CN106478810A - 一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，先将蓝藻破壁并固液分离得到藻胆蛋白粗提液，再进行两步盐析，获得沉淀后用磷酸盐缓冲液溶解，并用磷酸盐缓冲液作为透析液将溶解后的溶液透析，以获得透析后的藻胆蛋白溶液，最后进行纤维素柱层析以及羟基磷灰石柱层析，以获得了试剂级的藻蓝蛋白和试剂级的别藻蓝蛋白。本发明以水华新鲜蓝藻为原料，通过采用盐析联合柱层析分离纯化试剂级藻蓝蛋白和试剂级别藻蓝蛋白，与传统层析法工艺相比，在兼顾蛋白质回收率的前提下，能同时提取纯化两种高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，提高了蓝藻细胞中高价值蛋白综合提取纯化的效率，并且可以放大。

Description

一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生化分离技术领域，特别是涉及一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法。

背景技术

水华蓝藻中富含藻胆蛋白，不同藻胆蛋白的结构基本相似，均含有两条结构相似的多肽链α和β亚基，分子量约为3万道尔顿，每一亚基各与一分子的藻蓝素结合。按照吸收光谱性质藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白和藻红蓝蛋白。其中，藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白一般以三聚体和六聚体的形式存在。藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的纯度越高，售价越高，纯度计算分别以A₆₂₀/A₂₈₀与A₆₅₀/A₂₈₀来表征，根据其纯度的不同可分级为：食品级>0.7，药品级>3.0和试剂级>4.0。藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白都具有抗氧化性、抗炎性、抗衰老性、抗癌性和免疫荧光性等功能。因此，被广泛用作天然色素(食品、化妆品、染料等)、医药保健品和分子生物学研究中的荧光试剂。一般来说，水华蓝藻中藻蓝蛋白的含量达5％以上，别藻蓝蛋白含量在2％以上。从水华蓝藻中提取纯化较高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，既可实现水华蓝藻处理的无害化，又可实现高附加值的资源化利用。

藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白提取的方法主要有：冻融法、超声波法、高压均质法、化学试剂法等等。现行很多的破壁提取方法强调联用，尽管一定程度上增加了蓝藻破壁后蛋白质的得率，但是增加了相应工艺步骤，操作复杂性增加，成本增大。另外，藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白纯化的方法主要包括：盐析、超滤、透析、利凡诺沉淀、双水相萃取和层析法等等。现行很多的纯化方法主要重点在于单一提取纯化纯度大于4以上的藻蓝蛋白，不能整体有效的同时分离和纯化出高附加值的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，未能实现高附加值的多种蛋白质综合利用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，用于解决现有技术中不能整体有效的同时分离和纯化出高附加值的试剂级的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：

S1，将蓝藻进行破壁以产生藻液，将所述藻液进行固液分离，所得液体即为藻胆蛋白粗提液；

S2，向所述藻胆蛋白粗提液中加入适量硫酸铵，混匀并静置后离心，获得上清液；

S3，向步骤S2中获得的上清液中追加适量硫酸铵，混匀并静置后离心，获得沉淀；

S4，将步骤S3中获得的沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，并用磷酸盐缓冲液作为透析液将溶解后的溶液透析脱盐，脱盐后的溶液再离心弃去变性蛋白以获得透析后的藻胆蛋白溶液；

S5，将步骤S4中透析后的藻胆蛋白溶液，过平衡好的纤维素层析柱，并依次用含不同离子强度的洗脱液洗脱，分别收集洗脱的组分，检测组分中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的纯度和浓度，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用磷酸盐缓冲液作为透析液进行透析脱盐以获得含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液；

S6，将步骤S5中获得的混合液过平衡好的羟基磷灰石层析柱，并依次用含不同离子强度的洗脱液洗脱，分别收集洗脱的组分，以获得了试剂级的藻蓝蛋白和试剂级的别藻蓝蛋白。

优选地，所述步骤S1的具体操作为：将-20℃条件下冷冻保存的新鲜蓝藻在25-35℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现蓝藻细胞的破壁；将蓝藻破壁后的溶液用多层纱布粗过滤，去除藻渣，再离心后去渣即可获得藻胆蛋白粗提液。

优选地，所述步骤S2中硫酸铵添加量为1.0～1.4mol/L。

优选地，所述步骤S3中追加硫酸铵使其物质的量浓度达到1.6～2.2mol/L。

优选地，所述步骤S4中磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为6.5，选用截留量为100KDa的透析袋进行透析脱盐。

优选地，所述步骤S5中采用0.02mol/L、pH＝6.5、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡纤维素层析柱，平衡后，将透析后的藻胆蛋白溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3。

优选地，所述步骤S5中用分别含0.1、0.3、1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱线速度为200～300cm/h。

优选地，所述步骤S6中采用0.01mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将步骤S5中获得的混合液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3。

优选地，所述步骤S6中采用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脱线速度为200～300cm/h。

优选地，所述步骤S2、步骤S3中的离心操作均在4℃下进行。

如上所述，本发明的一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，具有以下有益效果：本发明以水华新鲜蓝藻为原料，通过采用盐析联合柱层析分离纯化试剂级藻蓝蛋白和试剂级别藻蓝蛋白，与传统层析法工艺相比，在兼顾蛋白质回收率的前提下，能同时提取纯化两种高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，提高了蓝藻细胞中高价值蛋白综合提取纯化的效率，并且可以放大。

附图说明

图1显示为本发明的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法的流程图。

图2显示为本发明的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法的实施例一的纤维素柱层析后第一洗脱次序洗脱的组分光谱图。

图3显示为本发明的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法的实施例一的纤维素柱层析后第二洗脱次序洗脱的含不同浓度(浓度单位为mg/mL)藻蓝蛋白的组分光谱图。

图4显示为本发明的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法的实施例一的HA柱层析后第一洗脱次序洗脱的含不同浓度(浓度单位为mg/mL)藻蓝蛋白的组分光谱图。

图5显示为本发明的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法的实施例一的HA柱层析后第二洗脱次序洗脱的组分光谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1至图5。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

本发明提供一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，采用冻融破壁获得藻胆蛋白粗提液，采用盐析联合柱层析的方法同时分离和纯化获得试剂级藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。冻融法的原理是通过冷冻破坏了细胞膜的疏水键结构，增加细胞膜的通透性，同时细胞内的水结冰，形成冰晶，撑破细胞膜，进而溶胀破壁，通过室温融化的方式获得藻胆蛋白破壁粗提液。冻融法易于保存蓝藻，不受时空限制，不会导致蛋白质的变形，操作简单。盐析法是使用中性盐来中和溶液中蛋白质的电荷，破坏蛋白质表面的水化膜，使蛋白质相互聚集形成沉淀而析出。Cellufine A-500柱层析是一种阴离子交换分离技术，原理是利用蛋白质在不同pH缓冲液中蛋白质所带正负电荷的差异，从而与阴离子离子交换剂结合的能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而被分离出来。纤维素基材的离子交换填料是交联的球状纤维素颗粒，有着较高的流速、机械稳定性和溶剂的耐受性。与葡聚糖、琼脂糖和人工合成的聚合物类填料相比，具有机械强度高、溶出物少的优点。HA填料具有独特的分离机理，是目前唯一直接用于蛋白质和核酸纯化的无机层析填料，具有高度耐碱、生物安全性的优点。其表面具有丰富的PO₄ ^3-和Ca²⁺，具有阳离子交换和金属螯合的混合作用机理。

如图1所示，本发明提供一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将-20℃条件下冷冻保存(一般保存约10h)的新鲜蓝藻(含水率99％)在25℃下融化(融化解冻时间可选为约6h)，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现蓝藻细胞的破壁；将蓝藻破壁后的溶液用多层纱布粗过滤，纱布数目优选为200目，去除藻渣，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，去渣即可获得藻胆蛋白粗提液；

(2)一步盐析：在4℃下，向上述藻胆蛋白粗提液加入中(NH₄)₂SO₄固体使粗提液中(NH₄)₂SO₄的浓度为1.0～1.4mol/L，搅拌混匀后静置30min，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，弃去沉淀，保留上清液；

(3)二步盐析：在4℃下，向步骤(2)获取的上清液中继续加入(NH₄)₂SO₄固体使上清液中(NH₄)₂SO₄的浓度为1.6～2.2mol/L，搅拌混匀后静置30min，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，弃去上清液，获得藻胆蛋白沉淀；

(4)透析脱盐：向步骤(3)获得的藻胆蛋白沉淀中加入少量0.01mol/L(指磷酸根浓度)，pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液，以将藻胆蛋白沉淀溶解。再将溶解后的溶液置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000r/min高速离心，离心时间30min，弃去变性蛋白以获得透析后的藻胆蛋白溶液。

(5)Cellufine A-500柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，量取50ml体积的Cellfine A-500，浸泡于2倍体积的高盐度洗脱溶液(20mmol/L磷酸盐溶液加入2mol/L的氯化钠溶液中而制得)中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.02mol/L、pH＝6.5、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡Cellufine A-500层析柱，平衡后，将透析后的藻胆蛋白溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后分别用含0.1、0.3、1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集用三种梯度的洗脱液洗脱的组分，检测组分中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的纯度和浓度，并进行紫外-可见吸收光谱扫描，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用0.01mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲液作为透析液进行透析脱盐以获得含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液；

(6)HA柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，称取30g羟基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.01mol/L、pH＝7.0、3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡HA层析柱，平衡后，将步骤(5)中获得的含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集洗脱的组分，以获得试剂级的藻蓝蛋白和试剂级的别藻蓝蛋白。

以下提供三个实施例。藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白的吸光度用紫外-可见分光光度仪检测，藻蓝蛋白纯度计算依据公式P₁＝A₆₂₀/A₂₈₀，别藻蓝蛋白纯度计算依据公式P₂＝A₆₅₀/A₂₈₀，藻红蛋白纯度计算依据公式P₃＝A₅₆₅/A₂₈₀，藻蓝蛋白浓度计算依据公式[PC]＝(A₆₂₀-0.7×A₆₅₀)/7.38，别藻蓝蛋白浓度计算依据公式[APC]＝(A₆₅₀-0.19×A₆₂₀)/5.65，藻红蛋白浓度计算依据公式[PE]＝(A₅₄₀-2.8×[PC]-1.34×[APC])/12.7，回收率计算依据公式Y＝(C_tV_t/C₀V₀)×100％，其中：A₂₈₀、A₅₄₀、A₅₆₅、A₆₂₀、A₆₅₀分别为波长280、540、565、620、650nm处的吸光度；C_t为样品溶液中的藻蓝蛋白(别藻蓝蛋白)质量浓度；C₀为粗提液中的藻蓝蛋白质(别藻蓝蛋白)质量浓度；V_t为样品溶液的体积；V₀为粗提液的体积。

实施例一：

(1)将-20℃条件下冷冻保存(一般保存约10h)的新鲜蓝藻(含水率99％)在25℃下融化(融化解冻时间可选为约6h)，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现蓝藻细胞的破壁；将蓝藻破壁后的溶液用多层纱布粗过滤，纱布数目优选为200目，去除藻渣，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，去渣即可获得藻胆蛋白粗提液；

(2)一步盐析：在4℃下，向上述藻胆蛋白粗提液加入中(NH₄)₂SO₄固体使粗提液中(NH₄)₂SO₄的浓度为1.0mol/L，搅拌混匀后静置30min，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，弃去沉淀，保留上清液；

(3)二步盐析：在4℃下，向步骤(2)获取的上清液中继续加入(NH₄)₂SO₄固体使上清液中(NH₄)₂SO₄的浓度为1.6mol/L，搅拌混匀后静置30min，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，弃去上清液，获得藻胆蛋白沉淀；

(4)透析脱盐：向步骤(3)获得的藻胆蛋白沉淀中加入少量0.01mol/L，pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液，以将藻胆蛋白沉淀溶解。再将溶解后的溶液置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000r/min高速离心，离心时间30min，弃去变性蛋白以获得透析后的藻胆蛋白溶液。

(5)Cellufine A-500柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，量取50ml体积的Cellfine A-500，浸泡于2倍体积的高盐度洗脱溶液(20mmol/L磷酸盐溶液加入2mol/L的氯化钠溶液中而制得)中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.02mol/L、pH＝6.5、5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡Cellufine A-500层析柱，平衡后，将透析后的藻胆蛋白溶液上样，上样量为柱床体积的2/3；进样完毕后分别用含0.1、0.3、1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱线速度为200cm/h；分别收集用三种梯度的洗脱液洗脱的组分，检测组分中藻红蛋白、藻蓝蛋白以及别藻蓝蛋白的纯度和浓度，并进行紫外-可见吸收光谱扫描。

按照洗脱顺序，洗脱出来的溶液颜色分别为粉红色、蓝色、黄褐色。对三个洗脱的组分进行250-700nm紫外-可见吸收光谱扫描，按照洗脱顺序，第一洗脱次序洗脱的组分(组分1)光谱图和第二洗脱次序洗脱的组分(组分2)光谱图分别如图2、图3所示。由图2可以看出，于270nm和565nm处出现吸收峰，说明主要物质成分为藻红蛋白，因为藻红蛋白在565nm附近具有典型特征吸收峰。图3为纤维素柱层析后，第二洗脱次序洗脱的含不同浓度(浓度单位为mg/mL，由洗脱后的组分进行不同倍数的稀释而得)藻蓝蛋白的组分光谱图，从上到下，浓度依次下降，从图中可以看出，对不同浓度的藻蓝蛋白，均分别于277nm和620nm附近出现吸收峰，说明主要物质成分为藻蓝蛋白，因为藻蓝蛋白在可见光区620nm处具有典型的特征吸收峰，在280nm处有典型的蛋白质部分氨基酸的吸收峰，并且，随着浓度的增加，其吸光度也增大。

通过检测组分中藻红蛋白、藻蓝蛋白以及别藻蓝蛋白的纯度和浓度可知，组分1中的粉红色物质主要为藻红蛋白，组分2中除主要含藻蓝蛋白外还含有少量别藻蓝蛋白。第三洗脱次序洗脱的黄褐色物质成分含有少量的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，另外还含有核酸类物质。由此将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分(这里为组分2)用0.01mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲液作为透析液进行透析脱盐以获得含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液；

(6)HA柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，称取30g羟基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.01mol/L、pH＝7.0、5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡HA层析柱，平衡后，将步骤(5)中获得的含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液上样，上样量为柱床体积的1/3；进样完毕后用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脱线速度为200cm/h；分别收集洗脱的组分，以获得试剂级的藻蓝蛋白和试剂级的别藻蓝蛋白。对洗脱的组分进行紫外-可见吸收光谱扫描，按照洗脱顺序，第一洗脱次序洗脱的组分(组分1)和第二洗脱次序洗脱的组分(组分2)的光谱扫描图分别如图4、图5所示。图4为HA柱层析后，第一洗脱次序洗脱的含不同浓度(浓度单位为mg/mL，由洗脱后的组分进行不同倍数的稀释而得)藻蓝蛋白的组分光谱图，从上到下，浓度依次下降，从图中可以看出，对不同浓度的藻蓝蛋白，均分别于280nm和620nm附近出现吸收峰，说明主要物质成分为藻蓝蛋白，因为藻蓝蛋白在可见光区620nm处具有典型的特征吸收峰，在280nm处有典型的蛋白质部分氨基酸的吸收峰，并且，随着浓度的增加，其吸光度也增大。由图5可知，分别于278nm和650nm处出现吸收峰，说明主要物质成分为别藻蓝蛋白，因为别藻蓝蛋白在650nm附近具有典型特征吸收峰。经检测组分中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的纯度和浓度可知，组分1的主要成分为藻蓝蛋白，组分2的主要成分为别藻蓝蛋白。此外，经检测分析，第三洗脱次序洗脱的组分为残留在柱中与HA结合比较紧密的痕量杂质蛋白组分。其实验数据见表1，经过HA柱层析后，组分1中的藻蓝蛋白以及组分2中的别藻蓝蛋白的纯度均大于4.0，说明采用本发明的分离纯化方法，可实现试剂级藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化。

表1 实施例一实验数据

实施例二：

(1)将-20℃条件下冷冻保存(一般保存约10h)的新鲜蓝藻(含水率99％)在25℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现蓝藻细胞的破壁；将蓝藻破壁后的溶液用多层纱布粗过滤，纱布数目优选为200目，去除藻渣，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，去渣即可获得藻胆蛋白粗提液；

(2)一步盐析：在4℃下，向上述藻胆蛋白粗提液加入中(NH₄)₂SO₄固体使粗提液中(NH₄)₂SO₄的浓度为1.2mol/L，搅拌混匀后静置30min，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，弃去沉淀，保留上清液；

(3)二步盐析：在4℃下，向步骤(2)获取的上清液中继续加入(NH₄)₂SO₄固体使上清液中(NH₄)₂SO₄的浓度为1.8mol/L，搅拌混匀后静置30min，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，弃去上清液，获得藻胆蛋白沉淀；

(4)透析脱盐：向步骤(3)获得的藻胆蛋白沉淀中加入少量0.01mol/L，pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液，以将藻胆蛋白沉淀溶解。再将溶解后的溶液置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000r/min高速离心，离心时间30min，弃去变性蛋白以获得透析后的藻胆蛋白溶液。

(5)Cellufine A-500柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，量取50ml体积的Cellfine A-500，浸泡于2倍体积的高盐度洗脱溶液(20mmol/L磷酸盐溶液加入2mol/L的氯化钠溶液中而制得)中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.02mol/L、pH＝6.5、5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡Cellufine A-500层析柱，平衡后，将透析后的藻胆蛋白溶液上样，上样量为柱床体积的2/3；进样完毕后分别用含0.1、0.3、1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱线速度为200cm/h；分别收集用三种梯度的洗脱液洗脱的组分，检测组分中藻红蛋白、藻蓝蛋白以及别藻蓝蛋白的纯度和浓度，并进行紫外-可见吸收光谱扫描，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用0.01mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲液作为透析液进行透析脱盐以获得含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液；

(6)HA柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，称取30g羟基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.01mol/L、pH＝7.0、5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡HA层析柱，平衡后，将步骤(5)中获得的含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液上样，上样量为柱床体积的1/2；进样完毕后用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脱线速度为200cm/h；分别收集洗脱的组分，以获得试剂级的藻蓝蛋白和试剂级的别藻蓝蛋白。对洗脱的组分进行紫外-可见吸收光谱扫描分析，并检测组分中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的纯度和浓度。按照洗脱顺序，第一洗脱次序洗脱的组分(组分1)主要成分为藻蓝蛋白，第二洗脱次序洗脱的组分(组分2)的主要成分为别藻蓝蛋白。其实验数据见表2，经过HA柱层析后，组分1中的藻蓝蛋白以及组分2中的别藻蓝蛋白的纯度均大于4.0，说明采用本发明的分离纯化方法，可实现试剂级藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化。

表2 实施例二实验数据

实施例三：

(1)将-20℃条件下冷冻保存(一般保存约10h)的新鲜蓝藻(含水率99％)在30℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现蓝藻细胞的破壁；将蓝藻破壁后的溶液用多层纱布粗过滤，纱布数目优选为200目，去除藻渣，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，去渣即可获得藻胆蛋白粗提液；

(2)一步盐析：在4℃下，向上述藻胆蛋白粗提液加入中(NH₄)₂SO₄固体使粗提液中(NH₄)₂SO₄的浓度为1.4mol/L，搅拌混匀后静置30min，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，弃去沉淀，保留上清液；

(3)二步盐析：在4℃下，向步骤(2)获取的上清液中继续加入(NH₄)₂SO₄固体使上清液中(NH₄)₂SO₄的浓度为2.0mol/L，搅拌混匀后静置30min，再在4℃下进行8000r/min的高速离心，离心时间20min，弃去上清液，获得藻胆蛋白沉淀；

(4)透析脱盐：向步骤(3)获得的藻胆蛋白沉淀中加入少量0.01mol/L，pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液，以将藻胆蛋白沉淀溶解。再将溶解后的溶液置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000r/min高速离心，离心时间30min，弃去变性蛋白以获得透析后的藻胆蛋白溶液。

(5)Cellufine A-500柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，量取50ml体积的Cellfine A-500，浸泡于2倍体积的高盐度洗脱溶液(20mmol/L磷酸盐溶液加入2mol/L的氯化钠溶液中而制得)中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.02mol/L、pH＝6.5、5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡Cellufine A-500层析柱，平衡后，将透析后的藻胆蛋白溶液上样，上样量为柱床体积的2/3；进样完毕后分别用含0.1、0.3、1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱线速度为300cm/h；分别收集用三种梯度的洗脱液洗脱的组分，检测组分中藻红蛋白、藻蓝蛋白以及别藻蓝蛋白的纯度和浓度，并进行紫外-可见吸收光谱扫描，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用0.01mol/L、pH为6.5的磷酸盐缓冲液作为透析液进行透析脱盐以获得含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液；

(6)HA柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，称取30g羟基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.01mol/L、pH＝7.0、5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡HA层析柱，平衡后，将步骤(5)中获得的含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液上样，上样量为柱床体积的2/3；进样完毕后用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h；分别收集洗脱的组分，以获得试剂级的藻蓝蛋白和试剂级的别藻蓝蛋白。对洗脱的组分进行紫外-可见吸收光谱扫描分析，并检测组分中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的纯度和浓度。按照洗脱顺序，第一洗脱次序洗脱的组分(组分1)主要成分为藻蓝蛋白，第二洗脱次序洗脱的组分(组分2)的主要成分为别藻蓝蛋白。其实验数据见表3，经过HA柱层析后，组分1中的藻蓝蛋白以及组分2中的别藻蓝蛋白的纯度均大于4.0，说明采用本发明的分离纯化方法，可实现试剂级藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化。

表3 实施例三实验数据

依据上述三个实施例制得的藻蓝蛋白为深蓝色溶液，藻蓝蛋白的纯度(A₆₂₀/A₂₈₀)大于4.0，满足试剂级藻蓝蛋白纯度的要求，蛋白质回收率≥6.0％。别藻蓝蛋白为天蓝色溶液，别藻蓝蛋白的纯度(A₆₅₀/A₂₈₀)大于4.0，满足试剂级别藻蓝蛋白纯度的要求，蛋白质回收率≥2.0％。

综上所述，本发明以水华新鲜蓝藻为原料，通过采用盐析联合柱层析制备试剂级藻蓝蛋白和试剂级别藻蓝蛋白，与传统层析法工艺相比，在兼顾蛋白质回收率的前提下，能同时提取纯化两种高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，提高了蓝藻细胞中高价值蛋白综合提取纯化的效率，并且可以放大。

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将蓝藻进行破壁以产生藻液，将所述藻液进行固液分离，所得液体即为藻胆蛋白粗提液；

S2，向所述藻胆蛋白粗提液中加入适量硫酸铵，混匀并静置后离心，获得上清液；

S3，向步骤S2中获得的上清液中追加适量硫酸铵，混匀并静置后离心，获得沉淀；

S4，将步骤S3中获得的沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，并用磷酸盐缓冲液作为透析液将溶解后的溶液透析脱盐，脱盐后的溶液再离心弃去变性蛋白以获得透析后的藻胆蛋白溶液；

S5，将步骤S4中透析后的藻胆蛋白溶液，过平衡好的纤维素层析柱，并依次用含不同离子强度的洗脱液洗脱，分别收集洗脱的组分，检测组分中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的纯度和浓度，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用磷酸盐缓冲液作为透析液进行透析脱盐以获得含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的混合液；

S6，将步骤S5中获得的混合液过平衡好的羟基磷灰石层析柱，并依次用含不同离子强度的洗脱液洗脱，分别收集洗脱的组分，以获得了试剂级的藻蓝蛋白和试剂级的别藻蓝蛋白。

2.根据权利要求1所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S1的具体操作为：将-20℃条件下冷冻保存的新鲜蓝藻在25-35℃下融化，再放入-20℃条件下冷冻，重复此步骤至少2次，以实现蓝藻细胞的破壁；将蓝藻破壁后的溶液用多层纱布粗过滤，去除藻渣，再离心后去渣即可获得藻胆蛋白粗提液。

3.根据权利要求1所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S2中硫酸铵添加量为1.0～1.4mol/L。

4.根据权利要求1所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S3中追加硫酸铵使其物质的量浓度达到1.6～2.2mol/L。

5.根据权利要求1所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S4中磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为6.5，选用截留量为100KDa的透析袋进行透析脱盐。

6.根据权利要求1所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S5中采用0.02mol/L、pH＝6.5、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡纤维素层析柱，平衡后，将透析后的藻胆蛋白溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3。

7.根据权利要求1或6所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S5中用分别含0.1、0.3、1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱线速度为200～300cm/h。

8.根据权利要求1所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S6中采用0.01mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将步骤S5中获得的混合液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3。

9.根据权利要求1或8所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S6中采用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1mol/L，pH＝7.0，洗脱线速度为200～300cm/h。

10.根据权利要求1所述的同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S2、步骤S3中的离心操作均在4℃下进行。