CN112851777A - 一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白 - Google Patents

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CN112851777A CN202110408959.9A CN202110408959A CN112851777A CN 112851777 A CN112851777 A CN 112851777A CN 202110408959 A CN202110408959 A CN 202110408959A CN 112851777 A CN112851777 A CN 112851777A
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范建华
季亮
钱宇慧
凌睿婧
马娆
王启要
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Abstract

本发明提供了一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，包括：取新鲜海洋微藻藻液于离心管，将藻液稀释至5×106‑5×107cells/mL；二次离心，去上清，获得藻体；将藻体重悬于PEG/盐双水相体系中，获得双水相藻体重悬液；然后经反复冻融，获得微藻细胞破碎液；接着，待双水相体系分配平衡后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；接着，依次经羟基磷灰石柱纯化和银离子交换柱纯化获得藻胆蛋白纯化液；接着，进行透析除盐，冷冻干燥获得微藻藻胆蛋白成品。本发明采用冻融法破碎双水相藻体重悬液，可一步实现藻体的破碎与藻胆蛋白的初步纯化，可简化分离纯化步骤，有效提高回收率。

Description

一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，具体地涉及一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白。
背景技术
微藻通常是指含有叶绿素a并能进行光合作用的微生物的总称，属于原生生物的一种。藻胆体是螺旋藻、红藻、隐藻等海洋微藻中主要的捕光天线复合物，藻胆体由藻胆蛋白和连接蛋白构成，藻胆蛋白则是由藻胆素色基与脱辅基蛋白通过共价键联接而成。不同藻胆蛋白的结构基本相似，均含有两条结构相似的多肽链α和β亚基，分子量约为3万道尔顿，每一亚基各与一分子的藻蓝素结合。藻胆蛋白按照吸收光谱性质藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)和藻红蓝蛋白(Phcoerycyanin，PEC)。其中藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白的纯度越高，售价越高，纯度计算分别以A620/A280、A565/A280与A650/A280来表征，根据其纯度的不同可分级为：食品级>0.7，药品级>3.0和试剂级>4.0。藻胆蛋白具有抗氧化性、抗炎性、抗衰老性、抗癌性和免疫荧光性等功能，被广泛用作天然色素(食品、化妆品、染料等)、医药保健品和分子生物学研究中的荧光试剂，潜在市场需求巨大。
对于藻胆蛋白这类胞内可溶性蛋白，要对其提取分离，必须破碎藻类细胞，在保持蛋白活性的基础上使其以溶解的状态释放出来，再进行分离纯化。在藻胆蛋白粗提液中，杂蛋白含量极高，要分离得到商品应用标准的藻胆蛋白，通常首先需要经过如利凡诺沉淀、盐析法、等电点法或结晶法初步分离除去杂蛋白后，再通过柱层析法纯化，包括轻基石灰石吸附层析法、纤维素系列离子交换层析法、亲和层析和分子排阴层析法等。上述藻胆蛋白纯化方法一次性可处理量较少且易污染，单柱纯化所得纯度低，柱回收操作复杂且效率低，导致生产成本太高而无法大量工业化制备。
在藻胆蛋白分离纯化方面，国内相关技术研究起步晚、研究基础较为薄弱，存在分离纯化工艺复杂、成本高、得率低的问题，目前开发利用的力度、深度还很小，大部分仅限于简单的食用。繁杂的分离纯化工艺使藻胆蛋白的应用受到了限制。因此，有必要开发一种简单高效的适合大量制备分离纯化藻胆蛋白的方法，为实现海洋微藻藻胆蛋白的工业化生产提供技术基础。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺陷和不足，提供一种操作简单、得率高、适用于大规模生产的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法。本发明的第二个目的是提供一种藻胆蛋白。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，包括：
步骤一、取新鲜海洋微藻藻液于离心管，将藻液稀释至5×106-5×107cells/mL；二次离心，去上清，获得藻体；将藻体重悬于PEG/盐双水相体系中，获得双水相藻体重悬液；
步骤二、反复冻融步骤一中所述的双水相藻体重悬液，获得微藻细胞破碎液，离心备用；
步骤三、待步骤二中的双水相体系分配平衡后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
步骤四、步骤三的藻胆蛋白提取液经纯化、透析除盐获得微藻藻胆蛋白。
根据本发明，所述高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，还包括如下步骤：
步骤A、采用羟基磷灰石柱纯化步骤三中所述的藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白纯化液1；
步骤B、采用阴离子交换柱进一步纯化步骤A中所述的藻胆蛋白纯化液1，获得藻胆蛋白纯化液2；
步骤C、针对步骤B中所述的藻胆蛋白溶液2进行透析除盐，冷冻干燥获得微藻藻胆蛋白成品。
根据本发明，海洋微藻包括但不限于螺旋藻、红藻、隐藻。
根据本发明，步骤一的离心转速为4000-10000rpm，离心时间为5-10min。
根据本发明，步骤一所述的PEG/盐双水相体系为等体积的PEG/酒石酸钾钠体系，系线长为15-35％，藻体与PEG/盐双水相体系的体积比为0.2-0.4，pH为6.8-8.0。
优选的，所述的PEG/酒石酸钾钠体系，系线长为20％，藻体与PEG/盐双水相体系的体积比为0.3，pH为7.2。
根据本发明，所述步骤二中所述的冻融的次数优选为5-10次，冻融的操作步骤优选为-80至-20℃冷冻结冰，0-4℃融化完全。
优选的，所述步骤二中所述的冻融的次数优选为6-8次，冻融的操作步骤优选为-80至-20℃冷冻结冰，4℃融化完全。
根据本发明，所述步骤三中所述的双水相体系分配平衡步骤为：将微藻细胞破碎液于3-5℃静置1-5h，直至出现明显的分层。
进一步的，微藻细胞破碎液于4℃静置3h。
根据本发明，步骤A、采用羟基磷灰石柱纯化步骤三中所述的藻胆蛋白提取液，并进行梯度洗脱，获得藻胆蛋白纯化液1。
进一步，所述步骤A中所述的采用羟基磷灰石柱纯化步骤为：采用0.01M、pH为7.0、3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的1/3-2/3，上样完毕后用含0.1-0.2M氯化钠、pH为6.5-7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为200-300cm/h。
根据本发明，所述阴离子交换柱为Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱。
根据本发明，所述步骤B中所述采用阴离子交换柱进一步纯化的步骤为：配置Tris-HCl缓冲液Buffer A、Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集洗脱液；用盐溶液清洗离子交换柱，然后用碱溶液反向冲洗；所述Tris-HCl缓冲液的pH为6-6.8，电导率为4-8μs/cm；Tris-HCl-NaCl缓冲液的pH为5-6.8，电导率为4-8.5μs/cm。
根据本发明，所述步骤C的具体透析步骤为：置于截留量为100-300KDa的透析袋中，并用0.01-0.02M、pH为6.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12-15h。
作为本发明的第二个方面，一种藻胆蛋白，采用上述所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法制备获得。
本发明的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其有益效果：
(1)传统提取工艺常常采用微藻干粉，而本发明直接以新鲜微藻藻泥作为原料，极大程度降低了干燥工艺带来的高能耗和高成本，在绿色环保的基础上，可进一步降低生产成本。
(2)不同于传统先破碎后初纯的藻胆蛋白分离纯化方法，本发明采用冻融法破碎双水相藻体重悬液，可一步实现藻体的破碎与藻胆蛋白的初步纯化，可简化分离纯化步骤，有效提高回收率。
(3)本发明采用的冻融-双水相一步提取初纯方法，提取工艺简单，成本低，适用于藻胆蛋白的大规模工业化生产。
(4)本发明采用的海洋微藻藻胆蛋白分离纯化方法，操作温度低，可有效保障藻胆蛋白的生物活性不受破坏。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步说明。实施例中未注明的具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下实施例的藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白的吸光度用紫外-可见分光光度仪检测，藻蓝蛋白纯度计算依据公式P1＝A620/A280，别藻蓝蛋白纯度计算依据公式P2＝A650/A280，藻红蛋白纯度计算依据公式P3＝A565/A280，藻蓝蛋白浓度计算依据公式[PC]＝(A620-0.7×A650)/7.38，别藻蓝蛋白浓度计算依据公式[APC]＝(A650-0.19×A620)/5.65，藻红蛋白浓度计算依据公式[PE]＝(A565-2.8×[PC]-1.34×[APC])/12.7，其中:A280、A565、A620、A650分别为波长280、565、620、650nm处的吸光度。
以下实施例采用的阴离子交换柱为Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱。所述阴离子交换柱的介质为粒径为50-150μm，交联度为6％的琼脂糖凝胶组成；优选地，粒经为90μm；所述琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，琼脂糖凝胶的结构是稳定的，可以在许多条件下使用(如水，pH为4-9范围内的盐溶液)；琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
实施例1
(1)取新鲜螺旋藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至5×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min，获得藻体；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融6次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例1的试验数据见表1。
表1实施例1的实验数据
Figure BDA0003023420710000051
实施例2
(1)取新鲜螺旋藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至1×107cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-80℃反复冻融8次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例2的试验数据见表2。
表2实施例2的实验数据
Figure BDA0003023420710000061
实施例3
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至5×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融6次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例3的试验数据见表3。
表3实施例3的实验数据
溶液名称 B-PE浓度(mg/L) 光谱学纯度
藻胆蛋白提取液 124 2.43
藻胆蛋白纯化液1 102 3.24
藻胆蛋白纯化液2 82 3.75
藻胆蛋白溶液 77 4.02
实施例4
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至1×107cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-80℃反复冻融8次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例4的试验数据见表4。
表4实施例4的实验数据
溶液名称 B-PE浓度(mg/L) 光谱学纯度
藻胆蛋白提取液 137 2.16
藻胆蛋白纯化液1 128 2.96
藻胆蛋白纯化液2 94 4.12
藻胆蛋白溶液 82 4.22
依据上述实施例1-实施例4的结果，采用上述方法可制得的藻蓝蛋白纯度＞4，别藻蓝蛋白纯度＞4，藻红蛋白纯度＞4，可满足试剂级要求。
实施例5
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至5×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融4次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例5的试验数据见表5。
表5实施例5的实验数据
溶液名称 B-PE浓度(mg/L) 光谱学纯度
藻胆蛋白提取液 76 1.99
藻胆蛋白纯化液1 61 2.52
藻胆蛋白纯化液2 35 3.12
藻胆蛋白溶液 27 3.86
实施例6
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至1×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融6次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例6的试验数据见表6。
表6实施例6的实验数据
溶液名称 B-PE浓度(mg/L) 光谱学纯度
藻胆蛋白提取液 18 1.87
藻胆蛋白纯化液1 15 2.34
藻胆蛋白纯化液2 / /
藻胆蛋白溶液 / /
实施例7
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至5×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融4次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例7的试验数据见表7。
表7实施例7的实验数据
溶液名称 B-PE浓度(mg/L) 光谱学纯度
藻胆蛋白提取液 76 1.99
藻胆蛋白纯化液1 61 2.52
藻胆蛋白纯化液2 35 3.12
藻胆蛋白溶液 27 3.86
依据上述实施例5-7的试验结果，采用上述方法可制得的藻蓝蛋白纯度＞3，别藻蓝蛋白纯度＞3，藻红蛋白纯度＞3，可满足药品级要求。
综上所述，本发明以新鲜海洋微藻为原料，通过冻融-双水相提取初纯法，可一步实现藻体的破碎与藻胆蛋白的初步纯化，进一步联合柱层析可制备高纯度藻胆蛋白，与传统层析法工艺相比，提取工艺简单，成本低，适用于藻胆蛋白的大规模工业化生产。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，包括：
步骤一、取新鲜海洋微藻藻液于离心管，将藻液稀释至5×106-5×107cells/mL；二次离心，去上清，获得藻体；将藻体重悬于PEG/盐双水相体系中，获得双水相藻体重悬液；
步骤二、反复冻融步骤一中所述的双水相藻体重悬液，获得微藻细胞破碎液，离心备用；
步骤三、待步骤二中的双水相体系分配平衡后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
步骤四、步骤三的藻胆蛋白提取液经纯化、透析除盐获得微藻藻胆蛋白。
2.如权利要求1所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，步骤四还包括如下步骤：
A、采用羟基磷灰石柱纯化步骤三中所述的藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白纯化液1；
B、采用阴离子交换柱进一步纯化步骤A中所述的藻胆蛋白纯化液1，获得藻胆蛋白纯化液2；
C、针对步骤B中所述的藻胆蛋白溶液2进行透析除盐，冷冻干燥获得微藻藻胆蛋白成品。
3.如权利要求1或2所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，海洋微藻包括但不限于螺旋藻、红藻、隐藻。
4.如权利要求1或2所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，步骤一所述的PEG/盐双水相体系为等体积的PEG/酒石酸钾钠体系，系线长为15-35％，藻体与PEG/盐双水相体系的体积比为0.2-0.4，pH为6.8-8.0。
5.如权利要求1或2所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，所述步骤二中所述的冻融的次数优选为5-10次，冻融的操作步骤优选为-80至-20℃冷冻结冰，0-4℃融化完全。
6.如权利要求1或2所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，所述步骤三中所述的双水相体系分配平衡步骤为：将步骤二中的微藻细胞破碎液于3-5℃静置1-5h，直至出现明显的分层。
7.如权利要求2所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，步骤A中所述的采用羟基磷灰石柱纯化步骤为：采用0.01M、pH为7.0、3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的1/3-2/3，上样完毕后用含0.1-0.2M氯化钠、pH为6.5-7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为200-300cm/h。
8.如权利要求2所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，所述步骤B中所述采用阴离子交换柱进一步纯化的步骤为：配置Tris-HCl缓冲液Buffer A、Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集洗脱液；用盐溶液清洗离子交换柱，然后用碱溶液反向冲洗。
9.如权利要求2所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其特征在于，所述步骤C的具体透析步骤为：置于截留量为100-300KDa的透析袋中，并用0.01-0.02M、pH为6.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12-15h。
10.一种藻胆蛋白，其特征在于，采用如权利要求1-9任一项所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法制备获得。
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