清液，获得藻细胞沉淀物。

具体来讲，取1mL～5mL提取液在10000×g的离心速度下进行一次离心处理，时间控制为5min～10min。

步骤S4、将藻细胞沉淀物置于PBS缓冲液中重悬，并过夜冻存，室温解冻后进行二次离心处理，保留第二上清液；第二上清液中包括嗜热C-藻蓝蛋白。

具体地，采用4mL～20mL的PBS缓冲液对步骤S3获得的藻细胞沉淀物进行重悬，并在-25℃～-20℃下过夜冻存，室温解冻后在10000×g的离心速度下进行二次离心处理，时间控制为5min～10min，由此，分离出的第二上清液中即含有嗜热C-藻蓝蛋白，即实现了从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C-藻蓝蛋白。

本实施例所使用的PBS缓冲液(pH＝7)的组成如表2所示。

表2 PBS缓冲液的成分表

优选地，为了降低上述嗜热C-藻蓝蛋白在分离提取过程中的光降解程度，上述步骤S3和S4在避光条件下进行。

本实施例获得的嗜热C-藻蓝蛋白的结构如图3所示，其具有如序列1所示的氨基酸序列。

在分离提取后，可通过测定OD615nm和OD652nm两个数值下嗜热C- 藻蓝蛋白的吸光度，并通过式1来预估嗜热C-藻蓝蛋白的质量。

在式1中，C_PC表示嗜热C-藻蓝蛋白的质量；A₆₁₅表示OD615nm的吸光度；A₆₅₂表示OD652nm的吸光度。

本实施例提取获得5.2256mg/mL的嗜热C-藻蓝蛋白。

对本实施例获得的嗜热C-藻蓝蛋白的热稳定性以及酸碱耐受力进行了测试。

热稳定性测试分为两组，第一组为分别在4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、 60℃、65℃、70℃、80℃以及90℃下保持5h，并测试了该嗜热C-藻蓝蛋白的吸光度及相对活性；测试结果分别如图4和图5所示。第二组为分别在4℃、25℃、 30℃、40℃、50℃、60℃、65℃以及70℃下保持两周，并测试了该嗜热C-藻蓝蛋白的相对活性；测试结果如图5所示。同时，利用chirascan圆二色性谱仪测定了该嗜热C-藻蓝蛋白的蛋白结构。

从图4中可以看出，在不超过65℃的温度下保持5h左右，该嗜热C-藻蓝蛋白仍能够在OD615nm处表现出良好的吸光度。

从图5中可以看出，各组之间活性变化不大，在50℃时仍能保持90％以上的活性，说明该嗜热C-藻蓝蛋白具有明显的温度耐受性，相比现有技术中由螺旋藻中提取的藻蓝蛋白的温度耐受范围要更广，由此也具有更显著的应用优势。通过chirascan圆二色性谱仪测定该嗜热C-藻蓝蛋白的蛋白结构，也发现其在上述温度变化下蛋白基本结构变化不大，也进一步印证了其基本可以保持活性。从图5中的两周数据可以看出，在65℃和70℃时活性破坏较大，基本属于失活状态，但在60℃下仍可以保持50％左右的活性，说明该嗜热C-藻蓝蛋白在不超过60℃的高温下仍能够保持良好的活性并维持两周之久，有利于其较长时间应用于耐热的环境中。

酸碱耐受力测试具体为将该嗜热C-藻蓝蛋白置于罗二氏缓冲液(pH范围为 4～12)中，该缓冲液的成分如表3所示，测试温度分别为4℃和50℃，并均保温测试4h；测试结果如图6所示。

表3罗二氏缓冲液的成分表

从图6可以看出，该嗜热C-藻蓝蛋白在4℃的温度下，在pH为4～12的缓冲溶液中基本能够保持90％以上的活性，在50℃的温度下，在pH为4～8的缓冲溶液中基本保持90％左右的活性，在pH大于9时活性显著下降；说明该嗜热 C-藻蓝蛋白在常规酸性及中性条件下都可以保持优异的活性，在弱碱条件下也可以保持30％以上的活性，这对工业应用反应中具有非常显著的优势。

实施例2

在实施例2的描述中，与实施例1的相同之处在此不再赘述，只描述与实施例1的不同之处。实施例2与实施例1的不同之处在于，在步骤S1中，将聚球藻属蓝细菌置于Bg-11培养基和水溶性碳酸氢盐溶液的混合溶液中进行培养；换句话说，在实施例2中，以Bg-11培养基和水溶性碳酸氢盐溶液的混合溶液作为复合培养基；其余参照实施例1中所述，获得了具有如序列1所示的氨基酸序列以及图1所述的结构的嗜热C-藻蓝蛋白。

优选地，该水溶性碳酸氢盐溶液的浓度为0.1mol·L^-1～0.3mol·L^-1；本实施例中优选为0.1mol·L^-1碳酸氢钠溶液。

在本实施例的嗜热C-藻蓝蛋白的提取过程中，同样对培养获得的藻液的吸光度对培养时间的变化进行分析，如图3所示；从图3中可以看出，采用本实施例的培养基能够使得生长速率较实施例1中显著提高，说明该聚球藻属蓝细菌菌株利用CO₂的能力比较强，由此可以节约培养成本。

虽然已经参照特定实施例示出并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解：在不脱离由权利要求及其等同物限定的本发明的精神和范围的情况下，可在此进行形式和细节上的各种变化。

<110> 北京大学深圳研究生院

<120> 嗜热C-藻蓝蛋白及从聚球藻属蓝细菌中提取的方法

<160> 1

<210> 1

<211> 162

<212> PRT

<213> C-Phycocyanin

<220>

<223> SEQ NO: 1

<400> 1

Met Lys Thr Pro Ile Thr Glu Ala Ile Ala

1 5 10

Ala Ala Asp Thr Gln Gly Arg Phe Leu Ser

15 20

Asn Thr Glu Leu Gln Ala Ala Asp Gly Arg

25 30

Phe Lys Arg Ala Val Ala Ser Met Glu Ala

35 40

Ala Arg Ala Leu Thr Asn Asn Ala Gln Ser

45 50

Leu Ile Asp Gly Ala Ala Gln Ala Val Tyr

55 60

Gln Lys Phe Pro Tyr Thr Thr Thr Met Gln

65 70

Gly Ser Gln Tyr Ala Ser Thr Pro Glu Gly

75 80

Lys Ala Lys Cys Ala Arg Asp Ile Gly Tyr

85 90

Tyr Leu Arg Met Val Thr Tyr Cys Leu Val

95 100

Ala Gly Gly Thr Gly Pro Met Asp Glu Tyr

105 110

Leu Ile Ala Gly Leu Ala Glu Ile Asn Ser

115 120

Thr Phe Asp Leu Ser Pro Ser Trp Tyr Val

125 130

Glu Ala Leu Lys Tyr Ile Lys Ala Asn His

135 140

Gly Leu Ser Gly Gln Ala Ala Val Glu Ala

145 150

Asn Ala Tyr Ile Asp Tyr Ala Ile Asn Ala Leu Ser

155 160 162

Claims

1.一种嗜热C-藻蓝蛋白，其特征在于，具有如序列1所示的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列的第21、28、33、37、42及145位中的不超过3个特征位置的氨基酸可调。

2.一种从聚球藻属蓝细菌中提取嗜热C-藻蓝蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

S1、将聚球藻属蓝细菌置于Bg-11培养基中，在45℃～50℃的温度以及60μmol·m^-2·s^-1～80μmol·m^-2·s^-1的光照强度下培养14d～20d，获得藻液；

S2、在培养期间每天监测OD 730nm的生长情况，确定OD 730nm为1时对应的藻液作为提取液；

S4、将所述藻细胞沉淀物置于PBS缓冲液中重悬，并过夜冻存，室温解冻后进行二次离心处理，保留第二上清液；其中，所述第二上清液中包括嗜热C-藻蓝蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤S1中，将所述聚球藻属蓝细菌置于Bg-11培养基和水溶性碳酸氢盐溶液的混合溶液中。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述水溶性碳酸氢盐溶液的浓度为0.1mol·L^-1～0.3mol·L^-1。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述水溶性碳酸氢盐溶液为碳酸氢钠溶液。

6.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，所述聚球藻属蓝细菌为蓝细菌PCC6715。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤S3和S4在避光条件下进行。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，一次离心处理的时间为5min～10min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述提取液的用量为1mL～5mL；在所述步骤S4中，所述PBS缓冲液的用量为4mL～20mL。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述步骤S4中，过夜冻存的温度为-25℃～-20℃；二次离心处理的时间为5min～10min。