CN104593333B - 稳定表达抗agr2人源化单克隆抗体的cho细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用。本发明提供一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株K70E10‑1D6，所述细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2014189。本发明所提供的CHO细胞株K70E10‑1D6能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体，且制备获得的抗AGR2人源化单克隆抗体能够与AGR2特异性结合，亲和力高达9.09×10⁸L/mol，并能够抑制乳腺癌细胞MCF7的生长。

Description

稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用。

背景技术

AGR2(Human anterior gradient-2,HAG-2)，又名人前梯度蛋白，是一种蛋白质的二硫键异构酶。AGR2是首先在1998年由Kuang W.等在表达雌激素受体的人乳腺癌细胞株中，通过比较筛选发现的一种生物学标记蛋白(Kuang W W,Thompson D A,Hoch R V,etc.Nucleic acids research,1998,26(4):1116-1123)。同年由Thompson A.和Weigel J.通过分子生物学方法得到全长的cDNA克隆，比较后发现其与非洲爪蟾的前梯度蛋白(Xenopus anterior gradient，XAG-2)同源，功能与蟾蜍的发育有关，并命名为AGR2(Thompson D A,Weigel R J.Biochemical and Biophysical Research Communications,1998,251(1):111-116.)。虽然人类的AGR2蛋白是XAG-2的同源物，但是与XAG-2不同的是，人的AGR2蛋白主要分布在由内胚层分化出的气管、肺部、胃部、结肠等部位，因此AGR2在人的正常组织发育中起着某些作用。虽然AGR2在正常组织中有表达，并具有生理功能，但是在肿瘤细胞中AGR2是一个相对于正常细胞更高度表达的分泌蛋白，AGR2能扰乱正常细胞的生长，促进肿瘤的形成、生长与转移。

因此，AGR2在肿瘤组织与正常组织中表达量存在差异，在正常细胞的生长、发育中起着重要的调节作用，也与肿瘤等疾病的发生、发展有密切关系。因此，AGR2是一个潜在的肿瘤治疗靶标。

单克隆抗体在肿瘤治疗中具有特异性强，副作用小的特点。由于AGR2能促进肿瘤的形成、生长与转移，抗AGR2单克隆抗体能够与AGR2特异性地结合，从而达到抑制肿瘤形成、生长与转移的治疗性效果。在公开号CN101519649的专利中，公布了一种能够分泌鼠源抗AGR2单克隆抗体的杂交瘤细胞株18A4及其制备方法。但是鼠源单克隆抗体具有较大的免疫原性，易产生不良反应。单克隆抗体经人源化改造后，能够解决以上问题。因此抗AGR2人源化单克隆抗体具有成为潜在抗肿瘤药物的前景。

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是较为成熟的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，具有多年的实践运用经验。CHO细胞易于大规模培养，外源基因易于稳定整合入细胞的基因组，在表达外源蛋白中具有较大优势。

筛选稳定表达单克隆抗体的CHO细胞株，目前有多种方式报道，如共转染带有抗性的载体、转染营养缺陷性的细胞株、基于荧光的可视化筛选系统等。抗性筛选系统包括G418抗性、嘌呤霉素抗性等。绿色荧光蛋白作为可视化筛选系统的代表有着广泛的应用，如转染pEGFP载体(美国专利，No.5625048)可将目的基因与绿荧光蛋白EGFP融合表达，通过观察可以根据绿荧光的强弱有选择性的确定目的蛋白的表达高低。通过将抗性筛选系统和绿色荧光蛋白的可视化筛选系统整合，组合成筛选标签，则综合了两者的优势。

但是，可视化筛选系统的不足在于，绿色荧光蛋白不是目标产物，可能影响目标蛋白的表达效率，同时绿色荧光蛋白也属于杂质，需要通过合适的方法予以去除。现有的去除绿色荧光蛋白的方法，如Cre重组酶系统等，需要在稳定细胞株上另外转染质粒，存在引入外源质粒的风险。能否不通过另外转染质粒，就达到除去细胞株中绿色荧光蛋白的目的，是可视化筛选系统急需解决的问题之一。

综上所述，AGR2是潜在的肿瘤治疗靶标，抗AGR2人源化单克隆抗体解决了鼠源抗体免疫原性的问题，具有成为潜在抗肿瘤药物的前景。抗AGR2人源化抗体的表达和制备成为需要突破的技术问题，也是抗AGR2人源化抗体成为候选抗肿瘤药物的必要条件。CHO细胞具有表达外源蛋白的优势，且易于大规模培养。抗性筛选系统与基于荧光的可视化筛选系统整合而成的筛选标签综合了两者的优势，有利于稳定细胞株的筛选。筛选完成后，需要解决不通过另外转染质粒而除去绿色荧光蛋白。因此，开发CHO细胞株能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体具有良好的应用前景和经济价值，并能解决上述技术问题。

目前，现有技术中尚无能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株报道，也没有将CHO细胞株用于抗AGR2人源化单克隆抗体制备的应用报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/K70E10-1D6，所述细胞株的保藏号为：CCTCC NO：C2014189。

该细胞株已于2014年10月10日在中国典型培养物保藏中心(地址：武汉市武汉大学)注册保藏，保藏号为CCTCC NO：C2014189，名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/K70E10-1D6。

本发明所述的CHO细胞株，能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体，具体为该细胞株能够分泌表达抗AGR2人源化单克隆抗体到细胞培养上清液中，所分泌的抗体能够通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测。该细胞株在细胞数倍增1-40次后，抗体的表达水平稳定，即在相同的培养条件下，细胞数倍增1-40次后，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测，细胞培养上清液中抗体浓度保持在1-5mg/L。

本发明所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株，其宿主细胞为CHO-S细胞，带有绿色荧光和嘌呤霉素抗性作为筛选标签，该筛选标签能够通过转染DNA片段cre plasmid-free的方法删除；基因组中带有能够被确认的特征序列。

具体来说，所述绿色荧光标签能够在荧光显微镜下显著地观察到；通过流式细胞仪的FITC-H通道检测，处于对数生长期的该细胞株的绿色荧光强度与宿主细胞CHO-S有显著的差异。通过转染序列为SEQ No.1的DNA片段cre plasmid-free，能够除去该细胞株的绿色荧光蛋白。该细胞株基因组中带有的如SEQ No.2所示的特征序列能够用PCR法进行扩增，并用测序的方法予以确认。

本发明第二方面提供所述细胞株在制备抗AGR2人源化单克隆抗体中的应用。

本发明所述的CHO细胞株能够运用于抗AGR2人源化单克隆抗体的制备，使用无血清培养基长时间培养该细胞株，通过酶联免疫吸附法(ELISA)、HPLC检测，细胞培养上清液中抗体表达浓度可达10-100mg/L。使用亲和纯化的方式，能够从细胞培养上清液中纯化抗AGR2人源化单克隆抗体。

本发明第三方面提供一种抗AGR2人源化单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO：C2014189的CHO细胞株或其传代细胞株分泌产生。

本发明所述的CHO细胞株K70E10-1D6制备的抗AGR2人源化单克隆抗体能够与AGR2特异性结合，并能够被免疫印迹法(Western Blot)检测，通过竞争性ELISA法检测，该抗体与AGR2的亲和力为9.09×10⁸L/mol。

本发明第四方面提供所述稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株和所述抗AGR2人源化单克隆抗体在制备检测试剂或诊断试剂中的应用。

本发明第五方面提供所述稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株和所述抗AGR2人源化单克隆抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的应用。

优选的，所述肿瘤为乳腺癌。

如上所述，本发明所提供的抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株K70E10-1D6能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体，且制备获得的抗AGR2人源化单克隆抗体能够与AGR2特异性结合，亲和力高达9.09×10⁸L/mol，并能够抑制乳腺癌细胞MCF7的生长。

附图说明

图1是CHO细胞株K70E10-1D6每一代的第2天细胞密度曲线；

图2是CHO细胞株K70E10-1D6每一代的第2天时的抗体表达量曲线；

图3是CHO细胞株K70E10-1D6的细胞倍增次数-抗体表达量曲线；

图4是CHO细胞株K70E10-1D6的放大100倍的荧光照片；

图5是CHO细胞株K70E10-1D6和CHO-S细胞用流式细胞仪的FITC-H通道检测绿色荧光；

图6是通过PCR扩增DNA片段cre plasmid-free的琼脂糖凝胶电泳图；

图7是CHO细胞株K70E10-1D6转染DNA片段cre plasmid-free前和转染24小时后的荧光照片；

图8是通过PCR扩增CHO细胞株K70E10-1D6基因组的特征序列片段；

图9是CHO细胞株K70E10-1D6的长时间培养时不同时间点的细胞密度曲线和对应的抗体表达量；

图10是CHO细胞株K70E10-1D6上清液在Protein A和Protein G纯化时各阶段液体中抗体浓度的检测；

图11(a)是使用Protein A-HPLC检测K70E10-1D6培养液中的抗体浓度结果，图11(b)是人源化单克隆抗体的标准品的拟合直线；

图12是CHO细胞株K70E10-1D6表达的抗体与AGR2结合的免疫印迹检测；

图13是CHO细胞株K70E10-1D6表达的抗体的亲和力检测；

图14是CHO细胞株K70E10-1D6表达的抗体抑制乳腺癌细胞MCF7的生长。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

CHO细胞株K70E10-1D6表达抗AGR2人源化单克隆抗体的稳定性检测

1实验方法

(1)细胞株的连续传代

将保藏号为CCTCC NO：C2014189的CHO细胞株K70E10-1D6按照3×10⁵个/ml接种到4ml体系中，该体系是在6孔细胞培养板中，培养基为CD CHO Serum-FreeMedium for CHO Cells(Sigma-Aldrich)，加入终浓度为8mM的谷氨酰胺、加入40μl的Anti-clumping Agent。由于该细胞株含有嘌呤霉素抗性标签，需要平行做两份，其中一份加入终浓度为10μg/ml的嘌呤霉素。放置在37℃，相对湿度70-80％，5％二氧化碳细胞培养箱中的摇床上培养，转速为：125±5rpm。

培养2天后观察细胞生长情况，计数。计数时先取50μL，加入50μL的0.4％台盼蓝染色液，而后加150μL的PBS溶液稀释，用血细胞计数板进行计数。每次记录活细胞数、死细胞数(被台盼蓝染成蓝色的为死细胞)，计算重悬到1ml后重新接种为3×10⁵个/ml浓度所需要的体积。计数后，通过1000rpm离心5分钟收集所有细胞，移除所有上清留样，加入1ml新鲜的培养基重悬，按照计算后的体积接种入一个新的6孔细胞培养板。如此操作记为传1代。

(2)细胞培养上清液中抗体浓度的检测

按照以上方法培养K70E10-1D6细胞株的各代上清液收获后，按照酶联免疫吸附法(ELISA法)测定各代上清液中的抗AGR2人源化单克隆抗体的浓度。测定的方法如下。

包被抗原：抗原(AGR2-MBP)用抗原包被液(pH＝9.6)稀释至5μg/ml，用多道移液器(Thermo Scientific)每孔加入100μL，用自封袋封口，4℃过夜，次日弃去全部液体，用PBS-T洗3遍，每孔200μL，每遍3分钟，拍干。

封闭：配置封闭液，用多道移液器(Thermo Scientific)每孔加入200μL，用自封袋封口，4℃过夜，次日弃去全部液体，用PBS-T洗3遍，每孔200μL，每遍3分钟，拍干。

ELISA检测：

1)将待测样品(CHO细胞株K70E10-1D6的细胞培养上清液)、标准品(1μg/ml的抗AGR2人源化单克隆抗体标准品)均经抗体稀释液梯度稀释后，加入板中，每孔100μL设置阴性对照(举例：细胞培养基)，用抗体稀释液作为空白对照。可以做几个平行孔以减小误差，用自封袋封口，4℃过夜。

2)次日将液体弃去，用PBS-T洗3遍，每孔200μL，每遍3分钟，拍干。

3)拍干后加入用二抗稀释液以1:10000的比例配置的二抗(goat-anti human IgGH+L HRP conjugate，Protein Tech)，每孔100μL，用自封袋封口，37℃孵育1小时。

4)将上述液体弃去，用PBS-T洗3遍，每孔200μL，每遍3分钟，拍干。

5)每孔加入底物显色液A、底物显色液B各80μL，用自封袋封口，于37℃显色30-60分钟，最后每孔加入50μL的终止液。用酶标仪在450nm处读数，并拍照或扫描保存结果。

数据处理：

1)用阴性对照和空白对照的平均值作为本底值，测得数据减去本底值即为真实值。

2)以不同稀释梯度标准品的抗体浓度作为横坐标，以不同稀释梯度标准品对应的真实值作为纵坐标，作图，在一定范围内拟合出线性的标准曲线，并使得R²>0.95，由此获得标准曲线的拟合公式，此范围成为线性范围。

3)在待测样品的真实值中寻找3个在线性范围内的值，代入拟合公式，计算出的浓度乘以待测样品的稀释倍数，最后取平均值，即为待测样品中抗AGR2人源化单克隆抗体的浓度。

(3)数据处理

以传代次数为横坐标，绘制每一代的生长2天后细胞数的变化曲线、每一代的生长2天后的抗体表达量曲线。

将传代次数换算成细胞倍增次数，换算方法如下所示。该公式中，细胞密度的单位是10⁶个/ml，n指传代次数。

以细胞倍增次数为横坐标，绘制抗体表达量曲线。

2实验结果

如图1显示的是CHO细胞株K70E10-1D6每一代的第2天细胞密度曲线。细胞株K70E10-1D6经过连续传代后，每一代的细胞培养至第2天传代时会统计活细胞数。通过将第2天的细胞密度对传代数目作图，能够分析K70E10-1D6在生长上的稳定性。如图1显示，K70E10-1D6在目前的培养条件和接种密度下，培养2天获得的活细胞数约为1-1.5×10⁶个/ml，加入和不加嘌呤霉素组之间没有显著性差别，说明CHO细胞株K70E10-1D6的生长在传代30次内是稳定的。

通过图1显示的数据还可以计算得，在以上的连续传代过程中，K70E10-1D6的细胞数同比倍增了40次。

如图2显示的是CHO细胞株K70E10-1D6每一代的第2天时的抗体表达量曲线。细胞株K70E10-1D6经过连续传代后，每一代的细胞培养至第2天传代时收取上清，用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定抗体表达量。通过将第2天的抗体表达量对传代数目作图，能够分析K70E10-1D6在抗体表达量上的稳定性。如图2显示，K70E10-1D6在目前的培养条件和接种密度下，培养2天获得的抗体表达量约为1-5mg/L，加入和不加嘌呤霉素组之间没有显著性差别，说明CHO细胞株K70E10-1D6的抗体表达量在传代30次内是稳定的。

由于图2所显示的抗体表达量是通过酶联免疫吸附法(ELISA法)在K70E10-1D6细胞培养上清液中测得的，因此也说明K70E10-1D6能够分泌抗AGR2人源化单克隆抗体到细胞培养上清液中。

如图3显示的是CHO细胞株K70E10-1D6的细胞倍增次数-抗体表达量曲线。图3所示曲线是由图1、图2数据将传代次数换算成细胞倍增次数后得到的。如图3所示的曲线，更清晰地反映了K70E10-1D6细胞株在不同细胞倍增次数时的抗体表达量的变化。

从图3显示的曲线分析，含有和不含有嘌呤霉素的K70E10-1D6细胞株在细胞数倍增40次后，抗体表达量稳定在1-5mg/L，两条曲线没有显著性差异，各倍增次数所对应的抗体表达量间也没有显著性差异。以上结果表明CHO细胞株K70E10-1D6在细胞数倍增40次后，依然具有良好的抗体表达的稳定性。

实施例2

CHO细胞株K70E10-1D6带有的绿色荧光标签的检测

1实验方法

(1)荧光显微镜观察

CHO细胞株K70E10-1D6在对数生长期(一般为接种后的第2-3天)，将细胞悬液取出加入10mm细胞培养皿中，用倒置荧光显微镜观察绿色荧光情况。在放大40倍的情况下可以观察到绿色荧光，放大100倍拍摄绿色荧光照片，同时拍摄相同位置的白光照片作为对照。

(2)流式细胞仪检测

将CHO细胞株K70E10-1D6和CHO-S细胞按照3×10⁵个/ml的密度分别接种到10mm皿中，培养基体系10ml，加入终浓度为8mM的谷氨酰胺、加入40μL的Anti-clumping Agent。在125rpm的摇床上培养3天后，进入对数生长期，取细胞悬液并计数，细胞密度应达到1×10⁶个/ml以上，将细胞再用移液管吹匀，取1ml进行检测。

取1ml的CHO-S细胞悬液，使用流式细胞仪进行检测，检测通道为FITC-H，调节电压使得细胞群集中在合适的位置，并调节荧光强度至基线位置(所有细胞的荧光强度在10¹-10²之间)。

取1ml的K70E10-1D6细胞悬液，按照相同的参数用流式细胞仪检测，通道为FITC-H。

分别输出两种细胞的散点图和FITC-H通道的峰型图。

2实验结果

如图4显示的是CHO细胞株K70E10-1D6的在荧光显微镜下观察，放大100倍时拍摄的荧光照片，并且有相同位置的白光照片作为对照。如图4显示，该细胞株处于对数生长期，通过照片可以观察到大部分细胞有明亮的绿色荧光。

如图5显示的是CHO细胞株K70E10-1D6和CHO-S细胞用流式细胞仪的FITC-H通道检测绿色荧光，所得到的散点图和FITC-H通道的峰型图。从图5可以定性地观察到，CHO细胞株K70E10-1D6与CHO-S所显示的峰型有显著差异；进一步地，CHO细胞株K70E10-1D6大部分细胞的荧光强度在10²-10⁴之间，而阴性对照CHO-S的所有细胞的荧光强度在10¹-10²之间。综上所述，经流式细胞仪检测，CHO细胞株K70E10-1D6相对于CHO-S有显著的绿色荧光。

实施例3

通过转染DNA片段cre plasmid-free除去CHO细胞株K70E10-1D6细胞株的绿色荧光

1实验方法

(1)DNA片段cre plasmid-free的制备

使用PCR法进行DNA片段cre plasmid-free的制备的模板为：pBS185质粒，使用如下的引物：

Sense:GCCAAGCTTGGCCCATTGCATACG(SEQ No.3)

Anti-sense:GAGGAAGCTTATGGGATATAGCTTG(SEQ No.4)

94℃预变性2min后进入循环，PCR反应的循环条件如下所示：

完成PCR扩增后，每份产物取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，确定DNA片段creplasmid-free的大小，如果该DNA片段在，并被成功扩增，应在3300bp位置看到明亮的条带。

将全部PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)的操作说明，进行切胶回收，回收大小约3300bp的明亮条带。将回收产物进行测序确认(上海华津生物科技有限公司)。

将测序结果与理论序列进行比对，如SEQ:No.1所示。

(2)转染DNA片段，荧光显微镜观察

测定纯化后的DNA片段的浓度，将培养至对数生长期的CHO细胞株K70E10-1D6取出，1000rpm常温离心5分钟，弃上清，用含有10％胎牛血清的DMEM重悬，按照5×10⁵个/皿的密度铺2个10mm平皿。培养3小时等待细胞贴壁，用倒置荧光显微镜观察两皿细胞的绿色荧光情况。放大100倍拍摄荧光照片，同时拍摄相同位置的白光照片作为对照。

取无血清培养基各1ml，在一份中加入12μg的DNA片段cre plasmid-free，在另一份中加入36μg的转染试剂PEI；将两份液体混合，静置常温孵育10分钟，保证DNA和转染试剂的质量比为1:3。在孵育期间，弃去两皿细胞中的液体，用PBS洗一遍，而后将混合后的转染液加入一皿细胞中，补加无血清培养基至10ml，另一皿直接加入10ml无血清培养基。

培养12小时后，将两皿细胞的液体换为含有10％胎牛血清的DMEM，继续培养24小时，用倒置荧光显微镜观察两皿细胞的绿色荧光情况。放大100倍拍摄荧光照片，同时拍摄相同位置的白光照片作为对照。

2实验结果

如图6显示的是通过PCR扩增DNA片段cre plasmid-free的琼脂糖凝胶电泳图。

如图6显示，泳道1和11是分子量Marker，泳道2-8是PCR扩增的产物，即DNA片段creplasmid-free，泳道9-10是模板pBS185质粒。如图6的电泳照片显示，泳道2-8在3300bp附近位置观察到明亮的条带，泳道9-10在5000bp附近位置观察到条带。将泳道2-8的3300bp附近位置的明亮条带切胶回收纯化后，通过测序比对，其长度为3341bp，序列均如SEQ:No.1所示。

如图7显示的是CHO细胞株K70E10-1D6转染DNA片段cre plasmid-free前和转染24小时后的荧光照片。

如图7显示，转染前K70E10-1D6细胞株有明显的绿色荧光，转染DNA片段creplasmid-free的24小时后，细胞的绿色荧光基本消失，与转染前的荧光照片有显著的差异。以上结果说明了转染DNA片段cre plasmid-free能够去除CHO细胞株K70E10-1D6的荧光，能够解决基于荧光的可视化筛选系统所存在的荧光蛋白残留问题。

实施例4

CHO细胞株K70E10-1D6基因组中的特征序列的检测

1实验方法

(1)细胞株基因组的提取

首先，需要配制以下溶液。

10×GB：670mM Tris,PH＝8.8

166mM Ammonium Sulfate

65mM MgCl₂

10×proteinase K:称取10mg proteinase K溶解在1ml去离子水中。

收集对数生长期的CHO细胞株K70E10-1D6、宿主细胞CHO-S，重悬在新鲜的培养基中，每份细胞数为1×10⁶个，4000rpm转速4℃离心5分钟，离心后除去上清，用PBS重悬后洗1遍，4000rpm转速4℃离心5分钟。

弃上清，每份样品加入50μL消化液(1×GB，1％β-巯基乙醇，0.5％Triton X-100)，重悬，将液体转移到干净的微量离心管中。

在PCR仪上，95℃消化5分钟，加入5μL的10×proteinase K，55℃消化1小时。将微量离心管涡旋震荡后，使沉淀重悬，55℃继续消化1小时，95℃消化5分钟。

将微量离心管高速离心，取上清液保存在-20℃，即为细胞株的基因组提取物。

(2)特征序列的扩增

进行特征序列扩增的样品为：细胞株构建使用的载体，CHO-S基因组提取物，CHO细胞株K70E10-1D6基因组提取物。

第一次扩增，使用如下的引物：

Fc-out-sense CACAACCATGGACTGGACCTGGAGC(SEQ No.5)

Fc-out-anti GATGAGGAAGAGCGTTTCTATTTAC(SEQ No.6)

94℃预变性2min后进入循环，PCR反应的循环条件如下所示。

第二次扩增以第一次扩增的PCR产物为模板进行，使用如下的引物：

Fc-in-sense GACTACTGGGGTCAAGGCACACTGG(SEQ No.7)

Fc-in-anti CTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG(SEQ No.8)

94℃预变性2min后进入循环，PCR反应的循环条件如下所示。

完成第二次扩增后，每份产物取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，确定特征片段的大小，如果特征片段存在，并被成功扩增，应在1000bp位置看到明亮的条带。

(3)测序确认和比对

将全部PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)的操作说明，进行切胶回收，回收大小约1000bp的明亮条带。将回收产物进行测序确认(上海华津生物科技有限公司)。

对比细胞株构建使用的载体、K70E10-1D6细胞株基因组扩增获得的特征片段的序列是否一致，并与理论序列进行比对，如SEQ:No.2所示。

2实验结果

如图8显示的是通过PCR扩增CHO细胞株K70E10-1D6基因组的特征序列片段，即通过PCR法扩增获得的产物的1％琼脂糖凝胶电泳照片。

如图8显示，泳道1是分子量Marker，泳道2是构建细胞株用载体的阳性对照，泳道3是宿主细胞CHO-S的基因组提取物，泳道4是添加嘌呤霉素培养的细胞株K70E10-1D6基因组提取物，泳道5是不添加嘌呤霉素培养的细胞株K70E10-1D6基因组提取物。如图5的电泳照片显示，泳道2、泳道4和泳道5在1000bp附近位置观察到明亮的条带，而泳道3在这个位置没有此条带。

将泳道2、泳道4和泳道5的1000bp附近位置的明亮条带切胶回收纯化后，通过测序比对，其序列均如SEQ:No.2所示。因此，细胞株K70E10-1D6的基因组中带有SEQ:No.2所示的特征序列。

实施例5

使用CHO细胞株K70E10-1D6制备抗AGR2人源化单克隆抗体

1实验方法

(1)CHO细胞株K70E10-1D6的长时间培养

将CHO细胞株K70E10-1D6按照3×10⁵个/ml接种到15ml体系中，该体系在带有盖子的125ml锥形瓶中，培养基为CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells(Sigma-Aldrich)，加入终浓度为8mM的谷氨酰胺、加入150μl的Anti-clumping Agent。接种后立即计数以确定实际的接种密度。将培养瓶的盖子拧松，放置在37℃，相对湿度70-80％，5％二氧化碳细胞培养箱中的摇床上培养，转速为：125±5rpm。

培养2天开始每天或者每隔2-3天观察细胞生长情况，计数。计数时先取50μL，加入50μL的0.4％台盼蓝染色液，而后加150μL的PBS溶液稀释，用血细胞计数板进行计数。每次记录活细胞数、死细胞数(被台盼蓝染成蓝色的为死细胞)。计数的同时需要取样，每次取上清800μL留样按照酶联免疫吸附法(ELISA法)检测抗体表达量。取样后补加培养基以维持体系的体积为15ml。

补料工艺：从第3天开始每两天进行一次补料，补料为CHO补料生物反应器补充物(Sigma-Aldrich)，每次补料的体积为150μL；同时补充D-(+)-葡萄糖溶液，每次补料的体积为150μL。

绘制生长曲线：通过每天获得的活细胞数、活力绘制细胞株的生长曲线，并在同一坐标上用柱状图表示抗体表达量的随时间的变化情况。

当细胞活力不足30％时，收取细胞培养上清液至50ml离心管，2000rpm转速4℃低温离心10分钟，将上清液转移至新的50ml离心管后，在-20℃保存。

(2)从细胞培养上清液中纯化抗AGR2人源化单克隆抗体

采用Protein A进行抗体亲和纯化：将CHO细胞株K70E10-1D6的长时间培养获得的细胞培养上清液2000rpm转速4℃低温离心10分钟后用0.45μm的滤膜进行过滤，除去细胞碎片等杂质备用。对MabSelect Protein A材料进行预处理，除去乙醇后，用PBS洗2遍，取1ml的材料装入商品化的亲和柱。

用亲和柱材料体积5倍的Binding buffer平衡柱材料。期间将过滤后的培养液与binding buffer按体积比1:1混合。平衡完成后进行上样，收集流出液。样品完全通过柱后，用5ml Elution buffer洗脱，每管收集一毫升洗脱液。洗脱后，用10体积的Elution buffer再生柱材，再用5体积的Binding buffer洗涤柱材，最后用1％叠氮钠在4度保存。用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测上样、流穿液、洗脱液等中的抗体浓度。

采用Protein G进行抗体亲和纯化：将CHO细胞株K70E10-1D6的长时间培养获得的细胞培养上清液2000rpm转速4度低温离心10分钟后用0.45μm的滤膜进行过滤，除去细胞碎片等杂质备用。对Protein G Agarose材料进行预处理，除去乙醇后，用PBS洗2遍，取1ml的材料装入商品化的亲和柱。

用亲和柱材料体积5倍的Binding buffer平衡柱材料。期间将过滤后的培养液与binding buffer按体积比1:1混合。平衡完成后进行上样，收集流出液。样品完全通过柱后，用5ml Elution buffer洗脱，每管收集一毫升洗脱液。洗脱后，用10体积的Elution buffer再生柱材，再用5体积的Binding buffer洗涤柱材，最后用1％叠氮钠在4℃保存。用酶联免疫吸附法

(ELISA法)检测上样、流穿液、洗脱液等中的抗体浓度。

2实验结果

图9显示的是CHO细胞株K70E10-1D6的长时间培养时不同时间点的细胞密度曲线和对应的抗体表达量。

图9表明，K70E10-1D6在15ml摇瓶体系中，在3×10⁵个/ml的接种密度和上述的培养条件下，在接种后2天，细胞密度为1.08×10⁶个/ml，符合图1所显示的稳定性研究时培养2天所获得的细胞密度；对应的抗体表达量为2.94mg/L，符合图2所显示的稳定性研究时培养2天所获得的抗体表达量。在接种后4天达到最大细胞密度，为3.02×10⁶个/ml，对应的抗体表达量提升至4.49mg/L。在接种后的5-11天，细胞密度出现连续的下降，至接种后8天降至1.06×10⁶个/ml，接种后11天降至7.6×10⁵个/ml；但是同时抗体的表达量提升显著，接种后8天为6.69mg/L，接种11天后为9.33mg/L。在接种后的第13天收取全部上清液，细胞密度为4×10⁵个/ml，对应的抗体表达量为10.63mg/L。

从图9的数据分析可知，在上述的培养条件下，CHO细胞株K70E10-1D6的长时间培养能够获得10mg/L左右的抗体表达水平。细胞在接种后，需要一定时间的生长，以达到最大的密度，而后的细胞密度维持时或者下降的区间是表达抗体的重要时间，抗体表达量在后期提升明显，显示了该细胞株的表达人源化单克隆抗体的潜力。

图10显示的是CHO细胞株K70E10-1D6上清液使用Protein A和Protein G进行亲和纯化时，收获各阶段的液体，通过酶联免疫吸附法(ELISA法)检测其中的抗体浓度所获得的结果。纯化的各阶段液体包括：细胞培养上清液、用binding buffer按1:1的比例稀释过的上清液、流穿液、洗脱液E1-E5(按照1毫升/管收集)、再生液等。每一个样品均检测原液、稀释10倍、稀释100被、稀释1000倍的抗体浓度。

从图10显示的结果分析，以0.1mg/L的标准抗AGR2人源化单克隆抗体为阳性对照，上清液和稀释后的上清液中均含有抗体，Protein A和Protein G柱的流穿液中抗体含量很低，仅分别为0.01mg/L和0.08mg/L；而洗脱液E2中含有高浓度的抗体，分别达到26.08mg/L和26.12mg/L。以上结果说明，CHO细胞株K70E10-1D6上清液中的抗体能够与Protein A或Protein G结合，并能被洗脱，即可以使用亲和纯化的方法纯化。

实施例6

使用Protein A-HPLC检测K70E10-1D6培养液中的抗体浓度

1实验方法

开启带有Protein A亲和纯化柱的HPLC仪器，使用缓冲液平衡仪器，使紫外检测器达到基线状态。取K70E10-1D6长时间细胞培养上清液100μL，进样，而后等待HPLC运行，15分钟内检出所有峰。

按照相同的方法，取新鲜培养基100μL作为阴性对照。

按照相同的方法，取不同浓度的人源化单克隆抗体标准品作为阳性对照，以人源化单克隆抗体的标准品的浓度为横坐标，获得的峰高为纵坐标作图，拟合直线。

将K70E10-1D6长时间培养细胞上清液的HPLC图与对照进行比对，识别出人源化单克隆抗体所对应的峰，通过仪器读出该峰的峰高，代入拟合直线的方程，即可获得K70E10-1D6长时间培养细胞上清液中抗AGR2人源化单克隆抗体的浓度。

2实验结果

如图11显示的是使用Protein A-HPLC检测K70E10-1D6培养液中的抗体浓度，图11中显示结果由培养基、K70E10-1D6长时间细胞培养液的HPLC峰图，以及抗体标准品获得的拟合标准曲线组成。

如图11显示，培养基在保留时间为0.475分钟有一个明显的峰。K70E10-1D6长时间细胞培养上清液在保留时间0.450分钟有一个明显的峰，该峰的保留时间与培养基中相近。K70E10-1D6细胞培养液中，与培养基明显不同的是，在保留时间4.942分钟处有一个明显的单峰，而相同条件下空白培养基中并没有这个峰存在，这与人源化单克隆抗体标准品所获得的抗体峰保留时间一致。

因此，图11中K70E10-1D6长时间培养上清液通过HPLC分离，获得的4.942分钟处的峰为抗AGR2人源化单克隆抗体所形成的特征峰。该抗体峰的峰高为12.209。

如图11显示，通过人源化单克隆抗体标准品获得的峰高-浓度标准曲线的方程为y＝176.90x-7.4912，R²为0.9991，方程中y为峰高，x为抗体浓度(单位：mg/ml)。将K70E10-1D6上清液中抗体峰的峰高代入拟合曲线方程，计算得K70E10-1D6长时间培养上清液中的抗体浓度为111.3mg/L。

实施例7

使用CHO细胞株K70E10-1D6制备的抗体性质的检测

1实验方法

(1)免疫印迹检测抗体与AGR2的结合

制备12％的分离胶。样品主要有AGR2-MBP和AGR2-His梯度稀释液(浓度分别为25ng/μl、20ng/μl、15ng/μl、10ng/μl、5ng/μl)，以及MCF7细胞、SKOV3细胞裂解液，以上样品分别加入五分之一体积的loading buffer，在电热恒温水浴锅中95度水浴加热5分钟，即完成样品制备。

在电泳槽中加入适量1×running buffer，依次上样，上样完成后，进行电泳，浓缩胶时电压80V，分离胶时电压120V。

在电泳期间准备PVDF膜，剪成合适的大小，在正面用签字笔写上日期，用甲醇润湿后，用Blotting Buffer在脱色摇床上置换，直至PVDF膜不疏水。

电泳结束后，取下分离胶，将分离胶和PVDF膜用夹子固定，两边用已润湿的滤纸贴紧，固定在转移槽上。在Blotting buffer中加入20％的甲醇，开始转移蛋白，300mA转移40分钟。

转移时，配置用TNET缓冲液配置5％的牛奶溶液，转移完成后，将膜充分浸入牛奶中4度封闭过夜。

第二日取出PVDF膜，用TNET缓冲液洗去牛奶，用5％的BSA溶液将K70E10-1D6细胞培养上清液纯化后获得的抗体稀释100倍作为一抗，在脱色摇床上用二抗室温孵育1小时，用TNET缓冲液洗3遍，每遍10分钟。

用5％的BSA溶液按照1:10000的比例配置二抗，抗体选用goat-anti human IgG H+L HRP conjugate(Protein Tech)，在脱色摇床上用二抗室温孵育1小时，用TNET缓冲液洗3遍，每遍10分钟。

各取400μL的ECL底物A和缓冲液B充分混合后，浸润膜的正面，在X光显影暗盒上固定后，尽快在暗室中显影，曝光时间3-10分钟，显影时间3分钟，定影时间3分钟。

(2)竞争性ELISA法检测抗体与AGR2结合的亲和力

将AGR2-MBP融合蛋白用抗原包被液(PH＝9.6)稀释至终浓度5μg/ml，每孔加入100μL，4度过夜。次日将液体弃去，用PBS-T洗3遍，每孔200μL，每遍3分钟。拍干后加入浓度为5％的BSA封闭液，每孔200μL，4度过夜。次日将液体弃去，用PBS-T洗3遍，每孔200μL，每遍3分钟，拍干后可用。

将AGR2-His融合蛋白稀释至1μM的浓度，而后以10倍梯度稀释9-11个浓度，与0.2μg/ml的经纯化的K70E10-1D6细胞株表达的人源化抗体按照体积比1:1混合后，在试管翻转器上4度反应过夜。

将反应后的液体加入已经包被好AGR2-MBP的板中，每孔100μL，以0.1μg/ml的抗AGR2人源化单克隆抗体作为阳性对照，抗体稀释液作为空白对照，4℃过夜。次日将液体弃去，用PBS-T洗3遍，每孔200μL，每遍3分钟。拍干后加入用0.5％的BSA溶液按照1:10000的比例配置的二抗(goat-anti human IgG H+L HRP conjugate，Protein Tech)，每孔100μL，37℃孵育1小时。将上述液体弃去，用PBS-T洗3遍，每孔200μL，每遍3分钟。加入显色液A、显色液B各80μL，于37℃显色15分钟，最后加入50μL的2mol浓硫酸终止反应。用酶标仪在450nm处读数。

数据处理用GraphPad Prism 5，将各样品的吸光度减去空白对照后，计算各样品的吸光值与阳性对照的吸光值的比值，以此比值为纵坐标，抗原浓度的对数作为横坐标作图，即可得到竞争性的亲和力曲线，拟合后，得出半数结合浓度，即可估算出亲和力常数。

2实验结果

图12显示的是用免疫印迹法(Western Blot法)检测CHO细胞株K70E10-1D6表达的人源化单克隆抗体与AGR2的结合的结果。该研究主要考察K70E10-1D6细胞株表达的人源化单克隆抗体与不同浓度的AGR2标签蛋白和肿瘤细胞天然的AGR2的结合情况。用于制备细胞裂解液的细胞系中，MCF7细胞为人乳腺导管癌细胞，AGR2表达阳性；SKOV3细胞为人卵巢癌细胞，AGR2表达阴性；上述细胞均购自ATCC。

如图12显示，AGR2-MBP标签蛋白在分子量约60KDa的位置呈现明显的条带，且随着AGR2-MBP蛋白量的减少，条带也呈现减弱的趋势；同样地，AGR2-His标签蛋白在分子量约17KDa的位置呈现明显的条带，且随着AGR2-His蛋白量的减少，条带也呈现减弱的趋势。MCF7细胞裂解液在分子量约17KDa的位置有明显的条带，应为肿瘤细胞的天然AGR2；同时，SKOV3细胞裂解液在分子量约17KDa的位置未见明显条带。

以上结果显示，CHO细胞株K70E10-1D6表达的人源化单克隆抗体能与AGR2结合。即无论是AGR2标签蛋白，还是肿瘤细胞的天然AGR2，人源化单克隆抗体均能够与以上AGR2结合，并在免疫印迹法中呈现清晰的条带。

如图13显示的是CHO细胞株K70E10-1D6表达的抗体的亲和力检测结果。图13上的点表示的是不同浓度的抗原与0.2μg/ml的经纯化后的人源化单克隆抗体结合后，所对应剩余的抗体百分比。

分析如图13所示结果，可以观察到在抗原浓度为10^-4μM附近，剩余抗体的百分比有显著的提升。使用GraphPad Prism 5对数据点进行拟合，得到获得半数结合时的抗原浓度为1.116×10^-4μM。由于亲和力常数为半数结合浓度的倒数，单位为L/mol，K70E10-1D6表达的人源化单克隆抗体的亲和力为9.09×10⁸L/mol。

实施例8

CHO细胞株K70E10-1D6制备的抗体对乳腺癌细胞MCF7生长的影响

1实验方法

将处于对数生长期的MCF7细胞用胰酶消化，用台盼蓝染色、血细胞计数板计数后，按照6000个活细胞/孔均匀加入E-Plate L8细胞培养板(ACEA Biosciences,USA)中，每孔培养基的体积是450μL，培养基为含有10％胎牛血清的DMEM，培养8小时，等待细胞贴壁并适应环境。

将细胞培养板中的所有液体除去，换为含有2％胎牛血清的DMEM，培养12小时，等待MCF7细胞周期同步化。

12小时后，将细胞培养板连接iCELLigence细胞生长测定仪(ACEA Biosciences,USA)，测定基线数值，设定数值显示为Normalized Cell Index模式，每分钟读取1次数值，观察等待基线平稳即可。

平稳基线使，使用含有2％胎牛血清的DMEM配制以下药物溶液：终浓度500ng/ml的AGR2-His，终浓度为20μg/ml的18A4(18A4为公开号CN101519649的专利中，公布的鼠源抗AGR2单克隆抗体)，终浓度为20μg/ml的抗AGR2人源化单克隆抗体(由CHO细胞株K70E10-1D6产生和制备)；用含有2％胎牛血清的DMEM为Control。

基线平稳后，除去细胞培养板中原有液体，加入以上配置的药液，分为四组：Control组、AGR2-His组、18A4组、抗AGR2人源化单克隆抗体组，每种药液平行做3份，每孔的培养液体积为450μL。加药后，设定数值显示为Normalized Cell Index模式，每分钟读取1次数值，共观察48小时的生长曲线。

48小时观察结束后，将所收集的数据绘制成图线，横坐标为观察时间，纵坐标是Normalized Cell Index的平均值(数值越大，反映活细胞数越多)，比较AGR2-His组、18A4组、抗AGR2人源化单克隆抗体组和Control组之间的区别。

2实验结果

图14显示的是CHO细胞株K70E10-1D6表达的抗体抑制乳腺癌细胞MCF7的生长的结果。本实施例采用了iCELLigence细胞生长测定仪观察抗体对肿瘤细胞MCF7生长的影响，Normalized Cell Index反映细胞生长情况，与活细胞数成正比，即活细胞数越多，该数值越大。观察的48小时内，能够每间隔1分钟自动测定细胞生长情况一次，因而不会遗漏细胞生长中任何一个关键的时间点，结果更具有说服力。

如图14显示的结果，从图线的总体趋势看，AGR2-His组的曲线始终呈现上升趋势，而Control组的曲线上升趋势不如AGR2-His组明显，说明AGR2-His具有促进乳腺癌细胞MCF7生长的作用；18A4组和抗AGR2人源化单克隆抗体组的曲线均呈现平缓和下降的趋势，说明18A4和抗AGR2人源化单克隆抗体均能够抑制乳腺癌细胞MCF7的生长；进一步地，抗AGR2人源化抗体组的下降趋势大于18A4组，说明由CHO细胞株K70E10-1D6制备的抗AGR2人源化单克隆抗体具有与18A4相同，甚至更好的抑制乳腺癌细胞生长的效果。

如图14显示的结果，从图线所反映的数值上看，在48小时后，Control组的Normalized Cell Index均值为0.093，而18A4组为0.002，抗AGR2人源化单克隆抗体组为-0.025；统计显示，18A4组、抗AGR2人源化单克隆抗体组与Control组组间有显著性差异，进一步说明应用CHO细胞株K70E10-1D6制备的抗AGR2人源化单克隆抗体能够抑制乳腺癌细胞MCF7的生长，达到并优于鼠源抗AGR2单克隆抗体18A4的效果。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/K70E10-1D6，所述细胞株的保藏号为：CCTCC NO：C2014189。

2.如权利要求1所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株在制备抗AGR2人源化单克隆抗体中的应用。

3.一种抗AGR2人源化单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO：C2014189的CHO细胞株或其传代细胞株分泌产生。

4.如权利要求3所述的一种抗AGR2人源化单克隆抗体，其特征在于，所述抗体与AGR2抗原特异性结合。

5.如权利要求1所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株和权利要求3-4任一权利要求所述的抗AGR2人源化单克隆抗体在制备检测试剂或诊断试剂中的应用。

6.如权利要求1所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株和权利要求3-4任一权利要求所述的抗AGR2人源化单克隆抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的应用。

7.如权利要求6所述的抗AGR2人源化单克隆抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。